CN103911380A - Epas1基因突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分离的编码EPAS1突变体的核酸、确定生物样品是否具有高原适应性的方法、确定生物样品是否具有高原适应性的系统，以及用于确定生物样品是否具有高原适应性的试剂盒。其中，该分离的编码EPAS1突变体的核酸，与所述核酸与野生型EPAS1相比，在chr2，46441523位具有突变。通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否具有高原适应性。

Description

EPAS1基因突变体及其应用

技术领域

本发明涉及EPAS1基因突变体及其应用。具体地，本发明涉及分离的编码EPAS1突变体的核酸，确定生物样品是否具有高原适应性的方法，确定生物样品是否具有高原适应性的系统，以及用于确定生物样品是否具有高原适应性的试剂盒。

背景技术

对于非高原世居人群，通常在初入高原的数天至数周内，各系统产生一系列生理学改变，如呼吸加深加快，以增加肺通气；血流量增加，血红蛋白浓度增加，以加强血氧供应。这一系列反应涉及诸多生物学过程，包括从基因到蛋白质水平的调节过程，称之为高原习服(acclimation)。研究表明，人类对高山低氧的习服有明显的个体差异，如习服程度大小、习服产生的快慢、习服表现的特点等均因人而异。并且高山习服的快慢和程度等与其在平原时的体质、体能状况并不完全相关。当急进高原时低氧环境、高原习服较差的人会产生各种病理反应，可在数小时至数天内发生急性高原病。急性高原病，发病急、病情重、发展快，但目前仍没有能够有效治疗及预防该病的方法和药物。因此，针对高原适应性及急性高原病的研究，意义重大。

然而，目前对急性高原病的研究仍有待深入。

发明内容

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

非高原世居人群，通常在初入高原的数天至数周内易发急性高原病。而高原世居藏族人群，对高原低氧环境适应能力最佳，不或很少发生急性高原病。目前，从生理和生化角度对藏族人高原适应机制的研究已取得了许多重大的发现，但是在基因水平的适应机制还不清楚。并且，迄今为止国外对高原人群适应性遗传机制的研究主要集中在南美安第斯山脉居民，而且主要以少数基因为着眼点，尚不能从基因组学角度全面深入地揭示低氧适应的遗传机制，也并没有有效的治疗及预防急性高原病的药物和方法。

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效确定生物样品是否具有高原适应性的方法。

本发明是基于发明人的下列工作而完成的：发明人通过高通量外显子组测序联合候选基因突变验证的方法确定了与野生型EPAS1相比，在chr2，46441523位具有突变的个体具有高原适应性。

根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的编码EPAS1突变体的核酸。根据本发明的实施例，该核酸与野生型EPAS1相比，在chr2，46441523位具有突变。根据本发明的实施例，发明人确定了EPAS1基因的突变体，该突变体与个体的高原适应性密切相关，从而通过检测该基因突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否具有高原适应性，进而能够针对性地对具有高原适应性差异的各生物样品进行深入研究，从而能够为急性高原病的治疗及预防奠定基础。

根据本发明的第二方面，本发明提出了一种确定生物样品是否具有高原适应性的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：从所述生物样品提取核酸样本；确定所述核酸样本的核酸序列；所述核酸样本的核酸序列与野生型EPAS1相比，在chr2，46441523位具有突变是所述生物样品具有高原适应性的指示。通过根据本发明实施例的确定生物样品是否具有高原适应性的方法，可以有效地确定生物样品是否具有高原适应性，进而能够针对性地对具有高原适应性差异的各生物样品进行深入研究，从而能够为急性高原病的治疗及预防奠定基础。并且，能够在面对高原缺氧环境时，及时有效地对不具有高原适应性的生物样品进行急性高原病的预防。

根据本发明的第三方面，本发明提出了一种确定生物样品是否具有高原适应性的系统。根据本发明的实施例，该系统包括：核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本；核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列；判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核酸序列与野生型EPAS1相比，是否在chr2，46441523位具有突变，判断所述生物样品是否具有高原适应性。利用该系统，能够有效地实施前述确定生物样品是否具有高原适应性的方法，从而可以有效地确定生物样品是否具有高原适应性。进一步，能够针对性地对具有高原适应性差异的各生物样品进行深入研究，从而能够为急性高原病的治疗及预防奠定基础。

根据本发明的第四方面，本发明提出了一种用于确定生物样品是否具有高原适应性的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒含有：适于检测EPAS1基因突变体的试剂，其中与野生型EPAS1相比，所述EPAS1基因突变体在chr2，46441523位具有突变。利用根据本发明的实施例的试剂盒，能够有效地确定生物样品是否具有高原适应性，从而能够在面对高原缺氧环境时，及时有效地对不具有高原适应性的生物样品进行急性高原病的预防。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明实施例的确定生物样品是否具有高原适应性的系统及其组成部分的示意图，其中，

