CN116814778A - 用于结直肠癌和/或腺瘤诊断的dna甲基化标志物、方法和试剂盒 - Google Patents

用于结直肠癌和/或腺瘤诊断的dna甲基化标志物、方法和试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN116814778A
CN116814778A CN202210280504.8A CN202210280504A CN116814778A CN 116814778 A CN116814778 A CN 116814778A CN 202210280504 A CN202210280504 A CN 202210280504A CN 116814778 A CN116814778 A CN 116814778A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sfrp1
seq
methylation
adenoma
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210280504.8A
Other languages
English (en)
Inventor
请求不公布姓名
苏松
周禾
时艳婷
李小飞
林俊超
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN202210280504.8A priority Critical patent/CN116814778A/zh
Publication of CN116814778A publication Critical patent/CN116814778A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种用于结直肠癌和/或腺瘤的早期诊断、检测或筛查的DNA甲基化标志物，所述标志物包括SEQ ID NO.1所示的SFRP1基因中的CpG位点。本发明还提供了检测上述DNA甲基化标志物的方法、引物对、探针和试剂盒。本发明对早期结直肠癌和/或腺瘤的特异性好、灵敏度高，且检测成本低、操作简单，有利于早期结直肠癌和/或腺瘤筛查、术后及预后评估等的广泛应用。

Description

用于结直肠癌和/或腺瘤诊断的DNA甲基化标志物、方法和试 剂盒
技术领域
本发明属于基因检测领域，涉及一种用于结直肠癌和/或腺瘤诊断的DNA甲基化标志物，具体涉及一种用于结直肠癌和/或腺瘤早期诊断、检测或筛查的DNA甲基化 标志物、方法和试剂盒。
背景技术
结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是目前全世界致死率非常高的一种恶性肿瘤， 其是在环境或遗传等多种致癌因素作用下引起结肠粘膜上皮发生的恶性病变。大部分结直肠癌来源于腺瘤(一种癌前病变)，从腺瘤发展到癌需5～7年。虽然结直肠癌可 防可治，但是很多患者确诊时已发展到中晚期，早期诊断率仅10-15％。有报道显示， 早期大肠癌术后存活率达90-95％以上，而晚期则只有5％。每年进行便隐血检测，可 使结直肠癌死亡率降低33％。粪便中含有微量的来源于人类肠道表皮脱落细胞的核酸， 对这些核酸的多靶标检测可以有效的预示恶变的信号。以Cologuard为代表的粪便 DNA检测技术可以前瞻性的筛查肠癌(92％灵敏度，84％特异性)，其已经于2014 年获得FDA批准用于肠癌筛查，并且已经列入NCCN肠癌筛查指南和美国癌症预防 计划。
传统的甲基化检测包括甲基化特异性PCR(MSP)、甲基化特异性荧光PCR法(methylight)及亚硫酸氢盐测序法。MSP及methylight是通过对样本DNA进行亚硫酸 盐处理，在保留甲基化胞嘧啶的同时将非甲基化胞嘧啶转化为胸腺嘧啶；再分别通过 甲基化/非甲基化特异性的引物来进行PCR，配合琼脂胶电泳后显影或使用荧光PCR 发光法来检测样本DNA中的甲基化程度。亚硫酸盐测序同样先对样本DNA进行亚硫 酸盐处理，并用通用引物(不含有CpG岛，因此可用于同时扩增甲基化模板及非甲基 化模板)进行PCR扩增；再将扩增产物进行测序，根据甲基化序列与非甲基化序列的 差异来识别样本DNA中的甲基化位点及程度。MSP及methylight法使用的甲基化引 物有一定概率通过错配而扩增非甲基化模板：理论上，单个引物含有的CpG序列不会 超过3个，因此非甲基化模板的一对引物至多只有6个碱基位点与甲基化引物不匹配， 而由于甲基化检测的样本是甲基化模板与非甲基化模板的混合物，且非甲基化模板通 常占到总模板量的90％以上，故MSP及methylight存在较高假阳性概率的缺陷；而 亚硫酸氢盐测序法成本高、通量低、操作繁琐，不利于广泛应用于早期诊断及筛查。 因此，提供一种新的检测结直肠癌和/或腺瘤基因DNA甲基化水平的方法显得尤为重 要。
发明内容
为克服现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种用于诊断结直肠癌和/或腺瘤的生 物标志物、试剂盒及方法，所述试剂盒包含能够鉴别特征性SFRP1基因和/或其甲基 化状态的试剂，根据受试者生物学样品中特征性SFRP1基因和/或其甲基化状态，判 断所述受试者是否患有结直肠癌和/或腺瘤或者预测受试者患结直肠癌和/或腺瘤的风 险。
本发明的目的是提供一种用于结直肠癌和/或腺瘤早期诊断、检测或筛查的DNA甲基化标志物、方法和试剂盒。
在本发明的第一方面，提供了一种与结直肠癌和/或腺瘤相关的DNA甲基化标志物，所述的DNA甲基化标志物包括SFRP1基因的CpG位点，所述SFRP1基因的核 苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述CpG位点包括SEQ ID NO.1第133位至第139位核苷酸片段中的 CpG位点中的至少一个。进一步优选地，所述生物标志物是指SEQ ID NO.1所示序 列中的第133位、第135位和第138位胞嘧啶C的甲基化，详见下划线部分。
在本发明的第二方面，提供了一种本发明第一方面所述的DNA甲基化标志物在 用于结直肠癌和/或腺瘤相关方面诊断或非诊断的应用。
