CN109504770B - 一种基于扩增子测序检测染色体杂合性缺失的试剂盒及方法 - Google Patents

一种基于扩增子测序检测染色体杂合性缺失的试剂盒及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109504770B
CN109504770B CN201811210956.9A CN201811210956A CN109504770B CN 109504770 B CN109504770 B CN 109504770B CN 201811210956 A CN201811210956 A CN 201811210956A CN 109504770 B CN109504770 B CN 109504770B
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
dna
kit
chromosome
heterozygosity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201811210956.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109504770A (zh
Inventor
龚建
冯晓燕
林挺
于祥春
穆珑丹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Epbay Biotechnology (suzhou) Co Ltd
Original Assignee
Epbay Biotechnology (suzhou) Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Epbay Biotechnology (suzhou) Co Ltd filed Critical Epbay Biotechnology (suzhou) Co Ltd
Priority to CN201811210956.9A priority Critical patent/CN109504770B/zh
Publication of CN109504770A publication Critical patent/CN109504770A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109504770B publication Critical patent/CN109504770B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一种基于扩增子测序检测染色体杂合性缺失的试剂盒及方法。本发明属于分子生物学核酸检测领域，涉及一种利用扩增子测序的方法检测染色体杂合性缺失的试剂盒及方法，所述试剂盒中含有用于检测人类1号染色体1p36.32区域的14组引物对和1q25.2区域的6组引物对、用于检测人类19号染色体19p13.2区域的14组引物对和19q13.33区域的7组引物对的混合物以及用于区分样本的20种标签引物，以及GC稳定剂、PCR酶混合物、纯化磁珠、质控标准品、ddH2O。经过两次PCR扩增及两次产物纯化并测序后，通过READS(1p)/READS(1q)与READS(19q)/READS(19p)的比值来分析样本中1p19q杂合性缺失状态。采用本发明所述的方法可全面真实准确地反应1p19q的变异情况并且可以同时高通量检测分析96个样本的基因变异，极大地降低了检测成本。

Description

一种基于扩增子测序检测染色体杂合性缺失的试剂盒及方法
技术领域
本发明属于分子生物学核酸检测领域，涉及一种基于扩增子测序的方法检测染色体杂合性缺失的试剂盒及方法。
背景技术
脑胶质瘤起源于神经胶质细胞，是颅内最常见的原发性肿瘤，约占所有中枢神经系统肿瘤的27％，约占恶性肿瘤的80％。我国胶质瘤年发病率为(3～6.4)/10万，年死亡人数达3万。恶性胶质瘤(Glioblastoma，GBM，WHO IV级)的发病率为5.8/10万，5年病死率在全身肿瘤中仅次于胰腺癌和肺癌，位列第3位。少突胶质细胞瘤占胶质瘤5～18％，是胶质瘤的一种独立类型。大多数少突胶质细胞肿瘤均存在1号染色体短臂(1p)和19号染色体长臂(19q)的杂合性缺失(Loss of Heterozygosity，LOH)，是指染色体(1；19)(q10；p10)的不平衡易位。具有1p19q联合缺失的胶质瘤对烷化剂化疗和放疗联合烷化剂化疗比较敏感，使患者预后较好。目前，常用于检测lp19q杂合性缺失(LOH)的方法包括：荧光原位杂交(FISH)、和以PCR为基础的杂合性缺失检测(PCR-LOH)。FISH是目前临床上检测LOH的金标准，但检测周期较长，需要有丰富经验的专业人员操作。PCR-LOH检测是一项比较成熟的分子生物学技术，通过有无扩增片断的出现判断是否存在某种缺失。这两种方法检测样本的通量太低，且结果分析掺杂因素较多，不能便捷、准确的判定测试结果。现有技术文件1(申请公布号CN107435077A)公开了使用普通PCR扩增电泳检测法对1号染色体短臂(1p)上的D1S468、D1S436、D1S489基因位点和19号染色体长臂(19q)上的D19S112、D19S217、D19S902基因位点进行检测，并只通过观测扩增条带的亮度来判读lp19q杂合性缺失。现有技术2(申请公布号CN 103805707A)公开了使用多重PCR结合毛细管电泳技术对1号染色体短臂(1p)上的D1S468、D1S436、D1S489基因位点和19号染色体长臂(19q)上的D19S112、D19S217、D19S902基因位点进行检测，并只通过毛细管电泳来检测不同基因位点的扩增情况。然而，现有技术文件1和2所公开的基因位点在不同细胞内的染色体上并不是全部缺失，而是部分细胞发生LOH，也就是说上述所检测的基因位点并不能判定染色体是否发生完全缺失的状态，而是反映了基因表达量高低的变化。
这些现有技术文件的任一个都没有公开和暗示将扩增子测序并通过测序结果对染色体上的每一个待检测区段的覆盖度(RAEDS数量)进行统计并基于RAEDS(长臂)/RAEDS(短臂)或RAEDS(短臂)/RAEDS(长臂)的比值以确定染色体杂合性缺失的准确状态的想法。
发明内容
本发明的目的是提供：用于测定人类1号染色体短臂1p36.32区域14个基因表达的引物对；用于测定人类1号染色体长臂1q25.2区域7个基因表达的引物对；用于测定人类19号染色体短臂19p13.2区域15个基因表达的引物对；用于测定人类19号染色体长臂19q13.33区域8个基因表达的引物对；用于标记不同样本的标签引物；高通量检测染色体杂合性缺失的试剂盒；该试剂盒的使用方法；该试剂盒的用途。
本发明人通过深入广泛的研究，得到了本发明所述的由SEQ ID NO：1～SEQ IDNO108条引物并与GC稳定剂、PCR酶混合物、纯化磁珠、ddH2O一起组成检测染色体1p19q杂合性缺失的试剂盒。本发明人已惊奇地发现使用该试剂盒既可以显著增强染色体杂合性缺失的检测准确性，又可以显著增加样本的检测数量、降低检测成本，从而完成本发明。
本发明的第一方面，提供了用于测定人类1号染色体短臂1p36.32区域14个基因表达的引物对，所述引物对由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：8和SEQ IDNO：29、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：11和SEQID NO：32、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：35所示序列的引物组成。
本发明的第二方面，提供了用于测定人类1号染色体长臂1q25.2区域7个基因表达的引物对，所述引物对由SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：19和SEQ IDNO：40、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：42所示序列的引物组成。
本发明的第三方面，提供了用于测定人类19号染色体短臂19p13.2区域15个基因表达的引物对组，所述引物对由SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：44和SEQ IDNO：67、SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：47和SEQID NO：70、SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：78、SEQ IDNO：56和SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：80所示序列的引物组成。