图1A为根据本发明实施例的确定生物样品是否具有高原适应性的系统的示意图；

图1B为根据本发明实施例的核酸序列确定装置的示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

EPAS1基因突变体

根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的编码EPAS1突变体的核酸。根据本发明的实施例，所述核酸与野生型EPAS1相比，在chr2，46441523位具有突变。在本文中所使用的表达方式“编码EPAS1突变体的核酸”，是指与编码EPAS1突变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受特别限制，可以是任何包含与EPAS1突变体的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根据本发明的一个具体示例，前面所述的编码EPAS1突变体的核酸为DNA。根据本发明的实施例，发明人确定了EPAS1基因的突变体，该基因突变体与个体的高原适应性密切相关，从而通过检测该基因突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否具有高原适应性，也可以通过检测该基因突变体在生物体中是否存在，可以有效地预测生物体是否具有高原适应性。

该编码EPAS1突变体的核酸，是本申请的发明人高通量外显子组测序联合候选基因突变验证的方法确定的使个体具有高原适应性的突变，在现有技术中并未被提到。

发明人发现的该EPAS1基因突变体与野生型EPAS1相比，在chr2，46441523位具有突变。

需要说明的是，上述野生型EPAS1基因的序列可以由人类基因组数据库hg18ucsc（可参见http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg18/chromosomes/，通过参照将其全文并入本文）获得，其位于chr246378555和chr246465303两个坐标之间，全长序列为86749n，在此不再赘述。另外，在本文中所使用的术语“chr2，46441523位”是指根据人类基因组数据库hg18ucsc中所列出的第二号染色体全长序列的第46441523位的碱基。发明人发现，当该位置的碱基由野生型的C突变为其他碱基时，尤其是突变为G，会使得生物体具有高原适应性的潜能。

已知，EPAS1基因也称作缺氧诱导因子2a（hypoxia-inducible factor2a，HIF-2a）。研究表明，在EPAS1基因上发生的蛋白质稳定突变和红细胞增多有关，且已证实EPAS1基因上的SNP突变与运动员的表现相关。这些说明EPAS1和红血球细胞的生产调控有关。因而，EPAS1基因可能参与个体的高原适应性的调控机制。

确定生物样品是否具有高原适应性的方法

根据本发明的第二方面，本发明提出了一种确定生物样品是否具有高原适应性的方法。根据本发明的实施例，该确定生物样品是否具有高原适应性的方法可以包括以下步骤：

首先，从生物样品提取核酸样本。根据本发明的实施例，生物样品的类型并不受特别限制，只要从该生物样品中能够提取到反映生物样品EPAS1是否存在突变的核酸样本即可。根据本发明的实施例，生物样品可以为选自人体血液、皮肤、皮下组织的至少一种。由此，可以方便地进行取样和检测，从而能够进一步提高确定生物样品是否具有高原适应性的效率。根据本发明的实施例，这里所使用的术语“核酸样本”应做广义理解，其可以是任何能够反映生物样品中EPAS1是否存在突变的样本，例如可以是从生物样品中直接提取的全基因组DNA，也可以是该全基因组中包含EPAS1编码序列的一部分。根据本发明的一个实施例，所述核酸样本为全基因组DNA。由此，可以扩大生物样品的来源范围，并且可以同时对生物样品的多种信息进行确定，从而能够提高确定生物样品是否具有高原适应性的效率。

接下来，在得到核酸样本之后，可以对核酸样本进行分析，从而能够确定所得到核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，确定所得到核酸样本的核酸序列的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的具体实施例，可以通过测序方法，确定核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，可以用于进行测序的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的实施例，可以采用第二代测序技术，也可以采用第三代以及第四代或者更先进的测序技术。根据本发明的具体示例，可以利用选自Hiseq2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种对核酸序列进行测序。由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因而能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而，能够提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。由此，根据本发明的实施例，确定核酸样本的核酸序列可以进一步包括：首先，针对所得到的核酸样本，构建核酸测序文库；以及对所得到的核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。根据本发明的一些实施例，可以采用选自Hiseq2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种对所得到的核酸测序文库进行测序。另外，根据本发明的实施例，可以对核酸样本进行筛选，富集EPAS1，该筛选富集可以在构建测序文库之前，构建测序文库过程中，或者构建测序文库之后进行。根据本发明的一个实施例，针对核酸样本，构建核酸测序文库进一步包括：利用EPAS1特异性引物，对核酸样本进行PCR扩增；以及针对所得到的扩增产物，构建核酸测序文库。由此，可以通过PCR扩增，富集EPAS1序列，从而能够进一步提高确定生物样品是否具有高原适应性的效率。根据本发明的实施例，EPAS1特异性引物的序列不受特别限制，根据本发明的优选实施例，这些EPAS1外显子特异性引物为如下表所示的至少一组引物：

序号	上游引物（5’-3’，SEQ ID NO：）	下游引物（5’-3’，SEQ ID NO：）
			1	CAGTGCCTGGCATGTAGTAG(1)	AATGCATCTGTTCTTTTCCC(2)