在本发明的第三方面，提供了一种检测和/或靶向本发明第一方面所述的DNA甲基化标志物的物质在制备用于诊断结直肠癌和/或腺瘤的产品中的应用。
在本发明的第四方面，提供了一种用于扩增本发明第一方面所述的DNA甲基化 标志物的引物对。在一个具体实施方式中，所述的引物对用于扩增SEQ ID No.1所示 的核苷酸区段。
在一个具体实施方式中，所述引物对包括：上游引物SFRP1-F1:5’ -GGTGTTGAGTCGCGTTTG-3’(SEQ ID No.3)；和/或下游引物SFRP1-R1: 5-GAACCGCACTCGTTACCA-3’(SEQ ID No.4)。
在本发明的第五方面，提供了一种靶向本发明第一方面所述的DNA甲基化标志 物的探针。
在一个具体实施方式中，所述探针的序列如SEQ ID No.7所示：TTT[C]G[C]GT [C]GGTGACGGA(SEQ ID No.7)，[X]表示碱基可被锁核酸修饰，X为C。
锁核酸是一种寡核苷酸衍生物，和普通寡核苷酸分子区别在于其结构中含有一个或多个2’-O，4’-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖核苷酸单体，核糖的2’-O位和4’-C 位通过亚甲基桥连接起来，成环形。本发明采用的锁核酸-MS-HRM检测方法，就是 在针对SEQ ID No.1所设计的PCR探针中添加至少一个锁核酸修饰，具体数量可能为 一个、二个、三个、四个、五个或六个等。本发明在引物或探针位点引入锁核酸修饰， 一方面增加上游引物(A/T含量较高且重复)的TM值，解决了以往根据PCR所设计 的双端引物TM值不匹配的问题；另一方面可同时提高探针的特异性及扩增效率。通 过调整探针中锁核酸修饰的位点和数量，即使很低丰度的甲基化也呈现很明显的峰值 信号。证实该位点确实存在鉴别部分肠癌和/或腺瘤特征的能力。
在本发明的第六方面，提供了一种诊断结直肠癌和/或腺瘤的产品。在一些优选实施方式中，所述产品含有上文所述的扩增引物对和/或探针。
在本发明的第七方面，提供了一种检测本发明第一方面所述的DNA甲基化标志 物的方法，包括以下步骤：
1)从样品中提取基因组DNA；
2)使用亚硫酸盐对步骤1)得到的DNA进行转化处理，得到转化产物；
3)使用本发明第四方面所述的引物对对步骤2)得到的转化产物进行扩增，得到扩增产物；及
4)向扩增产物中加入本发明第五方面所述的探针，检测步骤3)中获得的扩增序列中本发明第一方面所述的DNA甲基化标志物的甲基化情况。
在一个具体实施方式中，所述样品选自：粪便、血液(血浆、血清、全血、分离 的血细胞、从血液中分离的细胞)、结直肠病理组织(组织学切片、石蜡包埋的组织)、 结肠流出物、体液、尿及其组合；优选地为粪便。
在一个具体实施方式中，本发明第七方面的方法还包括在步骤1)之前保存样品的步骤。所述保存样品的步骤包括将样品置于样品保存液中。在一些实施方式中，所 述样品保存液至少包括：醋酸钠0.1M、氯化钠0.5M、EDTA 50mM、SDS 1.4％(质 量百分比)以及适量醋酸，所述醋酸用于将所述样品保存液的pH调节至5.5。
在一个具体实施方式中，本发明第一方面所述的DNA甲基化标志物所在序列为SEQ ID No.1所示的序列。在所述DNA甲基化修饰转化试剂的作用下，所述DNA甲 基化标志物所在序列转化为SEQ ID No.2所示的序列：
其中下划线处碱基 为所述DNA甲基化标志物的确切位点。步骤3)中扩增产物的序列如SEQID No.2 所示。
在一个具体实施方式中，步骤4)中的检测可采用本领域任何适宜的方法进行检测，包括但不限于是以下方法的至少任意一种：TaqMan-PCR检测、甲基化特异性PCR 法MSP、亚硫酸盐处理后测序法BSP、焦磷酸测序、高分辨熔解曲线分析HRM、质 谱-荧光共振能量转移法MS-FRET、甲基化特异酶限制性酶切法、核酸质谱分析 MassArray、Sanger测序、二代基因测序法NGS、扩增片段长度多态性分析AFLP、限 制性片段长度多态性分析RFLP、LUMA法(Luminometric Methylation Assay)、酶联 免疫吸附测定ELISA、长散在重复序列法(LongInterspersed Nuclear Elements)和 Cold-PCR法。优选地，步骤4)中的检测采用TaqMan-PCR或MS-HRM检测方法。 更优选地，所述步骤4)中的检测采用MS-HRM检测方法。更优选地，所述步骤4) 中的检测采用锁核酸-MS-HRM检测方法，其中步骤3)中使用的扩增引物为锁核酸修 饰的引物。
在本发明的第八方面，提供了一种诊断结直肠癌和/或腺瘤的产品。在一些优选实施方式中，所述产品为检测本发明第一方面所述的DNA甲基化标志物的试剂盒，其 包括本发明第一方面所述的DNA甲基化标志物的PCR扩增试剂。在一些具体实施方 式中，所述的DNA甲基化标志物的试剂盒包括样品DNA提取试剂、DNA甲基化修 饰转化试剂以及本发明第一方面所述的DNA甲基化标志物的PCR扩增试剂。
在一个具体实施方式中，所述的PCR扩增试剂包括本发明第四方面所述的引物对，以及任选地，本发明第五方面所述的探针。在一个具体实施方式中，所述的试剂盒还 包括荧光定量PCR试剂。
在本发明的第九方面，提供了一种样品保存液，其包括醋酸钠0.1M、氯化钠0.5M、EDTA 50mM、SDS 1.4％(质量百分比)，pH5.5。
附图说明
图1显示了按照实施例1的方法检测SFRP1基因中DNA甲基化标志物的检测结 果及绘制的ROC曲线。
具体实施方式
参考以下本申请的优选实施方案的详述以及包括的实施例可更容易地理解本公开内容。
除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本申请所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。
如本文所用术语“由…制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包 括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。