本发明的第四方面，提供了用于测定人类19号染色体长臂19q13.33区域8个基因表达的引物对，所述引物对由SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：62和SEQ IDNO：85、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：65至SEQID NO：88所示序列的引物组成。
本发明的第五方面，提供了用于标记不同样本的标签引物对，所述引物对由SEQID NO：89～SEQ ID NO：96和SEQ ID NO：97～SEQ ID NO：108所示序列的引物随机组成。
本发明的第六方面，提供了用于标记不同样本的标签引物对，所述引物SEQ IDNO：89～SEQ ID NO：96和SEQ ID NO：97～SEQ ID NO：108具有1～96种组合并且每个组合可以标记一个样本，从而可以同时分析96个样本。
本发明的第七方面，提供了一种基于扩增子测序检测染色体杂合性缺失的试剂盒，它含有SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：88所示序列组成的44对引物对混合物、20个标签引物，还包含GC稳定剂、PCR酶混合物、纯化磁珠、ddH2O。
本发明的第八方面，提供了上述本发明内容中第一方面至第六方面所述的引物对在制备用于确定基于染色体杂合性缺失的烷化剂化疗和放疗联合烷化剂化疗的试剂中的用途。
本发明的第九方面，提供了基于染色体杂合性缺失的烷化剂化疗和放疗联合烷化剂化疗方案包括：(1)从肿瘤样本中分离DNA；(2)以分离到的DNA为模板，使用所述试剂盒中的44对引物对混合物进行PCR扩增并获得第一次PCR扩增产物；(3)将第一次PCR扩增产物纯化后，根据样本数量，采用所述试剂盒中的标签引物SEQ ID NO：89～SEQ ID NO：96和SEQID NO：97～SEQ ID NO：108进行随意组合为引物对，并且对第一次PCR扩增产物的纯化产物进行第二次PCR扩增；(4)将第二次PCR扩增产物纯化后，进行质量检测；(5)对第二次PCR扩增产物纯化后的产物进行测序，并分析测序结果；(6)根据测序结果，对染色体上的每一个待检测区段的覆盖度(RAEDS数量)进行统计。(7)以RAEDS(长臂)/RAEDS(短臂)或RAEDS(短臂)/RAEDS(长臂)的比值确定基于染色体杂合性缺失的烷化剂化疗和放疗联合烷化剂化疗方案。
本发明的第十方面，可以提供烷化剂化疗和放疗联合烷化剂化疗方案的肿瘤样本包括胶质瘤石蜡切片样本以及胶质瘤脑脊液样本。
下面对本发明的试剂盒设计原理、使用方法和用途作进一步的说明：
人类基因组是由两条互补配对的染色体组成的二倍体，而某些基因组变异的情况常常只发生在一条染色体上，因此现有技术所公开的仅依靠盲目检测一条染色体上目标区域的有无以判断染色体缺失的状态往往会产生假阴性的结果。本发明是通过筛选1号染色体与19号染色体的短臂及长臂区域，最后确定1p36.32、1q25.2、19p13.2、19q13.33区域，这些区域稳定性高，同时均能覆盖染色体400Kb-2.5Mb，在这些区域上选取5～20个位点设计多对引物以检测更多区域达到更宽的检测范围。由于存在多个检测区域，避免了因缺失的随机性导致的漏检，即假阴性结果的出现，进一步保证了染色体杂合性缺失检测的科学性与可靠性。
本发明所涉及的引物是将多次设计的引物经过多次测试及筛选，之后在1号染色体的短臂1p与长臂1q上经过PCR扩增分别检测5～20个不同区域以及在19号染色体的短臂19p与长臂19q上分别经过PCR扩增检测5～20个不同区域并进行测序，再通过READS(1p)/READS(1q)与READS(19q)/READS(19p)的比值来分析样本中1p19q杂合性缺失状态，并且通过目的区域与对照区域覆盖度的比值来判定染色体缺失状态，即以1q和19p作为染色体变异检测的内参，因此可以全面真实准确地反应1p19q的变异情况。
本发明所述试剂盒及方法可针对胶质瘤包括石蜡切片样本、脑脊液样本提取所得的微量DNA进行两次PCR扩增，因此可以大大提高DNA的量，以达到测序要求的样本量并且准确测定1p19q杂合性缺失状况。
本发明所述试剂盒及方法因为包含经过特殊设计的标签引物，8个SEQ ID NO：89～SEQ ID NO：96的上游引物可与12个SEQ ID NO：97～SEQ ID NO：108的下游引物可以随机组合配对形成最多96对引物对，每对引物对可作为一个样本的标记标签，因此可以同时对96个样本进行检测，提供96个样本中的1p19q杂合性缺失情况，达到高通量的检测效果，大大降低了检测成本。
附图说明
图1为本发明所涉及的人类1号染色体和19号染色体检测区域指示图
图2为本发明实施例1的1p缺失状态ROC统计图
图3为本发明实施例1的19q缺失状态ROC统计图
具体实施方式
本发明公开了一种基于扩增子测序检测染色体杂合性缺失的试剂盒及方法，下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均属于本发明的保护范围内。
实施例1本发明所述试剂盒
本发明所述基于扩增子测序检测染色体杂合性缺失的试剂盒包括：
用于测定人类1号染色体短臂1p36.32区域14个基因表达的引物对组：引物对组由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：6和SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：9和SEQ IDNO：30、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：12和SEQID NO：33、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：35所示序列的引物组成，引物序列参见表1人类1号染色体短臂1p36.32区域14个基因的引物序列，每种引物的浓度为100μM。
表1、人类1号染色体短臂1p36.32区域14个基因的引物序列
用于测定人类1号染色体长臂1q25.2区域7个基因表达的引物对组：引物对组由SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：17和SEQ IDNO：38、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：20和SEQID NO：41、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：42所示序列的引物组成，引物序列参见表2人类1号染色体长臂1q25.2区域7个基因的引物序列，每种引物的浓度为100μM。
表2、人类1号染色体长臂1q25.2区域7个基因的引物序列
用于测定人类19号染色体短臂19p13.2区域15个基因表达的引物对组：引物对组由SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：45和SEQ IDNO：68、SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：48和SEQID NO：71、SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：79、SEQ IDNO：57和SEQ ID NO：80所示序列的引物组成，引物序列参见表3人类19号染色体短臂19p13.2区域15个基因的引物序列，每种引物的浓度为100μM。
表3、人类1号染色体长臂19p13.2区域15个基因的引物序列
用于测定人类19号染色体长臂19q13.33区域8个基因表达的引物对组：引物对组由SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：60和SEQ IDNO：83、SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：63和SEQID NO：86、SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：65至SEQ ID NO：88所示序列的引物组成，引物序列参见表4人类19号染色体长臂19q13.33区域8个基因的引物序列，每种引物的浓度为100μM。