2	AGCTCCTCCTGAATTTGCTA(3)	GCAAGACCCCATCTCTAAAA(4)
			3	TATAGGCTTCTCCCAAGGTG(5)	GGCCTGTGATCATGTGTCTA(6)
4	CCTGCTGAAATCCATTCTGT(7)	ACTTTTAGGTCATTGCTCCG(8)
			5	ACCTGCTGCTTTTATGGAAC(9)	GACAAAAATTTCATGAGGGG(10)
6	CCTCTAGCCTGCCACATATT(11)	TTGAGGTATGCAACCAGCTA(12)
			7	AAGACAGGACTGAGCACACA(13)	AGCTGAGAGTGAAAACTGGG(14)
8	CATTTGGGGGTAGAAATGAG(15)	GTGTCAGGTCCACAGACAGA(16)
			9	TTAGAGCATGTTACAGGCCA(17)	CCTCTCATCTACTGGCACCT(18)
10	GAGTCCCAGGTGTAGGGTAA(19)	TCAGGAAGGTCTTGCTATCC(20)
			11	ATCATGTGTGAACCAATCCA(21)	CAAATACAGTACCGGGAACC(22)
12	CATGGGCTTCAGGACTAGAT(23)	CATCTGTTCTCCCCATCTTC(24)
			13	AAGGAAATGCAGAAGACTGG(25)	GGAGAAGGGGAAACTGAGAT(26)
14	AAACACACACACAACCTTCCT(27)	TTTGACACTGCGTTTCCTTA(28)
			15	GTTCATTAACCTCCCCACTG(29)	CCCAGTAGCAGCTTTCATTT(30)
16	AAGGGAGCTTTAGAAAAGGC(31)	AACATGGCCAAGGATACACT(32)
			17	AGTGTATCCTTGGCCATGTT(33)	TTCTGTACCAGACGCTATGC(34)
18	GGTTTGCATTAAGGACCATC(35)	AAATCACTGGGAAGACCAAA(36)
			19	CTCTGGCCTTAGTTTCCTCA(37)	TTTATCCATCTGCCTGTTGA(38)
20	CATCAACAGGCAGATGGATA(39)	GCAACCACTCTTCTGCTTTT(40)

发明人惊奇地发现，通过采用这些引物，可以在PCR反应体系中显著有效地完成对EPAS1外显子的扩增。需要说明的是，这些上表所示的核苷酸序列是本发明的发明人在付出了艰苦的劳动后，意外获得的。关于针对核酸样本，构建测序文库的方法和流程，本领域技术人员可以根据不同的测序技术进行适当选择，关于流程的细节，可以参见测序仪器的厂商例如Illumina公司所提供的规程，例如参见Illumina公司Multiplexing Sample PreparationGuide（Part#1005361;Feb2010）或Paired-End SamplePrep Guide（Part#1005063；Feb2010），通过参照将其并入本文。根据本发明的实施例，从生物样品提取核酸样本的方法和设备，也不受特别限制，可以采用商品化的核酸提取试剂盒进行。

需要说明的是，在这里所使用的术语“核酸序列”应作广义理解，其可以是在对核酸样本进行测序得到的测序数据进行组装后，得到的完整的核酸序列信息，也可以是直接采用通过对核酸样本进行测序所得到的测序数据（reads）作为核酸序列，只要这些核酸序列中含有对应EPAS1的编码序列即可。

最后，在确定核酸样本的核酸序列之后，将所得到的核酸样本的核酸序列与野生型基因组序列相比对。如果在所得到的核酸序列中在chr2，46441523位具有突变，则指示生物样品具有高原适应性。由此，通过根据本发明实施例的确定生物样品是否具有高原适应性的方法，可以有效地确定生物样品是否具有高原适应性。根据本发明的实施例，对核酸序列与野生型序列进行比对的方法和设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作，根据本发明的具体实例，可以采用SOAP软件进行比对。

发明人惊奇地发现，利用本发明的确定生物样品是否具有高原适应性的方法，可以有效地确定生物样品是否具有高原适应性，进而能够针对性地对具有高原适应性差异的各生物样品进行深入研究，从而能够为急性高原病的治疗及预防奠定基础。并且，能够在面对高原缺氧环境时，及时有效地对不具有高原适应性的生物样品进行急性高原病的预防。

需要说明的是，根据本发明实施例的“确定生物样品是否具有高原适应性的方法”的用途不受特别限制，例如可以用作非诊断目的的检测方法。

确定生物样品是否具有高原适应性的系统和试剂盒

根据本发明的第三方面，本发明提出了一种能够有效实施上述确定生物样品是否具有高原适应性的方法的系统。

参考图1，根据本发明的实施例，该确定生物样品是否具有高原适应性的系统1000包括核酸提取装置100、核酸序列确定装置200以及判断装置300。

根据本发明的实施例，核酸提取装置100用于从生物样品提取核酸样本。

根据本发明的实施例，核酸序列确定装置200与核酸提取装置100相连，用于对核酸样本进行分析，以便确定核酸样本的核酸序列。如前所示，可以采用测序的方法确定核酸样本的核酸序列。由此，根据本发明的一个实施例，所述核酸序列确定装置200可以进一步包括：文库构建单元201以及测序单元202。文库构建单元201用于针对核酸样本，构建核酸测序文库；测序单元202与文库构建单元201相连，用于对核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。如前所述，可以通过PCR扩增富集EPAS1外显子，进一步提高确定生物样品是否具有高原适应性的效率。由此，文库构建单元201可以进一步包括PCR扩增模块（图中未示出），在该PCR扩增模块中设置有EPAS1特异性引物，以便利用EPAS1特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增，根据本发明的具体实施例，EPAS1特异性引物为下表所示的至少一组引物。

