CN102732516B

CN102732516B - 一种多重巢式甲基化特异性pcr扩增引物及其使用方法与应用

Info

Publication number: CN102732516B
Application number: CN201210248105.XA
Authority: CN
Inventors: 孔北华; 张青
Original assignee: Qilu Hospital of Shandong University
Current assignee: Qilu Hospital of Shandong University
Priority date: 2012-07-17
Filing date: 2012-07-17
Publication date: 2014-01-01
Anticipated expiration: 2032-07-17
Also published as: CN102732516A

Abstract

本发明公开了一种多重巢式甲基化特异性PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ IDNO.1～42所示的引物。所述多重巢式甲基化特异性PCR扩增引物的使用方法，步骤如下：（1）取患者血清提取DNA；（2）取DNA溶液，进行甲基化修饰；（3）采用引物配合PCR工作液进行检测；（4）结果判断：取所得产物，琼脂糖凝胶电泳，凝胶放置凝胶成像系统进行拍照分析，肉眼判断反应结果。本发明的多重巢式甲基化特异性PCR（MN-MSP）检测技术，最大限度地克服了血清游离DNA微量及单一甲基化标记物敏感性、特异性不高的缺点，实现了对7个目的基因甲基化状态的高效检测，具有特异性强、准确性高等优点，可作为一种有效的早期卵巢癌诊断检测手段。

Description

一种多重巢式甲基化特异性PCR扩增引物及其使用方法与应用

技术领域

本发明涉及一种多重巢式甲基化特异性PCR（MN-MSP）扩增引物及其使用方法，以及在检测卵巢癌，特别是早期卵巢癌中的应用。

背景技术

目前，卵巢癌发病率位居女性生殖系统恶性肿瘤第三位，病死率居第一位，占所有因癌症死亡女性患者3％。卵巢癌90%以上为上皮性卵巢癌，发病隐匿，临床确诊时约80％患者疾病已为晚期，预后差。晚期卵巢癌（FIGOⅡ-Ⅳ期）患者5年生存率仅为30～45％，而早期卵巢癌（FIGOⅠ期）患者5年生存率高达90％以上。因此，除积极寻找新的有效的治疗方式外，探讨卵巢癌发生发展的生物学机制，研发新型卵巢癌早期诊断技术迫在眉睫。

现有技术中尚无简便有效的、精确的、可常规用于卵巢癌早期诊断的检测方法。CA125是目前普遍使用的卵巢癌标志物，但仅有50～60％的I期卵巢癌患者CA125水平升高，且其他疾病如卵巢子宫内膜异位囊肿等亦可引起CA125水平升高，故其敏感性和特异性较差，卵巢癌阳性预测值仅有10%~35%。总体而言，对于血清CA125检测、经阴道超声探查等传统的早期诊断方法单一或联合应用，目前均无证据显示可降低人群的卵巢癌发病率和（或）病死率。其主要原因在于这些方法的假阴性或假阳性率均过高，敏感性和特异性达不到临床需要。

DNA甲基化即未甲基化胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(Cytosine-phosphate-Guanosine,CpG)二核苷酸发生甲基化，是重要的表观遗传学机制，是肿瘤抑制基因失活的关键机制之一，在某些情况下可能是唯一的机制。目前研究已证实原发性卵巢癌可有多种抑癌基因的甲基化，提示卵巢癌显示出CpG岛甲基化表型。作为癌症发生的早期事件，抑癌基因DNA异常甲基化检测可以在患者出现临床表现或者影像学证据之前做到分子诊断，为卵巢癌的早期诊断提供了新的途径。

目前，研究已证实癌症患者血清富含肿瘤DNA（Serum free circulating DNA，SfcDNA），可用于癌症分子生物学诊断。使用体液标本（血清、尿液等）检测其中游离肿瘤特异DNA在其他癌症如肺癌、头颈部肿瘤、前列腺癌等已被证实可行。更为重要的是，肿瘤游离DNA不仅在晚期转移癌症患者血清内存在，对于早期患者，血清内同样可检测到肿瘤游离DNA，研究认为其来源于侵入体内循环但无浸润机体实质器官能力的肿瘤细胞，或是由凋亡肿瘤细胞释放进入体内循环。因此，利用血清游离DNA（SfcDNA）进行癌症的早期分子生物学诊断是当前研究的一大热点。

