CN102559932B

CN102559932B - 一种高危人乳头瘤病毒的pcr检测试剂盒

Info

Publication number: CN102559932B
Application number: CN 201210016078
Authority: CN
Inventors: 林希瑾; 秦伟; 胡守旺; 谢佐福; 周晓强; 姚铭锋
Original assignee: TRIPLEX INTERNATIONAL BIOSCIENCES (CHINA) CO Ltd
Current assignee: Triplex International Biosciences Co ltd
Priority date: 2012-01-18
Filing date: 2012-01-18
Publication date: 2013-07-03
Anticipated expiration: 2032-01-18
Also published as: CN102559932A

Abstract

本发明的目的是采用实时荧光PCR技术，针对HPV 5个高危亚型基因L1区，设计特异性引物和荧光标记探针，特异扩增和检测HPV亚型基因片段。本发明的技术方案为提供一种高危人乳头瘤病毒的PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括DNA提取液，PCR反应试剂，阳性质控品，阴性质控品。所示PCR反应试剂含有两条扩增引物和五条Taqman探针。本发明的有益效果为填补了国内临床检测HPV5个高危亚型荧光PCR试剂盒的空白。对样本的检测灵敏度达到1.0×10³拷贝/ml，试剂盒对于HPV阴性样本，以及HPV其他亚型的样本，检测结果为阴性，无交叉反应。具有灵敏度和特异性高、稳定、及时、操作方便等优点。

Description

一种高危人乳头瘤病毒的PCR检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种疾病病原体基因检测技术，尤其涉及一种高危人乳头瘤病毒的PCR检测试剂盒。

背景技术

人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的存在与多种皮肤黏膜的良、恶性增生，特别是宫颈癌的发生、发展密切相关，病毒的各型基因序列与其生物学行为存在着高度相关性。不同基因型的HPV具有不同的致病危险性。HPV DNA的检测和分型对了解相关病情、判断预后及指导治疗具有重要价值，特别是对女性生殖道肿瘤的癌情预报具有重要意义。由于缺乏体外培养系统和可靠的血清反应物，所以HPV的分类几乎完全依赖于其分子学特性。根据定义，如果L1开放阅读框中特定的291bp有10％不同就属于不同的HPV型。目前世界上发现的HPV有110余种亚型，20余种HPV亚型从宫颈癌组织中分离，根据其致病力的大小分为高危型和低危型两种，国际癌症研究协会对9个国家11次病例对照研究资料分析，将HPV6，11，40，42，43，44，54，61，70，72，81，cp6108等12种归为低危型，主要引起生殖道肛周皮肤和阴道下部的外生性湿疣类病变、扁平湿疣类病变和低度子宫颈上皮内瘤样变(CINI)，多呈一过性，可自然逆转；高危型主要为HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68，73，82等15种，主要导致CINII-III级病变和宫颈癌的发生，持续高危型HPV感染的CINI级易进展为CINII～III。

在全球范围内，每年约有20多万女性死于宫颈癌。在发展中国家，宫颈位置宫颈癌则属于常见多发的妇科肿瘤，排行榜首。我国每年新发现的病例为13.15万，死亡率最高的地区是山西，最低的是西藏。当宫颈癌的症状出现三个月后就诊者已有2/3为癌症晚期。经临床追踪观察显示，从一般的宫颈癌前病变发展为宫颈癌大约需要10年时间。从这个角度看，宫颈癌并不可怕，它是一种可预防、可治愈的疾病。防治的关键在于：定期进行妇科检查，及时发现和治疗宫颈癌前病变，终止其向宫颈癌的发展。如能落实防治措施，宫颈癌的治愈率很高。宫颈癌也是目前唯一确切知道病因的癌症，这一病因就是HPV感染。因此，检测病毒，特别是高危型病毒可预示宫颈癌的发生。

目前HPV感染的实验室诊断方法主要有两大类，第一类是检查HPV的感染间接证据，如醋酸白试验，细胞学及组织学检查等。由于这些方法检测的是HPV感染后对机体造成的异常变化，而HPV感染后对机体造成特定的异常变化需要一定的时间，因此这些方法只能检测出亚临床期和临床期，检测不出潜伏期，对临床的早期诊断意义不大。

第二类是检查组织中是否有HPV存在，如免疫组化，超薄切片电镜技术或负染技术，以PCR为基础和HPV核酸分子检测等。由于这些方法检测的是HPV感染的直接证据，在时间上可比第一类方法能更早地检测出HPV感染，更适合早期诊断。免疫组化检测标本中是否存在HPV抗原，敏感性低，特异性高，繁琐、费时，目前已逐渐被淘汰。核酸印迹杂交的灵敏度及特异性均较高，但费时，繁杂，花费大，需用新鲜标本，实验室条件要求高，目前还未普遍用于临床。超薄切片电镜技术及负染技术可在电镜下看到典型的乳头瘤病毒颗粒，但受实验条件限制，一般的实验室很少采用。以PCR为基础和HPV核酸分子检测成为目前HPV检测的主流方法。

(1)测序分析法(Sequence-based test，SBT)：该方法优点是获取序列信息最多，可以明确被测区域的多态性，并能发现新基因，是其他所有方法的参考标准。但测序法对混合感染也不易确定，特别是对于混合感染病毒比例在25％以下时，容易造成漏检，而且测序法操作繁琐，耗时费力，仪器费用高昂，难以在临床上推广使用。

(2)限制性片段长度多态性(restriction fragment lengthpolymorphism，PCR-RFLP)：是较早出现的HPV基因分型检测方法，利用PCR扩增具有不同酶切位点的各种HPV基因型，将PCR产物用3-5种不同限制性内切酶进行酶切，电泳结果与已知限制性片段数据库进行比较，从而确定基因型。但该方法操作流程相对比较复杂，检测型别有限。

(3)基因型特异性引物扩增法(PCR-SSP)：根据不同HPV型在某一区段序列的差异，设计一系列特异性引物，不同型或亚型可扩增出不同长度的片段，并以此进行分型。该方法操作虽简单，但要保证HPV各型之间有较大差异，不但对PCR引物的设计要求较高，且每份样品需同时进行多次检测才能最终确定型别。该方法的优点是成本较低，不需要特殊设备，缺点是有时会出现较弱的扩增条带，难以判断，因而目前没有在临床或实验室广泛使用。

(4)基因型特异性核酸探针杂交法(PCR-SSO)：根据各型HPV某一区段的序列差异分别设计特异探针并固定在纤维素膜或玻片上，利用PCR通过生物素或荧光素标记的引物扩增HPV基因片段，产物与膜或芯片上特异性探针杂交，酶联显色反应或直接经荧光扫描仪分析，判定HPV基因型。目前在临床实验室中广泛使用的线性探针杂交(Line-ProbeAssay，LiPA)就是型特异性核酸探针杂交分型方法。该方法与测序结果比较，符合率高，且在检测混合感染时，比测序法更为优越，在国内外报道的HPV基因分型研究中常用。该方法存在的不足是，对低载量病毒检测结果不太好，需要专用检测分析设备。

(5)实时荧光PCR(Real time PCR)：目前发展迅速，应用较广的荧光PCR技术(Flurogenic Quantitive Polymerase Chain Reaction，FQ-PCR)，根据荧光共振能量转移的原理检测HPV基因型，检测探针一般是Taqman或MGB探针，特点是方便快捷，具灵敏度高，特异性强，假阳性低，成为HPV感染诊断和辅助诊断良好方法。荧光PCR检测HPV DNA在临床上值得推广应用。

发明内容

本发明的目的是采用实时荧光PCR技术，针对HPV 5个高危亚型基因L1区，设计特异性引物和荧光标记探针，特异扩增和检测HPV亚型基因片段。

本发明的技术方案为提供一种高危人乳头瘤病毒的PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括PCR反应试剂，所述PCR反应试剂包括：

1)特异性扩增人乳头瘤病毒的上游外引物，其碱基序列如SEQ IDNO：1所示；

2)特异性扩增人乳头瘤病毒的下游外引物，其碱基序列如SEQ IDNO：2所示；

3)用于检测人乳头瘤病毒的Taqman探针，其碱基序列如SEQ ID NO：3所示；

4)用于检测人乳头瘤病毒的Taqman探针，其碱基序列如SEQ ID NO：4所示；

5)用于检测人乳头瘤病毒的Taqman探针，其碱基序列如SEQ ID NO：5所示；

6)用于检测人乳头瘤病毒的Taqman探针，其碱基序列如SEQ ID NO：6所示；

7)用于检测人乳头瘤病毒的Taqman探针，其碱基序列如SEQ ID NO：7所示；

所述Taqman探针5’端用荧光染料标记，3’端用淬灭荧光染料标记。

优选的，所述荧光染料选自FAM、JOE和HEX，所述淬灭荧光染料选自Eclipse和TAMRA。

优选的，所述Taqman探针5’端标记FAM，3’端标记TAMARA。

优选的，所述上游引物的浓度为10μM，所述下游引物的浓度为10μM，所述Taqman探针的浓度为10μM。

优选的，所述PCR反应试剂还包括纯水、10×PCR buffer、25mMMgCl₂、20mM dNTP、Taq酶、UNG酶，所述dNTP包括dATP、dUTP、dGTP、dCTP。

优选的，所述试剂盒包括DNA提取液，PCR反应试剂，阳性质控品，阴性质控品。

本发明的有益效果为填补了国内临床检测HPV 5个高危亚型荧光PCR试剂盒的空白。对样本的检测灵敏度达到1.0×10³拷贝/ml，试剂盒对于HPV阴性样本，以及HPV其他亚型的样本，检测结果为阴性，无交叉反应。具有灵敏度和特异性高、稳定、及时、操作方便等优点。

附图说明

图1为阳性参考品检测结果图；

图2为阴性参考品检测结果图；

图3为密度参考品的内参照结果图；

图4为灵敏度参考品检测结果图。

具体实施方式

实时荧光PCR是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质。随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。实时荧光PCR的化学原理包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加。

本发明试剂盒的引物为指定碱基序列的寡聚核苷酸，检测引物(H1、H2)可同时扩增HPV16、18、33、52、58亚型基因片段。由上海英骏生物技术有限公司按要求合成，PAGE纯化，核对合成报告应与合成要求(序列)一致。

产品引物序列如表1所示。

表1

引物名称	序列
		H1(SEQ ID NO：1)	5’-TGGCATAACCAACTATTTGTTA-3’
H2(SEQ ID NO：2)	5’-TAAACTGTAAATCATATTCCTC-3’

检测探针为指定碱基序列的寡聚核苷酸，可检测HPV16/18/33/52/58基因亚型。检测探针的5’端用FAM标记，3’端TAMRA标记。由上海英骏生物技术有限公司按要求合成，HPLC纯化，核对合成报告应与合成要求(序列)一致。

本试剂盒Taqman探针序列如表2所示。

表2

探针名称	序列
		H3(SEQ ID NO：3)	5’-FAM-CTGCCATATCTACTTCAGAA-TAMRA-3’
H4(SEQ ID NO：4)	5’-FAM-CACAGTCTCCTGTACCTGGGCA-TAMRA-3’
		H5(SEQ ID NO：5)	5’-FAM-ACTAGTGACAGTACATATAAAAAT-TAMRA-3’
H6(SEQ ID NO：6)	5’-FAM-CACTCGTAGCACTAACATGACTTT-TAMRA-3’
		H7(SEQ ID NO：7)	5’-FAM-ATATGACATTATGCACTGAAGTAA-TAMRA-3’

实施例

一、本发明试剂盒组成

本发明试剂盒组成如表3和表4所示。

表3

配液前准备

(1)dN(U)TP

将购买的100mM的dATP、dUTP、dGTP、dCTP，按照1∶2∶1∶1(体积比)混合，混合液各成分浓度分别为：20mM、40mM、20mM、20mM取0.5mL离心管，分装成每管100μL dN(U)TP的母液。

(2)引物

将合成的引物13000rpm离心1min，加入适量纯水(根据合成量计算)将引物溶解成100μM，取0.5mL离心管，分装成每管100μL的引物母液。进行生产前，H1、H2需加入适量纯水配制成10μM使用液。

(3)探针

将合成的探针13000rpm离心1min，加入适量纯水(根据合成量计算)将探针溶解成100μM，取0.5mL离心管，分装成每管100μL的探针母液。进行生产前，H3、H4、H5、H6、H7需加入适量纯水配制成10μM使用液。

(4)At-Taq酶/UNG酶系配液

2.5U/μL At-Taq酶与UNG酶(1U/μL)按照100∶2(体积比)混合，配制成At-Taq DNA聚合酶/UNG酶系，-20±5℃以下冰箱中保存。每人份的PCR反应试剂中含有表4中的成分。

表4

试剂	(μL)
		纯水	22.5
10×PCR buffer	5
		25mM MgCl2	8
dN(U)TP(20、40mM)	0.5
		10μM H1	1.5
10μM H2	1.5
		10μM H3	1
10μM H4	1
		10μM H5	1
10μM H6	1
		10μM H7	1
At-Taq酶/UNG酶系	1
		总量	45

DNA提取液其成分为：25mM NaOH、10mMTris-HCl(pH8.0)、1％TritonX-100、1％NP-40、2％Chelex-100、0.1mM EDTA(pH8.0)。

二、本发明试剂盒的使用

1、样本收集及保存方法

HPV的临床样本主要是用拭子取表皮脱落细胞及活检组织。取样后的棉拭子放入备有1ml无菌生理盐水的试管中，充分漂洗后将拭子贴壁挤干丢弃。

采集的样本在室温放置不超过2小时，4℃保存不超过24小时，-20℃保存不超过3个月。

2、标本处理

(1)将标本管中样本液摇匀取200μl转入1.5ml离心管，10,000rpm离心5分钟，弃上清，留沉淀；

(2)阳性和阴性质控品解冻混匀，各取10ul，分别加入1.5ml的离心管；

(3)样本沉淀及质控品，分别加50μl DNA提取液混匀，煮沸10分钟，10,000rpm离心5分钟，上清备用。

3、PCR扩增

(1)取HPV5 PCR反应试剂，分别加入样本提取液或质控品提取液上清5ul。

(2)PCR扩增。PCR反应管液6,000rpm瞬时离心，放入PCR仪，按下列程序条件扩增：

循环参数Stage1 50℃----2min

Stage2 94℃----3min

Stage3 94℃---15sec(10cycles)

51℃----1min

Stage4 94℃----15sec(30cycles)

51℃----45sec

荧光素设置：HPV5-FAM，TAMRA

荧光信号收集：Stage4：51℃---45sec

反应体积：50ul。

(3)结果分析：反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在1～2、End值可设在5～10，调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线)，点击Analysis自动获得分析结果，在Report界面察看结果，实际CT值＝实验报告CT值+10)。

4、质量控制

(1)阴性质控品：无典型S型扩增曲线或无Ct值显示；

(2)阳性质控品：呈典型S型扩增曲线且Ct值≤35.1；

(3)以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。

5、试验结果的判定

(1)如果检测样本无典型S型扩增曲线或Ct值＞35.1，则判样本为本试剂盒指定检测的HPV 5个型阴性；

(2)如果检测样本呈典型S型扩增曲线且Ct值≤35.1，则判样本为本试剂盒指定检测的HPV 5个型阳性。

三、本发明试剂盒优点和效果：

请参阅图1、图2、图3、图4，通过对本产品准确性、特异性、重复性、稳定性、灵敏度和精密度进行研究，显示其具备以下性能：

图1为阳性质控品验证结果图(从P5-1到P5-77条荧光曲线所对应的基因亚型为HPV16、18、33、52、58、16/18、16/52)。

图2为阴性质控品N1的荧光曲线。

图3为精密度参考品P5-1的10次平行重复检测的10条荧光曲线。

图4为灵敏度参考品检测结果图(从左到右5条荧光曲线所对应的检测浓度依次为5.0×10⁴copies/ml、5.0×10³copies/ml、5.0×10²copies/ml、5.0×10copies/ml。最低检出限为5.0×10²copies/mL。)

表5为各参考品的组成。

表5

灵敏度：本试剂盒对标本的灵敏度为1.0×10³拷贝/ml。

交叉反应：试剂盒对于HPV阴性样本，以及HPV其他亚型的样本，检测结果为阴性，无交叉反应。

以深圳亚能生物技术有限公司的“人乳头瘤病毒基因分型检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)”的结果作为HPV核酸检测的对照试剂盒，泰普公司的“人乳头瘤病毒(高危5个型)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)”的考核结果如表6和表7所示。

表6

表7

本发明的人乳头瘤病毒(高危5个型)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)能高效、准确地对宫颈脱落细胞中的HPV病毒进行筛查，为临床诊断提供有效的依据。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.一种高危人乳头瘤病毒的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括PCR反应试剂，所述PCR反应试剂包括：

1)特异性扩增人乳头瘤病毒的上游外引物，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示；

2)特异性扩增人乳头瘤病毒的下游外引物，其碱基序列如SEQ ID NO：2所示；

2.根据权利要求1所述的高危人乳头瘤病毒的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述荧光染料选自FAM、JOE和HEX，所述淬灭荧光染料选自Eclipse和TAMRA。

3.根据权利要求1所述的高危人乳头瘤病毒的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述Taqman探针5’端标记FAM，3’端标记TAMRA。

4.按权利要求1所述的高危人乳头瘤病毒的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述上游引物的浓度为10μM，所述下游引物的浓度为10μM，所述Taqman探针的浓度为10μM。

5.按权利要求1所述的高危人乳头瘤病毒的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂还包括纯水、10×PCR buffer、25mM MgCl₂、20mM dNTP、Taq酶、UNG酶，所述dNTP包括dATP、dUTP、dGTP、dCTP。

6.按权利要求1所述的高危人乳头瘤病毒的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括DNA提取液，阳性质控品，阴性质控品。