连接词“由…组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相 关的常规杂质除外。当短语“由…组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在 主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所 述权利要求之外。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限 优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任 何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。 例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1 至3”、“1-2”、“1-2和4-5”、“1-3和5”等。当数值范围在本文中被描述时， 除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
为了实现早期结直肠癌和/或腺瘤的诊断、筛查与风险预测，本发明人通过大量实验发现，SFRP1基因中的甲基化位点与结直肠癌和/或腺瘤关系密切。具体地，本发明 人发现了一组SFRP1基因中的DNA甲基化CpG位点，并设计出针对这组CpG位点 的引物对、探针和检测方法。进一步，使用临床样品检验发现，在保证特异性的同时， 本方法检测结直肠癌和/或腺瘤的灵敏度40.74％以上，检测早期结直肠癌的特异性更 是高达93.33％以上。因此，所述SFRP1基因中的DNA甲基化位点可以作为结直肠癌 和/或腺瘤早期诊断、检测或筛查的DNA甲基化标志物。
甲基化标志物
本发明提供了一种用于结直肠癌和/或腺瘤早期诊断、检测或筛查的DNA甲基化标志物，所述标志物是SFRP1基因中的CpG位点在SEQ ID NO.1所示序列中，所述 SEQ IDNO.1的序列：
本申请中的“甲基化”是指从活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)上将甲基 催化转移到其他化合物的过程。甲基化是蛋白质和核酸的一种重要的修饰，调节基因 的表达和关闭，与癌症、衰老等许多疾病密切相关。最常见的甲基化修饰有DNA甲 基化和组蛋白甲基化，本发明涉及SFRP1基因的DNA甲基化。脊椎动物的DNA甲 基化一般发生在CpG位点(胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点，即DNA序列中胞嘧啶后紧连 鸟嘌呤的位点)。经DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DMT)催化胞嘧啶转 化为5-甲基胞嘧啶(5mC)。人类基因中约80％-90％的CpG位点已被甲基化，但是在某 些特定区域，如富含胞嘧啶和鸟嘌呤的CpG岛则未被甲基化。这与包含所有广泛表达 基因在内的56％的哺乳动物基因中的启动子有关。1％-2％的人类基因组是CpG群， 并且CpG甲基化与转录活性成反比。本文中，“甲基化”、“DNA甲基化”、“核 酸甲基化”、“基因甲基化”、“SFRP1基因中的DNA甲基化”、“SFRP1基因的DNA甲基化”可以相互替换，均指SFRP1基因中的CpG位点发生甲基化修饰。
其中所述特征性SFRP1基因和/或其内甲基化CpG二核苷酸的存在和/或含量提示所述受试者患有结直肠癌和/或腺瘤或者具有患结直肠癌和/或腺瘤的风险。例如，当 所述特征性SFRP1基因和/或其内甲基化CpG二核苷酸阳性检出个数为2个及以上时， 说明所述受试者可能患有结直肠癌和/或腺瘤或者具有患结直肠癌和/或腺瘤的风险较 高，当所述特征性SFRP1基因和/或其内甲基化CpG二核苷酸阳性检出个数低于2个 时，说明所述受试者可能不患有结直肠癌和/或腺瘤或者具有患结直肠癌和/或腺瘤的 风险较低。
本发明的具体实施方式中，所述SEQ ID NO.1序列在DNA甲基化修饰转化试剂 的作用下，转化为SEQ ID No.2所示的序列：
其中下划线处碱基为 SFRP1基因中DNA甲基化标志物的确切位点，可以用于早期结直肠癌和/或腺瘤的诊 断、筛查与风险预测。
本申请中的“结直肠癌(Colorectal Cancer)”是胃肠道中常见的恶性肿瘤，早期症状不明显，随着癌肿的增大而表现排便习惯改变、便血、腹泻、腹泻与便秘交替、 局部腹痛等症状，晚期则出现贫血、体重减轻等全身症状。结直肠癌生长很慢，潜伏 期较长，93％的结直肠癌来源于腺瘤(一种癌前病变)，从腺瘤发展到癌需5～7年。
引物对
本发明提供了一种用于扩增上述DNA甲基化标志物的引物对。本领域技术人员 可以根据现有技术针对所述标志物、位点和核酸序列设计并选择合适的引物对。
在一优选实施方式中，所述的引物对用于扩增SEQ ID No.1所示的核苷酸区段。
在一优选实施方式中，所述引物对包括：上游引物SFRP1-F1:5’-GGTGTTGAGTCGCGTTTG-3’(SEQ ID No.3)；和/或下游引物SFRP1-R1:5’-GAACCGCACTCGTTACCA-3’(SEQ ID No.4)。
本领域技术人员可以选择合适的内参基因。在一个具体实施方式中，作为内参基因的肌动蛋白ACTIN基因的扩增引物对为：上游引物ACTIN-F:5’-TTTGTTTTTTTGATTAGGTGTTTAAGA-3’(SEQ ID No.5)；和下游引物ACTIN-R: 5’-CACCAACCTCATAACCTTATC-3’(SEQ ID No.6)。
探针
本发明提供了一种靶向上述DNA甲基化标志物的探针。本领域技术人员可以根 据现有技术针对所述标志物、位点和核酸序列设计并选择合适的探针。
在一优选实施方式中，所述探针的序列如SEQ ID No.7所示：5’FAM–TTT[C]G [C]GT[C]GGTGACGGA-BHQ 3’(SEQ ID No.7)。
在一优选实施方式中，靶向内参基因ACTIN基因的探针为：5’VIC-TAATACCTACACCCACAACAC-BHQ 3’(SEQ ID No.8)。
在一个具体实施方式中，所述核酸探针经可检测地标记。
检测上述DNA甲基化标志物的方法
本发明还提供了一种检测上述DNA甲基化标志物的方法，所述方法可用于判断 受试者是否患有结直肠癌或者预测受试者患结直肠癌癌风险等，所述方法包括：
