CN114381516A

CN114381516A - 一种用于筛查高原肺水肿易感人群的试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN114381516A
Application number: CN202210285660.3A
Authority: CN
Inventors: 王艳; 刘柳
Original assignee: Chinese PLA General Hospital
Current assignee: Chinese PLA General Hospital
Priority date: 2022-03-23
Filing date: 2022-03-23
Publication date: 2022-04-22
Anticipated expiration: 2042-03-23
Also published as: CN114381516B

Abstract

本发明公开了一种用于筛查高原肺水肿易感人群的试剂盒及其应用。本发明提供了用于检测受试者基于SNP rs12733147的基因型的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下（a）或（b）：（a）筛查高原肺水肿易感个体；（b）评价受试者发生高原肺水肿的风险性。本发明还保护SNP rs12733147作为检测靶标在开发产品中的应用；所述产品的功能为如下（a）或（b）：（a）筛查高原肺水肿易感个体；（b）评价受试者发生高原肺水肿的风险性。本发明可用于避免或减少高原肺水肿的发生，对于高原地区具有重大的应用推广价值。

Description

一种用于筛查高原肺水肿易感人群的试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于基因检测领域，涉及一种用于筛查高原肺水肿易感人群的试剂盒及其应用，具体的，所述试剂盒为以SNP rs12733147作为检测靶标。

背景技术

高原肺水肿（High altitude pulmonary edema，HAPE）是指近期抵达高原（一般指海拔3000米以上，也有少量为海拔3000米以下），出现静息时呼吸困难、胸闷、胸部压塞感、咳嗽、咳白色或粉红色泡沫痰，患者感全身乏力或活动能力减低。高原肺水肿是高原特发性疾病，多见于3 000m以上的高海拔地区，以发病急、危害大、病死率高为主要特点。

近年来，国内外对HAPE的发生进行了一系列的研究，该病具有明显的遗传易感倾向，是遗传和环境共同作用的结果。在低氧环境下发病的机率与个体易感性基因密切相关，因此易感基因可能会作为一种重要的分子标志物预防和诊断疾病、评估病情严重程度，并提供有效的治疗办法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何筛查高原肺水肿易感个体或如何预测受试者对高原肺水肿的易感性或如何筛查携带人高原肺水肿易感基因的个体或如何评价高原肺水肿患病风险。

本发明保护一种产品，包括用于检测受试者基于SNP rs12733147的基因型的物质；所述产品的功能为如下（a）或（b）：

（a）筛查高原肺水肿易感个体；

（b）评价受试者发生高原肺水肿的风险性。

GA基因型受试者或AA基因型受试者为高原肺水肿易感个体。

GG基因型受试者发生高原肺水肿的风险性低于GA基因型受试者或AA基因型受试者。

示例性的，所述用于检测受试者基于SNP rs12733147的基因型的物质为引物组。具体的，所述引物组由三条引物组成，分别为序列表的序列1所示的单链DNA分子、序列表的序列2所示的单链DNA分子、序列表的序列3所示的单链DNA分子。

示例性的，所述用于检测受试者基于SNP rs12733147的基因型的物质为引物对。具体的，所述引物对由两条引物组成，分别为序列表的序列4所示的单链DNA分子、序列表的序列5所示的单链DNA分子。

本发明还保护用于检测受试者基于SNP rs12733147的基因型的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下（a）或（b）：

（a）筛查高原肺水肿易感个体；

（b）评价受试者发生高原肺水肿的风险性。

GA基因型受试者或AA基因型受试者为高原肺水肿易感个体。

本发明还保护SNP rs12733147作为检测靶标在开发产品中的应用；所述产品的功能为如下（a）或（b）：

（a）筛查高原肺水肿易感个体；

（b）评价受试者发生高原肺水肿的风险性。

SNP rs12733147位于人基因组DNA中，位置对应于序列表的序列6中第301位核苷酸，用R表示。

以上任一所述产品可为试剂盒。

以上任一所述受试者可为中国人。

以上任一所述受试者可为中国汉族人。

以上任一所述受试者可为中国汉族男性。

以上任一所述受试者可为平原地区的中国人。

以上任一所述受试者可为平原地区的中国汉族人。

以上任一所述受试者可为平原地区的中国汉族男性。

以上任一所述受试者可为由平原地区到达高原地区的中国人。

以上任一所述受试者可为由平原地区到达高原地区的中国汉族人。

以上任一所述受试者可为由平原地区到达高原地区的中国汉族男性。

以上任一所述受试者可为由平原地区预计去高原地区的中国人。

以上任一所述受试者可为由平原地区预计去高原地区的中国汉族人。

以上任一所述受试者可为由平原地区预计去高原地区的中国汉族男性。

以上任一所述高原地区可为青藏高原地区。

以上任一所述高原地区可为青藏高原的拉萨地区。

以上任一所述用于检测受试者基于SNP rs12733147的基因型的物质可为基于如下任一技术检测受试者基于SNP rs12733147的基因型的物质：DNA测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱、SNP芯片等。SNP芯片可包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白DNA结合反应的芯片，基于荧光分子DNA结合反应的芯片等。

以上任一所述用于检测受试者基于SNP rs12733147的基因型的物质包括引物组。所述引物组由三条引物组成，其中一条为单碱基延伸引物，另外两条用于扩增包括SNPrs12733147的DNA片段。两条扩增引物在序列上没有特殊要求，只要能扩增出包括SNPrs12733147在内的基因组DNA片段即可。所述单碱基延伸引物可根据人基因组中SNPrs12733147的上游或下游（不包括该SNP位点）设计，所述单碱基延伸引物延伸的核苷酸对应于人基因组中SNP rs12733147，即所述单碱基延伸引物的3’末端核苷酸对应于人基因组中SNP rs12733147的相邻位核苷酸（即SNP rs12733147的前一位核苷酸或rs12733147的后一位核苷酸）。

以上任一所述用于检测受试者基于SNP rs12733147的基因型的物质还可包括PCR试剂、DNA测序试剂和DNA测序仪等。

以上任一所述用于检测受试者基于SNP rs12733147的基因型的物质包括引物对。所述引物对由两条引物组成，用于扩增包括SNP rs12733147的DNA片段。两条引物在序列上没有特殊要求，只要能扩增出包括SNP rs12733147在内的基因组DNA片段即可。

本发明发现，SNP rs12733147可用于筛查高原肺水肿易感个体、预测人对高原肺水肿的易感性、筛查携带人高原肺水肿易感基因的个体和评价高原肺水肿患病风险。在实际应用中，为了提高准确率，也可将检测SNP rs12733147基因型的物质与其他物质（如检测其他与高原肺水肿相关的单核苷酸多态性或基因型的物质）联合在一起制备产品。

本发明发现，基于SNP rs12733147的基因型在高原肺水肿患者群体以及正常人群体中的分布频率存在显著差异，高原肺水肿患者群体中GG基因型的基因型频率显著低于正常人群体中GG基因型的基因型频率。在实施例3和实施例4中，本发明分别以不同人群样本为例，示例性的展示了高原肺水肿患者群体以及正常人群体中的基因型分布频率数据。本发明可用于避免或减少高原肺水肿的发生，对于高原地区具有重大的应用推广价值。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。p-value：Person

test。OR：比值比。

伦理声明：每个受试者均签署知情同意书，本研究得到解放军第七医学中心和西藏解放军总医院医学伦理委员会的批准。高原肺水肿患者均为医院确诊的患者，诊断标准参见文献：我国高原病命名、分型及诊断标准；高原医学杂志2010年第20卷1期；9-11。

实施例1、筛选与高原肺水肿患病风险具有相关性的SNP

配对群体由高原肺水肿患者群体以及相应的正常人群体组成。

建立多组配对群体，进行大量全基因组测序以及序列比对分析的工作，获取到大量差异SNP。依次验证各个差异SNP在高原肺水肿患者群体以及相应的正常群体中的等位基因频率以及基因型频率以进行关联分析。

SNP rs12733147，即NCBI中编号为rs12733147的SNP，位于SNX27基因的一个内含子中，具体位置为人1号染色体的第151624618位(GRCh38.p13)，多态形式为G/A。人基因组DNA中，SNP rs12733147及其周边核苷酸如序列表的序列6所示（SNP rs12733147即序列表的序列6中第301位核苷酸，用R表示）。

现有技术中尚未发现SNP rs12733147的任何临床诊断用途。

发明人通过前述大量工作发现，SNP rs12733147与高原肺水肿患病风险具有相关性，GG基因型受试者具有更低的高原肺水肿患病风险。

实施例2、建立检测受试者基于SNP rs12733147的基因型的方法

1、取受试者的外周血，提取基因组DNA。

2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，采用特异引物对进行PCR扩增。

特异引物对由引物F1和引物R1组成。

引物F1（序列表的序列1）：5’-ACGTTGGATGCGAGACCAACCTGATCAATA-3’；

引物R1（序列表的序列2）：5’-ACGTTGGATGACTATAGGCACCTGCCAGC-3’。

PCR扩增在384孔板中进行，每个孔一个反应体系。

PCR扩增的反应体系的组成（5μL）：0.5μL 10×PCR缓冲液、0.4μL 25mM MgCl₂溶液、0.1μL 25mM dNTP mix、基因组DNA、HotStart Taq DNA聚合酶、引物F1、引物R1，用超纯水补足体积。5μL体系中，基因组DNA的含量为20-50ng，HotStar Taq酶的含量为0.5U，引物F1的含量为0.5pmol，引物R1的含量为0.5pmol。

PCR扩增的反应程序：94℃ 4分钟；94℃ 20秒、56℃ 30秒、72℃ 1分钟，45个循环；72℃ 3分钟；4℃保持。

3、进行碱性磷酸酶处理（目的是去除体系中游离的dNTPs）。

取完成步骤2的384孔板，制备反应体系然后进行反应。

反应体系的组成（7μL）：5μL步骤2得到的产物溶液、0.3μL SAP、0.17μL 10×SAP缓冲液、1.53μL超纯水。

SAP（shrimp alkaline phosphatase，虾碱性磷酸酶）：产品规格为1.7U/μL；Agena公司，货号为10002.1。10×SAP缓冲液为SAP的配套缓冲液。

反应条件：37℃ 40分钟；85℃ 5分钟；4℃维持。

4、进行单碱基延伸。

取完成步骤3的384孔板，制备反应体系然后进行单碱基延伸反应。

单碱基延伸的反应体系的组成（10μL）：7μL步骤3得到的产物溶液、0.3μL单碱基延伸反应酶、0.17μL 10×单碱基延伸反应缓冲液、1μL单碱基延伸引物、1.53μL超纯水。

单碱基延伸反应酶：产品规格为1.7U/μL；Agena公司，货号为1432。10×单碱基延伸反应缓冲液为单碱基延伸反应酶的配套缓冲液。

单碱基延伸引物（序列表的序列3）：5’-ATGGTGAAACCCCAT-3’。

单碱基延伸的反应程序如下：

①94℃ 30秒；

②94℃ 5秒；

③52℃ 5秒、80℃ 5秒，5个循环；

④94℃ 5秒、52℃ 5秒、80℃ 5秒，40个循环；

⑤72℃ 3分钟；

⑥4℃保持。

5、进行树脂纯化。

取完成步骤4的384孔板，每孔加入16μL水，然后每孔加入Clean Resin树脂（美国Sequenom 公司），封膜，低速垂直旋转30分钟以使树脂与反应物充分接触，然后离心使树脂沉入孔底部，上清液即为树脂纯化后的延伸产物。

6、芯片点样。

启动MassARRAYNanodispenser RS1000点样仪（SEQUENOM公司），将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP (Sequenom)芯片（SEQUENOM公司）上。

7、质谱检测。

将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF分析，检测结果使用TYPER 4.0软件（sequenom）分型并输出结果。

实施例3、SNP rs12733147与高原肺水肿易感性的分析

外周血样本获取自西藏解放军总医院，收集于2018年9月至2019年9月。91份外周血样本获自91例高原肺水肿患者，76份外周血样本获自76例正常人（非高原肺水肿患者）。91例高原肺水肿患者和76例正常人均为血缘上无关的中国男性汉族人，均长期生活于平原地区（长期指的是1年以上）且在到达拉萨（海拔3658m）后取外周血。所有人均没有吸烟史和饮酒史，且都没有与自身免疫相关的疾病（例如白癜风、银屑病、I型糖尿病等），且之前都没有高原旅行史。91例高原肺水肿患者的年龄范围为10-60岁。76例正常人的年龄范围为18-31岁。

按照实施例2的方法进行操作。检测受试者基于SNP rs12733147的基因型。

91例高原肺水肿患者中，基因型为GG的个体为55例（基因型频率为60.4%），基因型GA的个体为29例（基因型频率为31.9%），基因型为AA的个体为7例（基因型频率为7.7%）。76例正常人中，基因型为GG的个体为64例（基因型频率为84.2%），基因型为GA的个体为12例（基因型频率为15.8%），无基因型为AA的个体。

试验数据采用 R 4.0.5统计软件进行处理统计。通过Logistic回归分析校正后，SNP rs12733147与人群的显著性P值为0.0005，OR为3.38。结果说明，SNP rs12733147是与高原肺水肿相关的单核苷酸多态性，基因型为GG的受试者发生HAPE的风险显著低于基因型为GA的受试者和基因型为AA的受试者。

实施例4、SNP rs12733147与高原肺水肿易感性的分析

外周血样本获取自西藏解放军总医院，收集于2018年9月至2019年9月。71份外周血样本获自71例高原肺水肿患者，66份外周血样本获自66例正常人（非高原肺水肿患者）。71例高原肺水肿患者和66例正常人均为血缘上无关的中国男性汉族人，均长期生活于平原地区（长期指的是1年以上）且在到达拉萨（海拔3658m）后取外周血。所有人均没有吸烟史和饮酒史，且都没有与自身免疫相关的疾病（例如白癜风、银屑病、I型糖尿病等），且之前都没有高原旅行史。71例高原肺水肿患者的年龄范围为15-55岁。66例正常人的年龄范围为19-30岁。

1、取受试者的外周血，提取基因组DNA。

特异引物对由引物F2和引物R2组成。

引物F2（序列表的序列4）：5’-TTACATTGGCTTTTCAGG-3’；

引物R2（序列表的序列5）：5’-GCCGAGGTAGGTGTATCA-3’。

3、完成步骤2后，回收PCR扩增产物并测序，根据测序结果获得受试者基于SNPrs12733147的基因型。

71例高原肺水肿患者中，基因型为GG的个体为46例（基因型频率为64.8%），基因型为GA的个体为25例（基因型频率为35.2%）。66例正常人中，基因型为GG的个体为56例（基因型频率为84.8%），基因型为GA的个体为9例（基因型频率为13.6%），基因型为AA的个体1例（基因型频率为1.5%）。

试验数据采用 R 4.0.5统计软件进行处理统计。通过Logistic回归分析校正后，SNP rs12733147与人群的显著性P值<0.05, OR为2.56。与实施例3的结果一致，基因型为GG的受试者发生HAPE的风险显著低于基因型为GA的受试者和基因型为AA的受试者。

本实施例的结果进一步说明，SNP rs12733147是与高原肺水肿相关的风险位点，可用于筛查高原肺水肿易感个体、预测人对高原肺水肿的易感性、筛查携带人高原肺水肿易感基因的个体和评价高原肺水肿患病风险。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国人民解放军总医院

<120> 一种用于筛查高原肺水肿易感人群的试剂盒及其应用

<130> GNCYX220126

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acgttggatg cgagaccaac ctgatcaata 30

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acgttggatg actataggca cctgccagc 29

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggtgaaac cccat 15

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttacattggc ttttcagg 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gccgaggtag gtgtatca 18

<210> 6

<211> 601

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 6

ttgtttttat tcttggtgac aagtggttac attggctttt caggtaatga tcagataata 60

aatgagcttt ttttttctga atagcttgat tttatatata tatatatata tatatgtatt 120

tttttttttt ttgcgatgga gtcttgctct gtcgcccagg ctggagtgca gtggcgtgat 180

cttggctcat tgcaacctcc atcttctggg ttcaagcaat tctctggtct cagcctccca 240

agtagcaggg actataggca cctgccagca cgcccggcta atttctgtat ttttaataga 300

ratggggttt caccatattg atcaggttgg tctcgaactc ctgacctcag gtgatacacc 360

tacctcggcc tcccaaaaag ctgggattac agacatgagc caccacgccc ggccagcttg 420

attatatttt tatatttatt ttttaaatat cttaaatcct tagccttatt atactttttt 480

ctctgaatga caagtatgat tcatttattt ggaaataaat ctacctgatt atatttgtat 540

actgattgcc ttggagttag aaggtttgag gaatctgtaa ttctttcttc cccagtaata 600

a 601

Claims

1.一种产品，包括用于检测受试者基于SNP rs12733147的基因型的物质；所述产品的功能为如下（a）或（b）：

（a）筛查高原肺水肿易感个体；

（b）评价受试者发生高原肺水肿的风险性。

2.如权利要求1所述的产品，其特征在于：所述用于检测受试者基于SNP rs12733147的基因型的物质为引物组，由三条引物组成，分别为序列表的序列1所示的单链DNA分子、序列表的序列2所示的单链DNA分子、序列表的序列3所示的单链DNA分子。

3.如权利要求1所述的产品，其特征在于：所述用于检测受试者基于SNP rs12733147的基因型的物质为引物对，由两条引物组成，分别为序列表的序列4所示的单链DNA分子、序列表的序列5所示的单链DNA分子。

4.用于检测受试者基于SNP rs12733147的基因型的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下（a）或（b）：

（a）筛查高原肺水肿易感个体；

（b）评价受试者发生高原肺水肿的风险性。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述用于检测受试者基于SNP rs12733147的基因型的物质为引物组，由三条引物组成，分别为序列表的序列1所示的单链DNA分子、序列表的序列2所示的单链DNA分子、序列表的序列3所示的单链DNA分子。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述用于检测受试者基于SNP rs12733147的基因型的物质为引物对，由两条引物组成，分别为序列表的序列4所示的单链DNA分子、序列表的序列5所示的单链DNA分子。

7.SNP rs12733147作为检测靶标在开发产品中的应用；所述产品的功能为如下（a）或（b）：

（a）筛查高原肺水肿易感个体；

（b）评价受试者发生高原肺水肿的风险性。