表4、人类19号染色体长臂19q13.33区域8个基因的引物序列
用于标记不同样本的标签引物对：引物对由SEQ ID NO：89～SEQ ID NO：96和SEQID NO：97～SEQ ID NO：108所示序列的引物随机组成，所述用于标记不同样本的标签引物SEQ ID NO：89～SEQ ID NO：96和SEQ ID NO：97～SEQ ID NO：108具有1～96种组合并且每个组合可以标记一个样本，从而可以同时分析96个样本，引物序列参见表5标签引物序列，每种引物的浓度为15μM。
表5、标签引物序列
GC稳定剂：购自Thermo Fisher Scientific公司
PCR酶混合物：购自Thermo Fisher Scientific公司
磁珠：购自Thermo Fisher Scientific公司
ddH2O：经过两次灭菌的纯净水
实施例2检测胶质瘤患者的石蜡包埋切片样本中1p19q杂合性缺失
1、检测方法
1.1提取石蜡切片中的DNA。
1.2第一次PCR扩增(多重靶向PCR扩增)组分如下：
组分 终浓度
引物混合物 0.2μM/each
GC稳定剂 1×
PCR酶混合物 1×
FFPE DNA模板 10ng
ddH<sub>2</sub>O to 25μL
引物混合物配制：将实施例1中所述的表1、表2、表3、表4中所述的1p36.32、1q25.2、19p13.2、19q13.33区域的88种、浓度为100μM的引物液每种各取3.5μL加入离心管中并充分混匀，使用时取10μL加入上述PCR反应体系中，每种引物的终浓度为0.2μM。
1.3第一次PCR反应程序：
1.4程序运行结束后取下PCR管，于掌上离心机中轻轻离心使反应液沉到管底，用于下一步纯化，否则储存于-20℃。
1.5第一次PCR产物纯化
1.5.1于96孔板各纯化孔中加入17.6μL(0.8倍PCR产物体积)磁珠。
1.5.2依次吸取22μL第一次PCR产物于相应纯化孔中。
1.5.3使用排枪吹打70次左右，使PCR产物与磁珠充分混匀，室温放置5min。
1.5.4将96孔板放置于磁力架上，用磁力架吸附磁珠直至溶液澄清，约3min。
1.5.5将上清液吸出至废液缸，小心操作，当心孔间污染。
1.5.6使用排枪于各纯化孔中加入200μL 80％新鲜乙醇，磁力架上静置2min至溶液澄清，将上清液吸出至废液缸。
1.5.7加入200μL 80％现配乙醇重复洗涤一次，将上清液吸出至废液缸，超净工作台静置96孔板，使残余乙醇挥发干净。
1.5.8加入ddH2O 20μL，从磁力架上取下孔板，反复吹打充分悬浮磁珠，室温放5min使DNA充分洗脱。
1.5.9将孔板重新置于磁力架上吸附磁珠，静置至溶液澄清，约2min，吸取上清液于新的离心管中。
1.5.10纯化产物可直接进行第二次PCR扩增，否则储存于-20℃。
1.6第二次PCR扩增体系组分如下：
组分 终浓度
标签引物 0.5μM each
GC稳定剂 1×
PCR酶混合物 1×
Round1纯化产物 13μL
ddH<sub>2</sub>O to 30μL
标签引物混合物配制：将实施例1中所述表5中的浓度为15μM的8种上游引物和12种下游引物液，按照检测样本的数量使用标签引物随意配对组合并对样本进行标记编号，使用时取1μL加入上述PCR反应体系中，每种引物的终浓度为0.5μM。
1.7第二次PCR反应程序：
1.8扩增程序结束后，将产物取下，涡旋混匀，并简单离心使反应液沉到管底，进行接下来的纯化步骤。若需要过夜放置，请于-20℃储存。
1.9第二次PCR产物纯化
1.9.1于96孔板各纯化孔中加入18.2μL(0.65倍PCR产物体积)磁珠。
1.9.2吸取28μL第二次PCR产物于相应纯化孔中。
1.9.3使用排枪吹打70次左右，使PCR产物与磁珠充分混匀，室温放置5min。
1.9.4将96孔板放置于磁力架上，用磁力架吸附磁珠直至溶液澄清，约3min。
1.9.5将上清液吸出至相应新的纯化孔中，小心操作，当心孔间污染。
1.9.6从磁力架上取下96孔板。
1.9.7在新的纯化孔中各加入4.2μL磁珠(0.15倍PCR产物体积)，使用排枪吹打70次，使反应液与磁珠充分接触，室温孵育5min。
1.9.8将96孔板重新放置于磁力架上吸附磁珠直至溶液澄清，约5min。
1.9.9使用移液器将上清液吸出废弃到废液缸中。
1.9.10使用排枪于各纯化孔中加入200μL 80％新鲜乙醇，磁力架上静置2min至溶液澄清，将上清液吸出至废液缸。
1.9.11再次加入200μL 80％现配乙醇重复洗涤一次，将上清液吸出至废液缸。
1.9.12将磁力架于超净工作台静置，使96孔板纯化孔中残余乙醇挥发，注意：不要过度晾干导致磁珠损失。
1.9.13加入20μL水，将96孔板从磁力架上取下，使用排枪反复吹打充分悬浮磁珠，约40次，室温放置5min使DNA充分洗脱。
1.9.14将孔板重新置于磁力架上吸附磁珠，静置至溶液澄清，约2min，吸取上清液于新的离心管中。
1.9.15纯化产物可直接进行质量检测，否则于-20℃储存。
1.10质量检测：使用Qubit4.0进行浓度测定，需要达到测序要求。
1.11上机测序与分析
2、检测结果：选取49例胶质瘤石蜡切片样品进行上述1中的检测方法操作过程并将扩增子进行测序并分析。该49例样品在进行本发明所述检测之前均已完成FISH检测并已确定为1p19q染色体杂合性变异的样品。根据测序结果，对染色体上的每一个已检测区段的覆盖度(RAEDS数量)进行统计。以RAEDS(长臂)/RAEDS(短臂)或RAEDS(短臂)/RAEDS(长臂)计算比值，所得到的比值通过ROC分析确定了1p以0.7391、19q以0.6787为阈值(如果大于或等于此值为阴性，即“—”，如果小于此值为阳性，即“+”)。将使用本发明所述方法检测所得到的结果与FISH检测结果判定进行比较分析发现，如表6所示，采用本发明所述的方法检测结果与经典检测方法FISH的检测结果相比，1p检测符合率为97.9％(48/49)；19q检测符合率为92％(45/49)，结果说明采用本发明所述的试剂盒及方法对染色体杂合性缺失情况的检测效果与目前FISH经典检测方法的检测结果一致。
表6、本发明所述的方法检测结果与FISH方法的检测结果比较表
实施例2检测胶质瘤患者脑脊液中的1p19q LOH
1、检测方法同实施例1
2、检测结果：同时收集上述49例样本中的编号为S222、S13、S30、S52、S215、S2116的6例脑脊液样本并进行与实施例1同样的检测，根据测序结果，对染色体上的每一个已检测区段的覆盖度(RAEDS数量)进行统计。以RAEDS(长臂)/RAEDS(短臂)或RAEDS(短臂)/RAEDS(长臂)计算比值，所得到的比值通过ROC分析确定了1p以0.7391、19q以0.6787为阈值(如果大于或等于此值为阴性，即“—”，如果小于此值为阳性，即“+”)。将使用本发明所述方法检测所得到的结果与石蜡切片检测结果判定进行比较分析发现，如表7所示，脑脊液中的1p结果与石蜡切片的检测符合度为100％(6/6)，19q结果与石蜡切片的检测结果的符合率为66％(4/6)。
表7、本发明所述的方法在使用脑脊液为样本的检测结果和使用石蜡切片为样本的检测结果与FISH检测结果比较表
序列表
<110> 艾普拜生物科技（苏州）有限公司
<120> 一种基于扩增子测序检测染色体杂合性缺失的方法
<130> 181012
<141> 2018-10-15
<160> 108
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
ctttccctac acgacgctct tccgatcttc gggacagatg ccaa 44
<210> 2
<211> 46
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
ctttccctac acgacgctct tccgatcttt gctgttaagc cagcct 46
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
ctttccctac acgacgctct tccgatcttt gttggacatt tgggtt 46
<210> 4
<211> 44
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
ctttccctac acgacgctct tccgatctgg cgtgtggtct ccct 44
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
ctttccctac acgacgctct tccgatctcc gtggtttgag tccct 45
