CN114605521A - 一种细胞免疫调节蛋白及其应用 - Google Patents

一种细胞免疫调节蛋白及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域,尤其是涉及一种细胞免疫调节蛋白及其应用,所述细胞免疫调节蛋白为pIL‑18BP‑X2,且所述pIL‑18BP‑X2的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。本发明从猪肺泡巨噬细胞(PAM)获得的细胞免疫调节蛋白pIL‑18BP‑X2在大肠杆菌表达系统中可实现高效表达,并且经NI柱纯化后可得到单一性蛋白;其是具有降低猪干扰素伽马(pIFN‑γ)分泌的小分子蛋白质,可显著抑制pIFN‑γ的mRNA表达量,调节pIFN‑γ的活性的效果,具有治疗应用潜力。因此,本发明的pIL‑18BP‑X2蛋白,丰富了细胞免疫调节剂,为临床上调节细胞免疫提供了很好的帮助。

Description

一种细胞免疫调节蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域,尤其是涉及一种细胞免疫调节蛋白及其应用。
背景技术
细胞免疫是把双刃剑,免疫太弱会使机体更容易感染病原微生物,而免疫太强会导致免疫细胞疯狂地攻击发炎部位周边的细胞、组织、器官,引起免疫过激反应,造成对自身的损害,从而引发“细胞因子风暴”。
研究发现,IL-18mRNA在多种细胞(单核细胞、血管平滑肌细胞及内皮细胞等)中表达,并在含有这些细胞的器官及组织(肝、肾、骨骼肌等)中可检测到IL-18mRNA的表达。IL-18具有多种有效的生物学功能,可通过诱导T细胞及自然杀伤细胞产生IFN-γ的作用,在抗感染、免疫调节、抗肿瘤及慢性炎性疾病的发生发展中扮演着重要角色。
目前,在发生结肠炎的患者中,干扰素-γ可以促进炎症并加剧肠道内的炎症反应,从而加重沙门氏菌引起的结肠炎,细胞免疫可以加重疾病的严重程度,此时应用本发明提供的蛋白可降低干扰素-γ的分泌,降低炎症反应。研究表明,IL-18与重组IL-18bp结合可通过干预关键炎症相关通路和杀伤细胞凋亡保护小鼠肝脏免受炎症损伤。
根据人类疾病发展与IL-18BP的关系研究,具有调节免疫作用的IL-18BP在猪的疾病康复过程中也具有良好应用前景,目前国内外对猪IL-18BP的研究尚处于空白。
本发明提供的细胞免疫调节蛋白(pIL-18BP-X2)是通过基因工程方法从猪肺泡巨噬细胞(PAM)获得,其具有降低猪干扰素伽马(pIFN-γ)分泌的作用。该蛋白能高亲和力与IL-18结合并抑制IL-18相关的生物学活性,从而降低其所参与的炎性反应,丰富了细胞免疫调节剂。并且,本发明提供的细胞免疫调节蛋白可在大肠杆菌大量表达制备便于纯化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型的细胞免疫调节蛋白,丰富了细胞免疫调节剂,为临床上调节细胞免疫提供了帮助。
根据本发明实施例的第一方面,提供一种细胞免疫调节蛋白,所述细胞免疫调节蛋白为pIL-18BP-X2,且所述pIL-18BP-X2的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
本发明的细胞免疫调节蛋白pIL-18BP-X2,全长190个氨基酸,理论分子量为21kDa,经证实,本发明的细胞免疫调节蛋白与已证明的细胞免疫调节蛋白同源性低,其为一种新型的可开发利用的免疫调节蛋白,丰富了细胞免疫调节剂。
根据本发明实施例的第二方面,提供一种细胞免疫调节剂,包括上述的细胞免疫调节蛋白,也理应属于本发明的保护范围。
根据本发明实施例的第三方面,提供一种上述细胞免疫调节蛋白的应用,所述细胞免疫调节蛋白在制备细胞免疫调节剂中的应用,也理应属于本发明的保护范围。
根据本发明实施例的第四方面,提供一种表达细胞免疫调节蛋白的基因,所述基因的碱基序列如SEQ IDNO.2所示。
本发明使用PCR方法克隆了表达细胞免疫调节蛋白的基因,该基因全长570bp,其DNA序列如SEQ IDNO.2所示。
根据本发明实施例的第五方面,提供一种制备上述基因的引物组合物,所述引物组合物包括pIL-18BP-X2-F(EcoRI)和pIL-18BP-X2-R(XhoI);
优选地,所述pIL-18BP-X2-F(EcoRI)的序列如SEQ IDNO.3所示,所述pIL-18BP-X2-R(XhoI)的序列如SEQ IDNO.4所示。
根据本发明实施例的第六方面,提供一种重组表达载体,其包括上述的基因。
根据本发明实施例的第七方面,提供一种上述重组表达载体的制备方法,将所述基因插入到表达载体的限制性酶切位点之间,所述表达载体为pET-28a。
本发明还提供了一种包括上述细胞免疫调节蛋白pIL-18BP-X2基因的重组表达载体的制备方法,具体为将本发明的细胞免疫调节蛋白pIL-18BP-X2基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间,使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接,并且本发明的表达载体优选为pET-28a。
作为本技术方案优选地,所述限制性酶切位点为pET-28a上的EcoRI和XhoI,所得到的重组表达载体的重组大肠杆菌表达载体pET-28a-X2。
根据本发明实施例的第八方面,提供一种重组工程菌株,将上述的重组表达载体转化宿主细胞,得到重组工程菌株。
在本发明中宿主细胞优选为大肠杆菌BL21,得到的重组工程菌株为BL21(pET-28a-X2)。
根据本发明实施例的第九方面,提供一种上述细胞免疫调节蛋白的制备方法,使用权利要求9所述的重组工程菌株制备,具体包括:
1)将含pIL-18BP-X2基因的重组表达载体转化宿主细胞,得重组工程菌株;
2)培养重组工程菌株,诱导重组细胞免疫调节蛋白pIL-18BP-X2的表达;
3)回收并纯化所表达的细胞免疫调节蛋白pIL-18BP-X2。
本发明的细胞免疫调节蛋白,与现有技术相比,具有以下优点:
1、本发明从猪肺泡巨噬细胞(PAM)获得的细胞免疫调节蛋白pIL-18BP-X2在大肠杆菌表达系统中可实现高效表达,并且经NI柱纯化后可得到单一性蛋白;
2、本发明的细胞免疫调节蛋白具有降低猪干扰素伽马(pIFN-γ)分泌的小分子蛋白质,可显著抑制pIFN-γ的mRNA表达量,因此,其具有调节pIFN-γ的活性的效果,具有治疗应用潜力;
3、本发明首次运用基因工程方法从PAM细胞中获得了pIL-18BP-X2可开发利用的蛋白,丰富了细胞免疫调节剂,为临床上调节细胞免疫提供了很好的帮助。
4、利用本发明的技术方案即可实现利用基因工程手段生产细胞免疫调节蛋白pIL-18BP-X2。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明pIL-18BP-X2蛋白纯化后SDS-PAGE分析;
图2为本发明pIL-18BP-X2蛋白在PBMC上对pIFN-γmRNA转录量的影响(3h);
图3为本发明pIL-18BP-X2蛋白在PBMC上对pIFN-γmRNA转录量的影响(6h)。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
试验材料
1、细胞株:猪PAM细胞和PBMC细胞取自6周无特定病源的小猪。
2、试剂耗材
蛋白纯化NI柱购自上海生工生物公司
BL21感受态细胞购自北京全式金有限公司
引物合成及测序均由上海生工生物公司
BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Therom公司
酶类:内切酶EcoRI、XhoI和T4连接酶购自NEB公司
TB
Figure BDA0003583489320000061
Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus)购自TaKaRa公司
仪器:离心机、振荡摇床、显微镜、酶标仪、荧光定量PCR仪
生化试剂:氨苄青霉素、卡那霉素、硫酸链霉素、胎牛血清(FBS),二甲基亚砜(DMSO)为Sigma产品。
3、培养基
高糖DMEM培养液,加入10%FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素,0.22μm滤膜过滤灭菌后4℃保存。
以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法,均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行,或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1
免疫调节蛋白pIL-18BP-X2编码基因筛选、克隆和表达载体构建
S1、以人的IL-18BP基因作为模板设计引物并进行猪的IL-18BP基因的扩增;
S2、设计并合成引物组合物pIL-18BP-X2-F(EcoRI)和pIL-18BP-X2-R(XhoI),其中,pIL-18BP-X2-F(EcoRI)的序列为5'-ATGACCAGGAGGCAGAACTGGA-3',pIL-18BP-X2-R(XhoI)的序列为5'-TTATGCGCGCCCGGCGTGGGCC-3';
S3、使用EcoRI和XhoI酶切PCR扩增产物,获得目标基因pIL-18BP-X2,将目标基因连接到经相同酶切的表达载体pET-28a,获得含有细胞免疫调节蛋白pIL-18BP-X2基因的重组表达载体pET-28a-X2,转化大肠杆菌BL21,获得重组工程菌株BL21(pET-28a-X2)。
实施例2
细胞免疫调节蛋白pIL-18BP-X2表达纯化
S1、取阳性转化子BL21(pET-28a-X2)菌株,接种于20mL含有50μg/mL卡那霉素的LB培养液中,37℃200rpm过夜活化;
S2、次日,以2%的接菌量,接种于200mL含有50μg/mL卡那霉素的LB培养液中,37℃200rpm培养至OD600为0.8-1.0,加终浓度为1mM的IPTG,37℃200rpm过夜诱导16h后,离心收集菌体。
S3、使用0.2体积的PBS溶解菌体,超声波破碎,离心收集上清液。
S4、将上清液使用NI柱纯化后,用BCA试剂盒测其蛋白浓度。
结果表明:经检测上述表达系统表达pIL-18BP-X2蛋白的理论分子量为26kDa(包括部分载体序列和限制酶切位点翻译氨基酸);并且,pIL-18BP-X2在大肠杆菌中高效表达,表达量为50mg/L;而且,由图1可以看出,经柱纯化后,蛋白质的纯度较为单一。
因此,本发明的pIL-18BP-X2在该大肠杆菌表达系统中可实现高效表达,即可快速提供相当数量的蛋白质纯品,以满足临床调节细胞免疫的需求。
实施例3
pIL-18BP-X2蛋白在PBMC细胞中对pIFN-γ的mRNA的影响
S1、使用RPMI 1640(含有5μg/mL ConA,含有10%FBS)将其稀释为2×106个/mL,加入96孔板中每孔100μL(2×105个/wall),放入培养箱培养2h;
S2、将500ng/mL的重组pIL-18和pIL-12(100ng/mL)与不同浓度的纯化pIL-18BP-X2(1000、750、500、250ng/mL)置于室温共同孵育2h,同时设立pIL-18+pIL-12、pIL-12和空白对照后,置于37℃培养3h和6h,收取细胞进行提取mRNA,反转录成cDNA,使用qPCR检测IFN-γmRNA的水平。
如图2-3所示,pIL-18BP-X2对pIFN-γ的mRNA水平具有明显的抑制作用,在3h和6h,pIL-18BP-X2浓度在500ng/ml、750ng/ml和1000ng/ml时,随着pIL-18BP-X2浓度的增加pIFN-γ的mRNA转录量逐渐减少。
因此,本发明的pIL-18BP-X2对pIFN-γ的mRNA转录量具有明显的抑制作用。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 内蒙古农业大学 金河佑本生物制品有限公司
<120> 一种细胞免疫调节蛋白及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 190
<212> Protein1
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
mtrrqnwtpa prplwallfc ahlvsqvarg tpapqatvva sasagmakdp cslqppallr 60
akgcpglevt wpeeevplng tltlsctacs rfphfsilyw lgngsfierl pgrlregsir 120
rerrgagtql rralvleqls pglrhanfsc vfsdpgqtaq rhlvlaqlwq etrrnrtqqr 180
reaaallprp 190
<210> 2
<211> 570
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgaccagga ggcagaactg gactccagcc cccaggcccc tgtgggccct gctcttctgt 60
gcccacctcg tctcccaggt ggccagaggc acccctgcgc cccaggccac cgtggtcgcc 120
agcgcctcag ccgggatggc caaggacccc tgctctctcc agccccccgc gctcctgcga 180
gctaaggggt gcccaggact ggaggtgacc tggccagaag aggaagtccc actgaatgga 240
acgctgaccc tgtcctgcac cgcctgcagc cgcttccccc acttcagcat cctctactgg 300
ctgggcaacg gctccttcat cgagcgcctc ccggggcgcc tgcgcgaggg cagcatcagg 360
cgggaacgcc ggggcgcagg gacccagctg cggcgggccc tggtgctgga gcagctgagc 420
cccggcctgc gccacgccaa cttctcctgt gttttctccg atcctgggca gacggcccag 480
cgtcacctgg ttctggccca gctctggcag gaaacgagaa ggaacaggac tcagcagcgc 540
agggaggcgg cggccctcct gcctcggccc 570
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgaccagga ggcagaactg ga 22
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttatgcgcgc ccggcgtggg cc 22

Claims (10)

1.一种细胞免疫调节蛋白,其特征在于,所述细胞免疫调节蛋白为pIL-18BP-X2,且所述pIL-18BP-X2的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种细胞免疫调节剂,其特征在于,包括权利要求1所述的细胞免疫调节蛋白。
3.一种权利要求1所述细胞免疫调节蛋白的应用,其特征在于,所述细胞免疫调节蛋白在制备细胞免疫调节剂中的应用。
4.一种表达权利要求1所述细胞免疫调节蛋白的基因,其特征在于,所述基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。
5.一种制备权利要求4所述基因的引物组合物,其特征在于,所述引物组合物包括pIL-18BP-X2-F(EcoRI)和pIL-18BP-X2-R(XhoI);
优选地,所述pIL-18BP-X2-F(EcoRI)的序列如SEQ ID NO.3所示,所述pIL-18BP-X2-R(XhoI)的序列如SEQ ID NO.4所示。
6.一种重组表达载体,其特征在于,包括权利要求4所述的基因。
7.一种权利要求6所述重组表达载体的制备方法,其特征在于,将所述基因插入到表达载体的限制性酶切位点之间,所述表达载体为pET-28a。
8.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述限制性酶切位点为pET-28a上的EcoRI和XhoI。
9.一种重组工程菌株,其特征在于,将权利要求6所述的重组表达载体转化宿主细胞,得到重组工程菌株。
10.一种权利要求1所述细胞免疫调节蛋白的制备方法,其特征在于,使用权利要求9所述的重组工程菌株制备。
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