CN108546763A - Epas1基因标签单核苷酸在筛选适应高原环境人群中的应用及筛选方法 - Google Patents

Epas1基因标签单核苷酸在筛选适应高原环境人群中的应用及筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了EPAS1基因标签单核苷酸在筛选适应高原环境人群中的应用，属于基因工程技术领域，所述标签的位点包括rs13419896、rs1868092、rs1868093和rs1868094；所述rs13419896处的核苷酸为A；所述rs1868092处的核苷酸为A；所述rs1868093处的核苷酸为A；所述rs1868094处的核苷酸为T，携带具有上述标签位点的核苷酸的携带者进入高原后既可以更好地适应低氧环境，也可以降低血液粘滞度。

Description

EPAS1基因标签单核苷酸在筛选适应高原环境人群中的应用 及筛选方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及EPAS1基因标签单核苷酸在筛选适应高原环境人群中的应用及筛选方法。
背景技术
我国是一个多山的高原国家，3000米以上高原地区占我国陆地面积1/4,是西部大开发的主要方向和主战场。其中，青藏高原是最主要的地区，具有丰富的资源(矿产、石油、水利、旅游等)，亟待开发。同时，青藏高原还是我国重要的国防和军事保障区域。
然而，对于初进高原的人群，高原低氧可引起高原反应，常见的症状有头痛、失眠、食欲减退、疲倦及呼吸困难等。一般来讲，平原人初次进入海拔3000m以上高原时，50～75％的人出现高原反应，6～24小时发病，3～10天习服后症状逐渐减轻至消失，少数可发展为高原脑水肿或高原肺水肿。因此，高原低氧对人体的危害大大影响了高原的建设、发展和稳定，故预防和减少急性高原反应，保持人体健康尤其重要，但是目前还没有方法能够对可能出现高原反应人群进行预测。
发明内容
本发明的目的在于提供EPAS1基因标签单核苷酸在筛选适应高原环境人群中的应用，标签的位点包括rs13419896、rs1868092、rs1868093和rs1868094；rs13419896处的核苷酸为A；rs1868092处的核苷酸为A；rs1868093处的核苷酸为A；rs1868094处的核苷酸为T。携带具有上述标签位点的核苷酸的携带者进入高原后既可以更好地适应低氧环境，也可以降低血液粘滞度。
本发明提供了EPAS1基因标签单核苷酸在筛选适应高原环境人群中的应用，所述标签的位点包括rs13419896、rs1868092、rs1868093和rs1868094；所述rs13419896处的核苷酸为A；所述rs1868092处的核苷酸为A；所述rs1868093处的核苷酸为A；所述rs1868094处的核苷酸为T。
本发明还提供了一种适应高原环境人群的筛选方法，包括以下步骤：
1)提取待测样本基因组DNA，将所述待测样本基因组DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；
所述PCR扩增使用的引物包括rs13419896引物对、rs1868092引物对、rs1868093引物对或rs1868094引物对；
所述rs13419896引物对的上游引物的序列如SEQ ID No.1所示，所述rs13419896引物对的下游引物的序列如SEQ ID No.2所示；
所述rs1868092引物对的上游引物的序列如SEQ ID No.3所示，所述rs1868092引物对的下游引物的序列如SEQ ID No.4所示；
所述rs1868093引物对的上游引物的序列如SEQ ID No.5所示，所述rs1868093引物对的下游引物的序列如SEQ ID No.6所示；
所述rs1868094引物对的上游引物的序列如SEQ ID No.7所示，所述rs1868094引物对的下游引物的序列如SEQ ID No.8所示；
2)将所述步骤1)得到的扩增产物进行测序，根据所述测序确定的核苷酸序列确认rs13419896处、rs1868092处、rs1868093处和rs1868094处的核苷酸种类；
所述测序使用的引物包括rs13419896测序引物、rs1868092测序引物、rs1868093测序引物或rs1868094测序引物；
所述rs13419896测序引物的序列如SEQ ID No.9所示；
所述rs1868092测序引物的序列如SEQ ID No.10所示；
所述rs1868093测序引物的序列如SEQ ID No.11所示；
所述rs1868094测序引物的序列如SEQ ID No.12所示；
3)当所述rs13419896处的核苷酸为A、rs1868092处的核苷酸为A、rs1868093处的核苷酸为A且rs1868094处的核苷酸为T，判断待测样本属于适应高原环境的人群。
优选的，所述步骤1)PCR扩增的体系每50μl包括：2×高保真PCR酶体系25μl，ddH2O19μl，浓度为10μM的上游引物0.5μl，浓度为10μM的下游引物0.5μl，样本基因组DNA5μl。
优选的，所述步骤1)PCR扩增的条件包括：94℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环后72℃延伸10min。
