CN104131101B - 一种检测p53基因snp位点的试剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测P53基因SNP位点的试剂及其应用，该试剂包括能够用于检测P53基因中rs17881013位点的基因型的试剂。发明人通过对患者进行基因分型，分析P53基因SNP位点和吉非替尼对晚期非小细胞肺癌治疗反应性的相关性，发现根据rs17881013位点的基因型，可以判断晚期非小细胞肺癌患者对吉非替尼的治疗反应性。本发明的试剂的开发为晚期非小细胞肺癌患者治疗方案的确定提供了一种可靠、灵敏的方式。

Description

一种检测P53基因SNP位点的试剂及其应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及一种检测P53基因SNP位点的试剂及其在制备判断晚期非小细胞肺癌患者对吉非替尼治疗反应性的试剂盒中的用途。
背景技术
肺癌是最常见、死亡率最高的恶性肿瘤之一，其发病率与死亡率还在逐年增加。其中非小细胞肺癌(NSCLC)占整个肺癌的80％以上，并且大部分患者在诊断时已经是晚期。化疗曾经是晚期非小细胞肺癌最主要的治疗手段，但即便是最好的化疗方案，目前治疗的总有效率也不足50％，1年生存率仅40％左右。
靶向治疗药物的出现改变了非小细胞肺癌的治疗现状，显著地提高了患者的生存期。其中吉非替尼(Gefitinib，ZD1839)是最早上市、目前临床应用最为广泛的非小细胞肺癌靶向治疗药物，属于一种选择性、可逆性EGFR(表皮生长因子受体)酪氨酸激酶抑制剂，目前在包括中国在内的许多国家已经上市，商品名为易瑞沙(Iressa)。
吉非替尼治疗非小细胞肺癌的客观有效率差异很大，文献报道从8.9-69％不等。其中在IDEAL1临床研究中，日本人的有效率为27％，而美国人则仅为12％。而在EAP研究中，中国人的有效率约为30％。以上均提示吉非替尼治疗非小细胞肺癌的临床疗效存在着显著的个体差异。由于晚期非小细胞肺癌患者生存期很有限，因此尽早选择最可能有效的药物治疗对延长患者生存尤为重要。加之吉非替尼为代表的靶向治疗药物比较昂贵，价格是普通化疗的数十倍，从卫生经济学的角度也要求选择最可能获益的患者接受靶向治疗。因此，寻找吉非替尼疗效预测指标，指导个体化靶向治疗，是目前亟待解决的关键性临床问题。
目前最常用于预测吉非替尼疗效的生物标记物为EGFR基因的突变，主要为外显子19的碱基缺失(G2235-A2249缺失)和外显子21的点突变(L858R)。一项针对ISEL国际多中心III期临床研究的生物标记物回顾性分析发现，存在EGFR基因突变的16例NSCLC患者接受吉非替尼治疗后的有效率为37.5％，而EGFR基因野生型的116例患者吉非替尼的有效率仅为2.6％。但是EGFR基因突变作为吉非替尼疗效预测的生物标记物，存在一定的不足：①突变的检测需要肿瘤组织，而大部分肺癌在初次诊断时已经是晚期，失去手术获得肿瘤标本的机会，即便是少部分患者有可能活检取得标本，也会因为检出率有限和活检标本量限制，难以进行突变检测,目前临床上能够满足突变检测要求的患者比例少于20％(ISEL研究中约为17％)；②基因突变受肿瘤异质性的影响，同一患者在不同部位或者疾病不同阶段获得的肿瘤标本，其突变检测结果可能存在差异，因此检测到的结果可能不能代表全身和全程的肿瘤特点；③突变检测的流程复杂，仪器设备的要求高，一般实验室难以开展，同时检测成本也高，影响了其广泛的临床应用。
基于以上EGFR基因突变的不足之处，开发更理想的疗效预测生物标记物及其检测方法的临床需求显得更为迫切。
发明内容
发明人发现了rs17881013位点与晚期非小细胞肺癌患者对吉非替尼治疗反应性的相关性，并据此开发了能够判断晚期非小细胞肺癌患者对吉非替尼治疗反应性的试剂盒，和rs17881013位点在制备晚期非小细胞肺癌患者对吉非替尼治疗反应性的判断试剂盒中的应用。