序号	上游引物（5’-3’，SEQ ID NO：）	下游引物（5’-3’，SEQ ID NO：）
			1	CAGTGCCTGGCATGTAGTAG(1)	AATGCATCTGTTCTTTTCCC(2)
2	AGCTCCTCCTGAATTTGCTA(3)	GCAAGACCCCATCTCTAAAA(4)
			3	TATAGGCTTCTCCCAAGGTG(5)	GGCCTGTGATCATGTGTCTA(6)
4	CCTGCTGAAATCCATTCTGT(7)	ACTTTTAGGTCATTGCTCCG(8)
			5	ACCTGCTGCTTTTATGGAAC(9)	GACAAAAATTTCATGAGGGG(10)
6	CCTCTAGCCTGCCACATATT(11)	TTGAGGTATGCAACCAGCTA(12)
			7	AAGACAGGACTGAGCACACA(13)	AGCTGAGAGTGAAAACTGGG(14)
8	CATTTGGGGGTAGAAATGAG(15)	GTGTCAGGTCCACAGACAGA(16)

9	TTAGAGCATGTTACAGGCCA(17)	CCTCTCATCTACTGGCACCT(18)
			10	GAGTCCCAGGTGTAGGGTAA(19)	TCAGGAAGGTCTTGCTATCC(20)
11	ATCATGTGTGAACCAATCCA(21)	CAAATACAGTACCGGGAACC(22)
			12	CATGGGCTTCAGGACTAGAT(23)	CATCTGTTCTCCCCATCTTC(24)
13	AAGGAAATGCAGAAGACTGG(25)	GGAGAAGGGGAAACTGAGAT(26)
			14	AAACACACACACAACCTTCCT(27)	TTTGACACTGCGTTTCCTTA(28)
15	GTTCATTAACCTCCCCACTG(29)	CCCAGTAGCAGCTTTCATTT(30)
			16	AAGGGAGCTTTAGAAAAGGC(31)	AACATGGCCAAGGATACACT(32)
17	AGTGTATCCTTGGCCATGTT(33)	TTCTGTACCAGACGCTATGC(34)
			18	GGTTTGCATTAAGGACCATC(35)	AAATCACTGGGAAGACCAAA(36)
19	CTCTGGCCTTAGTTTCCTCA(37)	TTTATCCATCTGCCTGTTGA(38)
			20	CATCAACAGGCAGATGGATA(39)	GCAACCACTCTTCTGCTTTT(40)

根据本发明的实施例，测序单元202可以包括选自HISEQ2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种。由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因而能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而，提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。

根据本发明的实施例，判断装置300与核酸序列确定装置200相连，适于将核酸样本的核酸序列进行比对，以便基于核酸样本的核酸序列与野生型核酸序列的区别判断生物样品是否具有高原适应性。具体地，基于核酸样本的核酸序列与野生型核酸序列相比，是否在chr2，46441523位具有突变，判断生物样品是否具有高原适应性。如前所述，根据本发明的一个实施例，核酸样本的核酸序列与野生型核酸序列相比，是否在chr2，46441523位具有突变，是生物样品具有高原适应性的指示。如前所述，根据本发明的实施例，对核酸序列与野生型序列进行比对的设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作，根据本发明的具体实例，可以采用SOAP软件进行比对。

由此，利用该系统，能够有效地实施前述确定生物样品是否具有高原适应性的方法，从而可以有效地确定生物样品是否具有高原适应性，进而能够针对性地对具有高原适应性差异的各生物样品进行深入研究，从而能够为急性高原病的治疗及预防奠定基础。并且，能够在面对高原缺氧环境时，及时有效地对不具有高原适应性的生物样品进行急性高原病的预防。

根据本发明的第四方面，本发明提出了一种用于确定生物样品是否具有高原适应性的试剂盒。根据本发明的实施例，该用于确定生物样品是否具有高原适应性的试剂盒包括：适于检测EPAS1基因突变体的试剂，其中与野生型EPAS1基因相比，该EPAS1基因突变体在chr2，46441523位具有突变。利用根据本发明的实施例的试剂盒，能够有效地确定生物样品是否具有高原适应性。在本文中，所使用的术语“适于检测EPAS1基因突变体的试剂”应做广义理解，即可以是检测EPAS1编码基因的试剂，也可以是检测EPAS1突变体多肽的试剂，例如可以采用识别特异性位点的抗体。