本发明还提供了一种试剂盒，包括上述技术方案所述的SEQ ID No.1～12所示序列的引物和2×高保真PCR酶体系。
优选的，所述rs13419896引物对的上游引物的浓度为10μM的，所述rs13419896引物对的下游引物的浓度为10μM；
所述rs1868092引物对的上游引物的浓度为10μM，所述rs1868092引物对的下游引物的浓度为10μM；
所述rs1868093引物对的上游引物的浓度为10μM，所述rs1868093引物对的下游引物的浓度为10μM；
所述rs1868094引物对的上游引物的浓度为10μM，所述rs1868094引物对的下游引物的浓度为10μM；
所述rs1868094测序引物的浓度为10μM；
所述rs13419896测序引物的浓度为10μM；
所述rs1868092测序引物的浓度为10μM；
所述rs1868093测序引物的浓度为10μM；
所述2×高保真PCR酶体系的体积为3～8ml。
优选的，所述rs13419896引物对的上游引物的体积为50～150μl，所述rs13419896引物对的下游引物的体积为50～150μl；
所述rs1868092引物对的上游引物的体积为50～150μl，所述rs1868092引物对的下游引物的体积为50～150μl；
所述rs1868093引物对的上游引物的体积为50～150μl，所述rs1868093引物对的下游引物的体积为50～150μl；
所述rs1868094引物对的上游引物的体积为50～150μl的，所述rs1868094引物对的下游引物的体积为50～150μl；
所述rs1868094测序引物的体积为50～150μl；
所述rs13419896测序引物的体积为50～150μl；
所述rs1868092测序引物的体积为50～150μl；
所述rs1868093测序引物的体积为50～150μl。
本发明提供了EPAS1基因标签单核苷酸在筛选适应高原环境人群中的应用，标签的位点包括rs13419896、rs1868092、rs1868093和rs1868094；rs13419896处的核苷酸为A；rs1868092处的核苷酸为A；rs1868093处的核苷酸为A；rs1868094处的核苷酸为T。携带具有上述标签位点的核苷酸的携带者进入高原后既可以更好地适应低氧环境，也可以降低血液粘滞度。
本发明实施例的结果显示：EPAS1基因标签单核苷酸的标签的位点包括rs13419896、rs1868092、rs1868093和rs1868094；rs13419896处的核苷酸为A；rs1868092处的核苷酸为A；rs1868093处的核苷酸为A；rs1868094处的核苷酸为T。携带具有上述标签位点的核苷酸的携带者进入高原后既可以更好地适应低氧环境，也可以降低血液粘滞度。
具体实施方式
本发明提供了EPAS1基因标签单核苷酸在筛选适应高原环境人群中的应用，标签的位点包括rs13419896、rs1868092、rs1868093和rs1868094；rs13419896处的核苷酸为A；rs1868092处的核苷酸为A；rs1868093处的核苷酸为A；rs1868094处的核苷酸为T。携带具有上述标签位点的核苷酸的携带者进入高原后既可以更好地适应低氧环境，也可以降低血液粘滞度。
本发明还提供了一种适应高原环境人群的筛选方法，包括以下步骤：
1)提取待测样本基因组DNA，将所述待测样本基因组DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；
所述PCR扩增使用的引物包括rs13419896引物对、rs1868092引物对、rs1868093引物对或rs1868094引物对；
所述rs13419896引物对的上游引物的序列如SEQ ID No.1所示，所述rs13419896引物对的下游引物的序列如SEQ ID No.2所示；
所述rs1868092引物对的上游引物的序列如SEQ ID No.3所示，所述rs1868092引物对的下游引物的序列如SEQ ID No.4所示；
所述rs1868093引物对的上游引物的序列如SEQ ID No.5所示，所述rs1868093引物对的下游引物的序列如SEQ ID No.6所示；
所述rs1868094引物对的上游引物的序列如SEQ ID No.7所示，所述rs1868094引物对的下游引物的序列如SEQ ID No.8所示；
2)将所述步骤1)得到的扩增产物进行测序，根据所述测序确定的核苷酸序列确认rs13419896处、rs1868092处、rs1868093处和rs1868094处的核苷酸种类；
所述测序使用的引物包括rs13419896测序引物、rs1868092测序引物、rs1868093测序引物或rs1868094测序引物；
所述rs13419896测序引物的序列如SEQ ID No.9所示；
所述rs1868092测序引物的序列如SEQ ID No.10所示；
所述rs1868093测序引物的序列如SEQ ID No.11所示；
所述rs1868094测序引物的序列如SEQ ID No.12所示；
3)当所述rs13419896处的核苷酸为A、rs1868092处的核苷酸为A、rs1868093处的核苷酸为A且rs1868094处的核苷酸为T，判断待测样本属于适应高原环境的人群。