<210> 6
<211> 44
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
ctttccctac acgacgctct tccgatctca gccgtctccg gact 44
<210> 7
<211> 46
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
ctttccctac acgacgctct tccgatctgt ggtgcatgcc tgtaat 46
<210> 8
<211> 45
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
ctttccctac acgacgctct tccgatctca cgctggtggg aagta 45
<210> 9
<211> 46
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
ctttccctac acgacgctct tccgatctac agggtggacg aaatga 46
<210> 10
<211> 46
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
ctttccctac acgacgctct tccgatcttc tccagagcac aggtgg 46
<210> 11
<211> 45
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 11
ctttccctac acgacgctct tccgatctgc gaacagaggc acgaa 45
<210> 12
<211> 44
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 12
ctttccctac acgacgctct tccgatctcg ggcagctgtg ctag 44
<210> 13
<211> 46
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 13
ctttccctac acgacgctct tccgatctga gaggtgaccc agggaa 46
<210> 14
<211> 45
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 14
ctttccctac acgacgctct tccgatctgc cccagagacg aagtc 45
<210> 15
<211> 46
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 15
ctttccctac acgacgctct tccgatctta tgtgacctgg ccctac 46
<210> 16
<211> 46
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 16
ctttccctac acgacgctct tccgatctcc acctcctggg ttcaag 46
<210> 17
<211> 45
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 17
ctttccctac acgacgctct tccgatcttg gctgccagat gttag 45
<210> 18
<211> 46
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 18
ctttccctac acgacgctct tccgatctgc gcagtggcct gtctac 46
<210> 19
<211> 46
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 19
ctttccctac acgacgctct tccgatcttg aggggtgtgg tcacag 46
<210> 20
<211> 46
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 20
ctttccctac acgacgctct tccgatctct cagctcactg cagctt 46
<210> 21
<211> 44
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 21
ctttccctac acgacgctct tccgatctag gggtacgtgt gcag 44
<210> 22
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 22
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tctcacagtc ccgaatcttc g 51
<210> 23
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 23
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tctagccaca cactgctctg g 51
<210> 24
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 24
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tctgacccag ccatcccatt a 51
<210> 25
<211> 49
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 25
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tctcagaaag gccgccaac 49
<210> 26
<211> 50
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 26
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tctgtaacgg ctcccgacac 50
<210> 27
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 27
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tctcgtctcg ccctgtgtaa c 51
<210> 28
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 28
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tctttgccca ggcttgagtg t 51
<210> 29
<211> 49
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 29
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tctggaccat gcctcggaa 49
<210> 30
<211> 49
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 30
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tctagcaccc tgggaactc 49
<210> 31
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 31
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tcttgctttg ctgggtgttt t 51
<210> 32
<211> 50
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 32
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tctgcctaga catcggctca 50
<210> 33
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 33