一方面，本发明提供了用于判断晚期非小细胞肺癌患者对吉非替尼治疗反应性的一个SNP位点，所述的SNP位点是rs17881013，当rs17881013位点基因型为GC或CC时，晚期非小细胞肺癌患者对吉非替尼治疗反应性好，患者治愈率高。
另一方面，本发明提供了用于检测SNP位点基因型的试剂，所述试剂可以为采用本领域已知的任何技术检测SNP所需的试剂，只要其能够检测样本中rs17881013位点的基因型即可。
本领域技术人员已知，可以用多种技术在DNA水平上体外检测CETP基因序列的多态性位点。可以经与用放射性标记的反义RNA或DNA探针与扩增后的DNA序列杂交，以鉴别位点多态性。也可以基于已知的核苷酸顺序的改变，合成正常的和具有特定多态性的PCR引物，在聚合酶链式反应(PCR反应)的底物中加入荧光标记的核苷酸，根据反应产物中有无荧光出现，确定在扩增所用的引物中有无碱基变化，从而检测特定多态性。通过DNA直接测序可以直接揭示对照基因和携带具有特定多态性基因之间的序列差异。当与PCR结合使用时，这种方法的灵敏性大大提高。各种DNA及DNA片段的核苷酸序列的测定也可用常规方法如双脱氧链终止法。此外，核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒或自动测序仪等。常规的自动测序法用放射性标记或荧光标记来确定核酸序列。也可以采用限制性片段多态性分析(RFLP)来体外检测CETP基因序列的多态性位点。
本发明提供的用于检测SNP位点基因型的试剂，包括用于扩增SNP位点在内的核苷酸序列的引物和/或能够使用MassARRAYSequenom检测SNP位点基因型的单碱基延伸引物。用于扩增rs17881013位点在内的核苷酸序列的引物序列如下：正向引物5’-ACGTTGGATGGGAGTGGAGAGAGAAACTGG-3’；反向引物5’-ACGTTGGATGGTTGTCCCCAGATCCTGTG-3’；所述单碱基延伸引物序列为：5’-GTGTCCCAGGAGCTA-3’。
又一方面，本发明提供了用于检测SNP位点基因型的试剂盒，该试剂盒包括采用本领域已知的任何技术检测SNP所需的试剂，只要其能够检测样本中rs17881013位点的基因型。
本发明提供的用于检测SNP位点基因型的试剂盒包括用于扩增SNP位点在内的核苷酸序列的引物和/或能够使用MassARRAYSequenom检测SNP位点基因型的单碱基延伸引物。用于扩增rs17881013位点在内的核苷酸序列的引物序列如下：正向引物5’-ACGTTGGATGGGAGTGGAGAGAGAAACTGG-3’；反向引物5’-ACGTTGGATGGTTGTCCCCAGATCCTGTG-3’。所述单碱基延伸引物序列为：5’-GTGTCCCAGGAGCTA-3’。
本发明提供了用于判断晚期非小细胞肺癌患者对吉非替尼治疗反应性的试剂盒，该试剂盒的判断原理是利用试剂盒中的试剂检测rs17881013位点的基因型，根据所测患者的上述SNP位点的基因型判断晚期非小细胞肺癌患者对吉非替尼治疗反应性。当rs17881013位点基因型为GC或CC时，晚期非小细胞肺癌患者对吉非替尼治疗反应性好，患者治愈率高。
该试剂盒中包括采用本领域已知的任何技术检测SNP基因型所需的试剂，只要其能够检测样本中rs17881013位点的基因型即可。本发明提供的用于判断晚期非小细胞肺癌患者对吉非替尼治疗反应性的试剂盒包括用于扩增SNP位点在内的核苷酸序列的引物和/或能够使用MassARRAYSequenom检测SNP位点基因型的单碱基延伸引物。用于扩增rs17881013位点在内的核苷酸序列的引物序列如下：正向引物5’-ACGTTGGATGGGAGTGGAGAGAGAAACTGG-3’；反向引物5’-ACGTTGGATGGTTGTCCCCAGATCCTGTG-3’。所述单碱基延伸引物序列为：5’-GTGTCCCAGGAGCTA-3’。