本发明提取待测样本基因组DNA，将所述待测样本基因组DNA进行PCR扩增，得到扩增产物。本发明对所述待测样本的来源没有特殊限定，优选来自于待测人群的血液、唾液或头发。本发明对所述待测样本基因组DNA的提取没有特殊限定，采用本领域技术人员常规提取基因组DNA的方法即可，在本发明实施例中具体采用DNA提取试剂盒提取待测样本基因组DNA。
在本发明中，所述待测样本基因组DNA的纯度优选为A260/A280≥1.8。
在本发明中，所述PCR扩增使用的引物包括rs13419896引物对、rs1868092引物对、rs1868093引物对或rs1868094引物对。
在本发明中，所述rs13419896引物对根据SEQ ID No.13所示的序列设计得到，具体序列如下所示：
在本发明中，所述rs13419896引物对的上游引物的序列如SEQ ID No.1所示，具体序列如下所示：
TCATTCCCTGTTCCCTCCTCCTT；
所述rs13419896引物对的下游引物的序列如SEQ ID No.2所示，具体序列如下所示：
GCCAGCTTCCCTTGACCATCTT。
在本发明中，所述rs1868092引物对根据SEQ ID No.14所示的序列设计得到，具体序列如下所示：
在本发明中，所述rs1868092引物对的上游引物的序列如SEQ ID No.3所示，具体序列如下所示：
TGAGCTGATAAGACTGGTGA；
所述rs1868092引物对的下游引物的序列如SEQ ID No.4所示，具体序列如下所示：
AAGTACATGCTGCTGGAATG。
在本发明中，所述rs1868093引物对根据SEQ ID No.15所述的序列设计得到，具体序列如下所示：
在本发明中，所述rs1868093引物对的上游引物如SEQ ID No.5所示，具体序列如下所示：
GACTGTGTTAAATACTTGGT；
所述rs1868093引物对的下游引物如SEQ ID No.6所示，具体序列如下所示：
CTCTGCTCTTCCCAATCACA。
在本发明中，所述rs1868094引物对根据SEQ ID No.16所述的序列设计得到，具体序列如下所示：
在本发明中，所述rs1868094引物对的上游引物的序列如SEQ ID No.7所示，具体序列如下所示：
CTGGACATGAGCATGATATG；
所述rs1868094引物对的下游引物的序列如SEQ ID No.8所示，具体序列如下所示：
ATCAACAAGCTGTGACTTGC。
在本发明中，所述PCR扩增的体系每50μl包括：2×高保真PCR酶体系25μl，ddH2O19μl，浓度为10μM的上游引物0.5μl，浓度为10μM的下游引物0.5μl，样本基因组DNA 5μl。在本发明中，所述上游引物和下游引物使用的体积为0.5μl为rs13419896引物对的上游引物、rs13419896引物对的下游引物、rs1868092引物对的上游引物、rs1868092引物对的下游引物、rs1868093引物对的上游引物、rs1868093引物对的下游引物、rs1868094引物对的上游引物和rs1868094引物对的下游引物各自独立使用的体积。
本发明对所述2×高保真PCR酶体系的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售的产品即可，在本发明实施例中具体购买于产地在日本的TaKaRa销售的产品，产品的型号为R040A。
在本发明中，所述PCR扩增的条件包括：94℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环后72℃延伸10min。
所述PCR扩增后，本发明将得到的扩增产物进行测序，根据所述测序确定的核苷酸序列确认rs13419896处、rs1868092处、rs1868093处和rs1868094处的核苷酸种类。
在本发明中，所述测序使用的引物包括rs13419896测序引物、rs1868092测序引物、rs1868093测序引物或rs1868094测序引物。
在本发明中，所述rs13419896测序引物的序列如SEQ ID No.9所示，具体序列如下所示：
TCATTCCCTGTTCCCTCCTCCTT。
在本发明中，所述rs1868092测序引物的序列如SEQ ID No.10所示，具体序列如下所示：
TGAGCTGATAAGACTGGTGA。
在本发明中，所述rs1868093测序引物的序列如SEQ ID No.11所示，具体序列如下所示：
GACTGTGTTAAATACTTGGT。
在本发明中，所述rs1868094测序引物的序列如SEQ ID No.12所示，具体序列如下所示：
CTGGACATGAGCATGATATG。
在本发明中，当所述rs13419896处的核苷酸为A、rs1868092处的核苷酸为A、rs1868093处的核苷酸为A且rs1868094处的核苷酸为T，判断待测样本属于适应高原环境的人群。
本发明还提供了一种试剂盒，包括上述技术方案所述的SEQ ID No.1～12所示序列的引物和2×高保真PCR酶体系。
在本发明中，所述rs13419896引物对的上游引物的浓度优选为10μM，所述rs13419896引物对的上游引物的体积优选为50～150μl，更优选为80～120μl，最优选为100μl；所述rs13419896引物对的下游引物的浓度优选为10μM，所述rs13419896引物对的下游引物的体积优选为50～150μl，更优选为80～120μl，最优选为100μl。