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tctctgcaga cctgggactc a 51
<210> 34
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 34
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tctaacgctt ttgagcgtga g 51
<210> 35
<211> 50
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 35
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tctatgccac cgcaaaagac 50
<210> 36
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 36
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tcttcatgga cactgctggt t 51
<210> 37
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 37
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tctgttcaag accagcctga c 51
<210> 38
<211> 49
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 38
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tctcagccat caccaccat 49
<210> 39
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 39
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tctgcctccc aggttcaagt g 51
<210> 40
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 40
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tcttgcccca gattcaaagt t 51
<210> 41
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 41
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tctaaaattt gacaggccgt g 51
<210> 42
<211> 49
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 42
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tctgggaggg tgggaaagg 49
<210> 43
<211> 46
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 43
ctttccctac acgacgctct tccgatcttg ggaggatcgc ttaagt 46
<210> 44
<211> 46
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 44
ctttccctac acgacgctct tccgatcttg gagtttcgct cttgtt 46
<210> 45
<211> 44
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 45
ctttccctac acgacgctct tccgatctca cctcccctac ggca 44
<210> 46
<211> 46
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 46
ctttccctac acgacgctct tccgatctca tgcctgtaat cccagc 46
<210> 47
<211> 46
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 47
ctttccctac acgacgctct tccgatctat tacaggtgcc catcac 46
<210> 48
<211> 46
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 48
ctttccctac acgacgctct tccgatctga agcaaatgct ttccca 46
<210> 49
<211> 46
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 49
ctttccctac acgacgctct tccgatctaa atgatccgcc tgcctt 46
<210> 50
<211> 46
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 50
ctttccctac acgacgctct tccgatctaa ttagccaggc atggtg 46
<210> 51
<211> 46
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 51
ctttccctac acgacgctct tccgatctcc tggccaacat gacaaa 46
<210> 52
<211> 46
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 52
ctttccctac acgacgctct tccgatctcc tggccaacat gacaaa 46
<210> 53
<211> 46
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 53
ctttccctac acgacgctct tccgatcttc ttggctcact gcaacc 46
<210> 54
<211> 46
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 54
ctttccctac acgacgctct tccgatctaa ggggcagagg gagaag 46
<210> 55
<211> 45
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 55
ctttccctac acgacgctct tccgatctcc ctcgagatgc gttgt 45
<210> 56
<211> 46
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 56
ctttccctac acgacgctct tccgatctaa catggtgaaa ccccgt 46
<210> 57
<211> 46
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 57
ctttccctac acgacgctct tccgatctga gatcctggca gggtga 46
<210> 58
<211> 46
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 58
ctttccctac acgacgctct tccgatctct tgggccagtt tttgtg 46
<210> 59
<211> 46
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 59
ctttccctac acgacgctct tccgatcttg ctgggattat aggcgt 46
<210> 60
<211> 46
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 60
ctttccctac acgacgctct tccgatctta gagcggccct tctacg 46
<210> 61