根据本发明的实施例，本发明的试剂盒可以进一步包括EPAS1基因的特异性引物，该所述特异性引物具有下表所示的至少一组引物所示的核酸序列。

序号	上游引物（5’-3’，SEQ ID NO：）	下游引物（5’-3’，SEQ ID NO：）
			1	CAGTGCCTGGCATGTAGTAG(1)	AATGCATCTGTTCTTTTCCC(2)
2	AGCTCCTCCTGAATTTGCTA(3)	GCAAGACCCCATCTCTAAAA(4)
			3	TATAGGCTTCTCCCAAGGTG(5)	GGCCTGTGATCATGTGTCTA(6)
4	CCTGCTGAAATCCATTCTGT(7)	ACTTTTAGGTCATTGCTCCG(8)
			5	ACCTGCTGCTTTTATGGAAC(9)	GACAAAAATTTCATGAGGGG(10)
6	CCTCTAGCCTGCCACATATT(11)	TTGAGGTATGCAACCAGCTA(12)
			7	AAGACAGGACTGAGCACACA(13)	AGCTGAGAGTGAAAACTGGG(14)
8	CATTTGGGGGTAGAAATGAG(15)	GTGTCAGGTCCACAGACAGA(16)
			9	TTAGAGCATGTTACAGGCCA(17)	CCTCTCATCTACTGGCACCT(18)
10	GAGTCCCAGGTGTAGGGTAA(19)	TCAGGAAGGTCTTGCTATCC(20)
			11	ATCATGTGTGAACCAATCCA(21)	CAAATACAGTACCGGGAACC(22)
12	CATGGGCTTCAGGACTAGAT(23)	CATCTGTTCTCCCCATCTTC(24)
			13	AAGGAAATGCAGAAGACTGG(25)	GGAGAAGGGGAAACTGAGAT(26)
14	AAACACACACACAACCTTCCT(27)	TTTGACACTGCGTTTCCTTA(28)
			15	GTTCATTAACCTCCCCACTG(29)	CCCAGTAGCAGCTTTCATTT(30)
16	AAGGGAGCTTTAGAAAAGGC(31)	AACATGGCCAAGGATACACT(32)
			17	AGTGTATCCTTGGCCATGTT(33)	TTCTGTACCAGACGCTATGC(34)
18	GGTTTGCATTAAGGACCATC(35)	AAATCACTGGGAAGACCAAA(36)
			19	CTCTGGCCTTAGTTTCCTCA(37)	TTTATCCATCTGCCTGTTGA(38)
20	CATCAACAGGCAGATGGATA(39)	GCAACCACTCTTCTGCTTTT(40)

根据本发明的一个实施例，适于检测EPAS1基因突变体的试剂为核酸探针，由此，可以高效地确定生物样品是否具有高原适应性，进而能够在面对高原缺氧环境时，及时有效地对不具有高原适应性的生物样品进行急性高原病的预防。

需要说明的是，在本文前面确定生物样品是否具有高原适应性的方法部分中所描述的特征和优点，同样适用于确定生物样品是否具有高原适应性的系统或者试剂盒，在此不再赘述。

此外，本领域技术人员可以理解，在本文中所使用的术语“核酸序列”，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了描述方便，在本说明书和权利要求书中，多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。具体地，例如，在本文中所使用的表达方式“核酸样本的核酸序列与野生型相比，在chr2，46441523位具有突变是所述生物样品具有高原适应性的指示”，其中所述的“核酸样本的核酸序列”包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测与其互补的另一条链，反之亦然。并且，在本文中，“核酸序列”包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种形式的序列，则意味着另一种形式的序列也被公开。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均与首次标明的内容相同。

一般方法

样本：41份藏族人的基因组DNA（分别来源于41个没有亲缘关系的藏族人的外周血，这些人分别居住在4300米喜马拉雅高海拔平原地域的定日和那曲两个村子，并有自报家族历史记录）；40份中国北京汉族人的基因组DNA（取自千人基因组数据库，http://1000genomes.org）。

1.1外显子组测序

发明人利用NimbleGen(Madison,WI)2.1M exon capturearray结合Solexa高通量测序技术分别对上述各样本进行外显子组测序，具体如下：

1）将基因组DNA随机打断成150-200bp左右的片段，随后在片段两端分别连接上接头制备杂交文库（可参见http://www.illumina.com/提供的Illumina/Solexa标准建库说明书，通过参照将其全文并入本文）。

2）文库经纯化后经过ligation-mediated PCR(LM-PCR)的线性扩增与SureSelect Biotinylated RNA Library(BAITS)进行杂交富集，再经过LM-PCR的线性扩增后进行上机测序。测序平台为Illumina GA，读取长度为90bp，每个样本的平均测序深度最少为20×。

3）测序后获得的原始数据由Illumina basecalling Software1.7进行处理，经过过滤去污染后，使用SOAPaligner2.20（可参见：Li,R.,et al.,SOAP:short oligonucleotide alignmentprogram.Bioinformatics,2008.24(5):p.713-4.；Li,R.,et al.,SOAP2:an improved ultrafast toolfor short read alignment.Bioinformatics,2009.25(15):p.1966-7，通过参照将其全文并入本文）比对参考基因组，获得比对到基因组上的Unique mapped reads。EPAS1的基因型由SOAPsnp（可参见：Li,R.,et al.,SNP detection for massively parallel whole-genome resequencing.Genome Res,2009.19(6):p.1124-32.，通过参照将其全文并入本文）确定。