(1)由源自所述受试者的生物学样品获取分离的基因组DNA；
(2)处理所述分离的基因组DNA或其片段，以使其中5’C位未甲基化的胞嘧 啶碱基转化为在杂交性能方面可检测地不同于胞嘧啶的其它碱基，从而获得经处理的 基因组DNA或其片段；
(3)使所述经处理的基因组DNA或其片段与能够鉴别SFRP1基因和/或其甲基 化状态的试剂接触；以及
(4)检测获得的所述生物学样品中所述SFRP1基因和/或其甲基化状态。
所述的方法为体外或离体方法。
步骤(1)中，所述样品可包括所有的临床样品种类，包括瘤性物质或瘤前物质， 例如，可以是选自：粪便、血液(血浆、血清、全血、分离的血细胞、从血液中分离 的细胞)、结直肠病理组织(组织学切片、石蜡包埋的组织)、结肠流出物、体液、 尿及其组合；优选地为粪便。
步骤(2)中，处理所述分离的基因组DNA或其片段包括使用甲基化修饰转化试 剂例如亚硫酸盐、重亚硫酸盐、亚硫酸氢盐和/或酸式亚硫酸盐试剂中的至少一种。
可以使用至少一种试剂或一组试剂处理所述分离的基因组DNA，使得能够区分甲基化和未甲基化的CpG二核苷酸序列。所述分离的基因组DNA可以基于甲基化修饰 转化试剂与胞嘧啶的特异反应，将胞嘧啶转变为尿嘧啶，同时5-甲基胞嘧啶保持不被 修饰。结果，甲基胞嘧啶可被常规的已知分子生物学技术例如扩增和杂交检测到。
步骤(3)中，所述接触还包括加入核酸扩增酶。可利用参比基因用于指示DNA 提取和修饰的质量。所述参比基因可以是本领域已知的各种参比基因，包括但不限于 β-ACTIN、NAPDH、EFBN。在一些优选实施方式中，所述参比基因为ACTIN基因。
步骤(3)中，所述鉴别SFRP1基因和/或其甲基化状态包括能够区分所述SFRP1 基因和/或其内甲基化和未甲基化的CpG二核苷酸(检测SFRP1中甲基化的CpG二核 苷酸的存在)。
在某些实施方式中，所述能够区分SFRP1基因和/或其内甲基化与未甲基化的CpG二核苷酸的试剂包括所述SFRP1的特异性扩增引物，所述SFRP1的特异性扩增引物 包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自SEQ ID NO:3或4所示的核酸序列，以 及它们的互补序列。
在某些实施方式中，所述能够区分SFRP1基因和/或其内甲基化与未甲基化的CpG二核苷酸的试剂还包括针对所述SFRP1的特异性核酸探针，所述核酸探针包含、互补 于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。
步骤(4)中，在确定所述基因的甲基化状态或水平之后，基于SEQ ID NO:1序 列的至少一个CpG二核苷酸序列的甲基化状态或水平，或多个CpG二核苷酸序列的 平均甲基化状态的均值来判断所述受试者是否患有结直肠癌和/或腺瘤，或预测所述受 试者患结直肠癌和/或腺瘤的风险，或对患者的结直肠癌和/或腺瘤进行动态监测，或 在使用药物进行治疗后对药物的疗效进行评估或对耐药性进行监测，或在结直肠癌和 /或腺瘤治疗后的复发及预后进行辅助判断。
常见的检测DNA甲基化的方法包括但不限于：甲基化特异性的PCR (Methylation-specific PCR，MSP)、亚硫酸盐测序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP)、 高分辨率熔解曲线法(High Resolution Melting，HRM)、基因组直接测序法等。
MSP法是用亚硫酸盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿 嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR；然 后通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增 片段，则说明该位点存在甲基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。
BSP法是用亚硫酸盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧 啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部 转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化， 称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率， 这种方法称为BSP-克隆测序法。
HRM法是在非CpG岛位点设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物， 这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸 盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变， 样品中的GC含量发生改变，从而导致熔解温度的变化。
基因组直接测序法是过去一直沿用的DNA甲基化的研究方法，用Maxam-Gilbert化学裂解法对基因组DNA进行处理，并以连接介导的PCR来放大信号强度，然后进 行序列分析。此法是基于5mC在标准的Maxam-Gilbert胞嘧啶化学裂解反应中不被裂 解，故5mC可通过在测序胶上缺少对应于胞嘧啶降解反应产物的一个条带而得以鉴 定。如采用MnO4 -哌啶法，结果则反之；因此在检测5mC时，此两法可提供完全互补 的检测信息。该法与LM—PCR结合后，大大降低了对基因组DNA的需要量(1-2ng)。 当5mC和C同时处于不同DNA分子上的同一位点时，该位点至少要有25％的5mC 才能被N2H4法检测到；MnO4 -法比N2H4法更灵敏。因为这两种基因组DNA化学修饰 法均有抑制DNA聚合酶延伸的特性，无须进行DNA哌啶裂解就可通过基因组直接测 序技术进行甲基化分析。
在一个具体实施方式中，上述方法还包括在步骤(1)之前保存样品的步骤。所 述保存样品的步骤包括将样品置于样品保存液中。所述样品保存液至少包括：醋酸钠 0.1M、氯化钠0.5M、EDTA 50mM、SDS 1.4％以及适量醋酸，所述醋酸用于将所述样 品保存液的pH调节至5.5。