在本发明中，所述rs1868092引物对的上游引物的浓度优选为10μM，所述rs1868092引物对的上游引物的体积优选为50～150μl，更优选为80～120μl，最优选为100μl；所述rs1868092引物对的下游引物的浓度优选为10μM，所述rs1868092引物对的下游引物的体积优选为50～150μl，更优选为80～120μl，最优选为100μl。
在本发明中，所述rs1868093引物对的上游引物的浓度优选为10μM，所述rs1868093引物对的上游引物的体积优选为50～150μl，更优选为80～120μl，最优选为100μl；所述rs1868093引物对的下游引物的浓度优选为10μM，所述rs1868093引物对的下游引物的体积优选为50～150μl，更优选为80～120μl，最优选为100μl。
在本发明中，所述rs1868094引物对的上游引物的浓度优选为10μM，所述rs1868094引物对的上游引物的体积优选为50～150μl，更优选为80～120μl，最优选为100μl；所述rs1868094引物对的下游引物的浓度优选为10μM，所述rs1868094引物对的下游引物的体积优选为50～150μl，更优选为80～120μl，最优选为100μl。
在本发明中，所述rs1868094测序引物的浓度优选为10μM，所述rs1868094测序引物的体积优选为50～150μl，更优选为80～120μl，最优选为100μl。
在本发明中，所述rs13419896测序引物的浓度优选为10μM，所述rs1868094测序引物的体积优选为50～150μl，更优选为80～120μl，最优选为100μl。
在本发明中，所述rs1868092测序引物的浓度优选为10μM，所述rs1868094测序引物的体积优选为50～150μl，更优选为80～120μl，最优选为100μl。
在本发明中，所述rs1868093测序引物的浓度优选为10μM，所述rs1868094测序引物的体积优选为50～150μl，更优选为80～120μl，最优选为100μl。
在本发明中，所述2×高保真PCR酶体系的体积优选为3～8ml，更优选为4～7ml，最优选为5ml。
下面结合具体实施例对本发明所述的EPAS1基因标签单核苷酸在筛选适应高原环境人群中的应用及筛选方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
1、研究对象
选择世居藏族人群50名为高原低氧适应组，男女各25名，年龄18～55岁，平均年龄33.9±8.3岁；同时随机挑选平原汉族人群166名为对照组，男82名，女84名，年龄13～45岁，平均年龄33.6±9.2岁。另选择平原汉族50名健康男性进入高原，年龄19～23岁，平均年龄20.9±1.0岁，并检测其高原前后血液学指标，其中20名作为观察组，筛选标准：进入高原前后HGB浓度差值≥35g/L、RBC计数差值≥1×1012/L和Hct差值≥0.1，剩余30名作为对照组。
2、血液样本收集
在知情同意的原则下，取EDTA抗凝外周血200uL，根据基因组DNA提取试剂盒步骤提取基因组DNA(天根生化科技(北京)有限公司)。
3、基因多态性分析
1)基因组DNA分离：利用DNA提取试剂盒从白细胞中分离基因组DNA，其纯度为A260/A280≥1.8。
2)候选基因选择及多态性分析：
候选基因的选择：已有研究发现与缺氧有关的EPAS1在调控缺氧耐受中起着重要作用，因此将EPAS1作为候选基因。
多态性位点的选择：根据EPAS1基因多态性对高原反应的可能影响，选择如下位点进行多态性分析：rs13419896(G/A),rs1868092(G/A),rs1868093(G/A)和rs1868094(C/T)。
多态性位点等位基因的鉴定：采用聚合酶链式反应(PCR)和常规PCR产物测序，确定样本的基因型。PCR反应体系见表1，PCR扩增引物序列见表2，PCR测序引物序列见表3。
表1PCR反应体系
2×高保真PCR酶体系 25.0μl
ddH2O 19.0μl
上游引物(10μM) 0.5μl
下游引物(10μM) 0.5μl
模板DNA 5.0μl
PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环后72℃延伸10min。
表2PCR扩增引物列表
表3PCR测序引物列表
4、EPAS1基因多态性位点A/B等位基因在病例-对照组的频率分析：
等位基因频率由基因型频率计数直接计算。例如：AA纯和基因型10例，AB杂合基因型33例，BB纯合基因型15例。A等位基因的频率为[(10*2+33/(10*2+33*2+15*2]*100％＝45.68％，B等位基因频率为54.32％。