虽然国内外研究者利用卵巢癌患者血清游离DNA甲基化检测，在卵巢癌早期诊断中的研究取得了令人振奋的进步，但是在实际操作过程中存在以下局限性：1、血清游离DNA微量（正常人浓度平均为：0.03ug/ml，肿瘤患者浓度平均为0.18ug/ml），并且多以小片段形式存在，大大增加了提取的难度，降低了临床检测的敏感性和特异性；2、目前DNA甲基化的主要研究方法为甲基化特异性PCR（Methylation Specific PCR,MSP），其操作繁琐，DNA经亚硫酸氢盐修饰后丢失严重，一般只用于单个基因检测，特异性和敏感性均较低；3、卵巢癌抑癌基因失活的不确定性及血清游离DNA的局限性，导致单一卵巢癌甲基化标记物检测无法满足临床要求。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种多重巢式甲基化特异性PCR（MN-MSP）扩增引物及其使用方法，以及其在检测卵巢癌，特别是早期卵巢癌中的应用。本发明的多重巢式甲基化特异性PCR（MN-MSP）检测技术，在国内外首次将多重PCR（Multiplex PCR）、巢式PCR（NestedPCR）与甲基化特异性PCR（MSP）相结合，利用课题组开发的引物设计软件设计全新的PCR引物，并模拟整个PCR过程，避免PCR过程中引物二聚体、发卡结构等的形成，同时创新性的应用两步爬坡缓慢退火（Ramping anneal）的方法，保证引物与模板结合的特异性，最大限度地克服了血清游离DNA微量及单一甲基化标记物敏感性、特异性不高的缺点，可实现最低达1/8000ug DNA（约相当于19个基因组DNA）中7个目的基因甲基化状态的高效检测，并经临床标本反复验证，对现有检测技术提供了有力补充，成为一种有效的早期卵巢癌诊断检测手段。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种多重巢式甲基化特异性PCR扩增引物，包括针对7种目的基因APC,RASSF1A,CDH1,RUNX3,TFPI2,SFRP5和OPCML的引物组，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～42所示，如表1所示。

表1.多重巢式甲基化特异性PCR（MN-MSP）检测引物

（说明：引物中存在简并位点（degeneration）,即Y=C/T,R=G/A）

表中所述多重巢式甲基化特异性PCR扩增引物可以用于早期卵巢癌的诊断，步骤如下：

（1）血清游离DNA的提取：取患者血清200ul，采用QIAamp MinElute Virus SpinKit(QIAGEN,57704)试剂盒提取，最终所得DNA溶液80ul；

（2）血清游离DNA甲基化修饰：取40ul DNA溶液，采用QIAamp EpiTect BisulfiteKits(QIAGEN,59104)试剂盒修饰，最终所得修饰后DNA溶液80ul；