在一个具体实施方式中，步骤(3)中，上述DNA甲基化标志物所在序列为SEQ IDNo.1所示的序列。在所述DNA甲基化修饰转化试剂的作用下，所述DNA甲基化 标志物所在序列转化为SEQ ID No.2所示的序列：
其中下划线处碱基为 所述DNA甲基化标志物的确切位点。步骤3)中扩增得到的序列如SEQID No.2所示。
在一个具体实施方式中，步骤4)中的检测采用选自下组的至少一种方法：TaqMan-PCR检测、甲基化特异性PCR法MSP、亚硫酸盐处理后测序法BSP、焦磷 酸测序、高分辨熔解曲线分析HRM、质谱-荧光共振能量转移法MS-FRET、甲基化特 异酶限制性酶切法、核酸质谱分析MassArray、Sanger测序、二代基因测序法NGS、 扩增片段长度多态性分析AFLP、限制性片段长度多态性分析RFLP、LUMA法 (Luminometric Methylation Assay)、酶联免疫吸附测定ELISA、长散在重复序列法 (Long Interspersed Nuclear Elements)和Cold-PCR法。优选地，步骤4)中的检测采 用TaqMan-PCR检测方法。
在探针位点引入锁核酸修饰，一方面增加上游引物(A/T含量较高且重复)的TM值，解决了以往根据PCR所设计的双端引物TM值不匹配的问题；另一方面可同时提 高上下游引物或探针的特异性及扩增效率。通过调整扩增探针中锁核酸修饰的位点和 数量，即使很低丰度的甲基化也呈现很明显的峰值信号。证实该位点确实存在鉴别部 分肠癌特征的能力。
本领域技术人员可以选择其他合适的检测方法，并可以根据现有技术针对本发明提供的SFRP1基因中的甲基化标志物设计并选择合适的检测试剂。
在一些实施方式中，本发明提供的检测上述DNA甲基化标志物的方法，包括以 下步骤：
1)从样品中提取基因组DNA；
2)使用甲基化修饰转化试剂对步骤1)得到的DNA进行转化处理；
3)使用上述引物对对步骤2)得到的转化产物进行扩增，得到扩增产物；
及4)向扩增产物中加入如权利要求6所述的应用中所述的探针，检测步骤3) 中获得的扩增产物中上述DNA甲基化标志物的甲基化情况。
试剂盒
本发明还提供了一种检测上述DNA甲基化标志物的试剂盒，所述试剂盒包含能 够鉴别特征性SFRP1基因和/或其甲基化状态的试剂。在一些实施方式中，所述试剂 盒包括样品DNA提取试剂、DNA甲基化修饰转化试剂以及DNA甲基化标志物的PCR 扩增试剂。
在一个具体实施方式中，所述DNA甲基化修饰转化试剂选自亚硫酸盐、重亚硫 酸盐、亚硫酸氢盐和/或酸式亚硫酸盐试剂中的至少一种。所述试剂可以将DNA的胞 嘧啶残基转化成尿嘧啶，但被甲基化的胞嘧啶残基则不受影响。所述试剂可用于区分 甲基化和未甲基化的CpG二核苷酸序列。
在一个具体实施方式中，所述的PCR扩增试剂包括上述引物对，以及任选地，上 述探针。在一个具体实施方式中，所述的试剂盒还包括荧光定量PCR试剂。
其中所述特征性SFRP1基因和/或其内甲基化CpG二核苷酸的存在和/或含量提示所述受试者患有结直肠癌和/或腺瘤或者具有患结直肠癌和/或腺瘤的风险。例如，当 所述特征性SFRP1基因和/或其内甲基化CpG二核苷酸阳性检出个数为2个及以上时， 说明所述受试者可能患有结直肠癌和/或腺瘤或者具有患结直肠癌和/或腺瘤的风险较 高，当所述特征性SFRP1基因和/或其内甲基化CpG二核苷酸阳性检出个数低于2个 时，说明所述受试者可能不患有结直肠癌和/或腺瘤或者具有患结直肠癌和/或腺瘤的 风险较低。
在一个具体实施方式中，所述试剂盒还包括说明书。
在一个具体实施方式中，所述的试剂盒还包含参比试剂，所述参比试剂包含能够鉴别内参基因和/或其甲基化状态的试剂，所述内参基因可以是ACTIN。
其中所述特征性SFRP1基因和/或其甲基化CpG位点二核苷酸的存在和/或含量 提示所述受试者患有结直肠癌和/或腺瘤或者具有患结直肠癌和/或腺瘤的风险等。
在某些实施方式中，所述能够鉴别特征性SFRP1基因和/或其CpG位点甲基化状 态包括能够区分所述SFRP1基因和/或其至少一个甲基化和未甲基化的CpG二核苷酸。
在一个具体实施方式中，所述结直肠癌由腺瘤进展而来。
用途
本发明提供了检测上述的DNA甲基化标志物在制备用于结直肠癌和/或腺瘤早期诊断、检测或筛查的试剂盒中的用途。
在一个具体实施方式中，所述试剂选自所述的引物对、所述的探针及其组合。
相比于现有技术，本发明提供的SFRP1基因中的新DNA甲基化标志物用于早期 结直肠癌和/或腺瘤的诊断、筛查与风险预测，表现出更高的灵敏度和特异性。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.本发明提供了一种SFRP1基因中的新DNA甲基化标志物，并建立了针对这一 标志物检测早期结直肠癌和/或腺瘤的方法，应用本方法结合TaqMan-PCR技术，可以 仅使用一对引物和探针，实现高特异性高灵敏度的检测结直肠癌和/或腺瘤。
2.本发明使用单基因单引物对的检测方式，靶向的核酸片段不超过300bp，技术简单、操作容易，大大降低了检测成本，易于推广和应用。
3.本发明使用的检测样品来源可以是粪便样品，并配套提供了一种长期保存粪便样品的试剂，适用于实际操作中遇到的不同环境和背景。
4.本发明还可以结合多种检测方法，实际检验时可以多种方法自由组合，还可以结合其他临床检验指标一起分析。
5.本发明的靶标数目相对较少，理论上扩大样品量后的稳定性比其他多靶标检测的稳定性更高，因此作为检测指标更清晰和有代表性。
如本文所用，术语“SFRP1”通常指一种肿瘤抑制基因，编码分泌性卷曲相关蛋 白1(Secreted frizzled-related protein1)。
如本文所用，术语“CpG二核苷酸”通常指一种短的单链DNA分子，其序列包 含一个胞嘧啶脱氧核苷酸(“C”)，紧接着一个鸟嘌呤脱氧核苷酸(“G”)，“p”是指 两者之间的磷酸二酯键链接。富含CpG二核苷酸的DNA区域称为CpG岛。