藏、汉族中EPAS1基因4个多态位点基因型和等位基因频率存在显著差异结果见表4。藏、汉族中rs13419896位点GG、GA、AA基因型频率分别为2.0％和43.4％、20.0％和47.0％、78.0％和9.6％(P<0.05)，G、A等位基因频率分别为12.0％和66.9％、88.0％和33.1％(P<0.001)；rs1868092和rs1868093位点GG、GA、AA基因型频率分别为2.0％和79.4％、36.0％和20.0％、62.0％和0.6％(P<0.001)，G、A等位基因频率分别为20.0％和89.4％、80.0％和10.6％(P<0.001)；rs1868094位点CC、CT、TT基因型频率分别为2.0％和79.4％、36.0％和20.0％、62.0％和0.6％(P<0.001)，C、T等位基因频率分别为20.0％和89.4％、80.0％和10.6％(P<0.001)。
表4EPAS1基因的4个多态性位点统计分析结果
5、病例-对照组间单体型分析：
应用SPSS软件20.0版本计算组间各等位基因频率分布；Haploview软件按照SNPs在染色体上的物理位置计算EPAS1基因非编码区的4个SNPs位点的连锁不平衡(linkagedisequilibrium,LD)。SHEsis在线软件分析基因型分布频数和等位基因频率，并进行Hardy-Weinberg平衡检验及单体型构建。EPAS1基因rs13419896(A)-rs1868092(A)-rs1868093(A)-rs1868094(T)单体型与高原反应抗性相关结果见表5，即观察组中“A-A-A-T”单体型频率显著低于对照组(P<0.05,OR值为0.032)，提示“A-A-A-T”单体型是高原反应抗性的保护因素，可促进平原汉族人群产生高原习服。
表5EPAS1基因的4个多态性位点单体型构建统计分析结果
本筛选方法应用的案例如前所述，观察组是进入高原前后HGB浓度差值≥35g/L、RBC计数差值≥1×1012/L和Hct差值≥0.1，单体型分析结果显示rs13419896(A)、rs1868092(A)、rs1868093(A)和rs1868094(T)“A-A-A-T”单体型频率与世居高原藏族所携带突变类似，且显著低于对照组(P＝0.034)，OR值为0.032<1，提示该单体型为所选观察组的保护因素，即rs13419896(A)、rs1868092(A)、rs1868093(A)和rs1868094(T)携带者进入高原后既可以降低HGB浓度、RBC数目和红细胞压积(Hct)以减小血液粘滞度，加快血流速度，保证更多的氧气供应，更好地适应低氧环境，利于高原习服训练。
为了更好地验证此结论，另在10例急进高原的人员中发现，携带rs13419896(A)、rs1868092(A)、rs1868093(A)和rs1868094(T)单体型者的高原反应例数相比未携带者降低(34.4％vs 25.8％、14.1％vs 6.9％)，见表6。
表6急进高原人员高原反应与基因单核苷酸多态性的关系
由以上实施例可以得出，rs13419896(A)、rs1868092(A)、rs1868093(A)和rs1868094(T)位点等位基因是藏族人群低氧适应的有利因素。A-A-A-T单体型携带者进入高原后既可以更好地适应低氧环境，也可以降低血液粘滞度，利于高原习服训练。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国人民解放军空军总医院
<120> EPAS1基因标签单核苷酸在筛选适应高原环境人群中的应用及筛选方法
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcattccctg ttccctcctc ctt 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gccagcttcc cttgaccatc tt 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgagctgata agactggtga 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aagtacatgc tgctggaatg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gactgtgtta aatacttggt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctctgctctt cccaatcaca 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctggacatga gcatgatatg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atcaacaagc tgtgacttgc 20
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcattccctg ttccctcctc ctt 23
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgagctgata agactggtga 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gactgtgtta aatacttggt 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctggacatga gcatgatatg 20
<210> 13
<211> 524
