CN105274100A

CN105274100A - 人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测标志物及试剂盒

Info

Publication number: CN105274100A
Application number: CN201510705760.7A
Authority: CN
Inventors: 王弢; 吉学桥; 张田田
Original assignee: SUZHOU MICRO DIAG BIOMEDICINE CO Ltd
Current assignee: SUZHOU MICRO DIAG BIOMEDICINE CO Ltd
Priority date: 2015-10-27
Filing date: 2015-10-27
Publication date: 2016-01-27
Anticipated expiration: 2035-10-27
Also published as: CN105274100B

Abstract

本发明提供一种人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测标志物以及试剂盒，所述人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测标志物包括TWIST1、Vimentin和ACTB三种基因的甲基化引物和探针。本发明能够用于膀胱癌的检测、辅助诊断以及复发的预测、疗效评价等方面，具有灵敏度高、特异性强、检测成本低、取材方便、样本易存放等优点。

Description

人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测标志物及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测标志物及试剂盒

背景技术

膀胱癌是发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤，是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是全身十大常见肿瘤之一。占我国泌尿生殖系肿瘤发病率的第一位，而在西方其发病率仅次于前列腺癌，居第2位。2012年全国肿瘤登记地区膀胱癌的发病率为6.61/10万，列恶性肿瘤发病率的第9位。膀胱癌可发生于任何年龄，甚至于儿童。其发病率随年龄增长而增加，高发年龄50～70岁。男性膀胱癌发病率为女性的3～4倍。临床上膀胱癌具有恶性程度高、术后复发率高等特点，因此早期诊断对治疗和预防复发有着非常重要的意义，可以增加保留膀胱的机会并提高患者总体生存率。

众所周知，恶性肿瘤的发生发展是一个多基因作用的多阶段过程。大量研究表明，有一套特定基因的改变导致并推动了癌症的发生发展：染色体不稳定性、微卫星不稳定性、表观遗传学改变等。表观遗传是指不涉及基因组DNA序列改变而在细胞分裂过程中可以遗传给子代细胞的基因组修饰作用，目前最为人们所知的表观遗传学主要方式是DNA甲基化。由于DNA甲基化往往发生在膀胱癌发生过程中的早期，很容易在患者的尿液中检测到。因此，检测尿液中DNA甲基化状态有望成为膀胱癌早期无创诊断的一条新途径。

膀胱癌DNA分子甲基化检测组合物一直以来都没有其特有的基因，多数研究是联合几个基因同时检测尿液中基因甲基化水平，以此来提高灵敏度与特异性。根据最新的文献报道，研究人员已经通过大规模的基因筛选和样本测序，发现在膀胱癌发生早期尿液脱落细胞中1-2个基因的甲基化概率明显增加，这为膀胱癌早期辅助诊断提供了可靠的检测标志物。

TWIST1是碱性的螺旋-环-螺旋蛋白家族中高度保守的转录因子，其mRNA在胎盘组织表达量最高，在胚胎发生、发展中发挥重要作用。它参与上皮间质转化过程的调控，进而影响肿瘤的侵袭与转移。转移性肿瘤中常见TWIST1过表达或启动子的甲基化。目前国内外涉及膀胱肿瘤与TWIST1基因的相关性研究包括，TWIST1蛋白表达与肿瘤的相关性分析，以及尿液标本甲基化水平检测。IsabelleRenard等人研究发现，在膀胱癌尿液样本中TWIST1甲基化的检出率达到88％，特异性达到94％。

Vimentin是中间丝纤维蛋白家族的一员，在很多方面表现出复杂的基因表达模式，主要表达于胚胎组织和来源于间叶组织的成体细胞。越来越多的研究表明，Vimentin的表达不再是间充质起源细胞、向间叶分化的肿瘤细胞的特异性生物标志，它也在乳腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌等上皮源性恶性肿瘤中共同表达，而且与癌细胞的侵袭性强和易转移密切相关。另有研究证实，与肿瘤癌前病变(如腺瘤)产生相关的Vimentin的表达下调可能与其启动子的甲基化密切相关，这提示DNA甲基化可以从基因转录水平下调Vimentin表达，其对于肿瘤细胞迁移具有促进作用。

目前，膀胱镜检查、对可疑病变组织进行活检以及对尿液进行细胞学检查仍然是膀胱肿瘤临床最常用的诊断和随访方法。然而，膀胱镜检查是一种侵入性且昂贵的检查方法，给患者带来痛苦及经济负担；尿液细胞学检查的灵敏度不高，阳性率较低，给临床应用带来不便。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简单快速、无创伤的膀胱癌检测标志物以及试剂盒，具有灵敏度高、特异性强、检测成本低、取材方便、样本易存放和无创伤性等优点。

为达到上述目的，本发明的技术方案是：人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测标志物，所述人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测标志物包括TWIST1、Vimentin和ACTB三种基因的甲基化引物和探针；

所述三种基因的甲基化引物和探针的序列分别是：

引物、探针	序列(5‘-3’)
		TWIST1-F	CGGTAAGAAGTTTGCGGGTTG
TWIST1-R	AAATACGCTAACGCTCCC
		TWIST1-P	FAM-AGCGGCGGCGGGAGTT-MGB
Vimentin-F	TAATCGGCGGGATAGTAGGG
		Vimentin-R	GCGCCTCTATCCATCGACTT
Vimentin-P	FAM-CGTCGTTTCGTAATTTTCG-MGB
		ACTB-F	GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT
ACTB-R	CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA
		ACTB-P	VIC-ACCACCACCCAACACACAA-MGB

。

本发明还提供一种人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测试剂盒包括：

提取试剂：尿液保存液、尿液漂洗液、裂解液、提取漂洗液、洗脱液；

硫化纯化试剂：硫化试剂、DNA保护液、结合液、磁珠、纯化漂洗液1、纯化漂洗液2、纯化漂洗液3、洗脱液；

PCR检测试剂：TWIST1PCRMix、VimentinPCRMix、ACTBPCRMix、阴性质控品、阳性质控品、聚合酶。

所述人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测试剂盒用于检测时的PCR程序如下：首先95℃变性5分钟，然后95℃变性20秒、62℃退火40秒，并进行45次循环，PCR循环过程中，仪器升降温速度设定为1.3℃/S，最后40℃维持30秒。

所述PCR结果在480II上进行TWIST1/Vimentin/ACTB的Cp值分析，根据空白对照组、阴性质控品、阳性质控品、待测样品的扩增情况，确定试验结果的有效性并对样本结果进行判读。

所述PCR结果的分析具体如下：

1)在480基本软件模块栏中选择“AnalysisOverview”；

2)选择“AbsQuant/2ndDerivativeMax”分析模式；

3)选择“FilterComb465-510”；

4)点击“Calculate”，软件自动给出目的基因TWIST1/Vimentin的Cp值；

5)选择“FilterComb533-580”；

6)点击“Calculate”，软件自动给出内参基因ACTB的Cp值。

所述PCR结果的具体判读如下表：

若判读结果为阴性，患膀胱癌风险性较低；若判读结果为阳性，患膀胱癌风险较高，建议镜检确认。

本试剂盒采用荧光PCR法检测膀胱癌尿液脱落细胞基因甲基化指标。将待测DNA样品、阴性质控品、阳性质控品和无模板对照进行PCR扩增反应，对检测基因和内参基因进行双重PCR扩增反应。通过对所述待测DNA样品、阴性质控品、阳性质控品和无模板对照的参数范围的判读，判断所述待测DNA样品的检测基因的甲基化情况。

本发明选择TWIST1和Vimentin两个基因中的标志片段进行膀胱癌检测，未见于任何报道，将其作为检测标志物，灵敏度高、特异性强。本发明组合物首次建立TWIST1和Vimentin双基因联合检测膀胱癌尿液脱落细胞基因甲基化体系，不仅可以用于膀胱癌早期诊断，还可以预测术后复发。

本发明在较少样本体积(5mL)下进行，依然可得到相同水平的灵敏度和特异性，可适用于小体积样本的检测。

采用本发明检测膀胱癌尿液中TWIST1与Vimentin甲基化情况，具有操作简单、快速、灵敏度高，特异性好，无创伤等优点，适合于复发率很高的膀胱癌的早期诊断与随访，使需定期进行膀胱镜检查的患者数量明显减少，具有很高的临床应用价值。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

实施例

1、人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测体系

样本：人尿液样本、阳性质控品、阴性质控品以及空白对照样本；

仪器：Lightcycler480、高速离心机、金属浴、PCR仪、漩涡震荡仪等；

TWIST1、Vimentin和ACTB三个基因的甲基化引物和探针如下所示：

引物、探针	序列(5‘-3’)
		TWIST1-F	CGGTAAGAAGTTTGCGGGTTG
TWIST1-R	AAATACGCTAACGCTCCC
		TWIST1-P	FAM-AGCGGCGGCGGGAGTT-MGB

Vimentin-F	TAATCGGCGGGATAGTAGGG
		Vimentin-R	GCGCCTCTATCCATCGACTT
Vimentin-P	FAM-CGTCGTTTCGTAATTTTCG-MGB
		ACTB-F	GATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT
ACTB-R	CCAATAAAACCTACTCCTCCCT
		ACTB-P	VIC-ACCACCACCCAACACACAA-MGB

2、人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测试剂盒

2.1根据确定的反应体系建立的人TWIST1/Vimentin基因提取试剂，具体组分如下：

注：*表示粉末，需加入相应体积的溶剂溶解后才能使用；**表示浓缩液，需加入相应体积的无水乙醇才能使用

2.2根据确定的反应体系建立的人TWIST1/Vimentin基因硫化纯化试剂，具体组分如下：

2.3根据确定的反应体系建立的人TWIST1/Vimentin基因PCR检测试剂，具体组分如下：

2.4根据确定的反应体系建立的人TWIST1/Vimentin基因质控品试剂，具体组分如下：

组分	规格	包装	备注
				阳性质控品	1.2mL/支	棕色离心管	T47D细胞DNA
阴性质控品	1.2mL/支	棕色离心管	293细胞DNA

3、人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测试剂盒检测过程

3.1、人TWIST1/Vimentin基因DNA提取

a)试剂准备

提取漂洗液：初次使用前加入12mL无水乙醇，振荡混匀。

b)提取步骤

3.1.1取一支15mL离心管(自备)，加入5mL尿液样本，3500rpm离心10min，弃掉上清，保留沉淀；

3.1.2尿沉淀用500μLPBS(4℃预冷)悬浮分装到1.5mL离心管中，3500rpm离心5min(4℃)，弃掉上清；

3.1.3重复1次步骤3.1.2；

3.1.4尿沉渣用500μLPBS重悬，加入750μL裂解液，颠倒混匀15次，涡旋震荡1min；

3.1.5将上述混合液转入到已装入收集管的吸附柱中，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。重复操作，将剩余混合液转入吸附柱；

3.1.6向吸附柱中加入500μL的提取漂洗液，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

3.1.7向吸附柱中加入500μL的85％乙醇(自备)，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

3.1.8重复1次步骤3.1.7；

3.1.912000rpm空离2min，彻底去除残余的乙醇，以免其影响后续反应；

3.1.10将吸附柱置于一个新的1.5mL离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入56℃预热的30μL的洗脱液，室温放置5-10min，12000rpm离心2min，收集DNA溶液，-20℃保存。

3.2、人TWIST1/Vimentin基因DNA硫化纯化

a)试剂准备

(1)硫化试剂：加入1mL灭菌水，室温涡旋振荡10min至粉末完全溶解。

(2)纯化漂洗液1：初次使用前加入40mL无水乙醇，振荡混匀。

(3)纯化漂洗液2：初次使用前加入12mL无水乙醇，振荡混匀。

(4)纯化漂洗液3：初次使用前加入12mL无水乙醇，振荡混匀。

b)操作步骤

3.2.1取一只PCR管，加入30μLDNA溶液，100μL硫化试剂溶液，30μLDNA保护液，轻弹管壁混匀后瞬离；

3.2.2将PCR管放入PCR仪，运行下列程序：

80℃for1hours；

20℃storageupto20hours；

3.2.3取一只2mL的EP管，加入1mL的结合液，再加入上述转化修饰产物(约160μL)，涡旋振荡15s，瞬离；

3.2.4加入20μL磁珠，涡旋振荡混匀，室温振荡20min，将离心管放置在磁力架上1min，磁珠完全吸附后，弃去上清；

3.2.5加入500μL纯化漂洗液1，涡旋混匀10s，将离心管放置在磁力架上1min，磁珠完全吸附后，弃去上清；

3.2.6加入500μL纯化漂洗液2，涡旋混匀10s后，室温振荡10min，将离心管放置在磁力架上1min，磁珠完全吸附后，弃去上清；

3.2.7加入500μL纯化漂洗液3，涡旋混匀10s，将离心管放置在磁力架上1min，磁珠完全吸附后，弃去上清；

3.2.8加入500μL纯化漂洗液1，涡旋混匀10s，将离心管放置在磁力架上1min，磁珠完全吸附后，弃去上清；

3.2.9重复步骤3.2.8；

3.2.10小心去除残留液体，自然干燥10min；

3.2.11向磁珠加入50μL预热到80℃的洗脱液，充分混匀后80℃孵育10min，中间再混匀一次；

3.2.12将离心管放置在磁力架上1min，磁珠完全吸附后，吸取上清(bisDNA)至新的离心管保存备用。

3.3、PCR检测

3.3.1将试剂盒组分置于4℃冰箱中，自然融化，瞬离至管底；

3.3.2按照下表反应体系，配制PCRMix和DNA聚合酶混合液，混匀后分装至PCR管，样品、质控品和纯化水作为模板加入，每个反应体积为20μL；

PCR反应体系

3.3.3根据待测样品数量设计加样布局，推荐PCR布局

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

PC-T

PC-V

S₅-T

S₅-V

S₁₃-T

S₁₃-V

S₂₀-T

S₂₀-V

S₂₈-T

S₂₈-V

S₃₆-T

S₃₆-V

B

PC-T

PC-V

S₆-T

S₆-V

S₁₄-T

S₁₄-V

S₂₁-T

S₂₁-V

S₂₉-T

S₂₉-V

S₃₇-T

S₃₇-V

C

NC-T

NC-V

S₇-T

S₇-V

S₁₅-T

S₁₅-V

S₂₂-T

S₂₂-V

S₃₀-T

S₃₀-V

S₃₈-T

S₃₈-V

D

NC-T

NC-V

S₈-T

S₈-V

S₁₆-T

S₁₆-V

S₂₃-T

S₂₃-V

S₃₁-T

S₃₁-V

S₃₉-T

S₃₉-V

E

S₁-T

S₁-V

S₉-T

S₉-V

S₁₇-T

S₁₇-V

S₂₄-T

S₂₄-V

S₃₂-T

S₃₂-V

S₄₀-T

S₄₀-V

F

S₂-T

S₂-V

S₁₀-T

S₁₀-V

S₁₈-T

S₁₈-V

S₂₅-T

S₂₅-V

S₃₃-T

S₃₃-V

S…-T

S…-V

G

S₃-T

S₃-V

S₁₁-T

S₁₁-V

S₁₉-T

S₁₉-V

S₂₆-T

S₂₆-V

S₃₄-T

S₃₄-V

NTC-T

NTC-V

H

S₄-T

S₄-V

S₁₂-T

S₁₂-V

S₂₀-T

S₂₀-V

S₂₇-T

S₂₇-V

S₃₅-T

S₃₅-V

NTC-T

NTC-V

注：PC：PositiveControl，阳性质控品；NC：NegativeControl，阴性质控品；NTC：NoTemplateControl，无模板对照；S：Sample，检测样品；T：检测TWIST1；V：检测Vimentin。

3.3.4按照下表指示设置反应程序

样品上机后，保存实验名称，运行PCR反应，并及时根据实验布局编写加样排版和样品名称。

3.4PCR结果分析

3.4.1在480基本软件模块栏中选择“Analysis”；

3.4.2选择“AbsQuant/2ndDerivativeMax”分析模式；

3.4.3选择“FilterComb465-510”；

3.4.4点击“Calculate”，软件自动给出目的基因TWIST1/Vimentin的Cp值；

3.4.5选择“FilterComb533-580”；

3.4.6点击“Calculate”，软件自动给出内参基因ACTB的Cp值。

3.4.7所述PCR结果的具体判读如下表所示：

4、人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测试剂盒的分析性能评估

按照本领域中常规的制作及检定规程对本试剂盒进行检定，结果如下：

4.1外观和性状

4.1.1试剂盒各组分应齐全、完整、液体无渗漏；中文包装标签应清晰、准确、牢固；

4.1.2液体组分应清澈透明，无沉淀、无悬浮物、无絮状物；

4.1.3固体组分应颗粒分明、色泽均一，无结块、无杂质。

4.2提取、硫化纯化效率

4.2.1对TWIST1强阳提取参考品、弱阳提取参考品进行提取、硫化纯化，经荧光PCR检测其为阳性；

4.2.2对Vimentin强阳提取参考品、弱阳提取参考品进行提取、硫化纯化，经荧光PCR检测其为阳性。

4.3准确性

4.3.1检测TWIST1阳性参考品，阳性符合率为100％；

4.3.2检测Vimentin阳性参考品，阳性符合率为100％；

4.3.3检测准确性参考品，阳性符合率应为100％。

4.4特异性

4.4.1检测TWIST1阴性参考品，阴性符合率为100％；

4.4.2检测Vimentin阴性参考品，阴性符合率为100％；

4.4.3检测特异性参考品，阴性符合率应为100％。

4.5灵敏度

4.5.1在10ng/mL野生型基因组DNA背景下，对TWIST1甲基化DNA含量为5％的灵敏度参考品能够准确检出；在TWIST1甲基化DNA含量为10％背景下，对DNA浓度为5ng/mL的灵敏度参考品能够准确检出；

4.5.2在10ng/mL野生型基因组DNA背景下，对Vimentin甲基化DNA含量为5％的灵敏度参考品能够准确检出；在Vimentin甲基化DNA含量为10％背景下，对DNA浓度为5ng/mL的灵敏度参考品能够准确检出。

4.6精密度

4.6.1对TWIST1强阳精密度参考品、弱阳精密度参考品重复检测10次，阳性检出率为100％，且CV≤5％；

4.6.2对Vimentin强阳精密度参考品、弱阳精密度参考品重复检测10次，阳性检出率为100％，且CV≤5％。

4.7稳定性

4.7.1效期稳定性：本产品有效期6个月。取到期后的样品检测，应符合4.1～4.6的要求。

5、人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测试剂盒的验证评估

利用41例膀胱癌、34例膀胱炎症尿液样本来验证试剂盒，对结果进行分析：本发明的特异性为87.5％，灵敏度为82.7％。

本发明灵敏度高、特异性强，即使在较少样本体积(5mL)下进行，依然可得到相同水平的灵敏度和特异性，可适用于小体积样本的检测。

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims

1.人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测标志物，其特征在于，所述人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测标志物包括TWIST1、Vimentin和ACTB三种基因的甲基化引物和探针；

所述三种基因的甲基化引物和探针的序列分别是：

引物、探针序列(5‘-3’) TWIST1-F CGGTAAGAAGTTTGCGGGTTG TWIST1-R AAATACGCTAACGCTCCC TWIST1-P FAM-AGCGGCGGCGGGAGTT-MGB Vimentin-F TAATCGGCGGGATAGTAGGG Vimentin-R GCGCCTCTATCCATCGACTT Vimentin-P FAM-CGTCGTTTCGTAATTTTCG-MGB ACTB-F GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT ACTB-R CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA ACTB-P VIC-ACCACCACCCAACACACAA-MGB

。

2.人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测试剂盒包括：

3.如权利要求2所述的人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测试剂盒用于检测时的PCR程序如下：首先95℃变性5分钟，然后95℃变性20秒、62℃退火40秒，并进行45次循环，PCR循环过程中，仪器升降温速度设定为1.3℃/S，最后40℃维持30秒。

4.如权利要求3所述的人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述PCR结果在上进行TWIST1/Vimentin/ACTB的Cp值分析，根据空白对照组、阴性质控品、阳性质控品、待测样品的扩增情况，确定试验结果的有效性并对样本结果进行判读。