结果，发明人发现，在藏族人群和汉族人群中频率差异较大的位点：chr2，46441523。

由此，发明人认为EPAS1基因在chr2，46441523位的突变与高原适应性相关。

进一步，由于外显子组测序存在一定程度的假阳性，发明人分别利用长范围PCR及Fst检验方法，对上述外显子组测序结果进行验证，具体如下：

1.2长范围PCR

首先，发明人利用长范围PCR和下一代测序技术确定各样本的EPAS1全基因序列以及该基因上下游20kb区域的序列（共129.3kb）。具体地，发明人分别对各样本的前述区域进行扩增，并利用hiseq2000测序仪分别对各扩增产物进行测序，以便获得测序数据，其中各样本的覆盖深度至少达到200×。

接下来，按照如下条件对测序数据进行过滤，除去污染：1)该位点在全体中为处于哈迪温伯格平衡；2)按照比对分数，处于难于比对上的区域；3)该位点两个基因型的质量分布显著不同；4)处于或在插入缺失附件(<=4bp)；5)该位点出现2个以上的碱基型。

然后，利用SOAPaligner软件将经过过滤的数据比对到hg18UCSC人类参考基因组上，并利用SOAPsnp确定各样本的EPAS1基因及其侧翼区域的基因型。

结果，检测出1150个多态性位点，其中639个处于内含子区域，5个位点造成错义，

14个位点位于5'UTRs，9个位点位于3'UTR，基因间区域的有429个位点。

由此，发明人进一步证实了EPAS1基因的chr2，46441523位突变与高原适应性相关。

1.3Fst检验

进一步，发明人对前述外显子组测序获得的SNP数据进行Fst检验，以便确定藏族人和汉族人样本之间差异最大的SNP位点，从而确定高原适应性相关的基因及位点。

其中，Fst（Fixation index）是一种基于基因组上的、类似于SNP数据的多态性数据，其是1920年，Sewall Wright在一种特殊情况下应用F-检验时发展而来的。Fst能够用于评价群体间的基因组的距离，以及统计群种的差异量。Fst零假设在同一物种的不同群体中等基因位点是随机相同的，而通常由群体间的等位基因频率差异比例表示遗传多样性。其中，Fst值的计算方法很多，但各种计算方法均遵循Hudson（1992）给出的定义:

$F_{\mathrm{ST}}=\frac{{\mathrm{\&Pi;}}_{\mathrm{Between}}-{\mathrm{\&Pi;}}_{\mathrm{Within}}}{{\mathrm{\&Pi;}}_{\mathrm{Between}}}$

在上述公式中，ΠBetween表示两群体(Between)的各个体之间，等位基因频率两两比对的差异的平均数；ΠWithin表示同一群体(Within)的各个体之间，等位基因频率两两比对的差异的平均数。

基于上述定义的原理，结合SNP数据的特点，可推导出利用SNP数据计算Fst值的公式：

$F_{\mathrm{ST}}=1-\frac{{\mathrm{\&Pi;}}_{\mathrm{Within}}}{{\mathrm{\&Pi;}}_{\mathrm{Between}}}=1-\frac{\left[\underset{j}{\mathrm{\&Sigma;}}\left(\begin{array}{c}{n}_j\\ 2\end{array}\right)\underset{i}{\mathrm{\&Sigma;}}2\frac{n_{\mathrm{ij}}}{n_{\mathrm{ij}}-1}{x}_{\mathrm{ij}}(1-x_{\mathrm{ij}})\right]/\underset{j}{\mathrm{\&Sigma;}}\left(\begin{array}{c}{n}_j\\ 2\end{array}\right)}{\underset{i}{\mathrm{\&Sigma;}}2\frac{n_i}{n_i-1}{x}_i(1-x_i)}$

如上式所示，其中x_ij是SNP位点i在群体j中的次等位碱基的频率；n_ij是SNP位点i在群体j中染色体上的物理位置；n则是群体j用于分析的SNP的总和。

此外，对各样本进行了遗传比较。由Fst检验结果可知，分别来源于两个藏族村子的样本的遗传结构非常相近(Fst=0.014)，因此，在本实施例中，发明人将藏族人样本当成一个群体，进而，将汉族人与藏族人分别看做两个群体进行Fst检验，以检验两者的遗传距离

由Fst检验结果可知，在大多数的位点上，藏族人和汉族人的基因频率差异较小，但是在某些基因上，发明人观测到了有着强烈基因频率差异的位点。而这些带有较大差异位点的基因，即是潜在受到自然选择的目标区域。其中，最强烈的基因频率差异信号来自于EPAS1基因，并且在该基因的第二个内含子区域(chr2:4464)，有着最大的藏汉频率差异，即该区域与藏族人为适应高原环境的进化相关可能性非常大。而在EPAS1基因上的SNP(单核苷酸突变)和运动员的表现相关的研究，也从理论上证实了EPAS1基因与缺氧环境中的适应性相关。