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tcattccctg ttccctcctc ctttttgttc ataaaaaaaa ttattttttt ccaaataagc 60
aaaatggagt caaactttgc atcctcaaaa tgtatgaagt aaacattatt cctaatgagc 120
ctctgggaaa gtgctcacct ttgaacttgg ccaaggatta tgcagcaaag aaaaagtctt 180
aagaacttga tagagtgtta gagcttcctg ggtttttaaa gtcaagttgc atattacatt 240
tcttttcctt aataggggca tttccagaaa cccttcctgg ttgagtaggc cagtgtctga 300
aagtgaagcg ctaggattgg ttactgactc tggttcaggg attgtcatct gggtgcgagg 360
caaccacagg gtaggaggca ccattgctag aatgctcttt ctttcctagg actcagcacc 420
tatgccgaca gtccttgcaa gacaggaggg gaacgtgtag gctatcctat ttatggtaag 480
gggaggccta tggaaaaaca ggaagatggt caagggaagc tggc 524
<210> 14
<211> 569
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tgagctgata agactggtga aggaaagact gtgttaaata cttggtagtt gcctaagtct 60
gaaaattcat attgtatctt ccatatttct gcaagtattt ttctatctat ctatctatgt 120
gcctcggggc cattttttgt atcctatggg gaacccaagg aaagaagtca tggtctctgc 180
tttcagaaaa ttacatgaag tcgtttgaga gccacactgt tctgtatatt cacatagtgc 240
actttgggat ggaggtcccg aagggaaagg ggcagcctgg gcattaggac ttcaatttgg 300
aggcggctgg gctggagtag ggtcttccca ggtagactgt gattgggaag agcagagatc 360
ccctcggcca gagacagagc acagtgaaag cccagaactg gacatgagca tgatatgttc 420
cccaattcaa atttcacttt tccagatcat gacctgcttg tgagcagacc tttgtctcca 480
tggagagatg ggggcaaggg gagagaccgt gcagcagcct gcgctctcac tgtctaccct 540
agaaccagcc attccagcag catgtactt 569
<210> 15
<211> 331
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gactgtgtta aatacttggt agttgcctaa gtctgaaaat tcatattgta tcttccatat 60
ttctgcaagt atttttctat ctatctatct atgtgcctcg gggccatttt ttgtatccta 120
tggggaaccc aaggaaagaa gtcatggtct ctgctttcag aaaattacat gaagtcgttt 180
gagagccaca ctgttctgta tattcacata gtgcactttg ggatggaggt cccgaaggga 240
aaggggcagc ctgggcatta ggacttcaat ttggaggcgg ctgggctgga gtagggtctt 300
cccaggtaga ctgtgattgg gaagagcaga g 331
<210> 16
<211> 320
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ctggacatga gcatgatatg ttccccaatt caaatttcac ttttccagat catgacctgc 60
ttgtgagcag acctttgtct ccatggagag atgggggcaa ggggagagac cgtgcagcag 120
cctgcgctct cactgtctac cctagaacca gccattccag cagcatgtac tttgcctaag 180
catttggtcc atatagtatg gtctcacatg tttgttagct tgttagctca ctggatccta 240
ggtctaagca atgccatggg cacccattct acagctgaaa ctgaggatct tatgacttaa 300
gcaagtcaca gcttgttgat 320

Claims (7)

1.EPAS1基因标签单核苷酸在筛选适应高原环境人群中的应用，所述标签的位点包括rs13419896、rs1868092、rs1868093和rs1868094；
所述rs13419896处的核苷酸为A；所述rs1868092处的核苷酸为A；所述rs1868093处的核苷酸为A；所述rs1868094处的核苷酸为T。
2.一种适应高原环境人群的筛选方法，包括以下步骤：
1)提取待测样本基因组DNA，将所述待测样本基因组DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；
所述PCR扩增使用的引物包括rs13419896引物对、rs1868092引物对、rs1868093引物对或rs1868094引物对；
所述rs13419896引物对的上游引物的序列如SEQ ID No.1所示，所述rs13419896引物对的下游引物的序列如SEQ ID No.2所示；
所述rs1868092引物对的上游引物的序列如SEQ ID No.3所示，所述rs1868092引物对的下游引物的序列如SEQ ID No.4所示；
所述rs1868093引物对的上游引物的序列如SEQ ID No.5所示，所述rs1868093引物对的下游引物的序列如SEQ ID No.6所示；
所述rs1868094引物对的上游引物的序列如SEQ ID No.7所示，所述rs1868094引物对的下游引物的序列如SEQ ID No.8所示；
2)将所述步骤1)得到的扩增产物进行测序，根据所述测序确定的核苷酸序列确认rs13419896处、rs1868092处、rs1868093处和rs1868094处的核苷酸种类；
所述测序使用的引物包括rs13419896测序引物、rs1868092测序引物、rs1868093测序引物或rs1868094测序引物；
所述rs13419896测序引物的序列如SEQ ID No.9所示；
所述rs1868092测序引物的序列如SEQ ID No.10所示；
所述rs1868093测序引物的序列如SEQ ID No.11所示；
所述rs1868094测序引物的序列如SEQ ID No.12所示；
3)当所述rs13419896处的核苷酸为A、rs1868092处的核苷酸为A、rs1868093处的核苷酸为A且rs1868094处的核苷酸为T，判断待测样本属于适应高原环境的人群。
3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤1)PCR扩增的体系每50μl包括：2×高保真PCR酶体系25μl，ddH2O 19μl，浓度为10μM的上游引物0.5μl，浓度为10μM的下游引物0.5μl，样本基因组DNA5μl。
4.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤1)PCR扩增的条件包括：94℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环后72℃延伸10min。
5.一种试剂盒，包括权利要求2所述的SEQ ID No.1～12所示序列的引物和2×高保真PCR酶体系。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述rs13419896引物对的上游引物的浓度为10μM的，所述rs13419896引物对的下游引物的浓度为10μM；
所述rs1868092引物对的上游引物的浓度为10μM，所述rs1868092引物对的下游引物的浓度为10μM；
所述rs1868093引物对的上游引物的浓度为10μM，所述rs1868093引物对的下游引物的浓度为10μM；
所述rs1868094引物对的上游引物的浓度为10μM，所述rs1868094引物对的下游引物的浓度为10μM；
所述rs1868094测序引物的浓度为10μM；
所述rs13419896测序引物的浓度为10μM；
所述rs1868092测序引物的浓度为10μM；
所述rs1868093测序引物的浓度为10μM；
所述2×高保真PCR酶体系的体积为3～8ml。
7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述rs13419896引物对的上游引物的体积为50～150μl，所述rs13419896引物对的下游引物的体积为50～150μl；
所述rs1868092引物对的上游引物的体积为50～150μl，所述rs1868092引物对的下游引物的体积为50～150μl；
所述rs1868093引物对的上游引物的体积为50～150μl，所述rs1868093引物对的下游引物的体积为50～150μl；
所述rs1868094引物对的上游引物的体积为50～150μl的，所述rs1868094引物对的下游引物的体积为50～150μl；
所述rs1868094测序引物的体积为50～150μl；
所述rs13419896测序引物的体积为50～150μl；
所述rs1868092测序引物的体积为50～150μl；
所述rs1868093测序引物的体积为50～150μl。
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