CN102676471A - 一种鸡il-18与新城疫病毒hn基因重组融合蛋白及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种重组鸡白细胞介素18(Interleukin-18，IL-18)与新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase，HN)融合蛋白(chIL-18-HN融合蛋白)的制备方法和应用。该融合蛋白为鸡IL-18(chIL-18)蛋白和新城疫病毒HN蛋白通过柔性Linker肽融合而成，编码该融合蛋白的DNA序列插入表达载体pPICZαA，电转化酵母菌X-33，获得高效表达重组chIL-18-HN融合蛋白的基因工程菌，通过液体培养、纯化制得的重组chIL-18-HN融合蛋白，该重组融合蛋白可作为新城疫新型基因工程疫苗，也可作为新城疫常规疫苗的新型免疫佐剂。本发明的chIL-18-HN融合蛋白经动物免疫实验证实，安全性好，无毒副作用，能够有效增强机体细胞免疫和体液免疫水平，具有广阔的应用前景。

Description

一种鸡IL-18与新城疫病毒HN基因重组融合蛋白及应用

技术领域

本发明涉及一种鸡白细胞介素-18(Interleukin-18，IL-18)与新城疫病毒HN融合蛋白及编码该融合蛋白的DNA序列以及含该DNA序列的载体和酵母菌，还涉及重组融合蛋白及其应用，属于生物技术制药工业中的基因工程生产疫苗和免疫佐剂的技术领域。

背景技术

新城疫(Newcastle disease，ND)被国际兽疫局列为对动物危害最大的A类传染病之一，它是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起禽类的一种以呼吸困难、拉黄绿色稀便、神经机能紊乱和粘膜、浆膜出血为主要特征的高度接触性、急性败血性传染病；给养禽业造成了巨大经济损失。鸡新城疫由于其发病率和死亡率都很高，是威胁养鸡业的头号疾病，对该病的控制成功与否直接决定了养禽业的发展趋势。NDV的血凝素-神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase，HN)基因编码的HN蛋白在NDV致病过程中发挥着重要作用，是NDV除F糖蛋白之外另一种较大的糖蛋白，也是病毒的主要宿主保护性抗原，可诱导机体产生中和性抗体，在机体抗感染免疫中起着重要作用。因此，HN基因是NDV基因工程疫苗研究中的首选基因之一，用基因工程表达的HN蛋白具有良好的免疫原性，免疫鸡后能产生较高水平的特异性抗体，对强毒攻击有很好的保护作用。

在鸡新城疫免疫预防中常规使用的疫苗主要有各种不同毒力的弱毒疫苗和油乳剂灭活疫苗。但传统新城疫灭活疫苗的共同特性是能诱导强烈的体液免疫应答，而细胞免疫反应则相对软弱。在新城疫的抗感染免疫中，抗体反应对于机体抵抗病毒的感染是必需的，但不能阻止病毒的传播。因而，近年来随着分子生物学技术的飞速发展，NDV基因工程疫苗的研制已成为人们研究的热点，但基因工程疫苗在诱导机体免疫反应方面还存在一些不尽如人意之处，动物保护实验效果不够理想。因此，研究者试图从多方面增强NDV疫苗的免疫效果，其中用细胞因子作为分子免疫佐剂，已引起研究者的关注。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有良好免疫效果的chIL-18-HN融合蛋白。

本发明的第二个目的是提供一种编码该融合蛋白的DNA序列。

本发明的第三个目的是提供一种含该DNA序列的载体以及宿主细胞。

本发明的第四个目的是提供一种以毕赤酵母菌为宿主细胞的基因工程chIL-18-HN融合蛋白的制备方法。

另外，本发明的目的还在于提供一种该融合蛋白在鸡新城疫防治中的应用方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种chIL-18-HN融合蛋白，包括鸡白细胞介素18(chIL-18)的氨基酸序列、新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶(HN蛋白)的氨基酸序列以及位于chIL-18氨基酸序列和新城疫病毒HN蛋白的氨基酸序列之间的柔性Linker肽氨基酸序列；由chIL-18基因和鸡新城疫病毒HN基因通过柔性Linker肽(-G-G-S-G-G-S-G-G)串联连接而成。

所述chIL-18-HN融合蛋白具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。

所述的柔性Linker肽具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。

同时，本发明的技术方案还采用了一种分离的DNA序列，编码具有序列为SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列的融合蛋白。

该DNA序列具有SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

本发明的技术方案还采用了一种重组毕赤酵母载体和宿主细胞，它含有具有SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列的DNA序列。

重组融合蛋白在鸡新城疫预防和治疗中的应用。

具体地：本发明的chIL-18-HN融合蛋白及其DNA序列如下：

chIL-18-HN融合蛋白基因是由鸡IL-18基因和鸡新城疫病毒HN基因通过柔性Linker基因串联连接而成，该串联DNA序列所编码的氨基酸序列即为chIL-18-HN融合蛋白。一方面，新城疫病毒HN蛋白能诱导机体产生高水平的特异性抗体，对强毒攻击有很好的保护作用。同时，IL-18能诱导IFN-γ产生，刺激T、B淋巴细胞的增殖和分化，增强Th、细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞等活性的功能，能特异性增强机体诱导细胞免疫和体液免疫的能力，在宿主防御、抗感染免疫等方面具有重要作用。二者通过柔性氨基酸肽连接，在保持独立的空间结构的同时能有效发挥各自的生物学功能。

本发明还采用了一种能高效表达chIL-18-HN融合蛋白的基因工程菌的构建方法：

为生产成本低的chIL-18-HN融合蛋白，须构建一种能生产chIL-18-HN融合蛋白的基因工程菌。本发明选用的基因工程菌是毕赤酵母X-33菌，重组的毕赤酵母X-33菌株，是通过同源重组技术，将chIL-18-HN融合蛋白的基因整合到毕赤酵母X-33菌基因组中。因此重组的毕赤酵母X-33菌株基因组中携带有chIL-18-HN融合蛋白的基因。

本发明还采用了一种可溶性的重组chIL-18-HN融合蛋白的制备方法：

选用毕赤酵母表达系统，在BMMY培养基中，重组的毕赤酵母X-33菌，在甲醇诱导下能高效表达chIL-18-HN融合蛋白；收集培养液上清经Ni柱亲和层析纯化后，收集穿透峰，冷冻干燥，可得到纯度极高的重组chIL-18-HN融合蛋白。

本发明将重组chIL-18-HN融合蛋白免疫鸡。通过对免疫鸡的NDV-HN抗体和抗体亚型、淋巴细胞增殖、血清中IL-4和IFN-γ的测定以及动物攻毒保护实验，评价重组chIL-18-HN的免疫特性。

本发明的重组chIL-18-HN融合蛋白的制备方法，其生产包括以下步骤：

(1)chIL-18和HN基因序列的获得

①禽IL-18基因序列的获得：

根据GenBank中禽IL-18的核苷酸序列，设计一对引物扩增鸡IL-18成熟蛋白基因片段。

用NDV-I系疫苗接种于10日龄鸡胚，于接种后48-72h取出未死的鸡胚脾脏，无菌研碎，并按试剂盒的要求立即进行总mRNA的提取和扩增。以鸡胚脾脏总mRNA为模板，RT-PCR扩增鸡IL-18基因。扩增PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切下目的条带，用大连TaKaRa公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收纯化，其纯化产物即为禽IL-18基因片段，并送大连宝生物测序；

②获得新城疫病毒HN基因

根据GenBank中新城疫病毒HN基因的核苷酸序列(收录号：AY510092)，设计一对引物扩增新城疫病毒HN基因片段。

将NDV毒株通过尿囊腔途径接种9～10日龄SPF鸡胚，收集鸡胚的尿囊液，20℃保存待用。按照大连宝生物工程有限公司RNA提取试剂盒说明进行NDV病毒RNA的提取。并以总RNA为模板，进行RT-PCR。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切下目的条带，用大连TaKaRa公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收纯化，纯化产物为新城疫病毒HN基因，并送大连宝生物测序；

(2)chIL-18-HN融合基因序列的获得

以(a)中所述①②获得的禽IL-18基因和新城疫病毒HN基因为模板，应用重叠延伸PCR方法扩增chIL-18-HN融合基因。

PCR产物经含有溴化乙锭1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切下目的条带，随后按胶回收试剂盒使用说明进行回收即为chIL-18-HN融合基因，并送大连宝生物测序。

(3)高效表达chIL-18-HN融合蛋白的基因工程菌株的构建

将上述获得的chIL-18-HN融合蛋白基因片段，插入到毕赤酵母载体pPICZαA中，得到重组表达的毕赤酵母载体pPICZαA-chIL-18-HN；采用电转化法，将重组质粒pPICZαA-chIL-18-HN转化进入毕赤酵母菌X-33中，通过高抗性筛选和PCR扩增鉴定，获得表达重组融合蛋白的基因工程毕赤酵母X-33/pPICZαA-chIL-18-HN菌株；

(4)可溶性chIL-18-HN融合蛋白的获得

将X-33/pPICZαA-chIL-18-HN菌株接种到BMGY中，振荡OD₆₀₀达到3-6，收集菌体重悬于BMMY培养基，用甲醇进行诱导表达；120h后，5000r/min离心10min收集培养液上清，即为获得的chIL-18-HN融合蛋白。

本发明的重组chIL-18-HN融合蛋白能有效增强机体的体液和细胞免疫应答。本发明应用重组的chIL-18-HN融合蛋白免疫鸡，检测结果表明：chIL-18-HN融合蛋白能诱导免疫鸡产生与新城疫活疫苗同样水平的IgG抗体，进一步的抗体亚型测定结果显示，chIL-18-HN融合蛋白免疫组鸡体能产生一个平衡的IgG1和IgG2a抗体反应。细胞因子ELISA试验结果表明融合蛋白免疫组主要刺激Th1分化(FNI-γ)，但也能刺激Th2(IL-4)的分化。

新城疫病毒强毒攻毒试验表明：chIL-18-HN融合蛋白可使实验鸡保护率达88.9％，且无一只死亡，而单纯的HN蛋白免疫组鸡保护率仅为55.8％，说明重组chIL-18-HN融合蛋白能有效增强机体的体液和细胞免疫应答，提高机体的攻毒保护率。

本发明的chIL-18-HN融合蛋白，不仅具有免疫鸡后能产生较高水平的特异性抗体，对强毒攻击有很好的保护作用；另外也具有白细胞介素-18的细胞因子免疫佐剂作用。本发明为制备重组chIL-18-HN融合蛋白提供了切实可行的技术路线，按本方法制备的chIL-18-HN融合蛋白可作为新城疫新型基因工程疫苗，也可作为新城疫常规疫苗的新型免疫佐剂，在鸡新城疫预防和治疗中具有广阔的应用前景。本发明易于实现大量生产，本发明重组的chIL-18-HN融合蛋白在生产时选择毕赤酵母表达系统，其优点在于技术简单，成本低，产量高，能大规模发酵，易于实现大量生产。

白细胞介素-18(Interleukin-18，IL-18)是一种重要的新型细胞因子，其能够诱导IFN-γ产生，刺激T、B淋巴细胞的增殖和分化，增强Th、细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞等活性的功能。与早期的另一细胞因子IL-2相比，IL-18在诱导IFN-γ产生和细胞免疫能力方面更优于IL-2。因此，在宿主防御、抗感染免疫、抑瘤抗瘤方面具有重要作用。同时，IL-18作为天然的免疫调节剂和疫苗佐剂克服了使用传统药物成本高，副作用大等缺点，是一种可以替代传统疗法的天然免疫增强剂。

附图说明

图1重组质粒pPICZαA-chIL18-HN酶切及PCR鉴定；

LaneM.λDNA/EcoR I+Hind III marker；Lane1.NotI/KpnI双酶切产物；Lane2.PCR扩增产物；

图2转化子基因组DNA的PCR鉴定；

Lane 1.阴性对照；Lane2.X-33PCR扩增产物；Lane3.X-33/pPICZαA PCR扩增产物；Lane4.X-33/pPICZαA-ChL 18-HN PCR扩增产物

图3重组酵母发酵上清中表达产物的SDS-PAGE分析；

Lane1.X-33/pPICZαA；Lane2-6.X-33/pPICZαA-ChIL18-HN在0、24、48、72、96h发酵液上清；Lane M.低分子量蛋白Marker

图4重组酵母发酵上清液中表达产物Western blot分析；

LaneM.预染低分子量蛋白Marker；Lane1-5X-33pPICZαA-IL18-HN在0、24、48、72、96h诱导上清；Lane6.X-33/pPICZαA

图5NDV-HN抗体和抗体亚型分析；

图6免疫重组蛋白后的淋巴细胞增值情况；

图7细胞因子检测结果。

具体实施方式：

实施例1chIL-18-HN融合蛋白编码基因序列的获得

1.禽IL-18基因序列的获得

根据GenBank中禽IL-18的核苷酸序列，利用DNA Star7.0、Primerpremier6.0软件设计一对特异性引物F₁、F₂扩增IL-18。引物由大连宝生物工程公司合成。引物F15’端引入NotI内切酶位点，F25’端BamHI内切酶位点并同时引入柔性接头。引物序列如下：

F1：SEQ ID NO.1；

P1：5′-GCGGCCGCGATGCCTTTTGTAAGGATA-3′

F2：SEQ ID NO.2；

P2：5′-GGTGGATCCGGCGGTTCTGGCGGATTATAGGTTGTGCCTTTCATTATG-3′

将NDV-I系疫苗做50倍稀释，通过尿囊腔接种于10日龄鸡胚，0.2mL/枚，37℃继续孵化。于接种后48-72h取出未死的鸡胚，取脾脏无菌研碎，并按试剂盒的要求立即进行总mRNA的提取和扩增。以鸡胚脾脏总mRNA为模板，RT-PCR扩增鸡IL-18基因。按一步法RT-PCR试剂盒的要求，在50μL反应体系中分别加入10×buffer 5μL，MgCl210μL，dNTP混合物5μL，RNA酶抑制剂1μL，反转录酶1μL，Taq酶1μL，上、下游引物F1和F2各2μL，模板5μL，无RNA酶水18μL。反应条件为：经50℃30min、94℃2min后，以94℃45sec、53℃90sec、72℃100sec的参数循环30次，最后72℃延伸10min。扩增的PCR产物经含有溴化乙锭(Ethidium Bromide，EB)1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切下目的条带，随后按胶回收试剂盒(大连TaKaRa公司)使用说明进行回收即为禽IL-18基因片段。

2.新城疫病毒HN基因的获得

根据GenBank中新城疫病毒HN基因的核苷酸序列(收录号：GU573799.1)，利用DNA Star7.0、Primer premier6.0软件设计一对特异性引物F₃、F₄扩增新城疫病毒HN基因，引物F35’端引入BamHI内切酶位点并同时引入柔性接头，F45’端引入KpnI内切酶位点。引物序列如下：

F3：SEQ.ID.NO.3；

P1：5′-GGTGGATCCATGGACCGCGCCGTTAGC-3′

F4：SEQ.ID.NO.4；

P2：5′-GGTACCACCGCCCTAGCCAGACCTGGCTTC-3′

将冻存的NDV毒株经37℃水浴融化后通过尿囊腔途径接种9～10日龄非免疫鸡胚(每个胚0.2mL)，37℃孵化。无菌收集24～48h死亡鸡胚的尿囊液(有红细胞或卵黄使尿囊液变浑浊的鸡胚液弃去)，经反复冻融3次后、8000r/min4℃离心15min，取上清液，20℃保存待用。病毒RNA的提取按照大连宝生物工程有限公司RNA提取试剂盒说明进行操作。以提取的总RNA 4μL为模板，加入MgCl₂3μL，10×反转录buffer 2.5μL，dNTP Mixture(10mmol/L)2.5μL，R N ase Inhititor 0.5μL(20U)，RT酶0.5μL，Taq酶0.5μL，引物F31μL，引物F41μL，灭菌dH₂O 9.5μL，总体系25μL。按以下反应条件进行RT-PCR反应：50℃40s，94℃2min后，以94℃45sec，53℃90sec，72℃100sec，循环32次，最后72℃延伸10min。PCR产物经含有溴化乙锭1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切下目的条带，随后按胶回收试剂盒使用说明进行回收即为新城疫病毒HN基因。

3.chIL-18-HN融合蛋白编码基因序列的获得

以上述获得的禽IL-18基因和新城疫病毒HN基因为模板，利用F1和F4引物，通过重叠延伸PCR方法扩增chIL-18-HN融合基因。

PCR反应体系50μl：10×PCR Buffer，5μL，MgCl₂，3μL；dNTP，10mmol/L，1μL；禽IL-18基因和新城疫病毒HN基因做为模板各加入5μL，引物F1和引物F4，终浓度为20pmol/L各2μL；TaKaRa ExTaq 0.5μL；灭菌超纯水，34.5μL；

PCR反应条件：94℃预变性2min，进入PCR循环：94℃30s，52℃1min，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min，PCR产物经含有溴化乙锭1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切下目的条带，随后按胶回收试剂盒使用说明进行回收即为chIL-18-HN融合基因(SEQ.ID.NO.5)。

实施例2chIL-18-HN融合基因重组酵母表达载体的构建

应用Not I、Kpn I内切酶对上述chIL-18-HN融合基因PCR产物和毕赤酵母表达载体pPICZαA进行双酶切，酶切产物同样经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，胶回收试剂盒进行回收鉴定。经过酶切的chIL-18-HN融合基因和毕赤酵母表达载体pPICZαA按1∶3的摩尔比4℃过夜连接。取连接产物加入含有100μL感受态DH5α的聚丙烯离心管中，轻轻混匀后冰浴30min。将聚丙烯离心管从冰中取出后42℃热休克90sec，然后立即冰浴2min。加入800μL 37℃预热的LB培养基，于37℃振摇(100～150rpm)45min。取100μL菌液均匀涂布含氨苄青霉素(Amp)50μg/mL的琼脂LB平板，在37℃正置20min后，倒置培养16-20h。按《分子克隆实验指南》上的碱裂解法提取质粒。对提取质粒进行Not I和KpnI双酶切鉴定。以酶切出现2000bp左右大小DNA片段的质粒为阳性质粒。并将阳性质粒命名为pPICZαA-chIL-18-HN，送上海Invitrongen公司测序。

实施例3表达chIL-18-HN融合蛋白的基因工程菌株的构建：

取实施例2得到的阳性重组酵母表达载体pPICZαA-chIL-18-HN进行SacI线性化，线性化的重组表达载体pPICZαA-chIL-18-HN 5μg与80μL感受态毕赤酵母菌X-33相混合，转移至预冷的0.2cm电转杯，置冰上5min，1.5kV、25μF、200Ω电击，立即加入1mL预冷的1mol/L山梨醇，取200μL涂布于YPDS平板上，30℃培养至单菌落出现；详细步骤参照PichiaExpression Kit；采用PCR方法分析毕赤酵母转化子，用煮--冻--煮法制备PCR模板，用引物F1和F4：反应体系同上，PCR反应条件：94℃5min；94℃45s，48℃45s，72℃45s，25个循环；72℃6min；鉴定扩增出大小约为2200bp的克隆定为毕赤酵母阳性转化子，即为表达chIL-18-HN融合蛋白的基因工程毕赤酵母X-33菌株。

实施例4重组chIL-18-HN融合蛋白的诱导表达及鉴定：

将筛选到阳性克隆X-33/chIL-18-HN接种到10mL BMGY中，30℃250r/min振荡培养约22h至OD₆₀₀达2-8；然后按10％的比例加到BMGY液体培养基中，于30℃，250r/min继续培养至OD₆₀₀达2-8，室温下静置4h，收集菌体，用等体积pH6.0BMMY培养基重悬菌体，于30℃，250r/min的摇床上加入1.5％甲醇进行诱导表达，共培养120h，期间每24h补加终浓度为1.5％的甲醇。120h后，5000r/min离心10min收集培养液上清，即为获得的chIL-18-HN融合蛋白。

将收集的培养液上清100μL，加等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液(100mmol/L Tris-Cl(pH6.8)；200mmol/L二硫苏糖醇(DTT)；4％SDS(电泳级)；0.2％溴酚蓝；20％甘油)，100℃煮沸5min使蛋白质变形，取10μL加样进行SDS-PAGE凝胶电泳，SDS-PAGE电泳凝胶的配制及电泳条件参照分子克隆手册。将电泳胶制备好后，向电泳槽内倒入Tris-甘氨酸电泳缓冲液(25mmol/L Tris；250mmol/L甘氨酸(电泳级)(pH8.3)；0.1％SDS)，加样结束后接通电源。电源负极端接上槽，正极端接下槽。在浓缩胶中电压为80V，进入分离胶中电压调整为120V。直到样品到达分离胶底部后关闭电源，取出凝胶，用考马斯亮蓝染色1h，随后在脱色摇床上脱色1-2h，观察结果。重组的chIL-18-HN融合蛋白分子量约100KDa。

同时用NDV阳性血清作为一抗进行Western-blot试验，重组毕赤酵母菌X-33菌的培养液上清上样的泳道有一条特异性目的条带，而阴性对照毕赤酵母菌X-33菌的培养液上清的上样泳道没有出现条带。表明，重组chIL-18-HN融合蛋白得到了成功表达，并且具有很好的免疫原性。

实施例5

重组chIL-18-HN融合蛋白的应用：

1)动物免疫

用上述重组chIL-18-HN融合蛋白免疫鸡，评价其免疫特性。将14日龄健康雏鸡250只随机分成5组，50只/组。第一组为阴性对照，免疫200μL PBS；第二组、第三组、第四组分别免疫200ppm的IL-18酵母表达产物(rIL-18)，HN酵母表达产物(rHN)，chIL-18-HN重组蛋白(用200μL PBS稀释)。采用胸部肌肉注射方式进行免疫。第五组为鸡新城疫IV系疫苗对照，采用滴鼻、点眼的途径免疫200μL；所有实验组均间隔二周免疫一次，共免疫三次。并分别于首次免疫接种后第7d、21d、35d时各随机抽取8只心脏采血，分离血清。同时，无菌采取各试验鸡的胸腺以供进行淋巴细胞增殖试验用。于最后一次免疫后2周时，取各组试验鸡18只应用F₄₈E₉标准强毒进行攻击(1000ELD₅₀/只)，攻毒后连续观察7天，记录各组试验鸡的发病、死亡情况。

2)新城疫病毒HN抗体和抗体亚型检测

分别于首免后7、21、35d时分离血清，通过ELISA检测每组实验鸡免疫后NDV-HN IgG抗体的产生，发现各抗原免疫组在首免1周后就能检测到IgG抗体反应，在第二次加强免疫后抗体产生不断增加。相对于IgG水平，chIL-18-HN融合蛋白免疫组与ND疫苗免疫组鸡在免疫后均有显著增加，与rHN免疫组相比差异均极显著(p＜0.01)，但二者之间在各时期差异不明显(p＞0.05)。相对于IgG1水平和IgG2a抗体反应，IgG1抗体是rHN免疫组鸡的主要的抗体亚型，而IgG2a抗体是新城疫IV系疫苗免疫组鸡的主要抗体亚型，然而，使用chIL-18-HN融合蛋白免疫组鸡能产生一个平衡的IgG1和IgG2a抗体反应。特别是在第二次加强免疫后，观察到占优势的IgG1和IgG2a抗体的水平，表明IL-18能有助于调节Th1类型免疫反应(图5)。3)四甲基偶氮唑蓝法(MTT)分析

从第一次免疫后第7、21、35d时无菌采取各试验鸡的胸腺，检测胸腺T淋巴细胞的增殖情况。结果显示在免疫后各检测时期chIL-18-HN融合蛋白免疫组诱导胸腺T淋巴细胞增殖能力均最强，与其它各组之间在各时期均差异显著或极显著(p＜0.05或p＜0.01)(图6)。

4)血清中IL-4和IFN-γ的测定

应用定量ELISA对血清中的IL-4和IFN-γ进行定量分析发现，chIL-18-HN融合蛋白免疫组诱导IL-4和IFN-γ的分泌在各免疫组最强，差异极显著(p＜0.01)。其次是rIL-18免疫组，IV系疫苗免疫组和rHN免疫组主要诱导IL-4的分泌，其诱导两种细胞因子的分泌水平低于rIL-18免疫组，尤其是诱导IFN-γ的水平明显低于rIL-18免疫组(p＜0.05)(图7)。

5)攻毒试验结果

在最后一次免疫接种后2周时，对各免疫组剩余鸡取18只应用F48E9强毒攻击。结果如表7-2所示，rHN免疫组18只试验鸡在7天观察期内有8只发病，保护率仅为55.8％，其中3只死亡；而IV系疫苗免疫组发病1只，保护率为94.4％。chIL-18-HN融合蛋白免疫组18只试验鸡在7天观察期内仅有2只发病，保护率达88.9％，稍低于活疫苗组(表1)。

表1功毒后各组的保护率

最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明，而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明。本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110>河南科技大学

<120>一种鸡IL-18与新城疫病毒HN基因重组融合蛋白及应用

<170>patentin version 3.3

<210>1

<212>DNA

<213>人工合成

<223>引物F1

<400>1

GCGGCCGCGATGCCTTTTGTAAGGATA

<210>2

<212>DNA

<213>人工合成

<223>引物F2

<400>2

GGTGGATCCGGCGGTTCTGGCGGATTATAGGTTGTGCCTTTCATTATG

<210>3

<212>DNA

<213>人工合成

<223>引物F3

<400>3

GGTGGATCCATGGACCGCGCCGTTAGC

<210>4

<212>DNA

<213>人工合成

<223>引物F4

<400>4

GGTACCACCGCCCTAGCCAGACCTGGCTTC

<210>5

<212>DNA

<221>chIL-18-HN融合蛋白的基因

<400>5

GCCTTTTGTAAGGATAAAACTATCAAAAGATTCTTTAGAAACGTCAATAGCCAGTTGCTT  60

GTGGTTCGTCCAGATTTAAACGTGGCAGCTTTTGAAGATGTAACAGATCAGGAGGTGAAA 120

TCTGGCAGTGGAATGTACTTCGACATTCACTGTTACAAAACCACCGCTCCTTCAGCAGGT 180

ATGCCTGTTGCATTCAGCGTCCAGGTAGAAGATAAGAGTTACTACATGTGTTGTGAGAAA 240

GAGCATGGGAAAATGGTTGTTCGATTTAGGGAAGGAGAAGTTCCCAAAGACATTCCTGGT 300

GAAAGTAACATCATATTTTTCAAAAAGACATTTACATCTTGCAGCTCCAAGGCTTTTAAG 360

TTCGAGTACTCACTTGAACAAGGAATGTTCTTGGCCTTTGAGGAAGAAGACTCCTTAAGA 420

AAACTAATTTTAAAGAAACTGCCGAGAGAAGATGAAGTTGATGAAACCACAAAATTCGTA  480

ACAAGTCATAATGAAAGGCACAACCTATAAGGTGGATCCGGCGGTTCTGGCGGAATGGAC  540

CGCGCCGTTAGCCAAGTTGCGTTAGAGAATGATGAAAGAGAGGCAAAAAATACATGGCGC  600

TTGATATTCCGGATTGCAATCTTATTCTTAACAGTAGTGACCTTGGCTATATCTGTGGCC  660

TCCCTTTTATATAGCATGGGGGCTAGCACACCTAGCGATCTTGTAGGCATACCGACTAGG  720

ATTTCCAGGGCAGAAGAAAAGATTACATCTACACTTGGTTCCAATCAAGATGTAGTAGAT  780

AGGATATATAAGCAAGTGGCCCTTGAGTCTCCGTTGGCATTGTTAAAAACTGAGACCACA  840

ATTATGAACGCAATAACATCTCTCTCTTATCAGATTAATGGAGCTGCAAACAACAGTGGG  900

TGGGGGGCACCTATCCATGACCCAGATTATATAGGGGGGATAGGCAAAGAACTCATTGTA  960

GATGATGCTAGTGATGTCACATCATTCTATCCCTCTGCATTTCAAGGACATCTGAATTTT 1020

ATCCCGGCGCCTACTACAGGATCAGGTTGCACTCGAATACCCTCATTTGACATGAGTGCT 1080

ACCCATTACTGCTACACCCATAATGTAATATTGTCTGGATGCAGAGATCACTCACATTCA 1140

TATCAGTATTTAGCACTTGGTGTGCTCCGGACATCTGCAACAGGGAGGGTATTCTTTTCT 1200

ACTCTGCGTTCCATCAACCTGGACGACACCCAAAATCGGAAGTCTTGCAGTGTGAGTGCA 1260

ACTCCCCTGGGTTGTGATATGCTGTGCTCGAAAGTCACGGAGACAGAGGAAGAAGATTAT 1320

AACTCAGCTGTCCCTACGCGGATGGTACATGGGAGGTTAGGGTTCGACGGCCAGTACCAC 1380

GAAAAGGACCTAGATGTCACAACATTATTCGGGGACTGGGTGGCCAACTACCCAGGAGTA 1440

GGGGGTGGATCTTTTATTGACAGCCGCGTATGGTTCTCAGTCTACGGAGGGTTAAAACCC 1500

AATTCACCCAGTGACACTGTACAGGAAGGGAAATATGTGATATACAAGCGATACAATGAC 1560

ACATGCCCAGATGAGCAAGACTACCAGATTCGAATGGCCAAGTCTTCGTATAAGCCTGGA 1620

CGGTTTGGTGGGAAACGCATACAGCAGGCTATCTTATCTATCAAGGTGTCAACATCCTTA 1680

GGCGAAGACCCAGTACTGACTGTACCGCCCAACACAGTCACACTCATGGGGGCCGAAGGC 1740

AGAATTCTCACAGTAGGGACATCTCATTTCTTGTATCAACGAGGGTCATCATACTTCTCT 1800

CCCGCGTTATTATATCCTATGACAGTCAGCAACAAAACAGCCACTCTTCATAGTCCTTAT 1860

ACATTCAATGCCTTCACTCGGCCAGGTAGTATCCCTTGCCAGGCTTCAGCAAGATGCCCC 1920

AACCCGTGTGTTACTGGAGTCTATACAGATCCATATCCCCTAATCTTCTATAGAAACCAC 1980

ACCTTGCGAGGGGTATTCGGGACAATGCTTGATGGTGTACAAGCAAGACTTAACCCTGCG 2040

TCTGCAGTATTCGATAGCACATCCCGCAGTCGCATTACTCGAGTGAGTTCAAGCAGTACC 2100

AAAGCAGCATACACAACATCAACTTGTTTTAAAGTGGTCAAGACTAATAAGACCTATTGT 2160

CTCAGCATTGCTGAAATATCTAATACTCTCTTCGGAGAATTCAGAATCGTCCCGTTACTA 2220

GTTGAGATCCTCAAAGATGACGGGGTTAGAGAAGCCAGGTCTGGCTAG             2268

<210>6

<212>PRT

<221>柔性Linker肽

<400>6

GGSGGSGG

<210>7

<212>PRT

<221>chIL-18-HN融合蛋白

<400>7

AFCKDKTIKRFFRNVNSQLLVVRPDLNVAAFEDVTDQEVKSGSGMYFDIHCYKTTAPSAGMPVAFSVQVE  70

DKSYYMCCEKEHGKMVVRFREGEVPKDIPGESNIIFFKKTFTSCSSKAFKFEYSLEQGMFLAFEEEDSLR  140

KLILKKLPREDEVDETTKFVTSHNERHNLGGSGGSGGMDRAVSQVALENDEREAKNTWRLIFRIAILFLT 210

VVTLAISVASLLYSMGASTPSDLVGIPTRISRAEEKITSTLGSNQDVVDRIYKQVALESPLALLKTETTI 280

MNAITSLSYQINGAANNSGWGAPIHDPDYIGGIGKELIVDDASDVTSFYPSAFQGHLNFIPAPTTGSGCT 350

RIPSFDMSATHYCYTHNVILSGCRDHSHSYQYLALGVLRTSATGRVFFSTLRSINLDDTQNRKSCSVSAT 420

PLGCDMLCSKVTETEEEDYNSAVPTRMVHGRLGFDGQYHEKDLDVTTLFGDWVANYPGVGGGSFIDSRVW 490

FSVYGGLKPNSPSDTVQEGKYVIYKRYNDTCPDEQDYQIRMAKSSYKPGRFGGKRIQQAILSIKVSTSLG 560

EDPVLTVPPNTVTLMGAEGRILTVGTSHFLYQRGSSYFSPALLYPMTVSNKTATLHSPYTFNAFTRPGSI 630

PCQASARCPNPCVTGVYTDPYPLIFYRNHTLRGVFGTMLDGVQARLNPASAVFDSTSRSRITRVSSSSTK 700

AAYTTSTCFKVVKTNKTYCLSIAEISNTLFGEFRIVPLLVEILKDDGVREARSG754

Claims (10)

1.一种chIL-18-HN融合蛋白，其特征在于：主要由鸡白细胞介素18(chIL-18)的氨基酸序列，新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶(HN蛋白)的氨基酸序列，以及位于chIL-18氨基酸序列和新城疫病毒HN蛋白的氨基酸序列之间的柔性Linker肽氨基酸序列组成；由鸡白细胞介素18(chIL-18)基因和鸡新城疫病毒HN基因通过柔性Linker肽串联连接而成。

2.根据权利要求1所述的chIL-18-HN融合蛋白，其特征在于：该蛋白具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的chIL-18-HN融合蛋白，其特征在于：所述的柔性Linker肽具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。

4.一种分离的DNA序列，其特征在于：编码具有序列为SEQ ID NO.7的氨基酸序列的融合蛋白。

5.根据权利要求4所述的DNA序列，其特征在于：具有SEQ ID NO.5的核苷酸序列。

6.一种重组毕赤酵母载体，其特征在于：它含有SEQ ID NO.5的DNA序列。

7.一种重组毕赤酵母菌，其特征在于：它含有SEQ ID NO.5的DNA序列。

8.一种重组融合蛋白的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)获得编码chIL-18-HN融合蛋白的基因序列；

(2)将步骤(1)获得的chIL-18-HN融合蛋白的基因序列，插入到毕赤酵母载体pPICZαA中，得到重组表达的毕赤酵母载体，命名为pPICZαA-chIL-18-HN；

(3)将步骤(2)获得的重组表达的毕赤酵母载体pPICZαA-chIL-18-HN，电击转化入毕赤酵母菌X-33感受态细胞中，高抗性筛选和PCR鉴定，获得表达重组融合蛋白的基因毕赤酵母X-33菌株；

(4)将步骤(3)获得的表达重组融合蛋白的基因工程酵母X-33菌株，培养，分离培养液上清，获得重组融合蛋白。

9.根据权利要求8所述的重组融合蛋白的制备方法，其特征在于：步骤(4)中的培养条件为：在pH6.0的BMMY培养液中30℃、250r/min下振荡培养，甲醇诱导浓度1.5％、诱导时间120h，期间每24h补加终浓度为1.5％的甲醇。

10.一种如权利要求8所获得的重组融合蛋白在制备鸡新城疫预防和治疗药物中的应用。

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