进一步，发明人对将氧饱和度，红细胞数和血红蛋白数结果与基因型进行一元线性回归F检验。通过一元线性回归F检验结果，发明人发现，EPAS1基因的第二个内含子区域(chr2：4464)与红细胞数增多(P=0.00141)和血红蛋白(P=0.00131)的存在显著关联，由此，表明该在藏族人中高频的位点还与低红细胞和相应的红血球蛋白水平有关。而机体应对高原环境时即会产生红细胞增多的生理反应，因此，上述结果表明该藏族人EPAS1基因上的特异性位点chr2：46441523，可能与机体在高原缺氧环境下保持血管中足够的氧浓度而不增加红细胞水平有关。由此，发明人的上述发现揭示了藏族人对高原缺氧环境的适应性在基因水平上的突变模式。

此外，除了频率差异最大的chr2：46441523位点，藏族人和汉族人两个群体在EPAS1基因上频率差异较大的位点如下表所示（参考基因组：hg18ucsc）：

综上，发明人认为，EPAS1基因在chr2，46441523位的突变与个体的高原适应性密切相关。

实施例1

分别对366个藏族正常人（分别来源于4300米喜马拉雅高海拔平原地域的定日和那曲两个村子，并有自报家族历史记录）进行基因进行外显子测序，即针对EPAS1基因所有外显子序列设计引物，通过PCR扩增、产物纯化以及测序的方法获得EPAS1有关序列，根据序列测定结果分别确定其chr2：46441523的基因型，验证EPAS1基因在chr2，46441523位的突变与高原适应性之间的相关性。具体方法步骤如下：

1.1基因组DNA制备：采集前述366个藏族正常人的外周静脉血，利用常规酚-氯仿法抽提外周血白细胞中的基因组DNA，利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，所得的每个样本基因组DNA的OD260/OD280均位于1.7-2.0之间，浓度不少于200ng/μl，总量不少于30微克。

1.2外显子特异性引物设计及PCR反应

参考人类基因组序列数据库hg18/build36.3设计EPAS1基因的外显子特异性引物，引物序列如下：

方向	引物序列(5’-3’，SEQ ID NO：)
		正向	ACGTTGGATGTCCATGTCTGACCCTTCCAC(41)
反向	ACGTTGGATGTATTGTGAGGAGGGCAGTTG(42)

然后，利用以上所述的外显子特异性引物，将获得的366个藏族正常人的基因组DNA分别进行PCR反应，以便获得各自的PCR扩增产物，其中，PCR反应体系及反应条件如下所示：

反应体系（5μL）：

1×PCR缓冲液Ⅰ(2mmol/L MgCl₂)

正向引物（0.1pmol/μl）

反向引物（0.1pmol/μl）

1μl DNA模板(10-25ng/μl)

1×PCR缓冲液(包含2mmol/L MgCl₂)

Hotstar Taq(0.5U)

dNTP(500μmol/L)

MgCl₂(2mmol/L)

dNTP mix(500μmol/L)

以及ddH₂O。

PCR反应条件：

1.3Sanger测序：

利用3130xl Genetic Analyzer（ABI，Foster City，CA）对366个藏族正常人的PCR扩增产物直接进行DNA测序，以便获得测序结果，并基于测序结果确定各样本的chr2：46441523位点的基因型。

1.4基因型与高原适应性的关联检验：

基于上述基因型确定结果，利用一元线性回归模型，将基因型与氧饱和度，红细胞数和血红蛋白数进行关联检验。具体地，将纯合子、杂合子和突变纯合子的基因型分别赋予数值0、1、2，然后利用E[Y|X_i]=β₀+β₁X_i公式来检验斜率β₁是否区别于零（即分别将“一般方法”中藏族人和汉族人的三种群体基因型频率与对应的表型数值做一元线性回归检验，观测是否存在线性关系）。在上述公式中，Y是数量特征（表型数值，如血氧浓度，为正数范围），X_i是位点i的基因型数值{0，1，2}。将366个藏族人按村分成两组，进行回归检验，结果见下表：

样品	366个藏族人	来自定日的藏族人	来自那曲的藏族人
				Sao2P	0.726	0.805	0.467
Erythrocyte P	0.00145	0.00188	0.0609
				Erythrocyteβ1	-0.236	-0.284	-0.214
Erythrocyte SE	0.0734	0.0901	0.113
				Erythrocyte n	314	198	116
Hemoglobin P	0.00127	0.00458	0.00166
				Hemoglobinβ1	-9.23	-9.14	-13.6
Hemoglobin SE	2.84	3.19	4.21
				Hemoglobin n	358	240	118

如上表所示，其中Sao2为血氧饱和浓度，Erythrocyte为红细胞，Hemoglobin为血红蛋白。

综上，发明人证明了红细胞数和血红蛋白数与chr2：46441523位点的基因型有显著关联，并且，如个体的该位点突变为G，则认为其可能具有一定的高原适应性。

此外，发明人还发现，chr2：46441523位点的基因型与性别无关。

实施例2

制备一检测试剂盒，其包含能够检测在chr2，46441523位具有突变的EPAS1基因突变体的引物，用于确定生物样品是否具有高原适应性，其中这些引物为EPAS1基因的外显子特异性引物，其序列如下表所示：