（3）PCR检测：

Step1：PCR反应体系------Outside：

模板：1ul------修饰后DNA溶液；

引物：1ul------7种目的基因Outside Primer（如SEQ ID NO.29～42所示）按照等比例混合；

MIX：10ul；

Enhancer：2ul；

ddH₂O：6ul；

PCR反应条件------Outside：

Step2：PCR反应体系------Inside：

模板：1ul------取Step1产物DNA1ul；

引物：1ul------7种目的基因Inside Primer（分别为甲基化引物、非甲基化引物）（如SEQID NO.1～28所示）按照等比例混合；

MIX：10ul；

Enhancer：2ul；

ddH₂O：6ul；

PCR反应条件------Inside：

（4）PCR结果判断：取Step2所得产物10ul，4%琼脂糖凝胶（单位g/ml）中150v电泳90min，凝胶放置凝胶成像系统进行拍照分析，肉眼判断反应结果：

①若M体系中出现任一阳性条带，判定结果为阳性，则证明该病人极有可能患有卵巢癌；

②若M体系中无阳性条带，U体系中出现任一阳性条带，判定结果为阴性，则证明该病人未患卵巢癌；

③若M、U体系中均无阳性条带，判定送检血清不合格，需重新送检。

本发明检测的特异性和敏感性经实验及大量的临床血清样本检测和统计学计算验证，达到临床诊断要求。本发明的主要原理为：

（1）DNA甲基化及甲基化特异性PCR(Methylation specific PCR，MSP)的原理：DNA甲基化即未甲基化胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(Cytosine-phosphate-Guanosine,CpG)二核苷酸发生甲基化，是最常见的一种表观遗传学修饰，主要发生位点是CpG岛。CpG位点在基因组中出现的频率远低于基因组中其它双核苷酸序列，但在某些区域CpG位点密度很高，可达均值的5倍以上，形成富含鸟嘌呤和胞嘧啶的CpG岛，CpG岛常位于基因的启动子区和第1外显子区，长约1kb。在正常人基因组中，CpG岛外的CpG位点通常是甲基化的，而CpG岛中的CpG位点通常处于非甲基化状态，这种甲基化的形式在随细胞分裂稳定的遗传。当肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG位点非甲基化程度增加,而CpG岛中的CpG位点呈高甲基化状态，导致染色体螺旋程度增加，转录抑制，基因表达缺失。甲基化特异性PCR(Methylationspecific PCR，MSP)是目前研究甲基化最敏感的实验技术之一，能发现最低约50pgDNA的甲基化，其基本原理为：单链DNA经过亚硫酸氢盐修饰后，所有未甲基化的胞嘧啶(cytosine，C)脱氨转变为尿嘧啶(uracil，U)，而CpG位点中甲基化的胞嘧啶保持不变，因此分别设计两对针对甲基化和非甲基化序列的引物，通过PCR扩增即可将甲基化（Methylation，M）与非甲基化（Unmethylation，U）DNA序列区分开来。

（2）筛选卵巢癌中甲基化频率高的基因作为候选基因：目前国内外关于卵巢癌甲基化方面的研究主要针对于卵巢癌组织，课题组筛选出7个在卵巢癌组织中甲基化频率较高的抑癌基因作为进一步研究对象，7个目的基因详细信息见表2。

表2

（3）多重PCR（Multiplex PCR）与巢式PCR（Nested PCR）的原理：多重PCR又称多重引物PCR或复合PCR，是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其特点是多个目的基因在同一反应管内同时检出，大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息。巢式PCR是指利用两套PCR引物（巢式引物）对目的基因进行两轮PCR扩增反应，其优点是降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的模板很少）增加了检测的敏感性，又有两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性。这两种PCR方法在多种病原微生物的同时检测或鉴定、某些遗传病及肿瘤相关基因的分型鉴定等方面有广泛的临床应用。

（4）多重巢式甲基化特异性PCR（MN-MSP）的构建及原理：基于甲基化特异性PCR、多重PCR与巢式PCR的原理及血清游离DNA微量、片段小的特点，课题组利用开发的引物设计软件设计全新的PCR引物，并模拟整个PCR过程，最大限度地避免PCR过程中引物二聚体、发卡结构等的形成，保证检测的准确性、灵敏性和特异性。首先，针对7个目的基因CpG岛中不含CpG位点的区域设计引物，富集目的基因特定的CpG区域，设计的7对OutsidePrimer针对亚硫酸氢盐修饰后的甲基化和非甲基化序列；其次，针对富集目的基因特定的CpG区域，设计针对甲基化（Methylation，M）与非甲基化（Unmethylation，U）序列的两套引物，用于特异性检测对应CpG位点的甲基化状态。反复优化PCR条件，创新性地采用两步爬坡缓慢退火（Ramping anneal）的方法，保证引物与模板结合的特异性，并最终在4种卵巢癌细胞系（A2780、HO8910、OVCAR3、SKOV3）中验证所构建的多重巢式甲基化特异性PCR（MN-MSP）体系。

