CN113621696B - 一种用于检测高原适应性的snp标志物及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于检测高原适应性的SNP标志物及试剂盒,属于生物技术领域。所述SNP标志物为rs1204168,rs1204168为CC或TC基因型指示人体具有高原适应性。采用Sanger测序法时,前向引物序列为核苷酸序列表中的SEQID No.1;后向引物序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.2;采用Sequenom基因分型法时,前向引物序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.3,后向引物序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.4,延伸引物序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.5。所述SNP标志物及试剂盒通过检测rs1204168的基因型可有效检测人体的高原适应性。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于检测高原适应性的SNP标志物及试剂盒,属于生物技术领域。
背景技术
近年来,随着高原地区经济的快速发展和旅游业的盛行,高原移居人口日益增多。但是,高原的低氧环境给人们进入高原地区带来了挑战。非高原世居人群,在进入高原低氧环境下,极易诱发急、慢性高原病。因此,预测个体高原环境适应能力,将有望为高原地区的旅游、工作等提供科学指导。高原适应性具有明显的遗传学基础。世居高原的藏族人群已适应了青藏高原上的低氧和高寒等恶劣环境,并世代生存,将优势遗传基因代代相传,是世界高原人群中居住海拔最高、适应历史最长的群体。人类基因组脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid,DNA)序列中最常见的多态性包括单核苷酸多态性(SingleNucleotide Polymorphism,SNP),是机体表型差异和环境适应性的遗传学基础。因此,有望基于SNP信息,实现人体高原适应性的预测。
随着基于SNP芯片技术、高通量测序技术和“中性理论检验”的分子进化分析的逐步发展,人类高原适应性(High Altitude Adaptation,HAA)相关基因组学研究也在大步向前。多项报道称发现了EPAS1基因和EGLN1基因的多态性是藏族人群能够适应高原地区低氧环境且免于罹患高原疾病的一个重要遗传学基础。但rs1204168所在基因MCUR1与高原适应性的关系及其作为高原适应性的标志物尚未见报道,同时在已有的专利中尚无涉及rs1204168的应用。
发明内容
为克服现有技术存在的缺陷,本发明的目的之一在于提供一种用于检测高原适应性的SNP标志物。
本发明的目的之二在于提供一种用于检测高原适应性的试剂盒。
为实现本发明的目的,提供以下技术方案。
一种用于检测高原适应性的SNP标志物,所述SNP标志物为rs1204168,rs号表示该位点在dbSNP数据库中的编号,基于人类基因组第19版本,rs1204168位于人类第6号染色体13,836,672位置,所述rs1204168为CC或TC的基因型是人体具有高原适应性的指示。
进一步地,Sanger测序方法所使用的前向引物序列为核苷酸序列表中数字标识符<210>所表示的序列标识符1所述的核苷酸序列,即核苷酸序列表中的SEQ ID No.1(简称SEQ ID No.1);后向引物序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.2(简称SEQ ID No.2);利用所述前向引物和后向引物可以使用Sanger测序方法有效地检测本发明所述SNP标志物rs1204168。
进一步地,Sequenom基因分型方法所使用的前向引物序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.3(简称SEQ ID No.3),后向引物序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.4(简称SEQ ID No.4),延伸引物序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.5(简称SEQ ID No.5);利用所述前向引物、后向引物和延伸引物可以使用Sequenom基因分型方法有效地检测本发明所述SNP标志物rs1204168。
一种用于检测高原适应性的试剂盒,所述试剂盒包括本发明所述的一种用于检测高原适应性的SNP标志物rs1204168,所述rs1204168为CC或TC的基因型是人体具有高原适应性的指示。
进一步地,所述试剂盒还包括Sanger测序方法所使用的序列为SEQ ID NO.1的前向引物,以及序列为SEQ ID NO.2的后向引物;利用所述前向引物和后向引物可以使用Sanger测序方法有效地检测本发明所述SNP标志物rs1204168。
进一步地,所述试剂盒还包括Sequenom基因分型方法所使用的序列为SEQ IDNO.3的前向引物,序列为SEQ ID NO.4的后向引物和序列为SEQ ID NO.5的延伸引物;利用所述前向引物、后向引物和延伸引物可以使用Sequenom基因分型方法有效地检测本发明所述SNP标志物rs1204168。
进一步地,所述试剂盒的检测样本为被试人体的血液、皮肤或皮下组织。
有益效果
1.本发明提供了一种用于检测高原适应性的SNP标志物,所述SNP标志物为rs1204168,可以将rs1204168为CC或TC的基因型作为人体具有高原适应性的指示。
2.本发明提供了一种用于检测高原适应性的SNP标志物,利用前向引物和后向引物可以使用Sanger测序方法有效地检测所述SNP标志物rs1204168。
3.本发明提供了一种用于检测高原适应性的SNP标志物,利用前向引物、后向引物和延伸引物可以使用Sequenom基因分型方法有效地检测所述SNP标志物rs1204168。
4.本发明提供了一种用于检测高原适应性的试剂盒,所述试剂盒包括所述SNP标志物rs1204168以及其使用Sanger测序方法或Sequenom基因分型方法检测所使用的引物,可以通过所述试剂盒来检测rs1204168的基因型来有效地检测人体是否具有高原适应性。
附图说明
图1为实施例1的藏族人群与汉族人群的FST结果曼哈顿图。
图2为实施例3中对实施例2的研究对象检测的rs1204168基因型频率图。
图3为实施例4的rs1204168基因型与血红蛋白浓度图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例详细描述本发明,所述实施例的示例在附图中示出。通过参考附图描述的实施例是示例性的,旨在用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
若未特别指明,实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段,可以参照《分子克隆实验指南》第三版或相关产品进行。所采用的试剂盒产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法,所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者,均在首次出现时表明,其后所用相同试剂如无特殊说明,均与首次标明的内容相同。
实施例1全基因组进化分析研究
研究对象:48例藏族人和50例汉族人的基因组DNA。48例藏族人的基因组DNA,分别来源于48个没有亲缘关系的藏族人的外周血,所述藏族人分别居住在四川省甘孜藏族自治州海拔2,600米到4,200米的5个城市,青海慢性高原病评分(Qinghai Chronic MountainSickness Score)小于5分,健康无高原病。50例汉族人的基因组DNA,分别来源于50个没有亲缘关系的汉族人的外周血,所述汉族人居住在广西省南宁市,平均海拔79米,具体信息如表1所示。
将所述研究对象通过全基因组测序检测rs1204168位点的基因型信息。
对所述研究对象进行进化分析研究,使用固定系数(Fixation Index,FST)检验方法和基于加性模型的逻辑斯蒂(Logistic)回归分析方法。其中,FST使用VCFTools软件计算,用于检验藏族人和汉族人的遗传距离。逻辑斯蒂回归以rs1204168基因型为自变量,设定TT=0,TC=1,CC=2,表型(民族)为因变量,校正性别、年龄,使用PLINK软件1.07版本计算,用于检验rs1204168在藏族人和汉族人之间的频率差异。
表1用于全基因组SNP频率差异研究的人群信息总表
进化分析研究结果:
全基因组平均FST可评估两个人群之间的遗传距离,本实施例发现藏族与汉族之间的遗传距离,即全基因组平均FST是0.011。SNP的FST值越大,提示这些SNP越可能受到正向选择(Positive Selection)。本实施例中取FST排名前1,500的SNP,作为潜在受到正向选择的SNP阈值。这些SNP的FST值(FST≥0.235)均高于全基因组FST值平均值以上5个标准差(FST>0.146)。其中,除去排名第一的SNP,其FST值(FST=0.565)高于平均值以上20个标准差(FST>0.551),新信号中排名第一的是6p23区域(index SNP rs1204168,FST=0.464),该自然选择信号区域包含14个FST非常显著的SNPs(FST>0.42),并且,该区域及附近基因尚未报道与高原适应性相关。由FST检验的结果显示,在大多数的SNP上,藏族人和汉族人的基因组遗传距离较小,如图1所示;但是在rs1204168上,观测到rs1204168的FST值为0.464,提示rs1204168是有强正向选择可能性的SNP,即rs1204168的C等位基因与藏族人适应高原环境的正向选择相关的可能性大。
逻辑斯蒂回归方法的结果显示,rs1204168是藏族人和汉族人的频率差异较大的SNP,其统计学检验OR=0.08759,P=1.11×10-7。藏族人携带的较高频率的变异是rs1204168的C等位基因。
综合以上结果证明rs1204168的C等位基因与个体的高原适应性密切相关。
实施例2利用Sanger测序方法对研究对象的rs1204168进行基因分型
研究对象:来自实施例1的48例藏族人基因组DNA样本。利用3130xl GeneticAnalyzer(ABI,Foster City,CA)对所述DNA样本的PCR扩增产物进行Sanger测序,以便获得测序结果;基于测序结果,确定所述DNA样本的rs1204168基因型。Sanger测序方法中,用于针对rs1204168的基因分型的前向引物和后向引物如下:
前向引物序列为:TATGAGACCACCGAGATTTG(SEQ ID NO.1),
后向引物序列为:GCCTTCACATTGTTTCCC(SEQ ID NO.2)。
测序结果显示:所述DNA样本分别呈现CC基因型和TT基因型,说明Sanger测序可以有效地区分rs1204168的不同基因型。
实施例3rs1204168在独立人群中的频率
研究对象:672例藏族人和270例汉族人的基因组DNA样本。藏族人均世居西藏拉萨市,平均海拔3,650米。汉族人来自全国多个省市,海拔均在2,500米以下。所有个体间均不存在亲缘关系,具体信息见表2。所有个体均已签署知情同意书,且本研究经辐射医学研究所伦理委员会批准执行。
针对rs1204168设计引物,通过Sequenom检测获得rs1204168突变情况。Sequenom检测的具体步骤如下:
针对所述研究对象的基因组DNA样本中待分型的rs1204168,设计PCR引物以及延伸引物。这一过程使用MassARRAY Design 3.0软件实施。每次实验每个样本需使用约15ng的基因组DNA。使用PCR实验进行DNA模板扩增,扩增产物和延伸引物被用于SNP位点的特异性单碱基延伸反应。将反应产物经自动点样仪转移至SpectroCHIP芯片(Sequenom,加利福尼亚州,美国)。在Sequenom核酸质谱平台(Sequenom,加利福尼亚州,美国)进行基因型检测,下机数据,使用MassARRAY TYPER软件(Sequenom,加利福尼亚州,美国)进行分析。Sequenom检测中,用于针对rs1204168基因分型的引物如下:
前向引物:ACGTTGGATGTGTGAATGGTGGCCCTTCAG(SEQ ID NO:3);
后向引物:ACGTTGGATGAAGTGTGTTTCTGGCTTCTC(SEQ ID NO:4);
延伸引物:GGCTTCTCTCTTGGAAAG(SEQ ID NO:5)。
表2用于实施例3的人群信息表
结果:通过计数可得rs1204168的C等位基因频率在藏族人群中为75%,在汉族人群中为47%。即,rs1204168的C等位基因频率在藏族人群和汉族人群中存在差异,如图2所示。
实施例4rs1204168的基因型与血红蛋白浓度的相关性
血红蛋白浓度指单位体积(L)血液内所含血红蛋白的量。血红蛋白是一种含色素的结合蛋白质,是红细胞主要成分,能与氧结合,运输氧和二氧化碳。血红蛋白浓度升高分为生理性和病理性。前者常见于住在高原地区的人,由于高原地区相对来说氧浓度较低,所以长期住在那里的人,机体会代偿性生成较多的血红蛋白。但血红蛋白浓度增减与红细胞浓度增减一致,当机体失代偿后血红蛋白浓度超过阈值则会导致机体罹患红细胞增多症,即血红蛋白浓度的过度升高与高原疾病的发生密切相关。
研究对象:使用的是实施例3中的270个人的基因组DNA样本。针对rs1204168设计引物,通过Sequenom检测获得rs1204168的基因型。血红蛋白浓度,使用HemoCue Hb 201+分析仪(恩厄尔霍尔姆,瑞典)检测。rs1204168的基因型与血红蛋白浓度的相关性,采用皮尔森相关性分析评估时,rs1204168基因型中,设定TT=0,TC=1,CC=2。当P<0.05时认为具有显著的统计学意义。
结果:为了探索rs1204168能否作为生物标记物,使用rs1204168的C等位基因频率与血红蛋白浓度进行了相关性分析。发明人证明了rs1204168的C等位基因频率与血红蛋白浓度呈显著负相关:r=-0.141,P=0.0199,如图3所示,图中n代表人数。说明C等位基因频率越高,血红蛋白浓度越低,进一步说明如个体的rs1204168位点的基因型为CC或者TC,则认为其具有一定的高原适应性。
核苷酸序列表
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 一种用于检测高原适应性的SNP标志物及试剂盒
<160> 5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sanger测序的前向引物
<400>
tatgagacca ccgagatttg 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sanger测序的后向引物
<400>
gccttcacat tgtttccc 18
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sequenom测序的前向引物
<400>
acgttggatg tgtgaatggt ggcccttcag 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sequenom测序的后向引物
<400>
acgttggatg aagtgtgttt ctggcttctc 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sequenom测序的延伸引物
<400>
ggcttctctc ttggaaag 18
Claims (5)
1.一种SNP标志物在制备检测人体高原适应性的产品中的用途,其特征在于:所述SNP标志物为rs1204168,所述rs1204168为CC或TC的基因型是人体具有高原适应性的指示。
2.根据权利要求1所述的一种SNP标志物在制备检测人体高原适应性的产品中的用途,其特征在于:所述用途包括Sanger测序方法所使用的前向引物序列为核苷酸序列表中的SEQ IDNo. 1;后向引物序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No. 2。
3.根据权利要求1所述的一种SNP标志物在制备检测人体高原适应性的产品中的用途,其特征在于:所述用途包括Sequenom基因分型方法所使用的前向引物序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No. 3,后向引物序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No. 4,延伸引物序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No. 5。
4.一种用于检测高原适应性的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒包括如权利要求1所述的一种用于检测高原适应性的SNP标志物rs1204168,所述rs1204168为CC或TC的基因型是人体具有高原适应性的指示;
所述试剂盒还包括Sanger测序方法所使用的前向引物和后向引物,前向引物的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No. 1;后向引物的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No. 2;或
所述试剂盒还包括Sequenom基因分型方法所使用的前向引物、后向引物和延伸引物,前向引物的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No. 3,后向引物的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No. 4,延伸引物的序列为SEQ ID NO.5。
5.根据权利要求4所述的一种用于检测高原适应性的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒的检测样本为被试人体的血液、皮肤或皮下组织。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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