如本文所用，术语“甲基化状态”通常指DNA序列内一个或多个CpG二核苷酸 处存在或不存在5-甲基胞嘧啶。当分析样品中CpG二核苷酸处的甲基化状态时，本 领域技术人员可以使用定量测定法来确定特定CpG二核苷酸处的甲基化水平(例如百 分比、份数、比率、比例或程度)。因此，术语“甲基化状态”还应被认为是指反映 CpG位置处甲基化程度的值。
如本文所用，术语“患结直肠癌和/或腺瘤风险”通常指对于还没有发展为结直肠癌和/或腺瘤的受试者来说发展结直肠癌和/或腺瘤的概率。所述受试者的结直肠可以 是健康的，也可以是受损的。所述患结直肠癌和/或腺瘤风险可以用本领域中的任何可 行方法进行检测，也可以根据受试者生物学样品中的特征性SFRP1基因的甲基化状态 检测患结直肠癌和/或腺瘤风险。例如，当特征性SFRP1基因的甲基化水平升高时， 所述受试者患结直肠癌和/或腺瘤的风险可以是高的；当特征性SFRP1基因的甲基化 水平与健康人群没有显著性差异时，所述受试者患结直肠癌和/或腺瘤的风险可以是低 的。
如本文所用，术语“扩增引物”通常指能识别被检测序列并与其杂交的DNA片 段，所述引物在合适条件下能被核酸聚合酶有效地延伸。所述引物序列的设计是本领 域技术人员已知的，其应包括至少一对核苷酸序列。
如本文所用，术语“探针”通常指能够特异地结合到靶序列上的任何分子。探针 可由本领域的技术人员合成，也可以从合适的生物样品中制备。作为举例，探针可以 是指由聚核苷酸构成的结构，其含有与靶区域中的核酸序列互补的核酸序列。探针的 聚核苷酸区可以由DNA、和/或RNA、和/或合成的核苷酸类似物构成。探针经过特殊 设计可被标记(例如，荧光剂、猝灭剂组成成分等)，例如Taqman探针、FRET探 针、分子信标等，其可用于检测所述探针与样品中的靶区域之间的杂交。在某些情形 中，所述的核酸探针的杂交区域可以与靶序列完全互补，也可以不需要完全的互补。
如本文所用，术语“可检测地标记”通常指在核酸序列中并入可检测的标记物或可检测标记物的核酸序列。标记核酸的各种方法是本领域已知的，包括但不限于：荧 光标记、化学发光、生物素基团、放射性同位素、放射性核素等。
如本文所用，术语“5’C位未甲基化的胞嘧啶碱基”通常指CpG二核苷酸中5’ C位未甲基化的胞嘧啶碱基。
实施例
下面结合说明书附图，进一步对本申请的优选实施例进行详细描述，以下的描述为示例性的，并非对本申请的限制，任何的其他类似情形也都落入本申请的保护范围 之中。
实施例1 TaqMan-PCR方法检测粪便样品中的甲基化位点
1.1 DNA样品的提取与转化
用吸附DNA的磁珠从粪便样品中提取出人源SFRP1和ACTIN基因片段。其中 SFRP1作为检测靶点，ACTIN作为内参。
样品保存液配方：
成份 醋酸钠 氯化钠 EDTA SDS
浓度 0.1M 0.5M 50mM 1.4％
用醋酸调节pH至5.5。
核酸提取具体操作如下：
(1)样品用电子天平配平，样品和配平管重量相差在±0.01g之间；
(2)离心：10000g离心10min；
(3)过滤：用滤网将上层液体过滤至新的50mL离心管中备用。
(4)取15mL离心管，每管中加入5mL吸附剂，5000g离心10min，然后用真空 泵吸弃上层液体。
(5)向15mL离心管加入5mL样品，涡旋混匀后5000g离心10min。
(6)把上层液体转移至新的15mL离心管中，并向管中加入1mL去垢剂和100 μL蛋白酶K，涡旋混匀30s后70℃孵育15min。
(7)孵育完成后擦净离心管上的水，向管中加入2mL 1-溴-3-氯丙烷。涡旋混匀 后5000g离心10min。
(8)转移上层清夜至新的15mL离心管中，并向管中加入4mL异丙醇和80μL 磁珠(磁珠使用前振荡混匀)。涡旋混匀30s后放至旋转混匀仪上混匀5min。
(9)将样品管放至磁力架上静置2min，待磁珠吸附到管壁后用真空泵吸弃废液。
(10)将离心管转移至管架，向其中加入5mL洗涤液1，涡旋振荡30s，尽量使 磁珠分散。将离心管放置于磁力架上2min，待磁珠吸附至管壁后用真空泵吸弃废液。
(11)重复步骤(10)。
(12)向离心管中加入5mL洗涤液2，涡旋振荡30s。将离心管放置于磁力架上2min，待磁珠吸附至管壁后用真空泵吸弃废液。
(13)将离心管转移至管架，向其中加入1mL洗涤液3，用移液器反复吹打磁珠 使磁珠分散后转移所有液体至1.5mL离心管中。将离心管放置于磁力架上2min，待 磁珠吸附完全后用真空泵吸弃废液。尽量把废液去除干净，该步骤对于核酸纯度影响 较大。
(14)将离心管和磁力架转移至生物安全柜中开盖晾干10min。
(15)洗脱：向离心管中加入80μL洗脱液，涡旋混匀后置于恒温金属浴1300rpm 65℃孵育5min。孵育完成后将样品管13500rpm离心30s，将液体收集到管底。将离 心管转移至磁力架上静置5min，得到提取的基因组DNA，转移DNA溶液至新的1.5mL 离心管中，样品-20℃保存。
然后，将提取的DNA进行亚硫酸盐转化，具体步骤如下：
(1)向CT转化试剂中加入900μL水、300μL M-稀释缓冲液和50μLM-溶解 缓冲液，配置成工作液。
(2)将提取的基因组DNA从冰箱取出解冻。取200μL PCR管，按20μL DNA 加130μLCT转化试剂的比例混合。混合好的样品运行如下程序：
98℃ 10分钟
64℃ 2.5小时
4℃ 保存时间在20小时以内
(3)把吸附柱放入收集管。向吸附柱中加入600μL M-结合缓冲液，并把(2) 中反应液全部转移至吸附柱中，上下颠倒10次，混匀后18000g离心30s；
(4)弃废液，向吸附柱中加入100μL M-洗涤缓冲液，混匀后18000g离心30s；
(5)弃废液，向吸附柱中加入200μL M-脱磺化缓冲液，直立放置室温孵育20min，18000g离心30s；
(6)弃废液，向吸附柱中加入200μL M-洗涤缓冲液，18000g离心30s，弃废液；
(7)重复步骤(6)；
(8)将吸附柱转移至1.5mL离心管中，向吸附柱中加入50μL洗脱缓冲液， 18000g离心30s，离心管中即为转化好的DNA。
如此，得到亚硫酸盐转化后的DNA样品。
1.2 TaqMan-PCR方法检测甲基化位点
设计结直肠癌基因转化后的特异性扩增引物，设计引物扩增的DNA片段不超300bp。本实施例中设计了针对SFRP1的1对引物，并根据其间的甲基化位点设计了 对应的探针，具体的引物及探针信息如下：
扩增引物 引物序列(5’-3’) SEQ ID No.
SFRP1 1F GGTGTTGAGTCGCGTTTG 3
SFRP1 1R GAACCGCACTCGTTACCA 4
ACTIN F TTTGTTTTTTTGATTAGGTGTTTAAGA 5
ACTIN R CACCAACCTCATAACCTTATC 6
探针名称 探针序列 SEQ ID No.:
SFRP1-1 5′FAM-TTT[C]G[C]GT[C]GGTGACGGA-3′BHQ 7
ACTIN 5′VIC–TAATACCTACACCCACAACAC-3′BHQ 8
每对引物的上下游引物等摩尔混合，得到相应的扩增引物混合液，每对扩增引物混合液的最终工作浓度为5μM。探针的工作液浓度为5μM。
以实施例1.1中得到的亚硫酸盐转化后的DNA样品为模板，利用上述扩增引物 和探针分别进行PCR扩增反应。具体操作步骤如下：
配制检测反应体系，PCR反应体系中组分如下：
KAPA PROBE FORCR Universal(KM4301) 10μL
引物对 0.1～1.0μmol
探针 0.1～1.0μmol
样品DNA模板 8.8μL
超纯水补足总体积 20μL
实时荧光PCR扩增反应条件优选为：
第一阶段：98℃3min；
第二阶段：95℃10s，58℃30s，50个循环；
每个循环收集荧光信号。
实施例2探针SFRP1检测临床样品的特异性验证
本实施例的样品为57例临床样品，预测值＝1/(1+EXP(-(2.11-0.0432* (SFRP1-actin))))，预测值即为靶标SFRP1-探针扣减actin的相对值，当预测值＞0.5为 阳性，预测值＜0.5为阴性，具体数据如下表所示：
/>
/>
如上表所示，根据本发明提供的SFRP1基因的DNA甲基化标志物的检测方法检 测腺瘤，结果显示，在27例腺瘤中，能够检测到11例结果为阳性，检测灵敏度为 11/27*100％＝40.74％；在30例正常人中，检测到2例检测结果为阳性，特异性为 28/30*100％＝93.33％；因此，检测灵敏度为40.74％，特异性为93.33％，远高于目前 常规报道中灵敏度20％。
为了分析比较本发明针对不同病理表型的区分度，利用上述数据进一步绘制了接受者操作特征曲线ROC，ROC曲线结果如图1所示，ROC曲线分析表明，ROC曲面 下面积(AUC值)为0.791，说明该种分类方法是可行的，检测结果的临床疾病分型 的符合度较高。
前述的示例仅是说明性的，用于解释本公开的特征的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实 施例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求并不被 说明本申请的特征的示例的选择限制。如在权利要求中使用的，术语“包括”和其语 意上的变体在逻辑上也包括不同和变化的用语，例如但不限于“基本组成为”或“组 成为”。当需要时，提供了一些数值范围，而这些范围也包括了在其之间的子范围。 这些范围中的变化也对于本领域技术人员也是自明的，且不应被认为被捐献给公众， 而这些变化也应在可能的情况下被解释为被所附的权利要求覆盖。而且在科技上的进 步将形成由于语言表达的不准确的原因而未被目前考虑的可能的等同物或子替换，且 这些变化也应在可能的情况下被解释为被所附的权利要求覆盖。
序列表
<110> 周禾
杨永胜
<120> 用于结直肠癌和/或腺瘤诊断的DNA甲基化标志物、方法和试剂盒
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 252
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttctttttct ccccttgtct ctttcctcct ccccctttta tttatgtatt tttggttttg 60
ttttttaagg ggtgttgagc cgcgtctggt tctagtaaac cgaacccgct cgcgagggag 120
gcgattggct cccgcgccgg tgacggacgt ggtaacgagt gcggctcgcc ccgccgggag 180
ctgattggct gcgcggggcg gctccgaggg ctcggccgta ggagccccgc gcactccagc 240
cctgcagcct cc 252
<210> 2
<211> 252
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tttttttttt ttttttgttt tttttttttt ttttttttta tttatgtatt tttggttttg 60
ttttttaagg ggtgttgagt cgcgtttggt tttagtaaat cgaattcgtt cgcgagggag 120
gcgattggtt ttcgcgtcgg tgacggacgt ggtaacgagt gcggttcgtt tcgtcgggag 180
ttgattggtt gcgcggggcg gtttcgaggg ttcggtcgta ggagtttcgc gtattttagt 240
tttgtagttt tt 252
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtgttgagt cgcgtttg 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaaccgcact cgttacca 18
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tttgtttttt tgattaggtg tttaaga 27
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caccaacctc ataaccttat c 21
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tttcgcgtcg gtgacgga 18
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
taatacctac acccacaaca c 21

Claims (12)

1.检测SFRP1基因的CpG位点甲基化状态的物质在制备用于诊断结直肠癌和/或腺瘤的产品中的应用，所述SFRP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.SFRP1基因的CpG位点作为DNA甲基化标志物在制备用于诊断结直肠癌和/或腺瘤的产品中的应用，或者在制备用于结直肠癌和/或腺瘤相关方面非诊断的应用，所述SFRP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述CpG位点包括SEQ ID NO.1第133位至第139位核苷酸片段中的CpG位点中的至少一个，所述CpG位点中的C在SEQ ID NO.1中以下划线表示如下：
TTCTTTTTCTCCCCTTGTCTCTTTCCTCCTCCCCCTTTTATTTATGTATTTTTGGTTTTGTTTTTTAAGGGGTGTTGAGCCGCGTCTGGTTCTAGTAAACCGAACCCGCTCGCGAGGGAGGCGATTGGCTCCCGCGCCGGTGACGGACGTGGTAACGAGTGCGGCTCGCCCCGCCGGGAGCTGATTGGCTGCGCGGGGCGGCTCCGAGGGCTCGGCCGTAGGAGCCCCGCGCACTCCAGCCCTGCAGCCTCC。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测SFRP1基因的CpG位点甲基化状态的物质为靶向SEQ ID NO.1第133位至第139位核苷酸片段的物质。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测SFRP1基因的CpG位点甲基化状态的物质为扩增引物对，其包括：
