CN103265627A - HPV16L1-g蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种人乳头瘤病毒16型L1蛋白HPV16L1-g及其编码基因与应用。该HPV16L1-g蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示,其编码基因如序列表中SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了HPV16L1-g的重组表达载体,本发明提供的HPV16L1-g蛋白具有良好的免疫原性,无潜在致癌危险,具有良好的安全性,免疫特性和生物学活性,并可以大规模制备和纯化,可用于制备预防宫颈癌的疫苗及治疗宫颈癌的药物,具有较好的经济价值和应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体地,涉及人乳头瘤病毒16型L1蛋白HPV16L1-g及其编码基因与应用。
背景技术
宫颈癌是一种常见的严重危害妇女健康的侵染性疾病,其发病率仅次于乳腺癌,位居世界女性恶性肿瘤的第二位,在一些发展中国家甚至位居第一。据世界卫生组织(WHO)统计,全球每年约有50万名妇女患宫颈癌,且有将近30万妇女死于宫颈癌,其中,80%的死亡病例发生在发展中国家。据统计,我国现有宫颈癌病人约13万,每年约有5万人死于宫颈癌,且发病率呈逐年上升、年轻化的趋势。1995年国际癌症研究中心公布研究结果HPV与宫颈癌有密切因果关系。HPV感染已成为严重危害人类健康的病原体。因此,研制高效廉价的预防性HPV疫苗,对预防宫颈癌具有十分重要的意义。
目前已经确定的HPV型别大约有160多种,根据HPV亚型与妇女生殖道恶性肿瘤的关系,将HPV分为低危型和高危型。低危型HPV包括HPV6、11、34、40、42、43、44等型别。高危型别HPV包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等型别。其中在中国超过85%的宫颈癌病例由HPV16型和18型引起。因此,开发HPV16、18型疫苗将能够有效的预防宫颈癌的发生。
人乳头瘤病毒(Human Papilloma virus,HPV)属乳多空病毒科乳头瘤病毒属的一个无包膜的小型双链环状DNA病毒,HPV是一种嗜上皮性病毒,具有高度的种属特异性。HPV病毒颗粒直径为50-60nm,呈球形,衣壳为有由72个壳微粒组成的20面体。其病毒颗粒衣壳由主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2组成。主要衣壳 蛋白L1在细胞中表达后能自动组装成与天然病毒颗粒相似的类病毒颗粒(Virus-Like Particle,VLP),该病毒颗粒不带有病毒核酸,无潜在致癌危险,具有良好的安全性,免疫特性和生物学活性,并可以大规模制备和纯化。因此,VLP疫苗已成为预防性HPV疫苗发展的主要方向。
HPV VLP预防性疫苗研发的关键是能够大量高效的制备VLP样品,目前最常用的表达系统是原核表达系统和真核表达系统。
原核表达系统表达的蛋白大多失去天然构象,不能产生保护性抗体。或者表达产物多为包涵体,包涵体变性、复性步骤复杂,且蛋白损失量大,收率低,很难实现大规模生产。也见可溶性表达的例子,但是表达量低,纯化目的蛋白难度大。也有报道进行融合表达增加目的蛋白可溶性及表达量,纯化相对容易,但融合蛋白的切割需要昂贵的酶,无法实现大规模生产。
常用的真核表达系统有昆虫杆状病毒表达系统、酿酒酵母表达系统、毕赤酵母表达系统、汉逊酵母表达系统。在真核表达系统中蛋白能自发的形成VLP,为纯化工艺提供极大的便利。然而目前上市的Merck公司的预防型HPV四价疫苗(酿酒酵母表达系统)及GSK公司的HPV二价疫苗(昆虫杆状病毒表达系统),由于其表达量低,生产成本高,因此该产品价格偏高,不能被广泛人群所使用。
多形汉逊酵母表达系统具遗传性质稳定、操作简单、易于高密度培养、外源蛋白产量高、生产成本低、适合于工业化大生产等特点,还具有原核生物表达系统所不具有的外源蛋白翻译后加工等优势,同时避免了其他酵母表达菌株不稳定、质粒易丢失、过度糖基化等缺点。因此,汉逊酵母表达系统是一个优于大肠杆菌和其它酵母的外源基因表达系统。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人乳头瘤病毒16型L1蛋白 (HPV16L1-g)及其编码基因;本发明的另一目的在于提供HPV16L1-g蛋白的应用。
为了提高蛋白的表达量,本发明利用汉逊酵母偏爱密码子对所述核酸序列进行了密码子优化。本发明提供的编码HPV16L1-g蛋白的基因其核苷酸序列为去掉酵母分泌信号肽的序列或被酵母识别的转录终止信号的序列。本发明编码HPV16L1-g蛋白的基因的密码子使用了汉逊酵母最偏爱的密码子。汉逊酵母密码子使用频率可参见 http://www kazusaor jp/codon/。为了避免翻译出来的mRNA的GC含量过高、mRNA的二级结构影响翻译的效率,本发明对某些氨基酸使用次偏爱密码,前提是该次偏爱密码与最偏爱密码使用频率非常接近,氨基酸序列原序列不变,在某些很特殊的情况下,为了减少或增加酶切位点,某些位置的序列做适当的序列调整。由此,本发明优化设计了HPV16L1截短体基因,其序列如SEQ ID NO.1所示,将其克隆入自行构建的汉逊酵母表达载体中,通过电转化汉逊酵母宿主菌,经过选择培养基筛选重组表达菌株;利用重组表达菌株进行发酵培养和甲醇诱导表达HPV16L1-g蛋白。
本发明提供的一种人乳头瘤病毒16型L1蛋白HPV16L1-g,其氨基酸序列为
a)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列;或
b)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
本发明提供了编码上述HPV16L1-g蛋白的基因,是如下a)或b):
a)其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示;或
b)由SEQ ID No.1所示核苷酸序列经取代一个或几个核苷酸,得到编码HPV16L1-g的核苷酸序列。
本发明提供了含有上述编码HPV16L1-g蛋白的基因的重组表达载体。
其中,上述重组表达载体含有甲醇氧化酶启动子(Methanol oxidase,MOX)或甲醛脱氢酶启动子(Formate dehydrogenase,FMD)。
优选地,上述载体含有甲醇氧化酶启动子(MOX)。
在本发明的实施例中,构建的重组表达载体为PMV-05-HPV16L1-g。
本发明提供了上述重组表达载体在制备人乳头瘤病毒16型L1-g蛋白中的应用。
本发明提供了上述重组表达载体在制备治疗宫颈癌药物中的应用。
本发明提供了上述重组表达载体在制备宫颈癌疫苗中的应用。
本发明提供了含有上述重组表达载体的宿主细胞。
进一步地,所述宿主细胞为汉逊酵母(Hansenula polymorpha)细胞。
所述汉逊酵母细胞为ATCC34438,ATCC26012。
优选地,所述汉逊酵母细胞为ATCC26012尿嘧啶缺陷性宿主细胞。本发明使用的ATCC26012尿嘧啶缺陷性宿主细胞为多型汉逊酵母AU-0501,其保藏编号为CGMCC No.7013,已于2012年12月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区大屯路,中国科学院微生物研究所,简称CGMCC,邮编100101)保藏,分类命名为多型汉逊酵母(Hansenula polymorpha)。
本发明提供了一种病毒样颗粒(VLPs),含有HPV16L1-g蛋白。
本发明提供了一种宫颈癌疫苗,含有HPV16L1-g蛋白。
本发明提供了HPV16L1-g蛋白及其编码基因在制备宫颈癌疫苗中的应用。
本发明的有益效果在于:提供了高效表达HPV16L1-g蛋白的重组表达载体,利用汉逊酵母表达系统实现了HPV16L1-g蛋白稳定高 效的表达,并能自动组装成病毒样颗粒(VLPS),破碎细胞后,经过微滤、超滤、PEG6000沉淀、超速离心、层析方法等纯化后,经电镜观察纯化样品中呈现病毒样颗粒,颗粒直径在50-60nm之间,颗粒完整、规则。本发明提供的含有HPV16L1-g蛋白的病毒颗粒不带有病毒核酸,无潜在致癌危险,具有良好的安全性和优良的免疫特性与生物学活性,并可以大规模制备和纯化,能够用于制备VLP疫苗,具有较好的经济价值和应用前景。
附图说明
图1为PCR扩增电泳检测结果,1、2、3、4、5分别为MOXP、MOXT、HARS、Ura3、Amp+ColE1;其中M:DL2000bp plus(北京全式金生物技术有限公司)。
图2为MOXP+MOXT基因片段PCR扩增电泳检测结果;其中M:DL2000bp plus(北京全式金生物技术有限公司)。
图3为HARS+Ura3+Amp+ColE1基因片段电泳结果;其中M:DL2000bp plus(北京全式金生物技术有限公司)。
图4为不同引物(MOXP-F/MOXP-R;Ura3-F/Ura3-R)对表达载体PMV单克隆菌落1-8号进行PCR鉴定的电泳检测结果;其中m1-m8为引物MOXP-F/MOXP-R鉴定结果,u1-u8为引物Ura3-F/Ura3-R鉴定结果;,其中M:DL2000bp plus(北京全式金生物技术有限公司)。
图5为表达载体PMV-05电泳检测结果,其中M:DL15000(宝生物工程有限公司)。
图6为表达载体PMV-05双酶切(SacI、SalI)电泳检测结果,1为重组表达载体PMV-05,2为重组表达载体PMV-05双酶切,其中M:DL15000(宝生物工程有限公司)。
图7为重组表达载体PMV-05-HPV16L1-g PCR鉴定电泳检测结果,1-8号均正确。其中M:DL2000bp plus(北京全式金生物 技术有限公司)。
图81、2、3、4均为重组表达载体PMV-05-HPV16L1-g电泳检测结果,M:DL15000(宝生物工程有限公司)。
图9为重组表达载体PMV-05-HPV16L1-g双酶切(BamHI、EcoRI)电泳检测结果,其中1为重组表达载体对照,2、3、4、5为进行双酶切的表达载体,M:DL15000(宝生物工程有限公司)。
图101、2、3分别为Ura35’端、Ura33’端、G418PCR扩增电泳检测结果,M:DL2000bp plus(北京全式金生物技术有限公司)。
图11为U5’-G418-U3’基因片段PCR电泳检测结果,M:DL2000bp plus(北京全式金生物技术有限公司)。
图12显示汉逊酵母表达的HPV16L1菌株(PMV-05-HPV16L1-g质粒转化菌)经小瓶甲醇诱导表达72h后的蛋白SDS-PAGE检定结果。M:为低分子量蛋白标准(北京全式金公司);1:为原核表达阳性对照菌株;2:为不带外源基因的宿主细胞蛋白(阴性对照);3、4、5:为菌株诱导样品。
图13显示汉逊酵母表达的HPV16L1菌株经小瓶甲醇诱导表达72h后的蛋白质免疫印迹(Western blot)检定结果。样品顺序如图12所示。
图14显示HPV16L1菌株发酵模式图。
图15显示经过超速离心纯化的HPV16L1蛋白的SDS-PAGE检定结果。M:为低分子量蛋白标准(北京全式金公司);1:为不带外源基因的宿主细胞蛋白(阴性对照);2-12:为超速离心后紫外吸收峰处分管收集蛋白样品。
图16显示HPV16L1-g蛋白的透射电镜照片。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步 骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,如《分子克隆:实验室手册》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件进行。
实施例1编码HPV16L1-g蛋白的基因序列优化
根据我国流行的高致病性HPV16型毒株的L1蛋白的核苷酸序列,使用vector软件对HPV16L1基因序列按照汉逊酵母最偏爱密码子进行优化设计,以提高其在汉逊酵母细胞中的表达量。本发明提供的编码HPV16L1-g蛋白的基因其核苷酸序列为去掉酵母分泌信号肽的序列或被酵母识别的转录终止信号的序列。本发明编码HPV16L1-g蛋白的基因的密码子使用了汉逊酵母最偏爱的密码子。汉逊酵母(Pichia angusta)密码子使用频率可参见 http://www.kazusa.or.jp/codon/。为了避免翻译出来的mRNA的GC含量过高、mRNA的二级结构影响翻译的效率,本发明对某些氨基酸使用次偏爱密码,前提是该次偏爱密码与最偏爱密码使用频率非常接近,氨基酸序列原序列不变,在某些很特殊的情况下,为了减少或增加酶切位点,某些位置的序列做适当的序列调整。由此,本发明优化设计了HPV16L1截短体基因,其序列如SEQ ID NO.1所示,优化后的HPV16L1基因序列如SEQ ID NO.1所示,该基因HPV16L1-g序列由上海捷瑞公司合成并克隆在Dev-C载体(购自上海捷瑞公司)上。HPV16L1-g蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2重组表达载体PMV-05-HPV16L1-g的构建
1、表达载体PMV-05的构建过程:
本发明的表达载体PMV-05由6部分组成:启动子(MOX-P)、终止子(MOX-T)、复制子HARS、ura3基因、ColE1复制子、Amp抗性基因。
以酵母基因组DNA为模板,分别以引物MOXP-F(序列见SEQ ID NO.3)、MOXP-R(见SEQ ID NO.4);MOXT-F(见SEQ ID NO.5)、MOXT-R(见SEQ ID NO.6);HARS-F(见SEQ ID NO.7)、HARS-R(见SEQ ID NO.8);Ura3-F(见SEQ ID NO.9)、Ura3-R(见SEQ ID NO.10)进行PCR扩增,调取基因MOXP、MOXT、HARS、Ura3。以PBR322质粒(购自宝生物工程大连有限公司,货号:D3050)为模板,以引物Amp+ColE1-F(见SEQ ID NO.11)、Amp+ColE1-R(见SEQ ID NO.12)进行PCR扩增,调取基因Amp+ColE1。PCR反应体系如下:PCR缓冲液10μl,dNTP10μl,引物F1μl,引物R1μl,Taq DNA polymerase1μl蒸馏水157μl总体积200μl。反应条件:95℃2min;95℃30s,55℃30s,72℃2min;反应30个循环。将PCR扩增的DNA片段以1%琼脂糖电泳进行检测,PCR产物大小分别约为MOXP:1500bp左右、MOXT:300bp左右、HARS:500bp左右、Ura3:1100bp左右、Amp+ColE1:2200bp左右,PCR电泳结果见图1。将以上5个基因片段用DNA片段纯化试剂盒进行纯化。分别取纯化好的MOXP、MOXT基因片段各1μl作为模板,以引物MOXP-F和MOXT-R进行PCR扩增获得MOXP+MOXT基因片段,反应体系及反应条件同上,PCR获得的MOXP+MOXT基因片段电泳结果如图2所示。分别取纯化好的HARS、Ura3、Amp+ColE1基因片段各1μl作为模板,以引物HARS-R和Amp+ColE1-R进行PCR扩增获得HARS+Ura3+Amp+ColE1基因片段,PCR反应体系如下:PCR缓冲液10μl,dNTP10μl,引物F1μl,引物R1μl,Taq DNA polymerase1μl蒸馏水155μl总体积200μl。反应条件:95℃2min;95℃30s,55℃30s,72℃4min;反应30个循环。PCR获得的HARS+Ura3+Amp+ColE1基因片段电泳结果如图3所示。将基因片段MOXP+MOXT、HARS+Ura3+Amp+ColE1用DNA片段纯化试剂盒进行纯化。将纯化好的基因片段MOXP+MOXT、HARS+Ura3+ Amp+ColE1分别进行(SacI、SalI)双酶切,酶切反应如下:基因片段60μl,SacI、SalI各3μl,10×Basal buffer10μl,10×BSA10μl,加水至100μl,于37℃进行酶切过夜。将酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳分离后,切胶回收酶切基因片段,通过SolutionI连接试剂盒(购自宝生物工程(大连)有限公司)进行连接。连接反应体系如下:HARS+Ura3+Amp+ColE1(SacI、SalI)双酶切纯化产物1μl,MOXP+MOXT(SacI、SalI)双酶切纯化产物4μl,SolutionI5μl共计10μl反应体系,于16℃连接1小时。将连接后的重组表达载体转化到100μl大肠杆菌(DH5a)感受态细胞中,涂LB+Amp(100μg/ml)固体培养基37℃培养箱过夜培养。
转化克隆筛选:挑取LB+Amp固体培养基上的单克隆菌落做为模板,分别以引物MOXP-F、MOXP-R,Ura3-F、Ura3-R进行PCR鉴定转化克隆,PCR反应体系如下:PCR缓冲液2μl,dNTP2μl,上游引物0.1μl,下游引物0.1μl,Taq DNA polymerase0.1μl蒸馏水15.7μl总体积20μl。反应条件:95℃2min;95℃30s,55℃30S,72℃1min;反应30个循环。将PCR扩增的DNA片段以1%琼脂糖电泳进行检测,以MOXP-F、MOXP-R为引物的PCR产物大小约应为1500bp左右,以Ura3-F、Ura3-R为引物的PCR产物大小约应为1000bp左右,PCR电泳结果见图4。将PCR鉴定正确的5号转化克隆命名为:重组表达载体PMV-05,并将其接种到10ml LB+Amp液体培养基于37℃摇床200rpm过夜培养。按照质粒提取试剂盒(来源:北京全式金生物技术有限公司)说明书进行重组表达载体PMV-05的提取,将提取的重组表达载体进行1%琼脂糖电泳进行检测,检测结果见图5。将所获得的表达载体进行酶切鉴定,酶切反应体积如下:质粒5μl,SacI、SalI各1μl,10×Basal buffer2μl,10×BSA2μl,加水至20μl,于37℃进行酶切4小时,酶切结果电泳检测如图6所示。
2、重组表达载体PMV-05-HPV16L1-g的构建:
将优化合成的基因HPV16L1-g克隆在Dev-C载体上,基因序列在优化设计时两端均加入了EcoRI、BamHI酶切位点以便克隆入表达载体。
将已克隆入HPV16L1-g基因的Dev-C载体与表达载体(PMV-05)进行EcoRI、BamHI(均购自宝生物工程(大连)有限公司)双酶切,反应体系如下:质粒30μl,EcoRI、BamHI各3μl,10×K buffer10μl,加水至100μl,于37℃进行酶切过夜。将酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳分离后,切胶回收基因片段与线性表达载体,通过SolutionI连接试剂盒(购自宝生物工程(大连)有限公司)进行连接。连接反应体系如下:载体PMV-05(EcoRI/BamHI)双酶切纯化产物1μl,HPV16L1-g基因(EcoRI/BamHI)双酶切纯化产物5μl,SolutionI6μl共计12μl反应体系,于16℃连接1小时。将连接后的重组表达载体转化到100μl大肠杆菌(DH5a)感受态细胞中,涂LB+Amp(100μg/ml)固体培养基37℃培养箱过夜培养。
转化克隆筛选:挑取LB+Amp固体培养基上的单克隆菌落做为模板,以表达载体上的引物F、R进行PCR鉴定转化克隆,PCR反应体系如下:PCR缓冲液2μl,dNTP2μl,引物F(AGTTTTTGCCCTACTTGATCACAG)0.1μl,引物R(ACTCGCTATTTCAGCTTTTCATCTC)0.1μl,Taq DNA polymerase0.1μl蒸馏水15.7μl总体积20μl。反应条件:95℃2min;95℃30s,55℃30s,72℃2min;反应30个循环。将PCR扩增的DNA片段以1%琼脂糖电泳进行检测,PCR产物大小约为1600bp左右,PCR电泳结果见图7。将PCR鉴定正确的转化克隆命名为:重组表达载体PMV-05-HPV16L1-g,并将其接种到10mlLB+Amp液体培养基于37℃摇床200rpm过夜培养。按照质粒提取试剂盒(来源:北京全式金生物技术有限公司)说明书进行重组表 达载体PMV-05-HPV16L1-g的提取,将提取的重组表达载体进行1%琼脂糖电泳进行检测,检测结果见图8。将所获得的重组表达载体进行酶切鉴定,酶切反应体积如下:质粒5μl,EcoRI、BamHI各1μl,10×K buffer2μl,加水至20μl,于37℃进行酶切4小时,酶切结果电泳检测如图9。
实施例3汉逊酵母表达的HPV16L1菌株G的诱导表达及检测
将重组表达载体PMV-05-HPV16L1-g通过电穿孔转化到汉逊酵母ATCC26012尿嘧啶缺陷型宿主细胞中(野生型宿主菌来自ATCC26012,通过基因敲除方法获得ATCC26012尿嘧啶缺陷型宿主细胞)。
ATCC26012尿嘧啶缺陷型宿主细胞获得:分别从Pichia pastoris表达载体pPIC9K(购自inritrogen公司)获得G418抗性基因序列,从Gene bank获得Hansenula Ura3基因序列。根据Ura3及G418基因序列设计引物P1、P2、P3、P4、P5、P6,其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13~18所示。
以汉逊酵母野生型宿主菌ATCC26012基因组DNA为模板,分别以引物P1和P2进行PCR扩增获得Ura3的5’端基因片段,以引物P5和P6进行PCR扩增获得Ura3的3’端基因片段;以Pichiapastoris表达载体pPIC9K为模板,以P3和P4为引物进行PCR扩增获得G418基因片段。PCR反应体系如下:PCR缓冲液10μl,dNTP8μl,模板1μl,上游引物0.5μl,下游引物0.5μl,Taq DNApolymerase0.5μl蒸馏水79.5μl总体积100μl。反应条件:95℃2min;95℃30s,55℃30s,72℃2min;反应30个循环。将PCR扩增的DNA片段以1%琼脂糖电泳进行检测,检测结果如图10所示。将三个基因片段用DNA片段纯化试剂盒进行纯化。分别取纯化好的Ura3的5’端基因片段、G418基因片段、Ura3的3’端基因片段个1μl作为模板,以引物P1和P6进行PCR扩增获得U5’-G418-U3’基 因片段,反应体系及反应条件同上,PCR获得的U5’-G418-U3’基因片段如图11所示。用DNA片段纯化试剂盒纯化上述PCR产物,将纯化获得U5’-G418-U3’基因片段通过电穿孔转化到汉逊酵母ATCC26012野生型宿主细胞中,U5’-G418-U3’基因片段通过同源重组方式整合于汉逊酵母ATCC26012野生型宿主细胞中。将转化后的细胞涂YPD+G418固体培养基于37℃培养箱培养至长出菌落。挑选100个菌落依次转接到YNB选择性固体培养基、YNB+尿嘧啶固体培养基、YPD+G418固体培养基上置37℃培养箱培养3天。挑选在YNB+尿嘧啶固体培养基、YPD+G418固体培养基上均生长而在YNB选择性固体培养基上不生长的菌落即为汉逊酵母ATCC26012尿嘧啶缺陷型宿主细胞,所述尿嘧啶营养缺陷型宿主细胞为通过同源重组的方式将乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶(URA3)基因阻断,具体的为在乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因的第396-546位处插入G418抗性基因,从而获得乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因共计150个核苷酸缺失的营养缺陷型汉逊酵母宿主细胞。其保藏编号为CGMCC No.7013。
通过选择培养基对转化菌株进行筛选。将表达载体转化菌命名为G,将菌株G接种在选择培养基MDL(0.67%酵母氮源培养基,购自SIGMA公司,规格:Y1251-KG,批号:030M1754),0.5%硫酸铵,2%葡萄糖)中,33℃摇床培养20小时,5000rpm离心6min,收集沉淀,加入诱导培养基MM(0.67%酵母氮源培养基,0.5%硫酸铵,1%甲醇)中,每天补加1%的甲醇,诱导表达3天。
SDS-PAGE凝胶电泳分析:取诱导后样品100μl离心,收集沉淀,用无菌水清洗,进行NaOH处理3min,离心弃上清,沉淀以100μl SDS Sample buffer重悬,煮沸10min,离心,上清10μl上样进行电泳,电泳完毕取下凝胶进行银染,凝胶成像系统软件扫描分析目的蛋白表达量。
SDS-PAGE检测结果显示(如图12):重组菌株表达的G蛋白 分子量在55.8KD左右,分子量大小与预期的目的蛋白大小一致,应用凝胶成像系统软件进行扫描分析结果表明目的蛋白的表达量占菌体总蛋白的1.5%,具有较好的表达量。
Western-blot检测:用抗HPV16L1抗体(abcam公司,ab69)作为一抗,使用HRP-羊抗鼠-IgG(北京博奥森公司)作为二抗,DAB显色。
Western-blot结果显示(如图13):表达产物能与单克隆抗体特异性结合,并在55.8KD处有较为明显的反应条带,与SDS-PAGE结果一致,说明该表达产物具有良好地免疫反应性。
实施例4重组HPV16L1酵母表达菌株在30L发酵罐中发酵培养
将重组的汉逊酵母菌株G接种到200ml一级种子培养基(0.67%酵母氮源培养基(购自SIGMA公司,规格Y1251-KG,批号:030M1754),0.5%硫酸铵,2%葡萄糖)中,在33℃,200rpm摇床振荡培养20小时。然后全量接种于2000ml二级种子培养基(0.67%酵母氮源培养基,0.5%硫酸铵,2%甘油)中,在33℃,200rpm摇床振荡培养20小时(OD600nm达8-10)。之后全量接种至30L发酵罐中,其中装有15L发酵培养基(甘油、磷酸二氢铵、氯化钾、氯化钙、氯化钠、硫酸镁、乙二胺四乙酸钠,其依次比例为:140:70:20:15:2:1),补充氨水调节发酵液pH值维持在5.0,发酵温度为30℃,转速控制在350-750rpm,空气流速0.5-1.0m3/h,高密度发酵需要纯氧补充,溶氧控制在20-60%,20h时发酵培养基中碳源耗尽,补加甘油共计2.0L,分5次补加0.40L/次,每次碳源耗尽,溶氧上升时加甘油,菌体生长共计36h左右,湿菌重最高可达0.3-0.4g/ml左右;去阻遏阶段:转速750rpm,空气流速1.0m3/h,溶氧控制在20-60%,加入1L甘油和甲醇混合液(甘油400ml,甲醇600ml)进行去阻遏培养,36-54h(共计16-18h)之间;诱导阶段:54-94h(36-40h)之间进行甲醇诱导,溶氧维持在40%左右。发酵结 束:92-94h时,待甲醇消耗完全,溶氧上升至80%以上,降温至20℃开始下罐发酵结束,湿菌重维持在0.3-0.4g/ml。根据多批发酵结果总结HPV16L1汉逊酵母发酵模式图如图14所示。
实施例5HPV16L1-g蛋白的分离纯化
破碎:将实施例4发酵得到的汉逊酵母细胞,重悬于细胞裂解缓冲液中(20mmol/L NaH2PO4,2mmol/L EDTA-Na2,0.4mol/L NaCl,pH7.5)洗2次,然后以1:4(W/V)的比例悬浮于含4mmol/LPMSF,1%Tween-20,3%PEG6000的细胞裂解缓冲液中,使用高压匀浆机在压力1100bar的操作压力下破碎细胞2次,使细胞破碎率达95%以上。
澄清:将破碎后的细胞液倒入离心筒中,进行8000rpm离心20min,收集上清液,以0.45μm膜包进行微滤以除掉大分子物质。
超滤:将澄清后的蛋白液以300KD的膜包进行超滤以除掉小分子物质。
沉淀病毒颗粒:将超滤后蛋白液,以0.5M NaOH调pH8.0,加入5M NaCl溶液,搅拌条件下滴加0.5g/ml PEG6000溶液至终浓度0.12g/ml,4℃下静置2h,4℃下12000rpm离心30min,弃上清液,用适当体积的20mmol/L PB溶解沉淀,于4℃下5000rpm再次离心30min,收集第2次离心上清液即为粗纯蛋白液。
超速离心:向粗纯蛋白液中加入固体溴化钾调密度至1.28g/ml。超度离心上样顺序为:1M NaCl-EDTA-Na2150ml垫液;1.28KBr样品液600ml;1.34KBr梯度液700ml;1.40KBr梯度液240ml。8℃,25000rpm离心4h,以1.40KBr溶液做为顶液,分管收集紫外吸收峰,每管取样进行SDS-PAGE检测,检测结果如图15所示。
分子筛层析:以Sephacryl S-500HR为例,以PBS(pH7.2)进行洗脱,收集紫外吸收峰即为纯化蛋白液。
纯化蛋白浓度检测(Lowry法):精确量取标准蛋白牛血清白蛋 白溶液(100μg/ml)0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml,分别置于试管中,加蒸馏水补至1ml,同时量取5倍稀释纯化蛋白液1ml于试管中,分别加5ml碱性铜液,0.5ml酚试剂,于比色杯中用650nm波长测定吸光度值。以标准蛋白的蛋白含量做为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制标准曲线,计算待检纯化蛋白液的浓度。检测结果如表1所示:
表1纯化蛋白浓度(Lowry法)检测结果
Lowry法检测结果获得纯化蛋白终浓度为256μg/ml。
纯化产物电镜分析:取经纯化的HPV16L1-g蛋白液10μl滴加于铜网上,避光保存5min,除净多余液体,用1%磷钨酸染色2min,通过透射电镜(TEM)对HPV16L1-g VLPs进行分析。结果表明HPV16L1-g蛋白呈现病毒样颗粒,具有天然病毒的正二十面体结构,病毒颗粒直径在50-60nm之间,颗粒完整规则(如图16所示,放大倍数:59000)。
实施例6HPV16L1-g蛋白病毒样颗粒制备疫苗的免疫原性(ED50)试验
HPV16L1-g疫苗的制备:将实施例5纯化获得的病毒样颗粒以原位法制备成含有铝佐剂的疫苗。
实验动物:挑选18-22g的SPF级BALB/c小鼠70只,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
免疫程序:将制备疫苗连续倍比稀释成1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125μg/ml,每个稀释度注射小鼠10只,每只腹腔注射 1ml,免疫30天后眼球采血。将采集的血液置37℃放置2h,4000g离心10min,吸取上清做为待检抗血清。
间接ELISA法检测抗血清:用包被液稀释实施例5纯化抗原液至浓度为1μg/ml各100μl加样于96孔酶标凹孔内,4℃包被过夜。除净包被液,加满洗涤液PBST洗涤酶标板。用封闭液(1%BSA的PBST液)加满酶标板37℃孵育1小时。除净封闭液每孔加入100μl待检抗血清,37℃孵育1小时。除净血清液,加满洗涤液PBST洗涤酶标板3次。每孔加入100μl HRP标记的羊抗小鼠IgG(1:4000稀释)37℃孵育1小时。除净酶标液,加满洗涤液PBST洗涤酶标板3次。每孔加入100μl TMB显色液,37℃避光作用15分钟。每孔加入50μl2M H2SO4终止。用酶标仪测定OD450值。
抗血清间接ELISA法检测结果如表2所示:
表2抗血清间接ELISA法检测结果
根据检测结果,抗体阳转率如表3所示:
表3抗体阳转率计算结果
根据Reed-Muench法计算:ED50=0.08(μg)
由小鼠ED50实验结果可见:本发明制备的HPV16L1-g蛋白病毒样颗粒疫苗仅0.05μg免疫小鼠后就能使抗体阳转率达到50%,因此本发明的HPV16L1-g蛋白具有较强的免疫原性。
实施例7HPV16L1-g蛋白病毒样颗粒制备疫苗的异常毒性试验
疫苗制备:同实施例6。
实验动物:18-22g的SPF级BALB/c小鼠5只,250-350g的SPF级Hartley豚鼠2只,均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
实验方法:注射前称量每只实验动物体重,小鼠为18-22g,豚鼠为250-350g。疫苗注射5只小鼠和2只豚鼠,小鼠腹腔注射0.5ml/只,豚鼠腹腔注射5.0ml/只,观察7天。同时设同批动物空白对照。合格标准:观察期内空白对照和实验组动物健存,无异常反应,到期每只动物体重增加。动物试验情况如表4所示:
表4实验动物体重改变情况
结论:观察期内空白对照和实验组动物健存,无异常反应,第8天每只动物体重均增加。证明HPV16L1-g蛋白病毒样颗粒制备疫苗无异常毒性,试验动物安全性较好。
Claims (10)
1.一种人乳头瘤病毒16型L1蛋白HPV16L1-g,其特征在于,其氨基酸序列为:
a)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列;或
b)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因,其特征在于,是如下a)或b):
a)其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示;或
b)由SEQ ID No.1所示核苷酸序列经取代一个或几个核苷酸,得到编码HPV16L1-g的核苷酸序列。
3.含有权利要求2所述基因的重组表达载体。
4.如权利要求3所述的重组表达载体,其特征在于,含有甲醇氧化酶启动子或甲醛脱氢酶启动子。
5.如权利要求4所述的重组表达载体,其为PMV-05-HPV16L1-g。
6.含有权利要求3-5任一所述的重组表达载体的宿主细胞。
7.如权利要求6所述的宿主细胞,其为汉逊酵母细胞。
8.权利要求3-5任一所述的重组表达载体在制备宫颈癌疫苗中的应用。
9.一种病毒样颗粒,其特征在于,含有权利要求1所述的HPV16L1-g蛋白。
10.一种宫颈癌疫苗,其特征在于,含有权利要求1所述的HPV16L1-g蛋白。
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李巍巍等: "人乳头瘤病毒16亚型L1蛋白在多形汉逊酵母中的优化表达", 《生物工程学报》 * |
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