CN1232648C - 一种生产猪瘟疫苗用抗原蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种生产猪瘟疫苗用抗原蛋白的方法，具体步骤包括：从猪瘟毒株提取病毒RNA，经反转录获得猪瘟病毒免疫基因E2；以E2基因为模板，进行聚合酶链反应，同时，根据毕赤酵母对密码子的偏爱性对E2基因进行密码子优化，然后通过酶切位点插入到毕赤酵母表达载体；将重组表达载体导入毕赤酵母菌，筛选出重组毕赤酵母菌；鉴定重组酵母菌的表达产物，并检测表达产物的免疫活性，确定入选的重组酵母菌；对选好的重组酵母菌的培养条件进行试验分析，选择出优化培养条件；在优化培养条件下培养重组酵母菌，生产疫苗用抗原蛋白。

Description

一种生产猪瘟疫苗用抗原蛋白的方法

技术领域

本发明涉及一种生产猪瘟疫苗用抗原蛋白的方法，特别是利用毕赤酵母表达系统生产猪瘟基因工程疫苗用抗原蛋白的方法，即利用基因重组技术构建了一个带有编码猪瘟病毒外膜糖蛋白(gp55)基因(E2)的酵母系统表达载体，借助细胞生物工程技术使整合到毕赤酵母染色体上的重组表达载体能够在高密度培养的寄主菌里高效表达外源基因，能大量生产猪瘟疫苗用抗原。

背景技术

猪瘟(Classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒引起的一种严重危害畜猪生命的传染病，现仍然在许多国家流行，因其给人类造成巨大的经济损失和严重公共卫生问题，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病。我国是猪瘟疫情较严重的国家，每年因本病死亡的猪占饲养总数的5％，其经济损失高达50亿/年。我国猪瘟兔化弱毒(C-株)疫苗以其良好的免疫效力曾有效地控制了60～70年代猪瘟的急性发生和大流行，但从80年代初开始，猪瘟的流行特点发生了重大变化，即由以往的急性猪瘟为主转变为以温和型猪瘟和母畜流产、死胎及新生仔猪死亡为主，传统的兔化弱毒(C-株)疫苗已不能控制疫情的频繁发生。本课题组研究发现，国内近年的流行毒株与C-株疫苗毒的主要保护性抗原蛋白(gp55)基因E2之间有较大的差异，它们的氨基酸同源性为87.9～90.4％，这说明近年流行毒株与C-株疫苗毒在抗原性上已相差甚远，故不难理解免疫失败的经常发生。随着我国加入WTO，禁止使用弱毒疫苗势在必行，因此有必要研制针对性强、抗原谱广的新型疫苗。基因工程疫苗无疑成了最有前途的新型疫苗之一，其最大的优势是安全、无毒，而且很容易用血清学方法鉴别疫苗免疫猪和自然感染猪，从而可彻底清除猪瘟疫源，有助于控制猪瘟的发生。

基因工程疫苗研制的关键问题是如何大量生产具有天然活性的重组蛋白抗原，而免疫基因在体外能否高效表达是解决这一问题的前提，这就要根据表达产物的性质和用途、寄主细胞的生长特性、异源蛋白质的表达水平以及表达产物的提纯方法等，选择最佳的表达系统。大肠杆菌表达系统较为成熟，但其表达产物以包涵体形式存在，无翻译后的糖基化等修饰加工过程，表达的疫苗蛋白其抗原性较差。真核表达系统是最具发展前景的蛋白质生产方式，如酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统等，昆虫细胞表达存在不正确糖基化、产物复杂和不易纯化及病毒污染等问题，而哺乳动物细胞表达存在成本高、产量低的缺点，故不适宜工业化生产疫苗抗原。毕赤酵母(P.Pastoris)是近十几年发展起来并广泛应用的真核表达系统，其兼有原核细胞良好的易操作性和真核系统的翻译后加工的双重特点，且具有高稳定、高表达、高分泌等特点，适合富含二硫键蛋白的表达，最大的优点是生长快速可高密度发酵培养且营养要求低，程度适中的糖基化保证了表达产物的天然活性。虽然国内外利用毕赤酵母已成功表达了数百种酶、药用及疫苗用蛋白，但由于种种未知的原因，并非所有的外源基因都能在该系统中表达，而且表达水平因外源基因、表达载体、寄主菌以及表达条件的不同而异。利用酵母表达系统生产的抗人乙型肝炎病毒亚单位疫苗是人类第一个真核细胞重组DNA商品化产品。

猪瘟病毒的RNA全长约12,300bp，由11～12个基因组成，其中E2基因编码的外膜糖蛋白gp55是主要的免疫原蛋白，在全部的结构蛋白中它引起的中和效力最强，可诱导动物产生有效的免疫保护力，而且人类对gp55的抗原结构已研究地很清楚(E2基因长约370个氨基酸，N端上游有一段信号肽序列，C端有一段跨膜区，抗原位点主要集中在N端部分区域)。因此，E2基因成了目前猪瘟基因工程疫苗研制最常用的材料。

发明内容

本发明的目的在于解决猪瘟基因工程疫苗用抗原蛋白大量生产的问题。为了达到该目的，本发明提供一种生产猪瘟疫苗用抗原蛋白的方法，具体步骤包括：从猪瘟毒株提取病毒RNA，经反转录获得猪瘟病毒免疫基因E2；以E2基因为模板，进行聚合酶链反应，同时，根据毕赤酵母对密码子的偏爱性对E2基因进行密码子优化，然后通过酶切位点插入到毕赤酵母表达载体；将重组表达载体导入毕赤酵母菌，筛选出重组毕赤酵母菌；鉴定重组酵母菌的表达产物，并检测表达产物的免疫活性，确定入选的重组酵母菌；对选好的重组酵母菌的培养条件进行试验分析，选择出优化培养条件；在优化培养条件下培养重组酵母菌，生产疫苗用抗原蛋白。

与传统的CSF疫苗(包括弱毒苗、灭活苗)用抗原蛋白的生产方式完全不同，本发明提供的方法是利用基因工程技术生产猪瘟疫苗用抗原蛋白的方法，其优点如下：

1)用本发明生产的疫苗抗原是免疫基因的表达产物，生产过程中不存在病毒的培养增殖，从而避免了人为地制毒、散毒；

2)用本发明生产的疫苗与传统疫苗(主要是弱毒苗)相比抗原成分单一，在免疫动物体内只产生相应的特异性抗体，因此可用血清学方法鉴别疫苗免疫猪和自然感染猪，从而有助于防疫措施的正确实施。

3)本发明涉及的疫苗用抗原是蛋白物质，与其它的新型疫苗(如活载体疫苗和核酸疫苗)相比不存在生物安全性的问题。

4)本发明涉及的毕赤酵母表达系统属单细胞真核生物，既具有原核生物生长快速、营养要求低、可高密度发酵培养的特点，又具有真核系统的翻译后加工的特点，适于表达产物的工业化生产。

附图说明

图1是表示密码子优化前后的E2基因核苷酸序列图；

图2是表示E2基因重组酵母表达载体构建策略图。

具体实施方式

下面，对本发明的具体实施方式进行说明，其中所使用的主要材料的作用或来源如下：

猪瘟流行毒株GXYL/2000：2000年采自广西省玉林地区，由由中国农业科学院兰州兽医研究所采集保存。

pMD18-T：基因克隆用载体，由TaKaRa公司出品。

SMD1168：一种表达外源基因用的毕赤酵母菌株，由中国科学院微生物研究所提供。

DH5α：是一种用于克隆外源基因的大肠杆菌类宿主菌，用于质粒转化时须经0.1M CaCl₂处理使其具有感受性，故称之为感受态细胞。该菌株由由中国农业科学院兰州兽医研究所保存。

JM109：是一种用于克隆外源基因的大肠杆菌类宿主菌，用于质粒转化时须经0.1M CaCl₂处理使其具有感受性，故称之为感受态细胞。该菌株由由中国农业科学院兰州兽医研究所保存。

pPROEX^TMHTb：一种原核表达载体，也可用于基因克隆。购自GIBCOBRL公司。

pPIC9K：一种酵母表达载体。购自Invitrogen公司。

AOX1(乙醇氧化酶)启动子：是毕赤酵母表达载体pPIC9K上的组成元件之一。本启动子在底物(甲醇)的诱导下可严格调控外源基因的表达，同时它也是载体和宿主菌染色体发生重组的位点。

终止序列(TT)：是毕赤酵母表达载体pPIC9K上的组成元件之一，由连续数个转录终止子(多聚腺苷酸化序列)组成。

α-因子信号肽(α-MF)序列：是毕赤酵母表达载体pPIC9K上的组成元件之一，由87个氨基酸组成，来自S.cerevsiae的α性成熟因子前导序列。本信号肽可引导外源基因表达产物被分泌到宿主菌的胞膜外。

酵母营养缺陷型选择标记HIS4基因：是毕赤酵母表达载体pPIC9K上的组成元件之一，HIS4基因可编码酵母菌生长所需的组氨酸，故作为转化子的筛选标记。

E.Coli复制起始序列ColE：源自E.Coli(埃希氏大肠杆菌)体内的高拷贝自我复制型质粒，作为毕赤酵母表达载体pPIC9K上的组成元件使pPIC9K成为一个既可用于外源基因的克隆又可用于外源基因酵母系统表达的穿梭载体。

氨卞青霉素(Amp)抗性基因：是毕赤酵母表达载体pPIC9K上的组成元件之一，当pPIC9K用作克隆载体时，它在大肠杆菌体系中充当转化子的筛选标记。

卡那霉素(Kan)抗性基因：是毕赤酵母表达载体pPIC9K上的组成元件之一，当pPIC9K用作表达载体时，它在酵母表达系统中充当高拷贝型转化子的筛选标记。

引物：所有基因扩增和改造用的引物均由TaKaRa公司合成。

pfu DNA聚合酶：是一种耐热性DNA聚合酶，PCR反应产物具有极高的保真性。购自上海生工(Sangon)公司。

扩增用单核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)：购自TaKaRa公司。

T4 DNA连接酶：购自TaKaRa公司。

核酸限制性内切酶(如EcoRI、BgIII、NotI、BamHI、HindIII等)：均购自Promega公司。

YNB(无碳源酵母氮源)固体培养基：购自Invitrogen公司。

生物素(Biotin)：购自Invitrogen公司。

实施例

1.从选择的猪瘟毒株中提取猪瘟病毒RNA

通过猪瘟流行毒株E2基因遗传衍化关系分析，选择当前的优势流行毒株或抗原谱较广的毒株为病毒材料。本实施例中选用猪瘟流行毒株GXYL/2000为病毒材料，从中提取猪瘟病毒RNA。以提取的病毒RNA为模板，反转录(RT)获得E2基因，再进行聚合酶链式扩增反应(PCR)和多巢聚合酶链式扩增反应(nPCR)扩增，本文将反转录一聚合酶链式扩增反应简称RT-PCR。

E2基因RT-PCR引物如下：E21  (正向)5’TGTATTAGACCAGACTGG 3’

                      E21’(反向)5’CTGCCAACCGCCGTCTATCTT 3’

E2基因nPCR引物如下：  E22  (正向)5’AGGGGACAGATCGTGCAA 3’

                      E22’(反向)5’GGCGAGTTGTTCTGTTAG 3’

2.对E2基因5’端部分存在的5处不利于在毕赤酵母中表达的低利用密码子区域进行了改造(见图1)。设计了如下9条改造用引物(F表示正向引物，R表示反向引物)。

F1 5′GCGAATTCAGACTTGCCTGTAAGGAAGATTAC 3′

F2 5′TTACAGATACGCTATCTCCTCCACCGATGAG 3′

F3 5′TGAGGTTGGTCTGTTGGGTGCTGA AGG 3′

F4 5′TTAGTAAGAGATACCTGGC 3′

F5 5′TACCTCA GTTACTTTCGAACTTCTTTTCGATGGGAC 3′

F6 5′GGAAGATCTGTTCTACTGC 3′

R1 5′GAACAGATCTTCCTTTTCAACAATAG 3′

R2 5′GCTGTGCTGTAGAAAGCACTGCCGT 3′

R3 5′GAGCGGCCGCGAACTAGTCCGTGTGGTG 3′

基因改造的方法为PCR基础上的定点突变技术，包括多巢PCR法和大引物诱变法，所有PCR均使用高保真聚合酶。

具体操作如下：首先分别以F1和R1、F6和R3为引物，以猪瘟GXYL毒株的E2基因为模板，分别扩增出两个带有重叠序列的片段，将E2分为两部分，由于引物上带有EcoRI、BgIII和NotI序列，在扩增片段两边分别引入了4个酶切位点。对E2基因密码子的优化的方法参照van Rijn等(1994)所采用的方法进行，通过两轮PCR扩增实施。第一轮扩增包括两个同时进行的PCR反应。一个PCR反应以F1R1片段为模板，F1、R2为引物扩增F1R2片段；另一个PCR反应也以F1R1为模板，其中的一条突变引物和R1为引物扩增出相应的片段。PCR反应的条件为：98℃ 10s，55℃ 30s，72℃ 1∶30min，35个循环。扩增的两个片段分别经琼脂糖凝胶电泳纯化后，分别取1％混合，进行第二轮PCR扩增。第二轮PCR在相同的反应条件下以F1R1作为引物进行扩增。如此共进行四次突变反应，待所有的反应完全结束后，将最后获得的F1R1片段与前面所扩增的F6R3片段分别用琼脂胶电泳回收纯化后，等体积混合，按照Ho S.N.等的方法，利用以F1、R3为引物，利用pfu DNA聚合酶(一种高保真聚合酶)扩增F1R3片段，PCR反应条件为：95℃ 50s，48℃ 1min，72℃ 150min，35个循环。扩增完成后，琼脂糖凝胶电泳回收纯化F1R3片段，然后利用T4DNA将其克隆到PMD-18T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态菌，得到阳性重组克隆PMD-18T/E2，小提质粒后送宝生物(大连)工程公司测序。

3.重组表达载体pPIC9K/E2的构建

用BamHI和HindIII分别双酶切pMD-18T/E2质粒和pPROEX^TMHTb载体，琼脂糖凝胶电泳分别回收约1100bp和4700bp片段，两片段按适当比例混合，加入T4 DNA连接酶于16℃连接20h，转化大肠杆菌DH5α感受态菌，挑选氨卞青霉素(Amp)⁺阳性的重组菌落接种含有Amp⁺的LB培养基，小提质粒后用BamHI和HindIII进行酶切鉴定，得到插入E2基因的重组质粒pPROEX^TMHTb/E2。用EcoRI和NotI双酶切pPROEX^TMHTb/E2质粒，同时用EcoRI和NotI双酶切毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K，利用琼脂糖凝胶电泳分别回收1100bp左右和9Kb左右的片段，将两片段按适当比例混合后，加入T4 DNA连接酶，于16℃连接20h。取5μL连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态菌，挑选Kana⁺阳性的重组菌接种含卡那霉素(Kana)⁺的LB培养基，小提质粒后用EcoRI和NotI进行双酶切鉴定，最后得到插入E2基因的重组表达质粒pPIC9K/E2(见图2)。

4.各种酵母培养基的配制

(1)10×YNB(酵母氮源)：将13.4g YNB固体培养基(无氨基酸)添加至100mL水中，抽滤除菌，4℃保存。

(2)500×B(Biotin，生物素)：在100mL水中溶解20mg生物素，抽滤除菌，4℃保存。

(3)100×H(Histidine，组氨酸)：在100ml水中溶解400mgL组氨酸，抽滤除菌，4℃保存。

(4)10×D(葡萄糖)：在100ml水中溶解20g D-葡萄糖，高压15min灭菌，4℃保存。

(5)10×M(Methanol，甲醇)：在95mL水中溶解5mL甲醇，抽滤除菌，4℃保存。

(6)10×GY(Glycerol，甘油)：向900mL水中加入100mL甘油，高压15min灭菌，4℃保存。

(7)1M磷酸钾缓冲液(PH60)：将132ML 1M K₂HPO4 868mL 1M KH₂PO4混合，确认PH约为6.0，高压灭菌，室温保存。

(8)YPD培养基：在900mL水中溶解10g酵母提取物、20g蛋白胨、(制备平板可加入2％的琼脂粉)，高压15min灭菌，冷却后加入100mL 10×D贮液，4℃保存。

(9)MD培养基：在800mL去离子水中溶解15g琼脂粉，后高压15min灭菌，冷却后加入100ML 10×YNB、2mL 500×B、100ML 10×D，定容至1L，混匀制板，4℃保存。

(10)MM培养基：在800mL去离子水中溶解15g琼脂粉，后高压15min灭菌，冷却后加入100mL 10×YNB、2mL 500×B、100mL 10×M、定容至1L，混匀制板，4℃保存。

(11)BMGY培养基/BMMY培养基：在700mL去离子水中加入10g酵母提取物、100mL 1磷酸钾缓冲液(PH6 0)、100ml L10×YNB、20g蛋白胨、高压15ming灭菌，冷却后加入100mL磷酸钾缓冲液(PH6 0)、100mL 10×YNB、2mL 500×B、100mL 10×GY贮液(如制各BMM，可用10×M代替10×GY)4℃保存备用。

(12)裂解缓冲液：在1L体系中加入6g磷酸钠、37.2mg EDTA、50mg甘油、用氢氧化钠调节PH值7.4，定容后4℃保存备用，用时可加入蛋白酶抑制剂1mM PMSF(苯甲基磺酰氟)。

5.表达载体pPIC9K/E2电转化毕赤酵母以及高拷贝重组子的筛选和鉴定

毕赤酵母表达载体有多种，我们所选用的表达载体pPIC9K是分泌型穿梭载体，属高拷贝型，主要由以下几部分组成：毕赤酵母的AOX1启动子和终止序列、α-因子信号肽序列、酵母营养缺陷型选择标记HIS4、E.Coli复制起始序列ColE、氨卞青霉素(Amp)和卡那霉素(Kan)抗性基因。

①重组表达载体线性化：将含pPIC9K/E2质粒的JM109单克隆增菌培养并用碱裂解法小量提取质粒，然后用SalI酶切、纯化回收，置-20℃备用。

②感受态细胞的制备：挑取毕赤酵母菌株SMD1168的单菌落28～30℃摇床，培养过夜。次日在装有100mL YDP培养基的500mL三角瓶中，按0.1～0.5％接种上述菌种，28～30℃振荡培养过夜，使菌体OD₆₀₀达到1.3～1.5，4℃ 1 500g离心，5min，收集菌体，用冰预冷的无菌去离子水悬浮洗涤2次，再用冰预冷的无菌1mol/L的山梨醇洗涤一次，最后取沉淀用1/500体积预冷的无菌1mol/L的山梨醇悬浮，制成酵母感受态细胞，立即用于转化。

③电转化：取20uL(约5～20ug)线性化的pPIC9k/E2，与800uL的上述感受态细胞混匀，放入预冷0.2cm的电击杯中，在电转化仪中进行电击。脉冲时间为10ms，强度为1500V/cm，电容值为50uF，阻抗为200Ω。电击后立即加入1mol/L山梨醇1ml，混匀，随即涂MD平板，置28～30℃温箱培养，观察。

④高拷贝转化子的筛选：将转化后的待检菌落，用无菌牙签接种于MM平板上，28～30℃培养3～4d，观察菌落大小，挑选在MM平板上生长迅速的菌落，即甲醇代谢快型(Mut⁺)菌落；将Mut⁺单克隆菌落按方阵法，用无菌牙签涂于含0.5mg/mL G418的MD板上，28～30℃培养，观察菌落；将在MD板中长出的转化子，影印法依次接种到含G418分别为2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL的YPD琼脂培养基上，逐级筛选G418抗性菌株即外源基因高拷贝菌株。

⑤高拷贝重组子的鉴定：从筛选得到的重组高拷贝菌株的单菌落上刮取少量菌体放入Eppendof管中，加10ul的灭菌水，加100ul(1mg/ml)的酶解酶，37℃水浴15分钟，消化酵母菌细胞壁，再经反复冻融，离心取上清，以其中少量的酵母菌染色体DNA为模板，PCR扩增表达载体上的目的基因E2以确认重组表达载体pPIC9K/E2是否整合到寄主菌的染色体上。

6.重组酵母菌株的诱导表达

任选一高拷贝菌株接种于20mL BMGY培养基中(装于一个250ml的三角瓶中)28～30℃摇床培养过夜(16～18h)转速为250～280r/min。当OD₆₀₀≈2～6时，即酵母处于对数生长期，室温下6000r/min离心，收集菌体，再用50mL的BMMY重悬菌体(装于一个500mL的三角瓶中)，加甲醇使其终浓度为1.0％，28～30℃摇床培养。每隔24h，取2～5mL菌液做检测，并补加甲醇使其终浓度0.5％，至到96h为止。

7.表达产物的检测和鉴别

①表达产物的初步纯化：

将诱导表达过程中不同时间收集的菌液，于4℃下6000r/min离心5min，收集上清；将上清置于冰上，加入磨碎的硫酸铵，边加边搅使其溶解至饱和浓度(约需1h)；4℃下8000～10000r/min离心1h，弃上清，沉淀用20mm Tris.HCl(PH8.0)缓冲液重悬后加入透析带中，并用此缓冲液在4℃透析过夜，其间换液5～6次；用PEG12000在4℃浓缩透析物，至其原体积，分装置-70℃备用。

②SDS-PAGE电泳检测表达产物：

洗净玻璃板，固定在蛋白电泳槽上，用2％的琼脂糖封边；以10％的聚丙稀酰胺凝胶配制下层分离胶(双面)，待其凝固后以5％的聚丙稀酰胺凝胶配制上层积层胶(双面)，插上梳子，垂直放置电泳槽使其凝固；加样40uL/孔，以50V电压跑上层胶，当进入下层胶后，提高电压到100V；电泳结束，取分离胶，一块进行考马斯亮染色过夜(室温)，一块用作Westernblot(蛋白免疫印迹试验)检测。

SDS-PAGE电泳显示表达产物大小约56Kda，与氨基酸序列推导的大小基本一致。

③Western-blot鉴别表达产物：

SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳)后，切出含待转移蛋白的凝胶，剪6张同样大小的滤纸和1张硝酸纤维素膜，将他们浸泡于转移缓冲液(48mmol/L Tris碱、39mmol/L甘氨酸、0.037％SDS、20％甲醇)中，在塑料支架上依次浸湿的海绵、3层滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、3层滤纸和海绵，使滤纸、凝胶和硝酸纤维素膜对齐，且各层之间须无气泡存在，将塑料支架加紧插入电转移槽中，硝酸纤维素膜一侧接阳极，凝胶一侧接阴极，加转移缓冲液没过凝胶，以250～300mA的电流电泳1.5h；电泳结束后，膜用1×PBST溶液(PH7.4，以下同)洗三次，15min/次，然后加封闭液(在PBST溶液中加10％的脱脂奶粉)于平皿中，并浸泡转移的硝酸纤维素膜，室温过夜；次日，用PBST溶液漂洗膜4次，5min/次，用PBST溶液1∶80稀释猪抗CSF高免血清，将膜浸入该溶液中37℃反应2.5h；用PBST溶液将膜漂洗4次，15min/次，用PBST(含有吐温20的磷酸盐缓冲溶液)溶液1∶800稀释酶标二抗(辣根过氧化物酶标记羊抗猪抗体)，并将膜浸入其中，37℃反应2h，回收二抗溶液；用PBST溶液漂洗膜4次，5min/次，置于20ml底物溶液(12mg DAB(二氨基联苯胺)溶于20ml 50mmol、PH7.6 Tris.HCI)中，加50ul的30％H₂O₂，室温显色10～30分钟，用自来水终止反应。观察结果。

Western blot印迹试验表明该表达产物能与CSF的阳性血清发生特异性反应。

④表达量的测定：

首先采用分光光度法，分别测定样品的OD₂₆₀、OD₂₈₀下的紫外吸收值，后根据公式[蛋白浓度(mg/mL)＝1.45×OD₂₈₀-0.74×OD₂₈₈]进行计算出菌液上清中的总蛋白含量；SDS-PAGE胶经考马斯亮蓝R250染色，脱色干燥后用薄层扫描仪测定目的蛋白的百分含量，从而计算出重组蛋白的表达量。

测定结果，表达量在0.25～0.46g/L之间。

8.表达产物的免疫活性检测

选用Sigma公司成品弗氏佐剂，参考弗氏佐剂免疫程序。第一次用完全弗氏佐剂按1∶1(V/V)与表达产物乳化：在事先干考无菌的乳钵中加入5ml的弗氏佐剂，再按专一方向研磨，并滴加5mL表达产物至粘稠的白糊状，然后吸入注射器，用12号针头点状(最好在淋巴结附近)免疫健康家兔8只，每只兔免疫E2抗原蛋白500ug，设空白对照4只。22天后用不完全弗氏佐剂乳化进行第二次免疫，免疫剂量为500ug/只。第二次免疫7天后采血，离心、分离血清，用猪瘟C-株细胞毒绵羊红细胞诊断试剂测其抗体水平。

检测结果：血凝抗体效价为1∶128～1∶256，说明本表达产物有良好的免疫原性。

9.表达条件的优化

用P.Pastoris系统表达外源基因，虽然运用的都是相同的Aox1启动子，但对于不同的外源蛋白，表达量千差万别。除外源基因序列本身的内在特性起着很重要的作用外，表达条件对表达量高低的影响也极其显著^[1]。因此，非常有必要进行表达条件的优化。我们分别在不同的时间、不同的诱导型、不同的PH、不同的诱导剂量方面进行了较详细的对比研究，得到了一套较完善的在P.Pastoris中表达CSFV E2基因的优化条件，以供今后在大规模发酵罐中表达E2基因蛋白生产亚单位疫苗时参照。

不同的诱导方式下表达：纯诱导方式是指在增菌平台期将BMGY培养基换成BMMY培养基，每24h补加甲醇到终浓度1％，72h后诱导结束；诱导/抑制方式是指在增菌的生长对数期加入0.5％甘油，同时加入1％的甲醇进行诱导，即甲醇/甘油混合补料，同样每24h混合补加一次，72h后诱导结束。结果表明，诱导/抑制方式的表达量比纯诱导方式的要大一些。

不同酸碱培养环境中的表达：分别配制PH6.0、PH6.5、PH7.0、PH7.5、PH8.0的BMMY甲醇培养液；取5个相同容量的三角瓶(100mL)，分别加30mL的不同PH在BMMY瓶中，加入等量的复苏的重组菌株，甲醇诱导表达，每24h补充甲醇，使终浓度为1％，72h后诱导结束；结果表明，PH值在6.5以下时杂蛋白较多，在PH7.5的培养液环境下本外源蛋白的表达产量最高，但杂蛋白最少。

不同剂量甲醇诱导表达：分别用0.5％、1％、2％、3％、4.0％剂量进行诱导表达，每24h补加甲醇一次，使其终浓度维持在0.5％、1％、2％、3％、3.5％，72h后诱导结束。结果表明，甲醇剂量在2％～3％之间表达量最高。

不同诱导时间的表达对比实验说明，在诱导表达72h即可获得很高的表达量，为了更经济，无需延长到96h(常规方法)。

10.重组酵母菌的高密度培养

从YPD平板上挑取单个菌落，接种于100ml的BMGY培养基中(用500ml容量的三角瓶)，于28℃摇床，250rpm增菌培养约12～16h，收集菌体备用；配制高密度发酵培养用的微量盐溶液PTM₁(每升含硫酸铜6.0g、碘化钾0.08g、硫酸锰3.0g、钼酸钠0.2g、硼酸0.02g、氯化钴0.5g、硫酸亚铁65g、生物素0.2g、氯化锌20g和浓硫酸5ml，过滤除菌)和基础盐溶液(每升含磷酸26.7ml、硫酸钙0.93g、硫酸钾18.2g、硫酸镁14.9g、氢氧化钾4.13g和甘油31.8ml，装罐高压灭菌后加PTM₁4.35ml)；将配好的分批发酵培养基础盐溶液2L装入生物发酵罐(德国贝朗公司产，带电脑监控装置)中，调节好循环水冷却系统，121℃、30min在位消毒，待各参数恢复设定值后，将外加的补料培养基(50％灭菌甘油，含PTM₁ 12ml/L)、诱导培养基(100％甲醇，含PTM₁ 12ml/L)和氨水分别接入发酵罐，调好气阀，并将酸碱泵调到自动档，使温度、溶氧、PH值均达到设定值；将增殖好的种子菌按10％的接种量接入发酵罐中，当基础盐培养基的碳源耗尽后流式添加补料培养基，当菌液浓度达OD₆₀₀＞400时停止添加补料，将PH值调至7.5，溶氧(DO)调至50％，并开始流式添加诱导培养基(前10小时按3％添加，10～24小时按4％添加，之后根据细胞生长情况按5％～8％添加)，诱导72h、96h时收获发酵液上清，经初步纯化，SDS-PAGE电泳检测。

检测结果，表达量可达1.08g/L。

Claims (8)

1、一种生产猪瘟疫苗抗原蛋白的方法，步骤包括：

从猪瘟毒株提取病毒RNA，经反转录获得猪瘟病毒免疫基因E2；

以E2基因为模板，进行聚合酶链反应，同时，根据毕赤酵母对密码子的偏爱性对E2基因进行密码子优化，然后通过酶切位点插入到毕赤酵母表达载体；

将重组表达载体导入毕赤酵母菌，筛选出重组毕赤酵母菌；

鉴定重组酵母菌的表达产物，并检测表达产物的免疫活性，确定入选的重组酵母菌；

对选好的重组酵母菌的培养条件进行试验分析，选择出优化培养条件；

在优化培养条件下培养重组酵母菌，生产疫苗用抗原蛋白；其特征在于，所述优化是把E2基因5’端部分表达的密码子区域在聚合酶链式扩增反应基础上采用定点突变的方式进行改造，改造用引物如下：

F15′GCGAATTCAGACTTGCCTGTAAGGAAGATTAC3′

F25′TTACAGATACGCTATCTCCTCCACCGATGAG3′

F35′TGAGGTTGGTCTGTTGGGTGCTGA AGG3′

F45′TTAGTAAGAGATACCTGGC3′

F55′TACCTCA GTTACTTTCGAACTTCTTTTCGATGGGAC3′

F65′GGAAGATCTGTTCTACTGC3′

R15′GAACAGATCTTCCTTTTCAACAATAG3′

R25′GCTGTGCTGTAGAAAGCACTGCCGT3′

R35′GAGCGGCCGCGAACTAGTCCGTGTGGTG3′

其中，F表示正向引物，R表示反向引物。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的猪瘟毒株为GXYL/2000。

3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的表达载体为质粒pPIC9K。

4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述导入毕赤酵母菌的菌株为SMD1168。

5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述优化培养条件是指在增菌的生长对数期加入0.5％甘油，同时加入2％～3％的甲醇进行诱导，每24h补加一次；培养液环境条件为PH7.5。

6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于在诱导72～96h内收获上清液。

7、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的表达载体包括毕赤酵母的AOX1启动子和终止序列、α-因子信号肽序列。

8、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在重组表达载体时使用大肠杆菌DH5α感受态菌。

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