<211> 46
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 61
ctttccctac acgacgctct tccgatctat ggcaaaatcc cactgg 46
<210> 62
<211> 46
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 62
ctttccctac acgacgctct tccgatctgt gatggtagcc gggaag 46
<210> 63
<211> 44
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 63
ctttccctac acgacgctct tccgatctcc gctcccgagc tagt 44
<210> 64
<211> 46
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 64
ctttccctac acgacgctct tccgatctgg caggttcacc agtttc 46
<210> 65
<211> 46
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 65
ctttccctac acgacgctct tccgatctca accagaaaca gggcaa 46
<210> 66
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 66
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tctgtttccc caccacagat t 51
<210> 67
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 67
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tctgcgcctg taatcccagc t 51
<210> 68
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 68
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tctcacccat ggcatagttg t 51
<210> 69
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 69
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tctccaccaa gcgtggctaa t 51
<210> 70
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 70
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tctaggccaa ggtgggtaga t 51
<210> 71
<211> 53
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 71
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tcttgcttct ctcagttcct tgc 53
<210> 72
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 72
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tcttcatgca gttcctgcca a 51
<210> 73
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 73
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tctgatggag tctcgctctg t 51
<210> 74
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 74
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tctgcctcag cctcctgagt a 51
<210> 75
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 75
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tctgtggctc acgcctgtaa t 51
<210> 76
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 76
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tctcatggag aaaccctgcc t 51
<210> 77
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 77
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tcttgtgagc ccaaacaacg a 51
<210> 78
<211> 50
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 78
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tctggggtgg atctagggca 50
<210> 79
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 79
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tcttcactgc aacctccaac t 51
<210> 80
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 80
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tcttgtgccc agctgagagt a 51
<210> 81
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 81
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tctaaaaggt tgcagctgct g 51
<210> 82
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 82
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tctgggctgg aaccttgtct g 51
<210> 83
<211> 50
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 83
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tctagcaccc acaaagcact 50
<210> 84
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 84
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tctagatttt ggctccctgc a 51
<210> 85
<211> 49
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 85
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tctgggaccg agacaccaa 49
<210> 86
<211> 49
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 86
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tctcgacccc aaaaggctc 49
<210> 87