上游引物SFRP1-F1:5’-GGTGTTGAGTCGCGTTTG-3’(SEQ ID No.3)；和/或
下游引物SFRP1-R1:5’-GAACCGCACTCGTTACCA-3’(SEQ ID No.4)。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测SFRP1基因的CpG位点甲基化状态的物质为探针，其序列如SEQ ID No.7所示：TTT[C]G[C]GT[C]GGTGACGGA，其中，[C]代表该核苷酸为锁核酸修饰。
7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的诊断包括早期诊断、检测或筛查，评估结直肠癌和/或腺瘤的易感性风险，动态监测，药物疗效评估，耐药监测，复发及预后的辅助判断中的至少一项。
8.用于扩增如权利要求1～3任一项所述的应用中所述的SFRP1基因的CpG位点的引物对，其特征在于，其包括：
上游引物SFRP1-F1:5’-GGTGTTGAGTCGCGTTTG-3’(SEQ ID No.3)；和/或
下游引物SFRP1-R1:5’-GAACCGCACTCGTTACCA-3’(SEQ ID No.4)。
9.用于靶向如权利要求1～3任一项所述的应用中所述的SFRP1基因的CpG位点的探针，其特征在于，其序列如SEQ ID No.7所示：TTT[C]G[C]GT[C]GGTGACGGA，其中，[C]代表该核苷酸为锁核酸修饰。
10.一种诊断结直肠癌和/或腺瘤的产品，其特征在于，所述产品含有如权利要求8所述的扩增引物对和/或如权利要求9所述的探针。
11.根据权利要求10所述的产品，其特征在于，所述的产品为试剂、试剂盒、基因芯片、核酸膜条或检测系统。
12.一种检测如权利要求1～3任一项所述的应用中所述的SFRP1基因的CpG位点甲基化状态的方法，包括以下步骤：
1)从样品中提取基因组DNA；
2)使用甲基化修饰转化试剂对步骤1)得到的DNA进行转化处理，得到转化产物；
3)使用权利要求8所述的扩增引物对对步骤2)得到的转化产物进行扩增，得到扩增产物；及
4)向扩增产物中加入如权利要求9所述的探针，检测步骤3)中得到的扩增产物中所述的SFRP1基因的CpG位点的甲基化状态。
CN202210280504.8A 2022-03-21 2022-03-21 用于结直肠癌和/或腺瘤诊断的dna甲基化标志物、方法和试剂盒 Pending CN116814778A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210280504.8A CN116814778A (zh) 2022-03-21 2022-03-21 用于结直肠癌和/或腺瘤诊断的dna甲基化标志物、方法和试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210280504.8A CN116814778A (zh) 2022-03-21 2022-03-21 用于结直肠癌和/或腺瘤诊断的dna甲基化标志物、方法和试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116814778A true CN116814778A (zh) 2023-09-29

Family

ID=88113262

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210280504.8A Pending CN116814778A (zh) 2022-03-21 2022-03-21 用于结直肠癌和/或腺瘤诊断的dna甲基化标志物、方法和试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116814778A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2352455C (en) Methods for stool sample preparation
US20080145852A1 (en) Methods and compositions for detecting adenoma
US20180258487A1 (en) Composite biomarkers for non-invasive screening, diagnosis and prognosis of colorectal cancer
WO2022022386A1 (zh) 早期结直肠癌和腺瘤的dna甲基化标志物、检测其的方法及其应用
US20150361502A1 (en) Method for screening cancer
CN110484621B (zh) 一种肝癌早期预警的方法
CN113355415B (zh) 用于食管癌诊断或辅助诊断的检测试剂及试剂盒
US20180334723A1 (en) Unbiased dna methylation markers define an extensive field defect in histologically normal prostate tissues associated with prostate cancer: new biomarkers for men with prostate cancer
CN110904231A (zh) 一种用于辅助诊断肝癌的试剂及其在制备试剂盒中的用途
CN107630093B (zh) 用于诊断肝癌的试剂、试剂盒、检测方法及用途
CN114891886B (zh) 用于诊断膀胱癌的核酸产品、试剂盒及应用
KR102637032B1 (ko) 특정 유전자의 CpG 메틸화 변화를 이용한 방광암 진단용 조성물 및 이의 용도
US11535897B2 (en) Composite epigenetic biomarkers for accurate screening, diagnosis and prognosis of colorectal cancer
CN116064786A (zh) 一种用于检测胃癌的组合物，试剂盒及其用途
CN116814778A (zh) 用于结直肠癌和/或腺瘤诊断的dna甲基化标志物、方法和试剂盒
US11542559B2 (en) Methylation-based biomarkers in breast cancer screening, diagnosis, or prognosis
CN117344010B (zh) 用于诊断胃癌的dna甲基化生物标记物、试剂盒及用途
EP2978861A2 (en) Unbiased dna methylation markers define an extensive field defect in histologically normal prostate tissues associated with prostate cancer: new biomarkers for men with prostate cancer
CN115094139B (zh) 检测甲基化水平的试剂在制备膀胱癌诊断产品中的应用以及膀胱癌诊断试剂盒
CA2517983C (en) Method for the identification of colorectal tumors
CN115838798A (zh) 检测甲基化水平的试剂在制备结直肠癌诊断产品中的应用
CN116179694A (zh) 检测甲基化水平的试剂在制备前列腺癌诊断产品中的应用以及前列腺癌诊断试剂盒
CN115838799A (zh) 检测基因甲基化的试剂在制备诊断结直肠癌的产品中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination