CN101217976A

CN101217976A - 疫苗

Info

Publication number: CN101217976A
Application number: CNA2006800230327A
Authority: CN
Inventors: B·D·A·科劳
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2005-04-26
Filing date: 2006-04-24
Publication date: 2008-07-09
Also published as: ZA200709207B

Abstract

本发明公开了一种预防HPV感染和/或疾病的方法，所述方法包括递送包含来自至少HPV 16和HPV 18的L1蛋白或其免疫原片段的第一HPV疫苗，和不含来自第一疫苗的HPV16和HPV 18 L1组分的第二HPV疫苗，其中第二HPV疫苗含有来自至少一种其它致癌性HPV型的L1蛋白或其免疫原片段，其中第一和第二疫苗可以任何顺序递送，并且间隔适合的时间递送。

Description

疫苗

本发明涉及人乳头瘤病毒(HPV)疫苗

发明背景

乳头瘤病毒为高度种属特异性的小DNA肿瘤病毒。目前为止，已经发现了100多种人乳头瘤病毒(HPV)基因型。HPV通常而言对皮肤(例如HPV-1和-2)或粘膜表面(例如HPV-6和-11)具有特异性，并经常引起良性肿瘤(疣)，持续数月或数年。这种良性肿瘤对相关的个体而言，是痛苦的，但除少数例外，不会有生命危险。

一些HPV还与肿瘤有关，称为致癌型HPV。HPV和人肿瘤之间最强的阳性相关，是存在于HPV-16和HPV-18与宫颈癌之间的阳性相关。宫颈癌是发展中国家最为常见的肿瘤，全世界每年出现约500,000新病例。

其它可引起癌症的HPV型为型31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68。型16和18与宫颈癌相关度最高。型31和45与癌症风险的相关性在其次(Munoz N，Bosch FX，de Sanjose S等.International Agency for Research on Cancer Multicenter CervicalCancer Study Group(国际癌症研究所多中心子宫颈癌研究小组).NEnglJMed 2003；348：518-27.)。

已有提议用HPV病毒样颗粒(VLP)作为有潜力的疫苗治疗HPV。动物研究表明VLP并不产生针对其它HPV型感染的交叉保护作用-例如见Suzich，J.A.等的Proc Natl Acad Sci，92：11553-11557，1995和Breitburd的Seminars in Cancer Biology，vol 9，1999，pp 431-445。

WO2004/056389中公开了HPV 16、HPV 18VLP疫苗可提供针对除16和18型之外HPV型的交叉保护作用。在某几组HPV型中观察到具有统计学意义的保护作用。仍需要能防御多种HPV型的疫苗。

发明简述

本发明涉及防御HPV感染和/或疾病的接种程序，所述程序包括递送包含至少来自HPV 16和18的L1蛋白或其免疫原片段的第一HPV疫苗，和不含第一疫苗HPV16和18L1组分的，而含有至少一种其它致癌性HPV型的L1蛋白或其免疫原片段的第二HPV疫苗，其中所述的第一和第二疫苗可以任何顺序递送，并且间隔适合的时间递送。

本发明进一步涉及防御HPV感染或疾病的接种程序，所述程序包括递送包含至少来自HPV 16和18的L1蛋白或其免疫原片段的第一HPV疫苗，在适合的间隔后，递送不含第一疫苗HPV16和18L1组分的，而含有至少一种其它致癌性HPV型的L1蛋白或其免疫原片段的第二HPV疫苗。

本发明进一步涉及防御HPV感染和/或疾病的方法，所述方法包括递送包含至少来自HPV 16和18的L1蛋白或其免疫原片段的第一HPV疫苗，和不含第一疫苗HPV16和18L1组分的，而含有至少一种其它致癌性HPV型的L1蛋白或其免疫原片段的第二HPV疫苗，其中的第一和第二疫苗可以任何顺序递送，并且间隔适合的时间递送。

本发明还进一步涉及防御HPV感染和/或疾病的方法，所述方法包括递送包含至少来自HPV 16和18的L1蛋白或其免疫原片段的第一HPV疫苗，在适合的间隔后，递送另一种不含第一疫苗HPV16和18L1组分的，而含有至少一种其它致癌性HPV型的L1蛋白或其免疫原片段的第二HPV疫苗。

本发明还涉及发明的疫苗组合物本身。

本发明还涉及包含本发明第一和第二疫苗组合物的试剂盒。

本发明一方面涉及来自一种第一HPV型的HPV L1蛋白或其免疫原片段在制备用以加强由来自第二种不同HPV型的HPV L1蛋白或其免疫原片段引发的免疫响应的药物中的用途。一方面，第二HPV型L1蛋白或其片段以病毒样颗粒形式存在，并用来加强由病毒样颗粒形式存在的第一HPV型L1蛋白或其片段引发的免疫响应。

本发明还涉及来自非HPV 16株HPV L1蛋白，优选以VLP形式存在的L1蛋白在加强HPV 16免疫响应中的用途。

本发明还涉及来自非HPV 18株HPV L1蛋白，优选以VLP形式存在的L1蛋白在加强HPV 18免疫响应中的用途。

一方面，用以加强免疫响应的病毒株为在实施例1中发现的对其具有一定交叉保护作用的病毒株，例如HPV 31、HPV 45和HPV52。

附图说明

图1和图5图示了不同的初始免疫和加强免疫方案产生的抗HPV 16的抗体。

图2和图6图示了不同的初始免疫和加强免疫方案产生的抗HPV 18的抗体。

图3和图7图示了不同的初始免疫和加强免疫方案产生的抗HPV 31的抗体。

图4和图8图示了不同的初始免疫和加强免疫方案产生的抗HPV45的抗体。

图9为图1-8中抗体响应的总结。

图10和图14图示了不同的初始免疫和加强免疫方案后CD4+细胞群中HPV 16L1特异性T细胞百分数。

图11和图15图示了不同的初始免疫和加强免疫方案后CD4+细胞群中HPV 18L1特异性T细胞百分数。

图12和图16图示了不同的初始免疫和加强免疫方案后CD4+细胞群中HPV 31L1特异性T细胞百分数。

图13和图17图示了不同的初始免疫和加强免疫方案后CD4+细胞群中HPV 45L1特异性T细胞百分数。

图18为图10-13中CMI数据的总结。

发明详述

按与之相关的某些组的HPV型的情况进行评价，结果表明由HPV 16和HPV 18提供的防御突发性和持续性感染的交叉保护是普遍存在的，WO2004/056389对此做了公开。

我们惊讶的发现，针对某种(非HPV 16、HPV 18)HPV型(正如通过HPV 16和HPV 18疫苗抗该类型的有效性评定)的交叉保护高于针对某种其它(非HPV 16、HPV 18)HPV型。交叉保护可被认为由含有一种HPV类型的疫苗提供的防御不同HPV型引起的感染(突发性或持续性)和/或疾病的保护。交叉保护可通过考虑疫苗的效果(V.E.)进行评价，其中的V.E.为对特定的HPV型而言，疫苗组比安慰剂组在防御感染或疾病方面提高的百分数。

感染可以为突发性或持续性感染。疾病可以为细胞学异常、ASCUS、CIN1、CIN2、CIN3或与HPV感染有关的宫颈癌。例如感染可以通过PCR进行评价。疾病以可以通过组织学检查或生化标志物分析例如p16进行评价。

当交叉保护统计学意义高于安慰剂时，可以认为存在一定水平的交叉保护作用。比较适宜的是，交叉保护水平高于0％，达到20％，达到40％，达到60％，达到70％，达到80％，甚至80％以上。这可通过HPV疫苗与安慰剂组比较，对预防该疫苗中不存在的HPV型引起的感染或疾病的疫苗效力进行测量。

该发现对疫苗设计和疫苗接种程序的设计有潜在意义。

例如，观察到交叉保护的HPV型可用做另一HPV型的初始免疫或加强免疫剂，在适合的间隔后，可提供同源性保护，而且可降低对特定HPV型的接种次数。

本发明涉及防御HPV感染或疾病的接种程序，所述程序包括递送包含至少来自HPV 16和18的L1蛋白或其免疫原片段的第一HPV疫苗，和不含第一疫苗HPV16和18L1组分的，而含有至少一种其它致癌性HPV型的L1蛋白或其免疫原片段的第二HPV疫苗。其中，第一疫苗和第二疫苗可以任何次序递送，且在适当的间隔后递送。

适当的间隔可以为7天、2周、4周、6周、8周、3月、4月、5月、6月、1年。接种疫苗的程序可以例如为0月、1月，或0月、2月，或0月、4月，或0月、6月。一般而言，适当的间隔是指该间隔内第二次递送疫苗时可以观察到加强效应的间隔，例如通过检测抗体滴度或细胞介导的免疫。一般而言，适合的间隔是指该间隔内已通过递送一种疫苗引发初次免疫响应，这可例如通过在递送第二疫苗前检测血清中抗体滴度进行测量。一方面，适当的间隔为初次响应，典型的是抗体响应达峰后的很短时间。一方面，该间隔为初次接种后2-26周，比较适合的间隔为2-22周、2-18周、2-14周、2-12周、2-10周、2-8周、2-6周，在一方面为初次接种后1个月。

致癌性HPV型包括HPV 31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68。

比较适宜的是，在第一疫苗的至少一个组分与第二疫苗的一个组分间可以观察到交叉保护。例如，比较适宜的是，第一疫苗包含来自HPV 16和HPV 18的L1蛋白及其免疫原片段，而第二疫苗包含来自HPV 31或HPV 45或HPV52的L1蛋白或其免疫原片段。

一方面，第一疫苗包含来自HPV 16和18的L1蛋白或其免疫原片段。另一方面，第一疫苗包含来自其它HPV型的L1蛋白或其免疫原片段，例如HPV型31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68中的一种或多种。在一方面，该HPV型为HPV33。

在另一方面，第二疫苗至少不包含来自第一疫苗的HPV 16和18的抗原，而包含来自已证明具有与本文HPV16和/或HPV18交叉保护作用的HPV型的L1蛋白或其免疫原片段，比较适宜的为HPV31和/或45和/或52。第二疫苗可包含其它HPV型，例如HPV型31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68中的一种或多种。

一方面，第二疫苗包括来自HPV 31和/或HPV 45的L1蛋白或其免疫原片段。在另一方面，第二疫苗包括来自HPV52型的L1蛋白或其免疫原片段。

另一方面，第二疫苗包括来自HPV58的L1蛋白或其免疫原片段。

本发明涉及一种疫苗组合物，所述组合物包含来自HPV31的L1蛋白或其免疫原片段，但不包含来自至少HPV 16和18的L1蛋白或其免疫原片段。

本发明还涉及一种疫苗的组合物，所述组合物包含来自HPV45的L1蛋白或其免疫原片段，但不包括来自至少HPV 16和18的L1蛋白或其免疫原片段。

本发明还涉及一种疫苗的组合物，所述组合物包含来自HPV52的L1蛋白或其免疫原片段，但不包括来自至少HPV 16和18的L1蛋白或其免疫原片段。

在另一方面，第二疫苗不包含所有含有第一疫苗抗原的HPVL1。比较适宜的是，第一疫苗和第二疫苗没有相同的L1蛋白或相同的完整蛋白片段。为避免疑义，用于第一和第二疫苗的L1蛋白或L1片段中的区域可以相似或相同。但使用相同的抗原(抗原或为整个L1或其片段)，在这方面，在第一和第二疫苗中都不做为首选。

在一方面，第一疫苗和第二疫苗并不具有来自同一HPV型的L1蛋白或其免疫原片段。

在一方面，第一疫苗的组分包含在系统发生学上并不亲近的HPV型，例如HPV 16和HPV 18。

在另一方面，第二疫苗的组分包含在系统发生学上并不近缘的HPV型，例如HPV 31和HPV 45。

据de Villiers等所评定的(Virology.2004Jun 20；324(1)：17-27)，系统发生学上不近缘的HPV型属于不同的种群。

比较适宜的是，第一疫苗中的HPV 16和/或HPV 18组分可预防第二疫苗中的至少一种HPV型引起的感染和/或疾病。

比较适宜的是，本发明中第一和第二疫苗包含来自以下HPV型的HPV L1VLP：

第一疫苗：HPV16、HPV18和HPV 33的组合。第一疫苗可包含另外的HPV58。

第二疫苗：HPV31、HPV45和任选HPV52和/或HPV58的组合。

比较适宜的是，第二次递送疫苗加强了针对第一次递送疫苗中至少一种组分的免疫响应。加强效果优选用本领域标准方法例如ELISA测定抗体滴度进行评价。

一方面，HPV L1蛋白或其免疫原片段用于增强先前激发的针对不同的HPV型的交叉反应抗体。

一方面本发明涉及来自一种HPV型的L1蛋白或其免疫原片段在加强针对第二不同HPV型免疫响应中的用途。

一方面本发明涉及来自一种HPV型的L1蛋白或其免疫原片段在加强针对同源HPV型免疫响应中的用途。

一方面本发明涉及来自一种HPV型的L1蛋白或其免疫原片段在加强针对第二不同HPV型免疫响应中的用途，其中第二HPV型与第二HPV型系统发生学相关。两种HPV型之间的系统发生学关系对本领域技术人员而言是公知的(例如见de Villers等.Virology.2004Jun 20；324(1)：17-27)。在该出版物中，可见乳头瘤病毒被分成系统发生学相关的不同种类。例如，在种16中，有型16、31、33。在种7中，有型18和45。

在另一方面，本发明涉及HPV 31L1蛋白或其免疫原片段在制备用以加强针对(或由其引起)包含L1蛋白或其片段的HPV 16疫苗的免疫响应的药物中的用途。

在另一方面，本发明涉及HPV 52L1蛋白或其免疫原片段在制备用以加强针对包含L1蛋白或其片段的HPV 16疫苗的免疫响应的药物中的用途。

在另一方面，本发明涉及HPV 45L1蛋白或其免疫原片段在制备用以加强针对包含L1蛋白或其片段的HPV 18疫苗的免疫响应的药物中的用途。

在另一方面，本发明涉及HPV18L1蛋白或其免疫原片段在制备用以加强针对包含L1蛋白或其片段的HPV 45疫苗的免疫响应的药物中的用途。

在另一方面，本发明涉及HPV16L1蛋白或其免疫原片段在制备用以加强针对包含L1蛋白或其片段的HPV31疫苗的免疫响应的药物中的用途。

在另一方面，本发明涉及HPV 16L1蛋白或其免疫原片段在制备用以加强针对包含L1蛋白或其片段的HPV 52疫苗的免疫响应的药物中的用途。

一方面，本发明涉及防御HPV感染或疾病的接种程序，所述程序包括递送包含至少来自HPV 16和18的L1蛋白或其免疫原片段的第一HPV疫苗，在适合的间隔后，递送不含第一疫苗HPV16和18L1组分的，而含有至少一种其它致癌性HPV型的L1蛋白或其免疫原片段的第二HPV疫苗。本发明的这一方面，上述限定的第一和第二疫苗的组分可以相反的顺序递送。例如，递送的第一HPV可包含HPV31和HPV45抗原，而递送的第二疫苗包含HPV16和HPV18抗原。

本发明的疫苗另外包含本发明限制范围内的来自其它HPV型的抗原，例如其它致癌型抗原(例如HPV 31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)，皮肤型(例如型5，8)和生殖疣型(型6，11)。

比较适宜的是，每种疫苗能够预防该疫苗中存在的HPV型引起的持续性感染。

比较适宜的是，每种疫苗能够预防该疫苗中存在的HPV型引起的突发性感染。

突发性和持续性宫颈感染在实施例1中有详细说明。

比较适宜的是，每种疫苗可防御与HPV感染(例如ASCUS、CIN 1、CIN2、M3、宫颈癌)相关的细胞学异常，优选由本发明中不含有的HPV引起的感染，例如HPV 31、45或52。

来自其它HPV型的L1蛋白或蛋白片段可包含在本发明的疫苗中，例如皮肤型(特别是HPV 5和8)及与生殖疣相关的类型例如HPV6和11，型6和11本文中被认为非致癌型。

在一方面，疫苗可包含不同量的HPV L1蛋白组分，优选病毒样颗粒。一方面，HPV 16和HPV 18VLP的剂量可以比其它致癌型HPV例如HPV 33或58更高。在另一方面，仅HPV 16和HPV 18VLP人用每剂量为20μg，而其它HPV VLP可以更低剂量用途，例如人用每剂量15或10μg。

在本发明一个方面中，该疫苗可包含一种HPV早期抗原，例如选自由HPV E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7或E8组成的列表中的一种抗原。在一可替代方面中，该疫苗可不含一种HPV早期抗原，例如选自由HPV E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7或E8组成的列表中的一种抗原。

一方面，本发明的疫苗组分为三价(包含一种来自3种不同致癌性HPV型的HPV L1蛋白或其片段)。在另一方面，该疫苗可以为四价，在另一方面该疫苗为五价，在另一方面该疫苗为六价，在另一方面该疫苗为七价，在另一方面该疫苗为八价。更高价也是本文所预料到的。在另一方面，就致癌性HPV型而言，所述疫苗至少为四价或至少为五价，或至少为六价，或至少七价，或至少八价。在另一方面，本发明的组合疫苗包含的片段中有来自4、5、6、7、8、9或10种不同HPV型的L1蛋白或免疫原片段。

优选的是，疫苗中HPV组分的组合并不明显影响任何一种HPV组分的免疫原性。在本发明疫苗组合中，特别优选HPV抗原之间不存在生物学相关的干扰，以使本发明的组合疫苗能够提供针对疫苗中存有的每个HPV基因型引起的感染的有效防御。比较适合的是，针对疫苗组合中的特定HPV型的免疫响应至少为该相同HPV型单独测定时的免疫响应的50％，优选100％或大约100％。对于针对HPV16和HPV18的响应，本发明中的组合疫苗优选激发的免疫响应至少为HPV 16/HPV 18组合疫苗激发的免疫响应的50％。比较适宜的是，在本发明疫苗引起的免疫响应所处于的水平下仍可见对每种HPV型的保护效应。免疫响应可以用适当方法的检测，例如通过在临床前或人体试验中测定抗体响应。在本技术领域内，抗体响应的检测是公知的技术，例如在WO03/077942中有公开说明。

本发明的疫苗或组合物包含L1蛋白的免疫原片段，适合的HPVL1免疫原片段包括在L1的截断、缺失、替代或插入突变体。这种免疫原片段能够提高免疫响应(如需要，当有佐剂辅助时)，所述免疫响应能够识别一种L1蛋白，例如产生该L1蛋白的HPV型的病毒样颗粒。

一方面，一种适合的HPV 16免疫原片段能够针对HPV 31和HPV 52中的至少一种提供交叉保护。本发明一方面能够对针对两者提供交叉保护。

另一方面，一种适合的HPV 18免疫原片段能够针对HPV 45提供交叉保护。

HPV 16和/或HPV 18免疫原片段获得的交叉保护可在人体试验中进行评价，例如在实施例1中所概述的。

同样，可用如实施例1中的标准技术或标准临床前模型检验不同的疫苗，以确定疫苗具有免疫原性。

适合的L1免疫原片段包括截短的L1蛋白。在一方面，截短是去除核定位信号(肽)。另一方面，截短为C末端截短。另一方面，C末端截去少于50个的氨基酸，例如少于40个氨基酸。当L1来自HPV16时，在另一方面，C末端截短是从HPV16L1去除34个氨基酸。当L1来自HPV18时，在另一方面，C末端截短是从HPV18L1去除35个氨基酸。

在一方面，HPV16序列为如下序列：(SEQ ID NO：1)

MSLWLPSEATVYLPPVPVSKVVSTDEYVARTNIYYHAGTSRLLAVGHPYFPIKKPNNNKI 60

LVPKVSGLQYRVFRIHLPDPNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGVEVGRGQPLGVGISGH 120

PLLNKLDDTENASAYAANAGVDNRECISMDYKQTQLCLIGCKPPIGEHWGKGSPCTNVAV 180

NPGDCPPLELINTVIQDGDMVDTGFGAMDFTTLQANKSEVPLDICTSICKYPDYIKMVSE 240

PYGDSLFFYLRREQMFVRHLFNRAGAVGENVPDDLYIKGSGSTANLASSNYFPTPSGSMV 300

TSDAQIFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMSLCAAISTSETTYKNTNF 360

KEYLRHGEEYDLQFIFQLCKITLTADVMTYIHSMNSTILEDWNFGLQPPPGGTLEDTYRF 420

VTSQAIACQKHTPPAPKEDPLKKYTFWEVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQ 471

在另一方面，本发明涉及仅由具有上述氨基酸序列的HPV16L1组成的病毒样颗粒，和涉及包含这种VLP的组合物。

HPV16序列也可为WO9405792或US6649167中公开的，例如适当被截短的序列。适当的截短的序列是根据序列比对评价，在与如上所示相当的位点上进行截短。

在一方面，HPV18的序列为如下序列：(SEQ ID NO：2)

MALWRPSDNTVYLPPPSVARVVNTDDYVTRTSIFYHAGSSRLLTVGNPYFRVPAGGGNKQ 60

DIPKVSAYQYRVFRVQLPDPNKFGLPDNSIYNPETQRLVWACVGVEIGRGQPLGVGLSGH 120

PFYNKLDDTESSHAATSNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTACKSRPL 180

SQGDCPPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSAD 240

PYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGTMGDTVPPSLYIKGTGMRASPGSCVYSPSPSGSIV 300

TSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGVCWHNQLFVTVVDTTRSTNLTICASTQSPVPGQYDATK 360

FKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTADVMSYIHSMNSSILEDWNFGVPPPPTTSLVDTYR 420

FVQSVAITCQKDAAPAENKDPYDKLKFWNVDLKEKFSLDLDQYPLGRKFLVQ 472

在另一方面，本发明涉及仅由具有上述氨基酸序列的HPV18L1组成的病毒样颗粒，和涉及包含这种VLP的组合物。

HPV18序列也可为WO9629413中公开的序列，该序列可被适当截短。适当的截短是根据序列比对评价，在与如上所示相当的位点上进行截短。

在本技术领域内，其它的HPV16和HPV18序列是公知的，也可以适用于本发明。

如果L1蛋白来自另一HPV型，可以根据DNA或蛋白序列比对，对其实施相对应于HPV16和HPV18进行过的C端截短。

适当的截短，例如HPV 31、HPV 45、HPV 52、HPV 58、HPV 33的截短也可以一方面根据序列比对评价，通过去除与以上描述的那些相当的L1蛋白C端部分而实现。

来自血清型31的截短的L1核苷酸(Nucleotidic)序列(SEO IDNO：5)：

ATGTCTCTGTGGCGGCCTAGCGAGGCTACTGTCTACTTACCACCTGTCCCAGTGTCTAAAGTTGTAAGCA 70

CGGATGAATATGTAACACGAACCAACATATATTATCACGCAGGCAGTGCTAGGCTGCTTACAGTAGGCCA 140

TCCATATTATTCCATACCTAAATCTGACAATCCTAAAAAAATAGTTGTACCAAAGGTGTCAGGATTACAA 210

TATAGGGTATTTAGGGTTCGTTTACCAGATCCAAACAAATTTGGATTTCCTGATACATCTTTTTATAATC 280

CTGAAACTCAACGCTTAGTTTGGGCCTGTGTTGGTTTAGAGGTAGGTCGCGGGCAGCCATTAGGTGTAGG 350

TATTAGTGGTCATCCATTATTAAATAAATTTGATGACACTGAAAACTCTAATAGATATGCCGGTGGTCCT 420

GGCACTGATAATAGGGAATGTATATCAATGGATTATAAACAAACACAACTGTGTTTACTTGGTTGCAAAC 490

CACCTATTGGAGAGCATTGGGGTAAAGGTAGTCCTTGTAGTAACAATGCTATTACCCCTGGTGATTGTCC 560

TCCATTAGAATTAAAAAATTCAGTTATACAAGATGGGGATATGGTTGATACAGGCTTTGGAGCTATGGAT 630

TTTACTGCTTTACAAGACACTAAAAGTAATGTTCCTTTGGACATTTGTAATTCTATTTGTAAATATCCAG 700

ATTATCTTAAAATGGTTGCTGAGCCATATGGCGATACATTATTTTTTTATTTACGTAGGGAACAAATGTT 770

TGTAAGGCATTTTTTTAATAGATCAGGCACGGTTGGTGAATCGGTCCCTACTGACTTATATATTAAAGGC 840

TCCGGTTCAACAGCTACTTTAGCTAACAGTACATACTTTCCTACACCTAGCGGCTCCATGGTTACTTCAG 910

ATGCACAAATTTTTAATAAACCATATTGGATGCAACGTGCTCAGGGACACAATAATGGTATTTGTTGGGG 980

CAATCAGTTATTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGTAGTACCAATATGTCTGTTTGTGCTGCAATTGCA 1050

AACAGTGATACTACATTTAAAAGTAGTAATTTTAAAGAGTATTTAAGACATGGTGAGGAATTTGATTTAC 1120

AATTTATATTTCAGTTATGCAAAATAACATTATCTGCAGACATAATGACATATATTCACAGTATGAATCC 1190

TGCTATTTTGGAAGATTGGAATTTTGGATTGACCACACCTCCCTCAGGTTCTTTGGAGGATACCTATAGG 1260

TTTGTCACCTCACAGGCCATTACATGTCAAAAAACTGCCCCCCAAAAGCCCAAGGAAGATCCATTTAAAG 1330

ATTATGTATTTTGGGAGGTTAATTTAAAAGAAAAGTTTTCTGCAGATTTAGATCAGTTTCCACTGGGTCG 1400

CAAATTTTTATTACAGTAA 1419

在另一方面，本发明涉及仅由具有上述氨基酸序列的HPV31L1组成的病毒样颗粒，和涉及包含这种VLP的组合物。

来自血清型45的截短的L1核苷酸序列(SEO ID NO：6)：

ATGGCTTTGTGGCGGCCTAGTGACAGTACGGTATATCTTCCACCACCTTCTGTGGCCAGAGTTGTCAACA 70

CTGATGATTATGTGTCTCGCACAAGCATATTTTACCATGCAGGCAGTTCCCGATTATTAACTGTAGGCAA 140

TCCATATTTTAGGGTTGTACCTAGTGGTGCAGGTAATAAACAGGCTGTTCCTAAGGTATCCGCATATCAG 210

TATAGGGTGTTTAGAGTAGCTTTACCCGATCCTAATAAATTTGGATTACCTGATTCTACTATATATAATC 280

CTGAAACACAACGTTTGGTTTGGGCATGTGTAGGTATGGAAATTGGTCGTGGGCAGCCTTTAGGTATTGG 350

CCTAAGTGGCCATCCATTTTATAATAAATTGGATGATACAGAAAGTGCTCATGCGGCTACGGCTGTTGTT 420

ACGCAGGATGTTAGGGATAATGTGTCAGTTGATTATAAGCAAACACAGCTGTGTATTTTAGGTTGTGTAC 490

CTGCTATTGGTGAGCACTGGGCCAAGGGCACACTTTGTAAACCTGCACAATTGCAGCCTGGTGACTGTCC 560

TCCTTTGGAACTTAAAAACACCATTATTGAGGATGGTGATATGGTGGATACAGGTTATGGGGCAATGGAT 630

TTTAGTACATTGCAGGATACAAAGTGCGAGGTTCCATTAGACATTTGTCAATCCATCTGTAAATATCCAG 700

ATTATTTGCAAATGTCTGCTGATCCCTATGGGGATTCTATGTTTTTTTGCCTACGCCGTGAACAACTGTT 770

TGCAAGACATTTTTGGAATAGGGCAGGTGTTATGGGTGACACAGTACCTACAGACCTATATATTAAAGGC 840

ACTAGCGCTAATATGCGTGAAACCCCTGGCAGTTGTGTGTATTCCCCTTCTCCCAGTGGCTCTATTATTA 910

CTTCTGATTCTCAATTATTTAATAAGCCATATTGGTTACATAAGGCCCAGGGCCATAACAATGGTATTTG 980

TTGGCATAATCAGTTGTTTGTTACTGTAGTGGACACTACCCGCAGTACTAATTTAACATTATGTGCCTCT 1050

ACACAAAATCCTGTGCCAGGTACATATGATCCTACTAAGTTTAAGCACTATAGTAGACATGTGGAGGAAT 1120

ATGATTTACAGTTTATTTTTCAGTTGTGCACTATTACTTTAACTGCAGAGGTTATGTCATATATCCATAG 1190

TATGAATAGTAGTATATTGGAAAATTGGAATTTTGGTGTACCTCCACCACCTACTACAAGTTTAGTGGAT 1260

ACATATCGTTTTGTGCAATCAGTTGCTGTTACCTGTCAAAAGGATACTACACCTCCAGAAAAGCAGGATC 1330

CATATGATAAATTAAAGTTTTGGACTGTTGACCT AAGGAAAAATTTTCCTCCGATTTGGATCAATATCC 1400

CCTTGGTCGAAAGTTTTTAGTTCAGTAA

在另一方面，本发明涉及仅由具有上述氨基酸序列的HPV45L1组成的病毒样颗粒，和涉及包含这种VLP的组合物。

本发明的L1蛋白或片段可任选以融合蛋白形式存在，例如L1蛋白与L2蛋白或一种早期蛋白融合。

HPV L1蛋白优选以一种衣壳蛋白亚单位或病毒样颗粒(VLP)形式存在。一方面，HPV VLP可用于本发明。在本技术领域内，HPVVLP和VLP的制备方法是公知的。VLP通常是由病毒的结构蛋白L1和任选的L2构建的，例如见WO9420137、US5985610、W09611272、US6599508B1、US6361778B1、EP 595935。任何适合的HPV VLP可用于本发明，以提供交叉保护，例如L1或L1+L2VLP。

比较适宜的是，该VLP为只含有L1蛋白的VLP。

VLP的形成可通过标准技术进行评价，例如电子显微镜法和动态激光光散射技术。

VLP可以包括全长L1蛋白。一方面用于形成VLP的L1蛋白为如上述的截短的L1蛋白。

可在任何合适的细胞基质中制备VLP，例如酵母细胞或昆虫细胞，例如杆状病毒。VLP制备技术为本领域公知技术，例如WO9913056、US 6416945B1、US 6261765B1和US6245568及其参考文献，其全部内容通过引用结合到本文中。

通过解体和重新组装技术可以制备VLP，该技术可提供更稳定和/或更均质的人乳头瘤病毒VLP。例如，McCarthy等，1998″Quantitative Disassembly and Reassembly of Human PapillomavirusType 11Virus L1ke Particles in Vitro(体外定量解体和组装人乳头瘤病毒II型病毒样颗粒)″J.Virology 72(1)：33-41，描述了纯化自昆虫细胞的重组L1HPV II VLP的解体和再组装以获得VLP′s的均质制备。WO9913056和US6245568还描述了解体/再组装过程以制备HPVVLP。

一方面，用例如WO9913056或US6245568描述的方法制备HPVVLP。本发明的HPV L1可与一种佐剂或免疫刺激物组合，但并不限于任何来源的脱毒脂质A和脂质A无毒衍生物、皂素和能够刺激THl型响应的其它试剂。

众所周知，肠道细菌脂多糖(LPS)是一种有效的免疫系统刺激物，尽管由于其毒性效应已减少了其在佐剂中的用途。通过从还原末端葡萄糖胺去除核心糖基和磷酸根制备了无毒的LPS衍生物-单磷酰脂质A(MPL)，该脂质A在Ribi等(1986，Immunology andImmunopharmacology of bacterial endotoxins，Plenum Publ.Corp.NY，p407-419)中有所描述，具有例如下结构：

将二糖骨架上3位的酰基链去除，结果得到进一步脱毒的MPL，被称为3-O-脱酰基-单磷酰脂质A(3D-MPL)。它可以通过GB2122204B中所授的方法纯化和制备，GB 2122204B在参考文献中还公开了二磷酰脂质A及其3-O-脱酰基突变体的制备方法。

3D-MPL的一种适合的剂型为乳剂，其具有小的颗粒，直径尺寸小于0.2μm，其制备方法公开于WO 94/21292中。WO9843670A2中描述了包含单磷酰脂质A和表面活性剂的水溶性制剂。

用来制成本发明组合物的细菌脂多糖源佐剂可从细菌中纯化和处理得到，也可通过合成得到。例如，Ribi等1986(supra)描述了纯化的单磷酰脂质A，专利GB 2220211和US 4912094中，描述了沙门氏菌源的3-O-脱酰基-单磷酰脂质A或二磷酰脂质A。其它纯化和合成的脂多糖已被描述(Hilgers et al.1986，Int.Arch.Allergy.Immunol，79(4)：392-6；Hilgers等，1987，Immunology，60(1)：141-6；和EP O 549074B1)。在一方面，细菌脂多糖佐剂为3D-MPL。

因此，可用于本发明的LPS衍生物为那些与LPS或MPL或3D-MPL结构相似的免疫刺激物。本发明另一方面，LPS衍生物为酰基化的单糖，为上述MPL结构一部分。

皂素在Lacaille-Dubois，M和Wagner H.(1996.A review of thebiological and pharmacological activities of saponins.皂素生物学和药理学活性的综述和Phytomedicine vol 2pp 363-386)中有描述(taught)。皂素为甾体类或三萜糖苷类化合物，在植物和海洋动物界有广泛分布。值得注意的是，皂素在水中形成胶体溶液，震荡时发泡，可用于沉淀胆固醇。当皂素靠近细胞膜时，它们在膜上制造孔状结构，引起膜破裂。这种现象的一个范例就是红细胞溶解，这是某种而不是全部皂素的特性。

众所周知，皂素可在疫苗全身给药中用做佐剂。各皂素的佐剂活性和红细胞溶解活性已在本技术领域被广泛研究(Lacaille-Duboisand Wagner，supra)。例如Quil A(derived from the bark of the SouthAmerican tree Quillaja Saponaria MoL l na来源自南美洲树QuillajaSaponaria Molina及其组分在US 5,057,540和“皂素作为疫苗佐剂”，Kensil，C.R.CritRev Ther Drug Carrier Sy st，1996，12(1-2)：1-55；和专利EP 0362279B1中有所描述。微粒结构，被称为免疫刺激复合物(ISCOMS)，包含Quil A的组分，具有溶血活性，被用于制备疫苗(Morein，B.EP 0109942B1；WO 96/11711；WO 96/33739)。具有溶血活性的皂素QS21和QS 17(Quil A的HPLC纯化组分)被描述为有效的全身性佐剂，其生产方法公开于美国专利No.5,057,540和EP 0362279B1中。被用于全身免疫研究的其它皂素包括那些来源自其它植物种属的皂素，例如石头花属(Gypsophila)和肥皂草属(Saponaria)(Bomford et al.Vaccine，10(9)：572-577，1992)。

例如WO 94/00153所公开的，一个增强的系统包括一种无毒脂质衍生物和一种皂素衍生物的组合物，特别是例如WO 96/33739所公开的QS21和3D-MPL的组合物，或一种例如WO 95/17210所公开的具有较低反应原性的组合物，其中的QS21用胆固醇使其灭活。

在WO 95/17210中，描述了一种特别有效的包含QS21和3D-MPL水包油乳剂的制剂，本发明的一个方面应用了该佐剂。

因此，在本发明的一个实施方案中，提供了一种以脱毒脂质A为佐剂的疫苗，更适合的是，以单磷酰脂质A及其衍生物为佐剂。

一方面该疫苗另外包含一种皂素，例如QS21。

一方面该剂型还附加包含一种水包油乳剂。本发明也提供一种制备疫苗制剂的方法，包括将一种本发明的L2肽与中药学上可接受的赋形剂混合，例如3D-MPL。

根据本发明，包含在该疫苗制剂中的其它成分包括非离子去污剂，例如本文中描述的辛苯昔醇(octoxynol)和聚氧乙烯酯，特别是聚乙二醇辛基苯基醚(t-octylphenoxy polyethoxyethanol)(TritonX-100)和聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(polyoxyethylene sorbitanmonooleate)(Tween 80)；本文描述的胆汁盐或胆汁酸盐衍生物，特别是脱氧胆酸钠或牛磺脱氧胆酸钠。这样，本发明一个方面，一种制剂包含了3D-MPL、Triton X-100、Tween 80和脱氧胆酸钠，该制剂可与L2抗原制备物组合以提供一种适合的疫苗。

本发明的一个实施方案中，该疫苗包括一种由胆固醇、皂素和LPS衍生物组成的多孔佐剂制剂。在这点上，该佐剂制剂包含一种内含胆固醇的单层液泡，该液泡具有由二油酰磷脂酰胆碱组成的脂质双层，其中皂素和LPS衍生物与脂质双层连接，或嵌入其中。一方面，这些包含皂素(QS21)和3D-MPL例如LPS衍生物的佐剂制剂中，其中的QS21与胆固醇的比率1∶1至1∶100(重量/重量)，在一方面，比率为1∶5(重量/重量)。这种佐剂制剂在EP 0822831B中有描述，其公开内容通过引用结合到本文中。

比较适宜的是，本发明的疫苗可以和铝合并使用，并优选被铝佐剂吸收或者部分吸收。比较适宜的是，佐剂为一种铝盐，它可以和3D MPL混合，例如磷酸铝和3D MPL。氢氧化铝任选与3D MPL混合也是适合的。

另一方面，本发明的疫苗包括HPV VLP和一种铝盐或者一种铝盐+3D MPL的组合物。氢氧化铝是比较适合的铝盐。

该疫苗也可以包括铝或一种铝化合物作为稳定剂。

在另一方面，这种佐剂可以是一种水包油的乳剂佐剂和3D MPL的组合物。同时这种水包油乳剂包括一种可代谢的油、一种甾体和一种乳化剂。

本发明的疫苗可以不同途径给药，例如口服(例如见专利WO9961052A2)，局部、皮下、黏膜(通常为阴道)、静脉、肌肉、鼻内、舌下、经皮和栓剂。

作为选择，该疫苗可以与其它HPV抗原或非HPV抗原一起被做成制剂或联合用药。比较适宜的是，这些非HPV抗原能提供针对抗其它疾病的保护，例如性传播疾病，如单纯疱疹病毒、EBV、衣原体和HFV。我们特别倾向于该疫苗包含来自HSV的gD或其截短型。这样该疫苗可针对HPV和HSV二者提供保护。

疫苗组分的剂量可根据个体健康状况、性别、年龄和体重、给药途径和疫苗的HPV型而改变。服用量也可根据VLP型的种类数而变化。比较适宜的是，递送一定剂量的疫苗能够产生免疫保护反应。适合的单次疫苗剂量含有每种VLP 1-100μg，一方面每种VLP5-80μg，另一方面5-30μg，另一方面，每种含有VLP 5-20μg，另一方面为5μg、6μg、10μg、15μg或20μg。

对于本发明的所有疫苗，一方面，该疫苗可用于10-15岁的青春期少女接种，例如10-13岁。但是，超过15岁的女孩和成年妇女也可以接种该疫苗。该疫苗也可适用于Pap涂片异常的妇女，或术后消除HPV引起的损伤的妇女，或致癌性HPV型血清反应阴性和DNA阴性的妇女。

一方面，本发明中的疫苗用于接种男性。

一方面，该疫苗按2剂量方案递送，例如可分别按第0、1月方案或第0、6月方案递送。该疫苗接种方案可包含5至10年后进行一剂加强针，例如10年。

一方面，本发明涉及一种3剂量的疫苗，其中(例如)包括递送第一剂和第二剂HPV疫苗，第一剂和第二剂疫苗不同，然后递送含有一种或多种第一剂和第二剂疫苗中所有HPV组分的第三剂疫苗。一方面，第一剂疫苗和第二剂疫苗完全与HPV L1成分完全不同。

例如，第一剂疫苗可以包含或由HPV 16和HPV 18L1蛋白组成。第二剂疫苗由HPV 31和HPV 45L1蛋白组成。第三剂疫苗可以包含来自四种HPV型的L1蛋白，即HPV 16、18、31和45。

另一方面，本发明涉及一种3剂量的疫苗，其中(例如)包括递送第一剂和第二剂HPV疫苗，第一剂和第二剂疫苗不同，然后递送不含有第一剂和第二剂疫苗中HPV L1组分的第三剂疫苗。

一方面，该疫苗为液体疫苗制剂，尽管该疫苗可以被冻干和在给药前重悬。

在本申请中所有参考文献的教授，包括专利申请或已授权的专利，均通过引用结合到本文中。

本发明的疫苗包含如上所列的某些HPV组分。本发明另一方面，该疫苗基本上由上述的组分构成。

本发明中所用的术语“疫苗”，是指一种含有免疫原性成分的组合物，可选择做成制剂或与辅助以佐剂，能在个体中，例如人中，激发免疫响应。比较适宜的是，疫苗可针对突发性感染或者持续性感染、或细胞学异常如ASCUS、CIN1、CIN2、CIN3，或由一种或多种HPV型引起的子宫癌诱发保护性免疫响应。

现用下面的用来举例说明本发明的实施例描述本发明。

实施例1

Harper等在the Lancet.2004Nov 13；364(9447)：1757-65中，提供了已开展实验的精确的细节。总之，用HPV 16和HPV 18L1 VLP的混合物免疫15至25岁健康妇女。录入标准是：1)HPV-16和HPV-18血清反应阴性；2)宫颈高危性HPV感染阴性(用HPV PCR检测)；3)有6个或少于6个终身性伴侣；4)PAP涂片正常。

每0.5ml给药剂量的混合物包含20μg HPV-16L1VLP和20μgHPV-18L1VLP，采用500μg氢氧化铝和50μg 3D MPL为佐剂。安慰剂组仅注射500μg的氢氧化铝。

评价了该疫苗针对某种致癌HPV型的疫苗效力(V.E.)，其中V.E.为疫苗组较安慰剂组在防御感染或疾病方面的提高百分数。

通过检测疫苗组和对照组中各种致癌HPV型特异的核酸的存在评价疫苗的交叉保护作用。用例如WO03014402及其参考文献描述的方法进行检测，特别是例如WO 99/14377和Kleter等[Journal ofCLl nical Microbiology(1999)，37(8)：2508-2517]所描述的，用LiPA系统进行HPV DNA非特异性扩增和后继的HPV DNA型检测，上述的全部内容通过引用结合到本文中。

但，任何适合的方法可用于检测样品中的HPV DNA，例如用每种感兴趣的HPV型的特异性引物进行型特异性PCR。对本领域技术人员而言，适合的引物是公知的，或如果致癌HPV型的序列已知，可被简单的构建。

详细地，本文将完整的重复Lancet论文中的方法部分：

本研究的主要目的是在ELISA法检测HPV-16/18血清反应阴性和PCR法检测HPV-16/18阴性的受试者中评价疫苗在6～18个月期间预防HPV-16、HPV-18或HPV-16/18感染的效果。第二个目的包括：评价疫苗在6～18月和6～27月期间预防HPV-16/18持续性感染的效果，评价疫苗预防细胞学确认的低度鳞状上皮内病变(LSIL)，高度鳞状上皮内病变(HSIL)和组织学确认的LSIL(CIN 1)、HSIL(CIN 2或CIN 3)鳞状细胞癌或HPV-16/18感染相关的腺癌的效果。预防HPV-16/18感染相关的细胞学诊断意义未明的不典型鳞状细胞(ASCUS)的效果也事后加入到结果分析中。

我们也进行了一项探索性分析，通过对受损组织PCR检测HPV-16/18DNA相关的CIN 1和CIN 2的组织病理学终点。其它目的包括对疫苗的免疫原性、安全性和耐受性的评价。

北美(加拿大和美国)和巴西的研究者通过广告和从先前的2000年7月至12月进行的HPV横断面流行病学研究的参加者中招募妇女。

对于32个研究地点中的每一个，伦理审查委员会批准了流程、同意表(知情同意书)和修改书。妇女单独签署书面同意书，同意参加研究和阴道镜检查。对于未满18岁者，必须得到父母和本人的同意。

研究包括两个阶段：初始阶段是接种疫苗，并进行随访至18个月做出结论；一延长的盲法研究阶段于27个月时做出结论。

符合初始阶段(0到18个月)条件的妇女包括15-25岁的健康妇女，她们的性伴侣不超过6个，无Pap检验异常或子宫颈消融或切除治疗历史，无正在治疗的外部尖锐湿疣，并且通过ELISA检测细胞学呈阴性，对HPV-16和HPV-18抗体呈血清反应阴性，并且录入研究前不超过90天内通过PCR检测14种高险性HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68)的HPV-DNA呈阴性。

最先完成研究初始阶段的妇女，录入后未进行子宫颈消融或切除治疗，或子宫切除的，符合参加研究延伸阶段(18-27月)的条件。

程序

每剂量二价体HPV-16/18病毒样颗粒疫苗(GlaxoSmithKLlneBiologicals，Rixensart，Belgium)含有20μg HPV-16L1病毒样颗粒和20μg HPV-18L1病毒样颗粒。每一型的病毒样颗粒在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)sf-9和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)Hi-5细胞基质中产生，疫苗以含有500μg的氢氧化铝和50μg的3-脱酰基-单磷酰脂质A(MPL，Corixa，Montana，USA)的AS04为佐剂，以单剂量小瓶形式提供。安慰剂每剂量含有500μg氢氧化铝，外观与HPV-16/18疫苗相同。每一研究参加者于0月、1月和6月接受0.5ml疫苗或安慰剂。

卫生保健提供者用宫颈刷和刮勺(在PreservCyt中洗涤，Cytyc公司，Boxborough，MA，美国)获得子宫颈样品，以在筛查中、6月和12时进行细胞学和HPV DNA检验。在0月、6月和随后的每3个月，妇女自己用2支有序的药签(放置于PreservCyt中)获得子宫颈样品，以进行HPV DNA检验[DM Harper，WW Noll，DR Belloni andBF.Cole，Randomized clinical trial of PCR-determined humanpapillomavirus detection methods：self-sampling versus clinician-directed-biologic concordance and women′s preferences，人乳头瘤病毒PCR检测方法的随机临床试验：自助取样与临床医师指导取样的比较-生物学和谐性(biologic concordance)和妇女偏好.Am J ObstetGynecol 186(2002)，pp.365-373]。中心实验室(Quest Diagnostics，Teterboro，NJ，USA)采用1991Bethesda分类系统报告细胞学结果(ThinPrep，Cytyc Corporation)。

流程指南建议在2次ASCUS报告或1次诊断意义未明的不典型腺体细胞、LSIL或HSIL、鳞状细胞癌、原位腺癌或腺癌报告后进行阴道镜检查。该流程指南还建议对可疑的损伤进行活组织检查。

中心组织学实验室根据福尔马林固定的组织样品为临床管理做出初步的诊断。3名病理学家组成的小组采用CIN系统完成后续的对HPV-16和HPV-18相关损伤的共识诊断。该共识诊断还包括对为进行PCR检查皮损HPV DNA时显微解剖而取的切片进行检查。

HPV DNA分离自细胞学样品(MagNa纯化总核酸系统，罗氏诊断，Almere，荷兰)和子宫颈活组织检查样品(蛋白酶K提取)，用广谱引物SPF10从一等份纯化的总DNA中扩增得到一段65bp大小L1基因。[B Kleter，LJ van Doom，J ter Schegget等，Novel short-fragment PCR assay for highly sensitive broad-spectrum detection ofanogenital human papillomaviruses(可高灵敏广谱检查肛门-生殖器人乳头瘤病毒的新颖的短片段PCR分析).Am J Pathol153(1998)，pp.1731-1739：LJ van Doom，W Quint，B Kleter等，Genotyping of humanpapillomavirus in Liquid cytology cervical specimens by the PGMY Lineblot assay and the SPF(10)Line probe assay(通过PGMY线性杂交分析法和SPF(10)线性探针分析法对液体细胞子宫颈样品中的人乳头瘤病毒进行基因分型).J Clin Microbiol 40(2002)，pp.979-983和WGQuint，G Scholte，LJ van Doom，B Kleter，PH Smits and J.Llndeman，Comparative analysis of human papillomavirus infections in cervicalscrapes and biopsy specimens by general SPF(10)PCR and HPVgenotyping(通过常规SPF(10)PCR和HPV分型比较分析子宫颈刮片和活组织检验样品中的人乳头瘤病毒感染).J Pathol 194(2001)，pp.51-58]。扩增的产物用DNA酶免疫分析法进行检测。采用线性探针分析法(LiPA Kit HPV DSfNO LiPA HPV基因型分析，SPF-10系统版本1，Inno genetics，Gent，比利时，由Labo Bio-medical Products生产，Rijswijk，荷兰)检测25种HPV基因型(6，11、16、18、31、33、34、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68、70和74)。[B Kleter，LJ van Doom，L Schrauwen等，Developmentand clinical evaluation of a highly sensitive PCR-reverse hybridizationLine probe assay for detection and identification of anogenital humanpapillomavirus开发和临床评价一种高灵敏的用以检测和鉴定肛门和生殖器人乳头瘤病毒的PCR-反向杂交线性探针分析法.J ClinMicrobiol 37(1999)，pp.2508-2517]。任何通过DNA酶免分析法检测为阳性的样品再用型特异性HPV-16和HPV-18PCR进行检验。HPV-16型特异性PCR引物扩增E6/E7基因的92bp的片段，而HPV-18型特异性PCR引物扩增L1基因的126bp的片段。[MF Baay，WG Quint，J Koudstaal等，Comprehensive study of several general and type-specific primer pairs for detection of human papillomavirus DNA by PCRin paraffin-embedded cervical carcinomas(比较分析几种通过对石蜡包埋子宫颈癌PCR以检测人乳头瘤病毒DNA的通用引物对和型特异性引物对).J Clin Microbiol 34(1996)，pp.745-747]

在试验过程中，当出现至少一次阳性HPV-16或HPV-18PCR结果时，我们定义为突发性子宫颈HPV-16/18感染，而间隔至少6个月同一病毒基因型有至少2次HPV-DNA PCR阳性分析结果，我们定义为持续性子宫颈HPV-16/18感染。[H Richardson，G Kelsall，PTelLl er等，The natural history of type-specific human papillomavirusinfections in female university students(女性大学生中型特异性人乳头瘤感染的自然史).Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 12(2003)，pp.485～90和AB Moscicki，JH Ellenberg，S Farhat和J.Xu，Persistence ofhuman papillomavirus infection in HIV-infected and -uninfectedadolescent girls：risk factors and differences，by phylogenetic type，HIV(感染和未感染青春期少女中人乳头瘤病毒的持续存在：不同系统发育类型的风险系数和差异).J Infect Dis 190(2004)，pp.37-45]。研究过程中HPV-DNA测试结果对研究者保密，细胞学和组织学诊断结果仅为临床管理目的而公开。分析包括子宫颈样品和合并的子宫颈和自助获得的子宫颈样品的HPV-16/18DNA的结果。

我们在0、1、6、7、12和18月从试验参加者采集血浆，以进行免疫原性评价。通过EL1SA进行HPV-16和HPV-18病毒样颗粒抗体的血清学检验。用重组HPV-16或HPV-18病毒样颗粒作为包被抗原以进行抗体检测(见webappendixhttp://image.thelancet.com/extras/04artl0103webappendix.pdf)。当滴度大于或等于检测截值滴度(对HPV-16为8EL1SA单位/毫升，对HPV-18为7EL1SA单位/毫升)时，被定义为血清阳性。代表性的正常滴度是通过测定先前流行病学研究中ELISA法诊断为HPV-16或HPV-18血清阳性的妇女中的血清而确定的。

妇女接种疫苗接种后最初7天在日记卡上记录经历的症状，症状有3级强度标准。另外，她们通过会面向研究人员报告疫苗接种后最初30天内所有的不良事件。整个研究过程中的严重不良事件都被收集。

统计方法

假设在12个月中，HPV-16和HPV-18型感染的累计发病率为6％，我们估计每处理组500名妇女可获得80％的把握度以评价疫苗效率的95％置信区间的低限高于0。我们假设在18个月内患者的保有率为80％。中期进行的对效果，安全性和免疫原性的分析仅为了未来研究计划。当中期分析发生后，用O′Brien and Fleming方法校正α值以服务于最终分析(全部为双侧检验)。[PC O′Brien and TR.Fleming，A multiple testing procedure for clinicaltrials用于临床试验的多重检验法.Biometrics 35(1979)，pp.549-556]。

根据确证的算法，采用因特网随机系统集中进行分层的区组随机化。根据年龄(15-17、18-21和22-25岁)和地区(北美和巴西)进行分层。每一剂疫苗标记一个基于研究人员输入到计算机化随机系统中的特定的参加者信息的随机选择的数字。处理分配对研究者和参加长期随访研究的妇女保密。

“意向治疗组群”和“根据流程组群”如图所示，其中排除于分析的理由按等级顺序列出；根据最高分级标准，符合多于一条排除标准的妇女，只被计算一次。我们将进入“意向治疗”和“根据流程分析”的一批参加者称为组群，尽管用以限制受试者入组“根据流程组群”的信息是通过随访后得知的。

我们对疫苗效果同时进行“根据流程分析”和“意向治疗分析”。在“根据流程18个月分析”中，疫苗效果的计算是基于接种组与安慰剂组比较患HPV-16/18感染的比例。疫苗效果定义为1减去两组感染比例的比率；95％置信区间衡量了效率估算的精密度，p值用双侧Fisher′s精确检验进行计算。相应的比率表示为以结果的病例数除以有危险的参加者的人数。“根据流程18个月组群”包括那些录入的接受3剂计划疫苗和遵守如图所描述的流程的妇女。

在“意向治疗分析”和“根据流程27个月分析”中，疫苗效果的计算基于Cox比例风险模型，比较接种组和安慰剂组时间与HPV-16/18感染病例发生率的关系。这使得能够控制每组中治愈者人次数据。疫苗效果的计算为：1减去风险率，p值用log rank检验计算。相应的比率表示为：病例数除以总人次。所有入组的妇女，接受至少一剂疫苗或安慰剂，在0月时高风险HPV-DNA为阴性，而且提供用以结果评价的任何数据，这样的妇女包含在“意向治疗组群”中。“根据流程27个月组群”包含来自“根据流程18个月组群”的结果和在延长期间发生的结果(从18个月到27个月)。

用Fisher′s精确检验比较法计算安全性分析的P值。安全性分析的组群包括接受至少一剂疫苗或安慰剂，并且遵守指定的最低流程要求的所有入组妇女(见下图：)

在一“根据流程安全性组群”的亚群中，评价了疫苗的免疫原性，该亚群包含有0、7和18个月的血清学结果的妇女，这些妇女根据计划接受全部3剂研究疫苗或安慰剂，遵守样品采集程序，在试验过程中没有变成HPV-16/18-DNA阳性。用Fisher′s精确检验法(p＜0.001判定为有意义)比较疫苗组和安慰剂组血清阳性率。用ANOVA和Kruskal-Wallis检验比较两组几何平均滴度。

用SAS 8.2版本(SAS Institute，Cary，North Carolina)进行区组随机化和统计分析。

初步分析和结果

对交叉保护的初步分析的结果见专利申请WO2004/056389，其全部内容通过引用结合到本文中。

在“ITT”(“(Intention To Treat)意向治疗组群”，是指所有至少接受一剂疫苗的受试者)中进行初步分析，数据见于表A。

如表B和表C所示的结果涉及“ATP”((According To Protocol)根据流程)组，其中的患者遵守试验的标准。表B是对所有患者的数据的中值分析，采样时组群中至少50％患者第一次疫苗接种后满18个月。表C为最终结果，所有数据得自第一次接种(0月)后18个月的受试者。在ATP组中，所有患者接受于0、1和6月接受3剂疫苗，并且在6月时为血清学阴性。

正如表A数据所证明的，用HPV 16和HPV 18VLP混合物免疫获得了明显的针对其它HPV型的交叉保护。在这点上，样本数太小不足以提供精确的统计分析，但数据表明了一种阳性趋势，并提示用HPV 16和HPV 18VLP免疫可有效防御其它HPV型的感染。

随着研究进展，这一点被证实。

表B表明HPV 16和HPV 18提供了针对一组高风险致癌HPV型31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68的具有统计学意义的交叉保护。

表C表明，除了HPV-18相关型(该型表现出非常强的趋势)，对以下所评价的组HPV 31、35、58；HPV 31、33、35、52、58；和12种高风险型(非HPV-16/18)的交叉保护作用具有统计学意义。

对特定型的特异的交叉保护进行了进一步分析。

评价了预防12种高风险致癌型31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68，HPV-16系统发生学相关型(组31，35和58；31，33，35，52和58)和HPV-18系统发生学相关型(45和59)相关的感染和疾病的疫苗效果。

对遵守所有临床试验标准的“ATP”(“根据流程组”)组患者进行了一项分析。在“ATP”组，所有患者于0、1和6个月接受了3剂疫苗，并且在6个月时，血清学呈阴性。

结果

如表1所示数据所证明的，用HPV 16和HPV 18VLP的混合物免疫可获得较对照组具有统计学意义的针对HPV31、52和45的交叉保护作用。

也观察到针对所有HPV 16相关型(HPV-31、33、35、52和58)的组和所有不包括型16和18的高风险型(HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68)的组的具有统计学意义的交叉保护作用。

还观察到针对型31和52的具有统计学意义的抗持续性感染的交叉保护作用，还观察到针对所有的HPV 16相关型的组引起的持续性感染的具有统计学意义的交叉保护作用(见表2)

还观察到针对与型HPV 52相关的细胞学异常的具有统计学意义的交叉保护作用，还观察到针对与所有的HPV 16型相关(HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-52和HPV-58)的组和不包括型HPV-16和HPV-18的所有高风险型(HPV31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-56、HPV-58、HPV-59、HPV-66和HPV-68)的组相关的细胞学异常的具有统计学意义的交叉保护作用。

实施例2

研究使用10组C57B1/6小鼠，每组24只。

根据以下信息按0天和第28天2剂量方案肌肉给药接种小鼠(1组小鼠用NaCl进行初始免疫和加强免疫，下面未列出)。

用不同的HPV病毒样颗粒组合物进行接种，使用的4种不同VLP为：仅HPV 16L1的VLP、仅HPV 18L1的VLP、仅HPV 31L1的VLP和仅HPV 45L1的VLP。

VLP是根据WO2003077942A2中公开内容制备和纯化的，在此通过引用结合到本文中。

更具体的讲，HPV 16VLP按以下顺序步骤纯化：阴离子交换色谱法(二甲基氨基乙基-DMAE)，阴离子交换色谱法(三甲基氨基乙基-TMAE)，羟基磷灰石色谱法，过滤和另一阴离子交换步骤，这次用二甲基氨基乙基-DMAE，随后是最后过滤。HPV 31VLP以同样的顺序步骤制备。

HPV 18VLP按以下顺序步骤纯化：阴离子交换色谱法(二甲基氨基乙基-DMAE)，阴离交换子色谱法(三甲基氨基乙基-TMAE)，羟基磷灰石色谱法，过滤和辛基琼脂糖凝胶柱(疏水作用色谱法)，随后是最后过滤。HPV 45VLP以同样的顺序步骤制备。

下面L1序列用于制造本实验的VLP：

来自血清型16的截短的L1的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)：

ATGTCTCTTTGGCTGCCTAGTGAGGCCACTGTCTACTTGCCTCCTGTCCCAGTATCTAAGGTTGTAAGCA 70

CGGATGAATATGTTGCACGCACAAACATATATTATCATGCAGGAACATCCAGACTACTTGCAGTTGGACA 140

TCCCTATTTTCCTATTAAAAAACCTAACAATAACAAAATATTAGTTCCTAAAGTATCAGGATTACAATAC 210

AGGGTATTTAGAATACATTTACCTGACCCCAATAAGTTTGGTTTTCCTGACACCTCATTTTATAATCCAG 280

ATACACAGCGGCTGGTTTGGGCCTGTGTAGGTGTTGAGGTAGGTCGTGGTCAGCCATTAGGTGTGGGCAT 350

TAGTGGCCATCCTTTATTAAATAAATTGGATGACACAGAAAATGCTAGTGCTTATGCAGCAAATGCAGGT 420

GTGGATAATAGAGAATGTATATCTATGGATTACAAACAAACACAATTGTGTTTAATTGGTTGCAAACCAC 490

CTATAGGGGAACACTGGGGCAAAGGATCCCCATGTACCAATGTTGCAGTAAATCCAGGTGATTGTCCACC 560

ATTAGAGTTAATAAACACAGTTATTCAGGATGGTGATATGGTTGATACTGGCTTTGGTGCTATGGACTTT 630

ACTACATTACAGGCTAACAAAAGTGAAGTTCCACTGGATATTTGTACATCTATTTGCAAATATCCAGATT 700

ATATTAAAATGGTGTCAGAACCATATGGCGACAGCTTATTTTTTTATTTACGAAGGGAACAAATGTTTGT 770

TAGACATTTATTTAATAGGGCTGGTGCTGTTGGTGAAAATGTACCAGACGATTTATACATTAAAGGCTCT 840

GGGTCTACTGCAAATTTAGCCAGTTCAAATTATTTTCCTACACCTAGTGGTTCTATGGTTACCTCTGATG 910

CCCAAATATTCAATAAACCTTATTGGTTACAACGAGCACAGGGCCACAATAATGGCATTTGTTGGGGTAA 980

CCAACTATTTGTTACTGTTGTTGATACTACACGCAGTACAAATATGTCATTATGTGCTGCCATATCTACT 1050

TCAGAAACTACATATAAAAATACTAACTTTAAGGAGTACCTACGACATGGGGAGGAATATGATTTACAGT 1120

TTATTTTTCAACTGTGCAAAATAACCTTAACTGCAGACGTTATGACATACATACATTCTATGAATTCCAC 1190

TATTTTGGAGGACTGGAATTTTGGTCTACAACCTCCCCCAGGAGGCACACTAGAAGATACTTATAGGTTT 1260

GTAACATCCCAGGCAATTGCTTGTCAAAAACATACACCTCCAGCACCTAAAGAAGATCCCCTTAAAAAAT 1330

ACACTTTTTGGGAAGTAAATTTAAAGGAAAAGTTTTCTGCAGACCTAGATCAGTTTCCTTTAGGACGCAA 1400

ATTTTTACTACAATAA 1416

来自血清型18的截短型L1的核苷酸序列(SEQ ID NO：4)

ATGGCTTTGTGGCGGCCTAGTGACAATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCTGTGGCAAGAGTTGTAAATA 70

CCGATGATTATGTGACTCGCACAAGCATATTTTATCATGCTGGCAGCTCTAGATTATTAACTGTTGGTAA 140

TCCATATTTTAGGGTTCCTGCAGGTGGTGGCAATAAGCAGGATATTCCTAAGGTTTCTGCATACCAATAT 210

AGAGTATTTAGGGTGCAGTTACCTGACCCAAATAAATTTGGTTTACCTGATAATAGTATTTATAATCCTG 280

AAACACAACGTTTAGTGTGGGCCTGTGTTGGAGTGGAAATTGGCCGTGGTCAGCCTTTAGGTGTTGGCCT 350

TAGTGGGCATCCATTTTATAATAAATTAGATGACACTGAAAGTTCCCATGCCGCCACGTCTAATGTTTCT 420

GAGGACGTTAGGGACAATGTGTCTGTAGATTATAAGCAGACACAGTTATGTATTTTGGGCTGTGCCCCTG 490

CTATTGGGGAACACTGGGCTAAAGGCACTGCTTGTAAATCGCGTCCTTTATCACAGGGCGATTGCCCCCC 560

TTTAGAACTTAAAAACACAGTTTTGGAAGATGGTGATATGGTAGATACTGGATATGGTGCCATGGACTTT 630

AGTACATTGCAAGATACTAAATGTGAGGTACCATTGGATATTTGTCAGTCTATTTGTAAATATCCTGATT 700

ATTTACAAATGTCTGCAGATCCTTATGGGGATTCCATGTTTTTTTGCTTACGGCGTGAGCAGCTTTTTGC 770

TAGGCATTTTTGGAATAGGGCAGGTACTATGGGTGACACTGTGCCTCCATCCTTATATATTAAAGGCACA 840

GGTATGCGTGCTTCACCTGGCAGCTGTGTGTATTCTCCCTCTCCAAGTGGCTCTATTGTTACCTCTGACT 910

CCCAGTTGTTTAATAAACCATATTGGTTACATAAGGCACAGGGTCATAACAATGGTGTTTGCTGGCATAA 980

TCAATTATTTGTTACTGTGGTAGATACCACTCGCAGTACCAATTTAACAATATGTGCTTCTACACAGTCT 1050

CCTGTACCTGGGCAATATGATGCTACCAAATTTAAGCAGTATAGCAGACATGTTGAGGAATATGATTTGC 1120

AGTTTATTTTTCAGTTGTGTACTATTACTTTAACTGCAGATGTTATGTCCTATATTCATAGTATGAATAG 1190

CAGTATTTTAGAGGATTGGAACTTTGGTGTTCCCCCCCCGCCAACTACTAGTTTGGTGGATACATATCGT 1260

TTTGTACAATCTGTTGCTATTACCTGTCAAAAGGATGCTGCACCGGCTGAAAATAAGGATCCCTATGATA 1330

AGTTAAAGTTTTGGAATGTGGATTTAAAGGAAAAGTTTTCTTTAGACTTAGATCAATATCCCCTTGGACG 1400

TAAATTTTTGGTTCAGTAA 1419

来自血清型31的截短型L1的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)

ATGTCTCTGTGGCGGCCTAGCGAGGCTACTGTCTACTTACCACCTGTCCCAGTGTCTAAAGTTGTAAGCA 70

CGGATGAATATGTAACACGAACCAACATATATTATCACGCAGGCAGTGCTAGGCTGCTTACAGTAGGCCA 140

TCCATATTATTCCATACCTAAATCTGACAATCCTAAAAAAATAGTTGTACCAAAGGTGTCAGGATTACAA 210

TATAGGGTATTTAGGGTTCGTTTACCAGATCCAAACAAATTTGGATTTCCTGATACATCTTTTTATAATC 280

CTGAAACTCAACGCTTAGTTTGGGCCTGTGTTGGTTTAGATGTAGGTCGCGGGCAGCCATTAGGTGTAGG 350

TATTAGTGGTCATCCATTATTAAATAAATTTGATGACACTGAAAACTCTAATAGATATGCCGGTGGTCCT 420

GGCACTGATAATAGGGAATGTATATCAATGGATTATAAACAAACACAACTGTGTTTACTTGGTTGCAAAC 490

CACCTATTGGAGAGCATTGGGGTAAAGGTAGTCCTTGTAGTAACAATGCTATTACCCCTGGTGATTGTCC 560

TCCATTAGAATTAAAAAATTCAGTTATACAAGATGGGGATATGGTTGATACAGGCTTTGGAGCTATGGAT 630

TTTACTGCTTTACAAGACACTAAAAGTAATGTTCCTTTGGACATTTGTAATTCTATTTGTAAATATCCAG 700

ATTATCTTAAAATGGTTGCTGAGCCATATGGCGATACATTATTTTTTTATTTACGTAGGGAACAAATGTT 770

TGTAAGGCATTTTTTTAATAGATCAGGCACGGTTGGTGAATCGGTCCCTACTGACTTATATATTAAAGGC 840

TCCGGTTCAACAGCTACTTTAGCTAACAGTACATACTTTCCTACACCTAGCGGCTCCATGGTTACTTCAG 910

ATGCACAAATTTTTAATAAACCATATTGGATGCAACGTGCTCAGGGACACAATAATGGTATTTGTTGGGG 980

CAATCAGTTATTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGTAGTACCAATATGTCTGTTTGTGCTGCAATTGCA 1050

AACAGTGATACTACATTTAAAAGTAGTAATTTTAAAGAGTATTTAAGACATGGTGAGGAATTTGATTTAC 1120

AATTTATATTTCAGTTATGCAAAATAACATTATCTGCAGACATAATGACATATATTCACAGTATGAATCC 1190

TGCTATTTTGGAAGATTGGAATTTTGGATTGACCACACCTCCCTCAGGTTCTTTGGAGGATACCTATAGG 1260

TTTGTCACCTCACAGGCCATTACATGTCAAAAAACTGCCCCCCAAAAGCCCAAGGAAGATCCATTTAAAG 1330

ATTATGTATTTTGGGAGGTTAATTTAAAAGAAAAGTTTTCTGCAGATTTAGATCAGTTTCCACTGGCTCG 1400

CAAATTTTTATTACAGTAA 1419

来自血清型45的截短型L1的核酸序列(SEQ ID NO：6)

ATGGCTTTGTGGCGGCCTAGTGACAGTACGGTATATCTTCCACCACCTTCTGTGGCCAGAGTTGTCAACA 70

CTGATGATTATCTGTCTCGCACAAGCATATTTTACCATGCAGGCAGTTCCCGATTATTAACTGTAGGCAA 140

TCCATATTTTAGGGTTGTACCTAGTGGTGCAGGTAATAAACAGGCTGTTCCTAAGGTATCCGCATATCAG 210

TATAGGGTGTTTAGAGTAGCTTTACCCGATCCTAATAAATTTGGATTACCTGATTCTACTATATATAATC 280

CTGAAACACAACGTTTGGTTTGGGCATGTGTAGGTATGGAAATTGGTCGTGGGCAGCCTTTAGGTATTGG 350

CCTAAGTGGCCATCCATTTTATAATAAATTGGATGATACAGAAAGTGCTCATGCGGCTACGGCTGTTGTT 420

ACGCAGGATGTTAGGGATAATGTGTCAGTTGATTATAAGCAAACACAGCTGTGTATTTTAGGTTGTGTAC 490

CTGCTATTGGTGAGCACTGGGCCAAGGGCACACTTTGTAAACCTGCACAATTGCAGCCTGGTGACTGTCC 560

TCCTTTGGAACTTAAAAACACCATTATTGAGGATGGTGATATGGTGGATACAGGTTATGGGGCAATGGAT 630

TTTAGTACATTGCAGGATACAAAGTGCGAGGTTCCATTAGACATTTGTCAATCCATCTGTAAATATCCAG 700

ATTATTTGCAAATGTCTGCTGATCCCTATGGGGATTCTATGTTTTTTTGCCTACGCCGTGAACAACTGTT 770

TGCAAGACATTTTTGGAATAGGGCAGGTGTTATGGGTGACACAGTACCTACAGACCTATATATTAAAGGC 840

ACTAGCGCTAATATGCGTGAAACCCCTGGCAGTTGTGTGTATTCCCCTTCTCCCAGTGGCTCTATTATTA 910

CTTCTGATTCTCAATTATTTAATAAGCCATATTGGTTACATAAGGCCCAGGGCCATAACAATGGTATTTG 980

TTGGCATAATCAGTTGTTTGTTACTGTAGTGGACACTACCCGCAGTACTAATTTAACATTATGTGCCTCT 1050

ACACAAAATCCTGTGCCAGGTACATATGATCCTACTAAGTTTAAGCACTATAGTAGACATGTGGAGGAAT 1120

ATGATTTACAGTTTATTTTTCAGTTGTGCACTATTACTTTAACTGCAGAGGTTATGTCATATATCCATAG 1190

TATGAATAGTAGTATATTGGAAAATTGGAATTTTGGTGTACCTCCACCACCTACTACAAGTTTAGTGGAT 1260

ACATATCGTTTTGTGCAATCAGTTGCTGTTACCTGTCAAAAGGATACTACACCTCCAGAAAAGCAGGATC 1330

CATATGATAAATTAAAGTTTTGGACTGTTGACCTAAAGGAAAAATTTTCCTCCGATTTGGATCAATATCC 1400

CCTTGGTCGAAAGTTTTTAGTTCAGTAA 1428

每种抗原使用剂量为2μg。HPV16、18和45VLP是吸附到佐剂上的。所用佐剂为AS04D，为人用量的1/10，即每支疫苗中总共含有5μg 3D MPL和50μg的氢氧化铝。

WO00/23105中公开了HPV病毒样颗粒与氢氧化铝、3D MPL结合。

例如，在四价16、18、31、45疫苗中，2μg每种HPV 16VLP被5μg氢氧化铝所吸附。对于HPV 18和HPV 45情况相同。对于HPV31VLP，则是2μg VLP被2.5μg的氢氧化铝所吸附。

5μg 3D-MPL是单独被17.5μg氢氧化铝所吸附。

然后3D-MPL和VLP混合，加入补充的氢氧化铝，结果每支疫苗剂量为50μg。

疫苗接种程序：

第一组合物第二组合物

VLP 16/18AS04D VLP 16/18AS04D

VLP 16/18/31/45AS04D VLP 16/18/31/45AS04D

NaCl VLP 31/45AS04D

读出结果(read out)

于初始免疫和二次免疫14天后(分别为post I和post II)，用本技术领域所公知的经典的ELISA技术测定抗体滴度。

于14天的post II进行细胞内染色(ICS，Roederer et al.2004 CLln.Immunol.110：199)评价CMI响应。

结果见图1-18。在这些图中，post I和post II数据是在免疫剂量I和II后分别测定的。被称为“post I加强剂(booster)”的棒反映了首先给予NaCl，然后在28天时给予二价或四价疫苗剂量的组群。

图1-9说明了由不同疫苗接种方案引起的抗体响应。图10-18说明了由不同疫苗接种方案引起的CMI响应。

结论

1-一种由HPV 31和45L1VLP组成的异源加强剂可有效加强由HPV 16和18L1VLP初免诱导的同源HPV 16和18L1 VLP响应。

2-一种由HPV 31和45L1VLP组成的异源加强剂可有效加强由HPV 16和18L1VLP初免诱导的异源HPV31和45L1VLP响应。

序列表

<110>Glaxosmithkline biologicals

<120>疫苗

<130>vb61381

<150>60/674829

<151>2005-04-26

<150>GB0509010.5

<151>2005-05-03

<150>PCT/EP2005/006461

<151>2005-06-14

<160>6

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>471

<212>PRT

<213>人乳头瘤病毒L1部分序列hpv 16

<400>1

Met Ser Leu Trp Leu Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val

1 5 10 15

Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ala Arg Thr Asn

20 25 30

Ile Tyr Tyr His Ala Gly Thr Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro

35 40 45

Tyr Phe Pro Ile Lys Lys Pro Asn Asn Asn Lys Ile Leu Val Pro Lys

50 55 60

Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Ile His Leu Pro Asp Pro

65 70 75 80

Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr Gln

85 90 95

Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Val Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro

100 105 110

Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp

115 120 125

Thr Glu Asn Ala Ser Ala Tyr Ala Ala Asn Ala Gly Val Asp Asn Arg

130 135 140

Glu Cys Ile Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Leu Ile Gly

145 150 155 160

Cys Lys Pro Pro Ile Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Ser Pro Cys Thr

165 170 175

Asn Val Ala Val Asn Pro Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Asn

180 185 190

Thr Val Ile Gln Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met

195 200 205

Asp Phe Thr Thr Leu Gln Ala Asn Lys Ser Glu Val Pro Leu Asp Ile

210 215 220

Cys Thr Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Ile Lys Met Val Ser Glu

225 230 235 240

Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Tyr Leu Arg Arg Glu Gln Met Phe

245 250 255

Val Arg His Leu Phe Asn Arg Ala Gly Ala Val Gly Glu Asn Val Pro

260 265 270

Asp Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Ser Thr Ala Asn Leu Ala Ser

275 280 285

Ser Asn Tyr Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp Ala

290 295 300

Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His Asn

305 310 315 320

Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr

325 330 335

Thr Arg Ser Thr Asn Met Ser Leu Cys Ala Ala Ile Ser Thr Ser Glu

340 345 350

Thr Thr Tyr Lys Asn Thr Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Arg His Gly Glu

355 360 365

Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr

370 375 380

Ala Asp Val Met Thr Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Thr Ile Leu Glu

385 390 395 400

Asp Trp Asn Phe Gly Leu Gln Pro Pro Pro Gly Gly Thr Leu Glu Asp

405 410 415

Thr Tyr Arg Phe Val ThrSer Gln Ala Ile Ala Cys Gln Lys His Thr

420 425 430

Pro Pro Ala Pro Lys Glu Asp Pro Leu Lys Lys Tyr Thr Phe Trp Glu

435 440 445

Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu

450 455 460

Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln

465 470

<210>2

<211>472

<212>PRT

<213>人乳头瘤病毒L1部分序列hpv 18

<400>2

Met Ala Leu Trp Arg Pro Ser Asp Asn Thr Val Tyr Leu Pro Pro Pro

1 5 10 15

Ser Val Ala Arg Val Val Asn Thr Asp Asp Tyr Val Thr Arg Thr Ser

20 25 30

Ile Phe Tyr His Ala Gly Ser Ser Arg Leu Leu Thr Val Gly Asn Pro

35 40 45

Tyr Phe Arg Val Pro Ala Gly Gly Gly Asn Lys Gln Asp Ile Pro Lys

50 55 60

Val Ser Ala Tyr Gln Tyr Arg Val Phe Arg Val Gln Leu Pro Asp Pro

65 70 75 80

Asn Lys Phe Gly Leu Pro Asp Asn Ser Ile Tyr Asn Pro Glu Thr Gln

85 90 95

Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Val Glu Ile Gly Arg Gly Gln Pro

100 105 110

Leu Gly Val Gly Leu Ser Gly His Pro Phe Tyr Asn LysLeu Asp Asp

115 120 125

Thr Glu Ser Ser His Ala Ala Thr Ser Asn Val Ser Glu Asp Val Arg

130 135 140

Asp Asn Val Ser Val Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Ile Leu Gly

145 150 155 160

Cys Ala Pro Ala Ile Gly Glu His Trp Ala Lys Gly Thr Ala Cys Lys

165 170 175

Ser Arg Pro Leu Ser Gln Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Lys Asn

180 185 190

Thr Val Leu Glu Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Tyr Gly Ala Met

195 200 205

Asp Phe Ser Thr Leu Gln Asp Thr Lys Cys Glu Val Pro Leu Asp Ile

210 215 220

Cys Gln Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Gln Met Ser Ala Asp

225 230 235 240

Pro Tyr Gly Asp Ser Met Phe Phe Cys Leu Arg Arg Glu Gln Leu Phe

245 250 255

Ala Arg His Phe Trp Asn Arg Ala Gly Thr Met Gly Asp Thr Val Pro

260 265 270

Pro Ser Leu Tyr Ile Lys Gly Thr Gly Met Arg Ala Ser Pro Gly Ser

275 280 285

Cys Val Tyr Ser Pro Ser Pro Ser Gly Ser Ile Val Thr Ser Asp Ser

290 295 300

Gln Leu Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu His Lys Ala Gln Gly His Asn

305 310 315 320

Asn Gly Val Cys Trp His Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr

325 330 335

Thr Arg Ser Thr Asn Leu Thr Ile Cys Ala Ser Thr Gln Sar Pro Val

340 345 350

Pro Gly Gln Tyr Asp Ala Thr Lys Phe Lys Gln Tyr Ser Arg His Val

355 360 365

Glu Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Thr Ile Thr Leu

370 375 380

Thr Ala Asp Val Met Ser Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Ser Ile Leu

385 390 395 400

Glu Asp Trp Asn Phe Gly Val Pro Pro Pro Pro Thr Thr Ser Leu Val

405 410 415

Asp Thr Tyr Arg Phe Val Gln Ser Val Ala Ile Thr Cys Gln Lys Asp

420 425 430

Ala Ala Pro Ala Glu Asn Lys Asp Pro Tyr Asp Lys Leu Lys Phe Trp

435 440 445

Asn Val Asp Leu Lys Glu Lys Phe Ser Leu Asp Leu Asp Gln Tyr Pro

450 455 460

Leu Gly Arg Lys Phe Leu Val Gln

465 470

<210>3

<211>1416

<212>DNA

<213>人乳头瘤病毒L1部分序列hpv 16

<400>3

atgtctcttt ggctgcctag tgaggccact gtctacttgc ctcctgtccc agtatctaag 60

gttgtaagca cggatgaata tgttgcacgc acaaacatat attatcatgc aggaacatcc 120

agactacttg cagttggaca tccctatttt cctattaaaa aacctaacaa taacaaaata 180

ttagttccta aagtatcagg attacaatac agggtattta gaatacattt acctgacccc 240

aataagtttg gttttcctga cacctcattt tataatccag atacacagcg gctggtttgg 300

gcctgtgtag gtgttgaggt aggtcgtggt cagccattag gtgtgggcat tagtggccat 360

cctttattaa ataaattgga tgacacagaa aatgctagtg cttatgcagc aaatgcaggt 420

gtggataata gagaatgtat atctatggat tacaaacaaa cacaattgtg tttaattggt 480

tgcaaaccac ctatagggga acactggggc aaaggatccc catgtaccaa tgttgcagta 540

aatccaggtg attgtccacc attagagtta ataaacacag ttattcagga tggtgatatg 600

gttgatactg gctttggtgc tatggacttt actacattac aggctaacaa aagtgaagtt 660

ccactggata tttgtacatc tatttgcaaa tatccagatt atattaaaat ggtgtcagaa 720

ccatatggcg acagcttatt tttttattta cgaagggaac aaatgtttgt tagacattta 780

tttaataggg ctggtgctgt tggtgaaaat gtaccagacg atttatacat taaaggctct 840

gggtctactg caaatttagc cagttcaaat tattttccta cacctagtgg ttctatggtt 900

acctctgatg cccaaatatt caataaacct tattggttac aacgagcaca gggccacaat 960

aatggcattt gttggggtaa ccaactattt gttactgttg ttgatactac acgcagtaca 1020

aatatgtcat tatgtgctgc catatctact tcagaaacta catataaaaa tactaacttt 1080

aaggagtacc tacgacatgg ggaggaatat gatttacagt ttatttttca actgtgcaaa 1140

ataaccttaa ctgcagacgt tatgacatac atacattcta tgaattccac tattttggag 1200

gactggaatt ttggtctaca acctccccca ggaggcacac tagaagatac ttataggttt 1260

gtaacatccc aggcaattgc ttgtcaaaaa catacacctc cagcacctaa agaagatccc 1320

cttaaaaaat acactttttg ggaagtaaat ttaaaggaaa agttttctgc agacctagat 1380

cagtttcctt taggacgcaa atttttacta caataa 1416

<210>4

<211>1419

<212>DNA

<213>人乳头瘤病毒L1部分序列hpv 18

<400>4

atggctttgt ggcggcctag tgacaatacc gtatatcttc cacctccttc tgtggcaaga 60

gttgtaaata ccgatgatta tgtgactcgc acaagcatat tttatcatgc tggcagctct 120

agattattaa ctgttggtaa tccatatttt agggttcctg caggtggtgg caataagcag 180

gatattccta aggtttctgc ataccaatat agagtattta gggtgcagtt acctgaccca 240

aataaatttg gtttacctga taatagtatt tataatcctg aaacacaacg tttagtgtgg 300

gcctgtgttg gagtggaaat tggccgtggt cagcctttag gtgttggcct tagtgggcat 360

ccattttata ataaattaga tgacactgaa agttcccatg ccgccacgtc taatgtttct 420

gaggacgtta gggacaatgt gtctgtagat tataagcaga cacagttatg tattttgggc 480

tgtgcccctg ctattgggga acactgggct aaaggcactg cttgtaaatc gcgtccttta 540

tcacagggcg attgcccccc tttagaactt aaaaacacag ttttggaaga tggtgatatg 600

gtagatactg gatatggtgc catggacttt agtacattgc aagatactaa atgtgaggta 660

ccattggata tttgtcagtc tatttgtaaa tatcctgatt atttacaaat gtctgcagat 720

ccttatgggg attccatgtt tttttgctta cggcgtgagc agctttttgc taggcatttt 780

tggaataggg caggtactat gggtgacact gtgcctccat ccttatatat taaaggcaca 840

ggtatgcgtg cttcacctgg cagctgtgtg tattctccct ctccaagtgg ctctattgtt 900

acctctgact cccagttgtt taataaacca tattggttac ataaggcaca gggtcataac 960

aatggtgttt gctggcataa tcaattattt gttactgtgg tagataccac tcgcagtacc 1020

aatttaacaa tatgtgcttc tacacagtct cctgtacctg ggcaatatga tgctaccaaa 1080

tttaagcagt atagcagaca tgttgaggaa tatgatttgc agtttatttt tcagttgtgt 1140

actattactt taactgcaga tgttatgtcc tatattcata gtatgaatag cagtatttta 1200

gaggattgga actttggtgt tccccccccg ccaactacta gtttggtgga tacatatcgt 1260

tttgtacaat ctgttgctat tacctgtcaa aaggatgctg caccggctga aaataaggat 1320

ccctatgata agttaaagtt ttggaatgtg gatttaaagg aaaagttttc tttagactta 1380

gatcaatatc cccttggacg taaatttttg gttcagtaa 1419

<210>5

<211>1419

<212>DNA

<213>人乳头瘤病毒L1部分序列hpv31

<400>5

atgtctctgt ggcggcctag cgaggctact gtctacttac cacctgtccc agtgtctaaa 60

gttgtaagca cggatgaata tgtaacacga accaacatat attatcacgc aggcagtgct 120

aggctgctta cagtaggcca tccatattat tccataccta aatctgacaa tcctaaaaaa 180

atagttgtac caaaggtgtc aggattacaa tatagggtat ttagggttcg tttaccagat 240

ccaaacaaat ttggatttcc tgatacatct ttttataatc ctgaaactca acgcttagtt 300

tgggcctgtg ttggtttaga ggtaggtcgc gggcagccat taggtgtagg tattagtggt 360

catccattat taaataaatt tgatgacact gaaaactcta atagatatgc cggtggtcct 420

ggcactgata atagggaatg tatatcaatg gattataaac aaacacaact gtgtttactt 480

ggttgcaaac cacctattgg agagcattgg ggtaaaggta gtccttgtag taacaatgct 540

attacccctg gtgattgtcc tccattagaa ttaaaaaatt cagttataca agatggggat 600

atggttgata caggctttgg agctatggat tttactgctt tacaagacac taaaagtaat 660

gttcctttgg acatttgtaa ttctatttgt aaatatccag attatcttaa aatggttgct 720

gagccatatg gcgatacatt atttttttat ttacgtaggg aacaaatgtt tgtaaggcat 780

ttttttaata gatcaggcac ggttggtgaa tcggtcccta ctgacttata tattaaaggc 840

tccggttcaa cagctacttt agctaacagt acatactttc ctacacctag cggctccatg 900

gttacttcag atgcacaaat ttttaataaa ccatattgga tgcaacgtgc tcagggacac 960

aataatggta tttgttgggg caatcagtta tttgttactg tggtagatac cacacgtagt 1020

accaatatgt ctgtttgtgc tgcaattgca aacagtgata ctacatttaa aagtagtaat 1080

tttaaagagt atttaagaca tggtgaggaa tttgatttac aatttatatt tcagttatgc 1140

aaaataacat tatctgcaga cataatgaca tatattcaca gtatgaatcc tgctattttg 1200

gaagattgga attttggatt gaccacacct ccctcaggtt ctttggagga tacctatagg 1260

tttgtcacct cacaggccat tacatgtcaa aaaactgccc cccaaaagcc caaggaagat 1320

ccatttaaag attatgtatt ttgggaggtt aatttaaaag aaaagttttc tgcagattta 1380

gatcagtttc cactgggtcg caaattttta ttacagtaa 1419

<210>6

<211>1428

<212>DNA

<213>人乳头瘤病毒L1部分序列hpv 45

<400>6

atggctttgt ggcggcctag tgacagtacg gtatatcttc caccaccttc tgtggccaga 60

gttgtcaaca ctgatgatta tgtgtctcgc acaagcatat tttaccatgc aggcagttcc 120

cgattattaa ctgtaggcaa tccatatttt agggttgtac ctagtggtgc aggtaataaa 180

caggctgttc ctaaggtatc cgcatatcag tatagggtgt ttagagtagc tttacccgat 240

cctaataaat ttggattacc tgattctact atatataatc ctgaaacaca acgtttggtt 300

tgggcatgtg taggtatgga aattggtcgt gggcagcctt taggtattgg cctaagtggc 360

catccatttt ataataaatt ggatgataca gaaagtgctc atgcggctac ggctgttgtt 420

acgcaggatg ttagggataa tgtgtcagtt gattataagc aaacacagct gtgtatttta 480

ggttgtgtac ctgctattgg tgagcactgg gccaagggca cactttgtaa acctgcacaa 540

ttgcagcctg gtgactgtcc tcctttggaa cttaaaaaca ccattattga ggatggtgat 600

atggtggata caggttatgg ggcaatggat tttagtacat tgcaggatac aaagtgcgag 660

gttccattag acatttgtca atccatctgt aaatatccag attatttgca aatgtctgct 720

gatccctatg gggattctat gtttttttgc ctacgccgtg aacaactgtt tgcaagacat 780

ttttggaata gggcaggtgt tatgggtgac acagtaccta cagacctata tattaaaggc 840

actagcgcta atatgcgtga aacccctggc agttgtgtgt attccccttc tcccagtggc 900

tctattatta cttctgattc tcaattattt aataagccat attggttaca taaggcccag 960

ggccataaca atggtatttg ttggcataat cagttgtttg ttactgtagt ggacactacc 1020

cgcagtacta atttaacatt atgtgcctct acacaaaatc ctgtgccagg tacatatgat 1080

cctactaagt ttaagcacta tagtagacat gtggaggaat atgatttaca gtttattttt 1140

cagttgtgca ctattacttt aactgcagag gttatgtcat atatccatag tatgaatagt 1200

agtatattgg aaaattggaa ttttggtgta cctccaccac ctactacaag tttagtggat 1260

acatatcgtt ttgtgcaatc agttgctgtt acctgtcaaa aggatactac acctccagaa 1320

aagcaggatc catatgataa attaaagttt tggactgttg acctaaagga aaaattttcc 1380

tccgatttgg atcaatatcc ccttggtcga aagtttttag ttcagtaa 1428

Claims

1.来自一种第一HPV型的人乳头瘤病毒L1蛋白或其免疫原片段在制备用以加强先前由来自不同HPV型的人乳头瘤病毒L1蛋白或其免疫原片段引发的免疫响应的药物中的用途。

2.根据权利要求1的用途，其中第二型在系统发生学上与第一型相关。

3.根据权利要求1或2的HPV31或HPV 52 L1蛋白或其免疫原片段在制备加强针对包含L1蛋白或其片段的HPV 16疫苗的免疫响应的药物中的用途。

4.根据权利要求3的HPV31蛋白或其免疫原片段在制备加强针对包含L1蛋白或其片段的HPV 16疫苗的免疫响应的药物中的用途。

5.根据权利要求3的用HPV52蛋白或其免疫原片段在制备加强针对包含L1蛋白或其片段的HPV 16疫苗的免疫响应的药物中的用途。

6.根据权利要求1或2的HPV16 L1蛋白或其免疫原片段在制备加强针对包含L1蛋白或其片段的HPV 31或HPV 52疫苗的免疫响应的药物中的用途。

7.根据权利要求6的HPV16 L1蛋白或其免疫原片段在制备加强针对包含L1蛋白或其片段的HPV 31疫苗的免疫响应的药物中的用途。

8.根据权利要求6的HPV16 L1蛋白或其免疫原片段在制备加强针对包含L1蛋白或其片段的HPV 52疫苗的免疫响应的药物中的用途。

9.根据权利要求1或2的HPV 45 L1蛋白或其免疫原片段在制备加强针对包含L1蛋白或其免疫原片段的HPV 18疫苗的免疫响应的药物中的用途。

10.根据权利要求1或2的HPV 18 L1蛋白或其免疫原片段在制备加强针对包含L1蛋白或其片段的HPV 45疫苗的免疫响应的药物中的用途。

11.一种防御HPV感染和/或疾病的疫苗接种程序，所述程序包括递送包含来自至少HPV 16和HPV 18的L1蛋白或其免疫原片段的第一HPV疫苗，和不含来自第一疫苗的HPV 16和HPV 18 L1组分的第二HPV疫苗，其中第二HPV疫苗含有来自至少一种其它致癌性HPV型的L1蛋白或其免疫原片段，其中第一和第二疫苗可以任何顺序递送，并且间隔适合的时间递送。

12.一种预防HPV感染和/或疾病的方法，所述方法包括递送包含来自至少HPV 16和HPV 18的L1蛋白或其免疫原片段的第一HPV疫苗，和不含第一疫苗HPV 16和HPV 18 L1组分的第二HPV疫苗，其中第二HPV疫苗含有至少一种其它致癌性HPV型的L1蛋白或其免疫原片段，其中的第一和第二疫苗可以任何顺序递送，并且间隔适合的时间递送。

13.根据权利要求11或12的方法或程序，其中所述的第一疫苗包含来自HPV 16、HPV 18和任选的HPV 33的L1蛋白或其免疫原片段。

14.根据权利要求13的方法或程序，其中所述的第一疫苗另外包含来自HPV 58的L1蛋白或其免疫原片段。

15.根据权利要求11-13中任何一项的方法或程序，其中所述的第二疫苗包含来自HPV 31和/或HPV 45和/或HPV 52的L1蛋白或其免疫原片段。

16.根据权利要求15的方法或程序，其中所述的第二疫苗包含来自HPV 31和HPV 45的L1蛋白或其免疫原片段。

17.根据权利要求16的方法或程序，其中所述的第二疫苗包含来自HPV 31、HPV 45和HPV 52的L1蛋白或其免疫原片段。

18.根据权利要求11-17中任何一项的方法或程序，其中所述的第一和第二疫苗没有共有的相同的L1蛋白或蛋白片段。

19.根据权利要求11-18中任何一项的方法或程序，其中第一疫苗的HPV 16或HPV 18组分可防御由第二疫苗中至少一种HPV型引起的感染和/或疾病。

20.一种疫苗组合物，包含HPV 31 L1蛋白或其免疫原片段与HPV 45 L1蛋白或其免疫原片段的组合，该疫苗不包含HPV 16或HPV 18 L1蛋白或其免疫原片段。

21.根据权利要求20的疫苗组合物，包括HPV 52 L1蛋白或其免疫原片段。

22.一种试剂盒，包含权利要求11的第一和第二疫苗组合物。

23.根据权利要求22的试剂盒，其中所述的第一疫苗组分包含HPV 16和HPV 18 L1蛋白或其免疫原片段，并且第二疫苗组分包含HPV 31和HPV 45蛋白或其免疫原片段。

24.根据前述权利要求中任何一项的用途、方法、程序、疫苗或试剂盒，其中所述的HPV L1蛋白为病毒样颗粒形式。

25.根据前述权利要求中任何一项的用途、方法、程序、疫苗或试剂盒，其中所述第一或第二疫苗都包含佐剂。

26.根据权利要求25的用途、方法、程序、疫苗或试剂盒，其中所述的佐剂包含3D-MPL。

27.根据权利要求25的用途、方法、程序、疫苗或试剂盒，其中所述的佐剂包含铝盐。

28.根据权利要求26或27的用途、方法、程序、疫苗或试剂盒，其中所述的佐剂包含铝盐和3D MPL。

29.根据权利要求26的用途、方法、程序、疫苗或试剂盒，其中所述的佐剂包含水包油乳剂佐剂和和3D MPL。

30.根据权利要求29的用途、方法、程序、疫苗或试剂盒，其中所述的水包油乳剂包含可代谢油、固醇和乳化剂。