附图说明

图1：在不同DNA模板量条件下，以TFPI2基因为目的基因的PCR结果示意图。

图2：在1/8000ug DNA量条件下，7个目的基因在甲基化标准品中，不应用巢式PCR和应用巢式PCR效果的比较。

图3：以7个目的基因的甲基化标准品为模板的PCR结果示意图。

图4：以甲基化标准品为模板，验证甲基化引物及非甲基化引物结果示意图。

图5：以非甲基化标准品为模板，验证甲基化引物及非甲基化引物结果示意图。

图6：以A2780、HO8910、OVCAR3、SKOV3四种卵巢癌细胞系修饰后DNA为模板，检测7个目的基因在4种卵巢癌细胞系中的甲基化状态结果示意图。

图7：本发明的多重巢式甲基化特异性PCR（MN-MSP）对临床标本检测结果示意图（48例正常女性血清中不存在7个目的基因的甲基化）。

图8：本发明的多重巢式甲基化特异性PCR（MN-MSP）对临床标本检测结果示意图（37例良性卵巢肿瘤血清样本中发现2例假阳性）。

图9：本发明的多重巢式甲基化特异性PCR（MN-MSP）对临床标本检测结果示意图（35例晚期卵巢癌中33例存在至少一个目的基因甲基化）。

图10：本发明的多重巢式甲基化特异性PCR（MN-MSP）对临床标本检测结果示意图（31例早期卵巢癌中28例存在至少一个目的基因甲基化）。

具体实施方式

下面结合实验对本发明作进一步的说明。

实验对本发明的检测方法的检测灵敏性、特异性及临床标本检测应用的验证和评估

1、所使用的试剂盒为：

（1）血清游离DNA提取：QIAamp MinElute Virus Spin Kit(QIAGEN,57704)试剂盒；

（2）细胞及组织DNA提取：DNeasy Blood & Tissue Kit(QIAGEN,69504)试剂盒；

（3）DNA甲基化修饰：QIAamp EpiTect Bisulfite Kits(QIAGEN,59104)试剂盒；

（4）甲基化及非甲基化DNA标准品：EpiTect PCR Control DNA Set(QIAGEN,59695)；

（5）PCR反应套装：AmpliTaq360Master Mix（ABI，4398881）；

（6）琼脂糖：Regular Agarose（Biowest，111860）

（7）DuRed核酸染料（泛博，009）

2、PCR条件：

Step1：PCR反应条件------Outside：

Step2：PCR反应条件------Inside：

3、PCR结果判断

取Step2所得产物10ul与4%琼脂糖凝胶中150v电泳90min，凝胶放置凝胶成像系统进行拍照分析，肉眼判断反应结果：①若M体系中出现任一阳性条带，判定结果为阳性，则证明该病人极有可能患有卵巢癌；②若M体系中无阳性条带，U体系中出现任一阳性条带，判定结果为阴性，则证明该病人未患卵巢癌；③若M、U体系中均无阳性条带，判定送检血清不合格，需重新送检。

一、多重巢式甲基化特异性PCR（MN-MSP）检测灵敏度的验证

取2ugA2780细胞系DNA进行甲基化修饰，修饰后以原始DNA量为基准，采用倍比稀释的方法，得到浓度梯度：1/40ug、1/400ug、1/2000ug、1/4000ug、1/8000ug；以TFPI2基因为目的基因（在A2780中TFPI2为完全甲基化状态）；PCR条件如Step1所示；由图1可以看出，在1/8000ug浓度条件下（约相当于19个基因组DNA）可见明显阳性条带，说明：在课题组所采用的DNA提取和修饰的条件下，甲基化特异性PCR检测所需的最低DNA量为1/8000ug。

图2示：在1/8000ug DNA量前提下，7个目的基因在甲基化标准品中，不应用巢式PCR和应用巢式PCR效果的比较，说明：应用巢式PCR显著提高了检测灵敏性，大大降低了对DNA量的要求，完全满足血清游离DNA检测的需要。

二、多重巢式甲基化特异性PCR（MN-MSP）引物特异性的验证

1、Outside Primer特异性验证

以甲基化标准品为模板，验证Outside Primer特异性，纵向为温度梯度（50℃～60℃），寻找Outside Primer的最适退火温度，最终确定PCR爬坡退火温度（Ramping temperature）范围及时间，如图3所示，最终确定PCR爬坡退火温度（Ramping temperature）范围为50℃～60℃，爬坡时间0.1～0.2℃/s。

2、Inside Primer特异性验证

分别以甲基化标准品和非甲基化标准品为模板，PCR条件如Step1，验证甲基化引物和非甲基化引物的特异性。理论上对于甲基化引物，在甲基化标准品中为全阳性，而在非甲基化标准品中为全阴性；对于非甲基化引物，在甲基化标准品中为全阴性，而在非甲基化标准品中为全阳性。如图4所示证明课题组设计的甲基化引物高度特异，可准确检测目的基因CpG位点的甲基化状态；图5所示课题组设计非甲基化引物中CDH1、SFRP5特异性不好，在甲基化标准品和非甲基化标准品中均有扩增，但是由于实验设计中非甲基化引物不是判定阳性的标准，只是作为DNA提取修饰阳性的标志，所以课题组未对CDH1、SFRP5非甲基化引物做过多调整。

三、多重巢式甲基化特异性PCR（MN-MSP）体系的验证

以A2780、HO8910、OVCAR3、SKOV3四种卵巢癌细胞系修饰后DNA为模板，PCR条件如Step1、Step2所述，检测7个目的基因在4种卵巢癌细胞系中的甲基化状态，结果如图6示：检测结果与单个基因分别检测一致，证明了检测的高效性、准确性与特异性。

四、多重巢式甲基化特异性PCR（MN-MSP）对临床样本检测敏感性和特异性的验证

1、实验步骤如下：

（1）血清游离DNA提取：取200ul血清，按QIAamp MinElute Virus SpinKit(QIAGEN,57704)试剂盒步骤提取，最终得80ul DNA溶液；

（2）DNA甲基化修饰：取40ul DNA溶液，按QIAamp EpiTect BisulfiteKits(QIAGEN,59104)试剂盒步骤提取，最终得80ul DNA溶液；

（3）PCR条件：

Step1：PCR反应体系------Outside：

模板：1ul------修饰后DNA；

引物：1ul------7种目的基因Outside Primer按照等比例混合；

MIX：10ul

Enhancer：2ul

ddH₂O：6ul

PCR反应条件------Outside：

Step2：PCR反应体系------Inside：

模板：1ul------取Step1产物DNA1ul；

引物：1ul------7种目的基因Inside Primer（M、U）按照等比例混合；

MIX：10ul

Enhancer：2ul

ddH₂O：6ul

PCR反应条件------Inside：

（4）PCR结果判断

2、收集正常女性、病理确诊为卵巢良性肿瘤及卵巢癌患者血清进一步验证本发明的多重巢式甲基化特异性PCR（MN-MSP）对临床标本检测的敏感性和特异性。

共收集正常女性血清48例，病理确诊良性肿瘤患者血清37例，病理确诊卵巢癌患者66例（其中I期病例31例），具体检测结果如表3所示：

48例正常女性血清中不存在7个目的基因的甲基化，见图7。

37例良性卵巢肿瘤血清样本中发现2例假阳性，见图8。

35例晚期卵巢癌中33例存在至少一个目的基因甲基化，见图9。

31例早期卵巢癌中28例存在至少一个目的基因甲基化，见图10。

表3

（注：阴性对照包括正常女性及卵巢良性肿瘤患者）

因此，多重巢式甲基化特异性PCR（MN-MSP）检测卵巢癌的特异性为97.65%，敏感性为92.42%；在早期（I期）卵巢癌检测方面，见表4，敏感性和特异性明显优于目前临床上普遍采用的CA125检测法，见表5。

表4

（注：阴性对照包括正常女性及卵巢良性肿瘤患者）

表5

	敏感性	特异性
			MN-MSP	90.32%	97.65%
CA125	38.71%	60.6%

3、应用本发明的多重巢式甲基化特异性PCR（MN-MSP）对临床上术前可疑为卵巢肿瘤患者的血清进行检测，并与最终手术常规病理结果进行比较，进一步验证多重巢式甲基化特异性PCR（MN-MSP）在卵巢癌诊断中的应用价值。

共收集正常女性血清及术前可疑为卵巢肿瘤患者血清共计80例，所有患者均为术前采血，多重巢式甲基化特异性PCR（MN-MSP）检测后与术后常规病理对照，具体检测结果如表6所示：

表6

（注：阴性对照包括正常女性及卵巢良性肿瘤患者）

本检测方法的灵敏性为94.73％，特异性为90.47％，阴性预测值为95.00％，阳性预测值为90.00％。

总结：

本发明多重巢式甲基化特异性PCR（MN-MSP）技术可高度特异性和敏感性地实现对7个卵巢癌高频甲基化基因（APC,RASSF1A,CDH1,RUNX3,TFPI2,SFRP5和OPCML）的同时检测，最大限度地突破了外周血中游离DNA微量难以检测的技术瓶颈；同时在48例正常对照女性、37例卵巢良性肿瘤及66例卵巢癌患者血清中进一步应用，检测7个目的基因的甲基化状态，结果证实：在正常对照女性中未发现任何一个目的基因甲基化，在37例卵巢良性肿瘤发现2例阳性，而在66例卵巢癌中发现61例阳性（特异性为97.65%，敏感性为92.42%），在双盲实验中，本检测方法的临床应用前景得到了进一步验证，更重要的是，31例早期卵巢癌患者有28例阳性，并且特异性和敏感性（特异性为97.65%，敏感性为90.32%）明显优于传统CA125检测。本检测方法不需要借助专业的病理学医生及其他精密设备，操作简便，成本低廉，速度快，仅需普通PCR仪即可，结果判定客观准确，非常适合在缺乏高水平病理医生的基层医疗机构及筛查中应用。本检测方法大大提高了卵巢癌的早期诊断率，对检测阳性的患者联合CA125检测、经阴道超声探查及MRI等严密随诊，可显著降低卵巢癌患者的手术及治疗费用，提高卵巢癌患者的生存质量，对降低卵巢癌的病死率将起到决定性作用。

Claims

1.一种多重巢式甲基化特异性PCR扩增引物，其特征在于：包括针对7种目的基因APC,RASSF1A,CDH1,RUNX3,TFPI2,SFRP5和OPCML的引物组，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1～42所示。