本发明还提供了rs17881013位点在制备检测SNP位点基因型的试剂中的应用。所述试剂可以为采用本领域已知的任何技术检测SNP基因型所需的试剂，只要其能够检测样本中rs17881013位点的基因型即可。
本发明还提供了rs17881013位点在制备检测SNP位点基因型的试剂盒中的应用。所述试剂盒中包括能够检测SNP位点基因型的试剂。在一个具体的实施方案中，所述试剂包括用于扩增SNP位点在内的核苷酸序列的引物和/或能够使用MassARRAYSequenom检测SNP位点基因型的单碱基延伸引物。用于扩增rs17881013位点在内的核苷酸序列的引物序列如下：正向引物5’-ACGTTGGATGGGAGTGGAGAGAGAAACTGG-3’；反向引物5’-ACGTTGGATGGTTGTCCCCAGATCCTGTG-3’。所述单碱基延伸引物序列为：5’-GTGTCCCAGGAGCTA-3’。
本发明还提供了rs17881013位点在制备用于判断晚期非小细胞肺癌患者对吉非替尼治疗反应性的试剂盒中的应用。所述试剂盒的判断原理是利用试剂盒中的试剂检测rs17881013位点的基因型，根据所测患者的上述SNP位点的基因型判断晚期非小细胞肺癌患者对吉非替尼治疗反应性。当rs17881013位点基因型为GC或CC时，晚期非小细胞肺癌患者对吉非替尼治疗反应性好，患者治愈率高。
本发明还提供了用于检测rs17881013位点基因型的试剂在制备用于检测rs17881013位点基因型的试剂盒中的应用。
本发明还提供了用于检测rs17881013位点基因型的试剂在制备用于判断晚期非小细胞肺癌患者对吉非替尼治疗反应性的试剂盒中的应用。
本发明优点和有益效果如下：发明人研究发现，P53基因单核苷酸多态(rs17881013)是一种可预测吉非替尼治疗非小细胞肺癌疗效的生物指标。以P53rs17881013基因多态检测作为吉非替尼疗效预测指标，能在一定程度上克服现行预测指标(EGFR基因突变)的部分缺点：①rs17881013检测的标本可以来源自任何正常或肿瘤组织的有核细胞，最简便的方法是2ml外周血即可，因此几乎所有患者均可以获得检测标本；②rs17881013属于遗传变异，检测结果不受肿瘤异质性的影响，在患者一生中任何时候取得标本，或者取自任何部位标本，其检测结果应保持一致；③rs17881013检测流程相对简便、设备要求低、成本低廉，有利于临床推广。
具体的实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，应注意，如无特别指出，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限定本发明的保护范围。
1.研究对象：晚期非小细胞肺癌患者，87例。入选的患者(≥18岁)经组织学或细胞学确证为晚期非小细胞肺癌，所有患者均提供了知情同意书。
2.用药方法：吉非替尼250mg，每日一次，口服。用药周期为1年。
3.P53基因SNP位点的选择：在国际人类基因组单体型图计划提供的SNP公共数据库(http://hapmap:ncbi.nlm.nih.gov/)中检索P53基因，首先选取已知汉族人群中信息的SNP位点，再以其中的标签SNP作为进一步分型的候选多态位点，然后结合最小基因频率(MAF)以及哈迪-温伯格平衡P值(HWPval)等统计特征对候选标签SNP进行筛选以得出最佳的标签SNP。选取要求：MAF>0.1且HWPval>0.1。针对P53基因进行了基于标签SNP为主体的全面SNP位点选择，并且将与之关联的部分功能SNP替换进去，P53基因的候选SNP位点为rs17881013。
4.实验方法
4.1基因组DNA提取
采集病例研究对象2ml抗凝外周血标本，采用酚-氯仿法提取基因组DNA。DNA标本分离自外周血白细胞，简述如下：
(1)将收集的抗凝血标本从–80℃取出后置于室温，待溶化后将血转入另一干净的离心管，盖严后于5,000×g离心15min；
(2)将离心后的血上层弃去，留血细胞，加入适量裂解缓冲液(含10mMpH为8.0的Tris-HCl、0.1MEDTA、20μg/ml胰RNA酶、0.5％SDS)，混匀，于37℃温浴1h，加蛋白酶K(100μg/ml)混匀后37℃温浴过夜；
(3)温浴结束后加入等体积经Tris-HCl饱和过的平衡酚(pH7.4)充分混匀后于8,000×g离心15min；
(4)将上层水相移至另一离心管并加入等体积酚：氯仿(1:1)，充分混匀后8,000×g离心15min；
(5)将上层水相移入另一离心管中，加入10％体积的乙酸铵溶液(10M)，混匀后加入2倍体积的无水乙醇，混匀后放入–20℃。沉淀出的DNA经75％乙醇洗涤两次后，溶于适量TE缓冲液。使用分光光度计测定DNA浓度。
提取出的DNA通过分光光度法来测定其浓度，Sequenom技术要求DNA达以下标准:浓度在10ng/μl以上；OD260/280＝1.8～2.0。DNA样品置于1.5mlEP管中储存于-80℃超低温冰箱内。进行SNP分型检测时，样品被编码后分装于96孔板内。
4.2候选多态的基因分析
4.2.1SNP分型方法
根据NCBIGenBank数据库中相关的基因序列，设计PCR引物和单核苷酸扩展引物，采用高通量的MassARRAY时间飞行质谱生物芯片系统(Sequenom)分析候选SNP的基因型。SNP分型由博淼生物科技(北京)有限公司协助完成。MassARRAY系统的工作原理是利用杂交探针与PCR产物结合后进行延伸反应时不同等位基因延伸长度不同，通过质谱飞行时间不同鉴别探针延伸长度来确定不同基因型，其基因分型准确率达到97％以上。MassARRAY系统是目前唯一采用质谱法直接检测SNP的设备，其反应体系不依赖杂交，因此不受杂交错配的干扰。该系统与TaqMan分型平台不同，也不需要对引物或探针进行荧光标记，避免了荧光物质对基因分型过程的干扰。
为了质量控制，基因分型检测时均设平行重复样品和阴性对照(不含DNA的空白)，平行样品分析结果的重现率为100％。此外，每一样品的疾病状态对分型操作及分析人员保持盲态。
4.2.2Sequenom实验操作步骤
4.2.2.1引物设计
根据SNP位点序列信息，使用sequenom公司的引物设计软件Assaydesign3.1，设计并合成PCR反应和单碱基延伸引物(表1)。
表1各SNP位点PCR反应引物和延伸引物(补充)
4.2.2.2PCR反应
反应体系(384孔PCR板+38％的试剂损耗)
表2反应体系
试剂 浓度 体积(μl)
水，HPLC级 NA 927.5
含有15mM MgCl2的PCR缓冲液 10x 331.25
MgCl2 25mM 172.25
dNTP混合物 25mM 53
引物混合物 0.5μM 530
HotStar Taq 5U/μl 106
DNA模板 10ng/μl 1/孔
总计 5/孔
反应条件
表3反应条件
4.2.2.3SAP消化
反应体系(384孔PCR板+38％的试剂损耗)
表4SAP消化反应体系
试剂 浓度 体积(μl)
水 NA 810.9
SAP缓冲液 10x 90.1
SAP 1.7U/μl 159.0
总计 2/孔
反应条件
表5SAP消化反应条件
温度(℃) 时间(min) 循环数
37 40 1
85 5 1
4 ∞ 1
4.2.2.4延伸反应
反应体系(384孔PCR板+38％的试剂损耗)
表6反应体系
试剂 浓度 体积(μl)
水 NA 400.2
iPLEX buffer plus 10x 106
iPLEX terminator NA 106
引物混合物 0.6-1.3μM 426.1
iPlex酶 NA 21.7
总计 2/孔
反应条件
表7反应条件
4.2.2.5上机检测
将反应产物(共9μl)稀释3倍，使用树脂进行脱盐；将脱盐处理后的样品点在样品靶上，自然结晶；上机进行质谱检测，并收集数据。
5.统计分析
统计学分析用SPSS16.0软件进行。以χ2检验比较病例组和对照组之间各等位基因和基因型分布的差异；所有的统计检验均为双侧概率检验，以P＜0.05作为具有统计学显著性差异标准。
6.实验结果
6.1基因分型结果
吉非替尼有效组与吉非替尼无效组患者的各SNP位点的基因型分布见表8。P53基因rs17881013位点检测到GG、GC和CC三种基因型，GG基因型在吉非替尼有效组与吉非替尼无效组所占比例分别为49.1％和50.9％，CC基因型在两组间的所占比例分别为100％和0％，GC基因型在两组间所占比例分别为80％和20％，三组基因型在两组间所占比例有显著统计学差异(P＝0.011)。CC+GC基因型在吉非替尼有效组与吉非替尼无效组所占比例分别为81.3％和18.8％，与CC在两组间的分布差别具有显著性(P＝0.003)。
表8两组间各基因SNP位点基因型分布
6.2SNP位点与晚期非小细胞肺癌对吉莫替尼治疗反应敏感性的分析
非条件Logistic回归分析显示，rs17881013位点与晚期非小细胞肺癌对吉莫替尼治疗反应敏感性密切相关。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (9)

1.rs17881013位点在制备用于判断晚期非小细胞肺癌患者对吉非替尼治疗反应性的试剂盒中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂盒中包括检测rs17881013位点基因型的试剂。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述试剂包括用于扩增所述rs17881013位点在内的核苷酸序列的引物，或包括用于扩增所述rs17881013位点在内的核苷酸序列的引物和能够使用MassARRAYSequenom检测rs17881013位点基因型的单碱基延伸引物。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述用于扩增rs17881013位点在内的核苷酸序列的引物序列如下：正向引物5’-ACGTTGGATGGGAGTGGAGAGAGAAACTGG-3’；反向引物5’-ACGTTGGATGGTTGTCCCCAGATCCTGTG-3’。
5.根据根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述单碱基延伸引物序列为：5’-GTGTCCCAGGAGCTA-3’。
6.检测rs17881013位点基因型的试剂在制备用于判断晚期非小细胞肺癌患者对吉非替尼治疗反应性的试剂盒中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述试剂包括用于扩增所述rs17881013位点在内的核苷酸序列的引物，或包括用于扩增所述rs17881013位点在内的核苷酸序列的引物和能够使用MassARRAYSequenom检测rs17881013位点基因型的单碱基延伸引物。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述用于扩增rs17881013位点在内的核苷酸序列的引物序列如下：正向引物5’-ACGTTGGATGGGAGTGGAGAGAGAAACTGG-3’；反向引物5’-ACGTTGGATGGTTGTCCCCAGATCCTGTG-3’。
9.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述单碱基延伸引物序列为：5’-GTGTCCCAGGAGCTA-3’。
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