利用上述试剂盒确定生物样品是否具有高原适应性的具体步骤为：按照实施例1的1.1所述的方法提取待测者DNA，以所提取的DNA为模板与上述特异性引物进行PCR反应，并按照本领域常规方法对PCR产物纯化，将纯化的产物进行测序，然后通过观察测序所得到的序列在chr2，46441523位具有突变，能够有效地检测本发明的EPAS1基因突变体在待测者DNA中是否存在，从而能够有效地确定待测者是否具有高原适应性，进而能够在面对高原缺氧环境时，及时有效地对不具有高原适应性的生物样品进行急性高原病的预防。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种分离的编码EPAS1突变体的核酸，其特征在于，所述核酸与野生型EPAS1相比，在chr2，46441523位具有突变。

2.一种确定生物样品是否具有高原适应性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

从所述生物样品提取核酸样本；

确定所述核酸样本的核酸序列；

所述核酸样本的核酸序列与野生型EPAS1相比，在chr2，46441523位具有突变是所述生物样品具有高原适应性的指示，

任选地，所述生物样本为选自人体血液、皮肤、皮下组织的至少一种，

任选地，所述核酸样本为全基因DNA。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，确定所述核酸样本的核酸序列进一步包括：

针对所述核酸样本，构建核酸测序文库；以及

对所述核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果，

任选地，采用选自Hiseq2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种对所述核酸测序文库进行测序。

4.一种确定生物样品是否具有高原适应性的系统，其特征在于，包括：

核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本；

核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列；以及

判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核酸序列与野生型EPAS1相比，是否在chr2，46441523位具有突变，判断所述生物样品是否具有高原适应性。

5.根据权利要求4所述的系统，其特征在于，所述核酸序列确定装置进一步包括：

文库构建单元，所述文库构建单元用于针对所述核酸样本，构建核酸测序文库；以及

测序单元，所述测序单元与所述文库构建单元相连，用于对所述核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。

6.根据权利要求5所述的系统，其特征在于，所述测序单元包括选自HISEQ2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种。

7.一种用于确定生物样品是否具有高原适应性的试剂盒，其特征在于，含有：

适于检测EPAS1基因突变体的试剂，其中与野生型EPAS1相比，所述EPAS1基因突变体在chr2，46441523位具有突变。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述适于检测EPAS1基因突变体的试剂为核酸探针。

9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括EPAS1特异性引物。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述EPAS1特异性引物为如下表所示的至少一组引物：

序号 上游引物（5’-3’，SEQ ID NO：） 下游引物（5’-3’，SEQ ID NO：） 1 CAGTGCCTGGCATGTAGTAG(1) AATGCATCTGTTCTTTTCCC(2) 2 AGCTCCTCCTGAATTTGCTA(3) GCAAGACCCCATCTCTAAAA(4) 3 TATAGGCTTCTCCCAAGGTG(5) GGCCTGTGATCATGTGTCTA(6) 4 CCTGCTGAAATCCATTCTGT(7) ACTTTTAGGTCATTGCTCCG(8) 5 ACCTGCTGCTTTTATGGAAC(9) GACAAAAATTTCATGAGGGG(10) 6 CCTCTAGCCTGCCACATATT(11) TTGAGGTATGCAACCAGCTA(12) 7 AAGACAGGACTGAGCACACA(13) AGCTGAGAGTGAAAACTGGG(14) 8 CATTTGGGGGTAGAAATGAG(15) GTGTCAGGTCCACAGACAGA(16) 9 TTAGAGCATGTTACAGGCCA(17) CCTCTCATCTACTGGCACCT(18) 10 GAGTCCCAGGTGTAGGGTAA(19) TCAGGAAGGTCTTGCTATCC(20) 11 ATCATGTGTGAACCAATCCA(21) CAAATACAGTACCGGGAACC(22) 12 CATGGGCTTCAGGACTAGAT(23) CATCTGTTCTCCCCATCTTC(24) 13 AAGGAAATGCAGAAGACTGG(25) GGAGAAGGGGAAACTGAGAT(26) 14 AAACACACACACAACCTTCCT(27) TTTGACACTGCGTTTCCTTA(28) 15 GTTCATTAACCTCCCCACTG(29) CCCAGTAGCAGCTTTCATTT(30) 16 AAGGGAGCTTTAGAAAAGGC(31) AACATGGCCAAGGATACACT(32) 17 AGTGTATCCTTGGCCATGTT(33) TTCTGTACCAGACGCTATGC(34) 18 GGTTTGCATTAAGGACCATC(35) AAATCACTGGGAAGACCAAA(36) 19 CTCTGGCCTTAGTTTCCTCA(37) TTTATCCATCTGCCTGTTGA(38) 20 CATCAACAGGCAGATGGATA(39) GCAACCACTCTTCTGCTTTT(40)