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 87
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tctccctaac ctgggttccc t 51
<210> 88
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 88
ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tctcacaccc tctcaccacc a 51
<210> 89
<211> 66
<212> DNA
<213> Artifical
<400> 89
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact gaacctttct ttccctacac gacgctcttc 60
cgatct 66
<210> 90
<211> 66
<212> DNA
<213> Artifical
<400> 90
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact gctaagttct ttccctacac gacgctcttc 60
cgatct 66
<210> 91
<211> 66
<212> DNA
<213> Artifical
<400> 91
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact gttctcttct ttccctacac gacgctcttc 60
cgatct 66
<210> 92
<211> 66
<212> DNA
<213> Artifical
<400> 92
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact aagacactct ttccctacac gacgctcttc 60
cgatct 66
<210> 93
<211> 66
<212> DNA
<213> Artifical
<400> 93
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc taatcgatct ttccctacac gacgctcttc 60
cgatct 66
<210> 94
<211> 66
<212> DNA
<213> Artifical
<400> 94
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc tagaacatct ttccctacac gacgctcttc 60
cgatct 66
<210> 95
<211> 66
<212> DNA
<213> Artifical
<400> 95
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact aagttcctct ttccctacac gacgctcttc 60
cgatct 66
<210> 96
<211> 66
<212> DNA
<213> Artifical
<400> 96
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact agacctatct ttccctacac gacgctcttc 60
cgatct 66
<210> 97
<211> 69
<212> DNA
<213> Artifical
<400> 97
caagcagaag acggcatacg agatatcacg accggtctcg gcattcctgc tgaaccgctc 60
ttccgatct 69
<210> 98
<211> 69
<212> DNA
<213> Artifical
<400> 98
caagcagaag acggcatacg agatacagtg gtcggtctcg gcattcctgc tgaaccgctc 60
ttccgatct 69
<210> 99
<211> 69
<212> DNA
<213> Artifical
<400> 99
caagcagaag acggcatacg agatcagatc cacggtctcg gcattcctgc tgaaccgctc 60
ttccgatct 69
<210> 100
<211> 69
<212> DNA
<213> Artifical
<400> 100
caagcagaag acggcatacg agatacaaac ggcggtctcg gcattcctgc tgaaccgctc 60
ttccgatct 69
<210> 101
<211> 69
<212> DNA
<213> Artifical
<400> 101
caagcagaag acggcatacg agatacccag cacggtctcg gcattcctgc tgaaccgctc 60
ttccgatct 69
<210> 102
<211> 69
<212> DNA
<213> Artifical
<400> 102
caagcagaag acggcatacg agataacccc tccggtctcg gcattcctgc tgaaccgctc 60
ttccgatct 69
<210> 103
<211> 69
<212> DNA
<213> Artifical
<400> 103
caagcagaag acggcatacg agatcccaac ctcggtctcg gcattcctgc tgaaccgctc 60
ttccgatct 69
<210> 104
<211> 69
<212> DNA
<213> Artifical
<400> 104
caagcagaag acggcatacg agatcaccac accggtctcg gcattcctgc tgaaccgctc 60
ttccgatct 69
<210> 105
<211> 69
<212> DNA
<213> Artifical
<400> 105
caagcagaag acggcatacg agatgaaacc cacggtctcg gcattcctgc tgaaccgctc 60
ttccgatct 69
<210> 106
<211> 69
<212> DNA
<213> Artifical
<400> 106
caagcagaag acggcatacg agattgtgac cacggtctcg gcattcctgc tgaaccgctc 60
ttccgatct 69
<210> 107
<211> 69
<212> DNA
<213> Artifical
<400> 107
caagcagaag acggcatacg agatagggtc aacggtctcg gcattcctgc tgaaccgctc 60
ttccgatct 69
<210> 108
<211> 69
<212> DNA
<213> Artifical
<400> 108
caagcagaag acggcatacg agataggagt ggcggtctcg gcattcctgc tgaaccgctc 60
ttccgatct 69

Claims (4)

1.一种基于扩增子测序检测染色体1p19q杂合性缺失的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有44对引物对混合物，所述44对寡核苷酸引物对混合物由SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：88所示序列的引物组成。
2.根据权利要求1所述的基于扩增子测序检测染色体1p19q杂合性缺失的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有20个标签引物，分别为SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ IDNO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：108所示序列。
3.根据权利要求1所述的基于扩增子测序检测染色体1p19q杂合性缺失的试剂盒，其特征在于：还包含GC稳定剂、PCR酶混合物、纯化磁珠、ddH2O。
4.根据权利要求2所述的基于扩增子测序检测染色体1p19q杂合性缺失的试剂盒，其特征在于，所示试剂盒能够用于确定基于染色体1p19q杂合性缺失的烷化剂化疗和放疗联合烷化剂化疗方案，包括：
（1）从肿瘤样本中分离DNA；
（2）以分离到的DNA为模板，使用所述试剂盒中的44对引物对混合物进行PCR扩增并获得第一次PCR扩增产物；
（3）将第一次PCR扩增产物纯化后，根据样本数量，采用所述试剂盒中的标签引物SEQID NO：89～SEQ ID NO：96和SEQ ID NO：97～SEQ ID NO：108进行随意组合为引物对，并且对第一次PCR扩增产物的纯化产物进行第二次PCR扩增；
（4）将第二次PCR扩增产物纯化后，进行质量检测；
（5）对第二次PCR扩增产物纯化后的产物进行测序，并分析测序结果；
（6）根据测序结果，对染色体上的每一个待检测区段的RAEDS数量进行统计；
（7）以长臂RAEDS/短臂RAEDS或短臂RAEDS/长臂RAEDS的比值确定基于染色体1p19q杂合性缺失的烷化剂化疗和放疗联合烷化剂化疗方案。
CN201811210956.9A 2018-10-17 2018-10-17 一种基于扩增子测序检测染色体杂合性缺失的试剂盒及方法 Active CN109504770B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811210956.9A CN109504770B (zh) 2018-10-17 2018-10-17 一种基于扩增子测序检测染色体杂合性缺失的试剂盒及方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811210956.9A CN109504770B (zh) 2018-10-17 2018-10-17 一种基于扩增子测序检测染色体杂合性缺失的试剂盒及方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109504770A CN109504770A (zh) 2019-03-22
CN109504770B true CN109504770B (zh) 2019-11-19

Family

ID=65746654

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811210956.9A Active CN109504770B (zh) 2018-10-17 2018-10-17 一种基于扩增子测序检测染色体杂合性缺失的试剂盒及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109504770B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11788137B2 (en) 2019-09-30 2023-10-17 Diagenode S.A. Diagnostic and/or sequencing method and kit

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3828283A1 (en) * 2019-11-28 2021-06-02 Diagenode S.A. An improved sequencing method and kit
CN110628890B (zh) * 2019-11-07 2020-11-13 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 测序质控标准品及其应用与产品
CN112626214A (zh) * 2020-12-29 2021-04-09 嘉兴允英医学检验有限公司 检测1p/19q杂合性缺失的引物组、试剂盒及方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105524983A (zh) * 2014-09-30 2016-04-27 大连晶泰生物技术有限公司 基于高通量测序的标记和捕获多个样本的一个或多个特定基因的方法和试剂盒

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105524983A (zh) * 2014-09-30 2016-04-27 大连晶泰生物技术有限公司 基于高通量测序的标记和捕获多个样本的一个或多个特定基因的方法和试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Detection of 1p19q Deletion by Real-Time Comparative Quantitative PCR;Abhishek Chaturbedi等;《Biomarker Insights》;20121231;第7卷;9-17 *
Molecular cytogenetic analysis of chromosomes 1 and 19 in glioma cell lines;Mark E. Law等;《Cancer Genetics and Cytogenetics》;20051231;第160卷;1-14 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11788137B2 (en) 2019-09-30 2023-10-17 Diagenode S.A. Diagnostic and/or sequencing method and kit

Also Published As

Publication number Publication date
CN109504770A (zh) 2019-03-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109504770B (zh) 一种基于扩增子测序检测染色体杂合性缺失的试剂盒及方法
CN106520931B (zh) Egfr基因突变检测引物探针及其试剂盒
Woo et al. Association of TP53 mutations with stem cell-like gene expression and survival of patients with hepatocellular carcinoma
CN111187839B (zh) m5C甲基化相关调节基因在肝癌预后预测中的应用
US20080305473A1 (en) Propagation of primary cells
CN104046700B (zh) 一种快速鉴定驴皮、马皮和骡子皮的检测试剂盒
CN112501268A (zh) 一种基于纳米孔测序的快速鉴别呼吸道微生物引物组、试剂盒及其应用
US20060223058A1 (en) In vitro association studies
WO2020048518A1 (zh) 一组用于髓母细胞瘤分子分型的基因及其应用
CN108004345A (zh) 高通量检测小麦抗赤霉病基因分型的方法及其试剂盒
CN106987640A (zh) Pik3ca基因突变检测引物探针及其试剂盒
CN108949929A (zh) 用于同时检测mthfr和mtrr基因多态性的产品及其方法和应用
CN113528509A (zh) 一种用于预测胃癌免疫治疗的肿瘤微环境评分系统的构建方法以及分子探针
CN105274100A (zh) 人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测标志物及试剂盒
CN105274197B (zh) 用于生物样本核酸检测的质控方法及试剂盒
CN107058548A (zh) c‑kit基因突变检测引物探针及其试剂盒
CN103937806A (zh) 一种Rh血型DEL型RHD838G&gt;A等位基因及其检测方法
CN116064842A (zh) 一种用于降解检材推断的生物地理祖先DIPs和性别鉴定的复合扩增盒
CN109735611A (zh) 一种用于检测骨髓衰竭综合征的基因组合、引物库、构建高通量测序文库的方法及其应用
KR102267332B1 (ko) 고구마 품종 판별용 snp 마커 및 이를 이용한 품종 판별 방법
CN102021228B (zh) 用于组织或全血egfr基因突变检测的特异性引物
CN114854852A (zh) 一组神经胶质瘤标志物及应用
CN104131101B (zh) 一种检测p53基因snp位点的试剂及其应用
CN102899390A (zh) 小细胞肺癌标志物及其检测
CN102382896A (zh) Npm1基因突变检测方法及其试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant