CN110643626A - 一种提高万古霉素产生菌生产万古霉素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高万古霉素产生菌生产万古霉素的方法，包括如下步骤：步骤一、克隆生物合成调节基因AORI_1475至载体，并转入感受态细胞培养富集；步骤二、构建包含AORI_1475基因序列的质粒，并转入大肠杆菌JM110去甲基化并过表达；步骤三、提取步骤二中所述过表达的质粒，转入万古霉素生产菌株，获得AORI_1475基因过表达的重组菌株。本发明还公开了一种生物合成调节基因AORI_1475用于生产万古霉素的应用、一种重组载体、以及一种AORI_1475基因过表达的重组菌株用于生产万古霉素的应用。采用本发明的方法，可以提高万古霉素的产量，具有良好的工业应用价值。

Description

一种提高万古霉素产生菌生产万古霉素的方法
技术领域
本发明属于微生物基因工程技术领域，具体地说，是关于一种提高万古霉素产生菌生产万古霉素的方法。更具体而言，涉及一种生物合成调节基因AORI_1475在万古霉素产生菌中过表达提高万古霉素产量的方法。
背景技术
万古霉素在临床上常被作为治疗甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)引起感染的一线药物，通常在大多数抗菌药物治疗失败后使用，也被称作“最后一道防线”。MRSA引起皮肤脓肿和软组织感染、骨关节感染、中枢神经系统感染等，随着它对β-内酰胺类抗生素产生耐药性，万古霉素的优势也逐渐显现。万古霉素的抗菌作用主要是与细菌肽聚糖链N-酰基-D-Ala4-D-Ala5中的末端D,D-二肽形成氢键，从而干扰细胞壁的合成。
研究微生物次级代谢产物生物合成的调控可全面了解菌株的生理、代谢网络和调控机制，为菌株更好的发挥作用提供理论依据。strR是途径特异性转录调控基因。 1985年文献首次报导了链霉菌属strR编码的蛋白对strA和strB基因的完全表达具有正影响作用，并推测strR区可能含有参与调控链霉素合成的调节装置。2007年报道了bbr(一种strR型转录调控基因)在拟无枝酸菌Amycolatopsis balhimycina 中的转录调控，bbr编码的转录调控子与balhimycina合成基因簇中的五个启动子区域的DNA结合，对balhimycina的合成起正调控作用。Marius Spohn等将bbr引入不产抗生素的Amycolatopsis japonicum菌株，激活了氨基糖苷类抗生素ristomycin 的代谢途径。
2014年徐莉等人对东方拟无枝酸菌A.orientalis HCCB10007进行了全基因组测序，并完成基因组序列的拼接[Xu L,Huang H,Wei W等人]。东方拟无枝酸菌 HCCB10007的染色体为环形染色体，GenBank序列号为CP003410，基因组由一个环形的染色体和一个环形的内源质粒组成。HCCB10007的染色体基因具有核心区和非核心区，核心区范围是AORI_0001至AORI_2890和AORI_5565至AORI_8121。万古霉素合成基因簇(vcm)属于NRPS次级代谢生物合成基因簇，位于基因组的核心区(AORI_1471 至AORI_1505)。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种提高万古霉素产生菌生产万古霉素的方法，利用在万古霉素产生菌中过表达生物合成调节基因AORI_1475提高万古霉素的产量。本发明的第二个目的是提供一种生物合成调节基因AORI_1475用于生产万古霉素的应用。本发明的第三个目的是提供一种包含所述的生物合成调节基因AORI_1475的重组载体。本发明的第四个目的在于提供一种AORI_1475基因过表达的重组菌株用于生产万古霉素的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
作为本发明的第一个方面，一种提高万古霉素产生菌生产万古霉素的方法，包括如下步骤：
步骤一、克隆生物合成调节基因AORI_1475至载体，并转入感受态细胞培养富集；
步骤二、构建包含AORI_1475基因序列的质粒，并转入大肠杆菌JM110去甲基化并过表达；
步骤三、提取步骤二中所述过表达的质粒，转入万古霉素生产菌株，获得 AORI_1475基因过表达的重组菌株。
根据本发明，所述步骤一的生物合成调节基因AORI_1475以东方拟无枝酸菌HCCB10007基因组为模板，分别用如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物通过PCR 调取AORI_1475片段的方式获得。
根据本发明，所述PCR扩增的条件如下：
PCR反应体系为：5μL 10×reaction buffer，1μL 1475-F，1μL 1475-R， 1μLHCCB10007基因组模板，4μL dNTP(2mM)，1μL Taq DNA polymerase，4μL DMSO，33μL ddH2O；
PCR扩增程序为：热启动94℃8min；变性94℃30s；退火67℃30s；延伸72℃ 1min，以上三步循环30次；最后延伸72℃10min。
根据本发明，生物合成调节基因AORI_1475上调vanH基因的表达。
进一步的，生物合成调节基因AORI_1475上调vanH基因的表达的步骤为：将所述生物合成调节基因AORI_1475可操作地连接载体并导入万古霉素生产菌株中，以实现所述表达提高。
作为本发明的第二个方面，一种生物合成调节基因AORI_1475用于生产万古霉素的应用。
作为本发明的第三个方面，一种重组载体，其包含上述所述的生物合成调节基因AORI_1475。
作为本发明的第四个方面，一种AORI_1475基因过表达的重组菌株用于生产万古霉素的应用。
本发明的有益效果是：本发明通过生物信息学分析及过表达实验，确认生物合成基因簇中AORI_1475基因编码蛋白为strR家族的一种调控蛋白，通过共转录单元的确认、相对表达量的影响以及蛋白与DNA的体外结合研究，确认该调控蛋白的结合位点，为万古霉素的生物合成、调控机制及其应用奠定基础。
附图说明
图1为调控基因AORI_1475在HCCB10007染色体上的位置。
图2为过表达菌株与野生型菌株万古霉素的HPLC结果，其中，A为HCCB10007， B为HHT1475。
图3为过表达菌株万古霉素的相对产量。
图4、图5、图6为共转录单元的确认。其中，图4、图5、图6中的A为Genome ofHCCB10007；B为cDNA of HCCB10007；C为cDNA of HHT1475。其中，图4-图6 中的M、1-28分别为：
M：DNA ladder；1：vanH-vanA；2：vanA-vanX；3：vanX-1474；4：1474-vtr； 5：vtr-pdh；6：pdh-abc；7：abc-vcmA；8：vcmA-vcmB；9：vcmB-vcmC；10：vcmC-mbtH； 11：mbtH-oxyA；12：oxyA-oxyB；13：oxyB-oxyC；14：oxyC-vhal；15：vhal-gtfD； 16：gtfD-gtfE；17：gtfE-vasC；18：vasC-1489；19：1489-vmt；20：vmt-hpgT； 21：hpgT-vhp；22：vhp-vcmD；23：vcmD-oxyD；24：oxyD-hmaS；25：hmaS-hmo；26： hmo-1497；27：1497-vasAEBD；28：vasAEBD-dpgABCD。
图7为转录水平分析。
图8为pCold-1475蛋白表达纯化(IPTG＝0.1mM)。其中，M、1-9分别为：
1：菌体破碎前沉淀；2：菌体破碎后沉淀；3：菌体破碎后上清；M：Marker；4：上清过Ni柱后留样；5：Wash buffer冲洗第一管；6：Wash buffer冲洗最后一管； 7-9：Elutionbuffer冲洗第一、二、三管。
图9为生物膜干涉技术拟合曲线。其中，A-G分别为：
A：片段EMSA-6C(2000nM)；B：片段EMSA-6C(1000nM)；C：片段EMSA-6C(500nM)； D：片段EMSA-6E(5000nM)；E：片段EMSA-6E(2000nM)；F：片段EMSA-6E(1000nM)； G：空白对照(buffer)。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
以下实施例所用的试剂及质粒来源：
1、质粒pLYW2为本实验室构建；
2、质粒pMD19-T simple、pCold为市售品；
3、质粒pLYW2-1475和pCold-1475为申请人自行构建；
4、E.coli DH5α和E.coli JM110为市售品；
5、万古霉素产生菌A.orientalis HCCB10007为本实验室保藏菌株。
本发明的提高万古霉素产生菌生产万古霉素的方法的步骤如下：
首先，利用引物PCR调取东方拟无枝酸菌A.orientalis HCCB10007基因组中的调控基因AORI_1475(如图1所示)。产物回收后，克隆到载体pMD19-Tsimple上，转入DH5α感受态中富集并测序。利用NdeⅠ和XbaI酶切测序正确的质粒和过表达载体质粒pLYW2，并用T4连接酶连接，构建过表达质粒pLYW2-1475。将过表达质粒转化进大肠杆菌JM110去甲基化，抽提过表达质粒。抽提酶切验证正确的JM110转化子中的过表达质粒，并电转入万古霉素生产菌株东方拟无枝酸菌HCCB10007。挑取转化子于TSB液体培养3天，菌液PCR验证，获得调控基因过表达菌株HHT1475。对调控基因过表达菌株和野生型菌株分别进行发酵，并对产物进行HPLC分析(如图2和图3所示)，基因AORI_1475的过表达菌株HHT1475能使万古霉素产量提升55％。结合基因对比分析，推测该基因为途径特异性调控基因，在万古霉素的生物合成途径中起正调控作用。
本发明的另一个目的在于提供生物合成调节基因AORI_1475的功能。本发明对万古霉素生物合成基因簇进行共转录分析，先分别提取HCCB10007菌株和HHT1475菌株的总RNA，再通过反转录反应获得HCCB1007和HHT1475的cDNA。分别设计万古霉素生物合成基因簇两个相邻基因间隔区的引物共28对，将HCCB10007的基因组及反转录后两者的cDNA作为模板用EasyTaq酶进行PCR反应，通过反应结果确定共转录单元(如图4所示)。
本发明对共转录单元的第一个基因和单独转录的基因进行荧光实时定量PCR反应，将HCCB10007菌株和HHT1475菌株的cDNA作为模板，以16s RNA作为内参基因，共设计6对引物。程序：95℃下3分钟，95℃下30秒，60℃下30秒，后两步循环 40次。用2-ΔΔCt去分析HCCB10007和HHT1475之间的转录水平(如图5所示)。AORI_1475 均能上调它们的表达量，其中共转录单元vanH至AORI_1474的上调作用最明显，其次是vhp至AORI_1497。
本发明对基因AORI_1475所在的万古霉素生物合成基因簇进行了共转录单元分析，根据RT-PCR反应后的琼脂糖凝胶电泳图可以发现，万古霉素生物合成基因簇中共有1个单独的转录基因和5个共转录单元，单独的转录基因为hpgT，从基因vanH 开始，途径基因vanA、vanX，以基因AORI_1474截止为一个共转录单元；从基因vtr 开始，途径基因pdh、abc、vcmA、vcmB、vcmC、mbtH，以基因oxyA截止为一个共转录单元；从基因oxyB开始，途径基因oxyC、vhal、gtfD、gtfE、vasC，以基因vmt 截止为一个共转录单元；从基因vhp开始，途径基因vcmD、oxyD、hmaS、hmo，以基因AORI_1497截止为一个共转录单元；以及从基因vasAEBD开始，以基因dpgABCD 截止为一个共转录单元。
确定转录单元后，选取单独转录的基因和每个共转录单元的第一个基因作为研究对象，进行实时定量PCR反应，分别是vanH、vtr、oxyB、hpgT、vhp、vasABCD。在确定使用模板浓度后对各个基因进行实时定量PCR实验，根据公式算得AORI_1475 对各基因的表达量均上调，其中对vanH的上调量最大，其次是vhp。对上调量最高的转录单元上游ATG前的启动子区域附近进行PCR，获得DNA。
然后，在大肠杆菌中异源表达并纯化AORI_1475蛋白。本发明为获得AORI_1475 的调控蛋白，进行了pCold质粒与基因AORI_1475的重组，并通过诱导对重组质粒进行蛋白表达。首先将AORI_1475基因从东方拟无枝酸菌中扩增获得，将其与pCold 质粒线性化片段相连，筛选后获得正确的重组质粒，将质粒转入蛋白表达感受态细胞 BL21中，对其诱导表达，将表达后的菌液进行超声破碎，分别对上清和沉淀进行 SDS-PAGE，观察蛋白条带，发现超声破碎前蛋白位于沉淀中，即在细菌细胞的胞内，为非分泌性蛋白，超声破碎后蛋白大量存在于上清中，为可溶性蛋白，使用Ni柱对蛋白进行纯化，获得纯化后的AORI_1475蛋白。
最后，将蛋白与DNA进行BLI实验，观察不同样品间的结合情况及解离常数，发现调控蛋白AORI_1475与基因簇2922-3021bp处结合最紧密，初步判断该处为 AORI_1475的调控位点，AORI_1475基因能够编码调控蛋白，调节蛋白与相关基因结合能够上调相关基因的表达，从而进一步调控代谢产物的产量。
实施例1构建重组pCold-1475质粒
步骤一、以东方拟无枝酸菌HCCB10007基因组为模板，分别用引物1475-F/1475R通过PCR调取其中的AORI_1475片段。
1475-F：CCCATATGCGGGTGGTCGATGGCCA(SED IQ NO:1)
1475-R：TTTCTAGATTACGCGATCGCTCCCGTGG(SED IQ NO:2)
PCR反应体系为：5μL 10×reaction buffer，1μL 1475-F，1μL 1475-R， 1μLHCCB10007基因组模板，4μL dNTP(2mM)，1μL Taq DNA polymerase，4μL DMSO，33μL ddH2O。
PCR扩增程序：热启动94℃8min；变性94℃30s；退火67℃30s；延伸72℃ 1min，以上三步循环30次；最后延伸72℃10min。
步骤二、扩增出的AORI_1475片段通过将加A连接到T载体质粒后，转化进DH5a 感受态细胞中，涂布LB固体培养基(加入氨苄青霉素筛选)，37℃培养14-16小时，再挑取单菌落，用LB液体培养基富集质粒(加入氨苄青霉素)；
步骤三、用试剂盒抽提质粒后用SmaI酶酶切验证，保存验证都正确的菌种。大量抽提质粒并用NdeI酶和XbaI酶大量酶切，根据试剂盒步骤操作，回收AORI_1475 片段；
步骤四、活化含表达载体p-Cold TF的菌株，用NdeI酶和XbaI酶大量酶切，并用试剂盒回收p-Cold质粒线性化片段，步骤与回收AORI_1475相同，将p-Cold质粒线性化片段与AORI_1475相连构成重组质粒。
实施例2HCCB10007的发酵培养及总RNA的提取
步骤一、将HCCB10007菌液均匀涂布于高氏1号固体培养基平板上，在28℃恒温培养箱中倒置培养70h，至长满白色孢子；
步骤二、用无菌平铲挖取1cm2左右的菌块转接入种子培养基S1中，于220rpm， 28℃摇床中震荡培养40-44h；
步骤三、吸取培养后的种子菌液(总体积的8％)转入25ml发酵培养基F1中，放入220rpm的28℃恒温摇床中震荡培养48h；
步骤四、将培养后的发酵培养基倒入提前灭菌的离心管中，在7500rpm，4℃离心机中离心10分钟，弃去上清，用无菌平铲刮取少量菌体(约0.1-0.15g)包于干净的锡箔纸内，放入液氮中冰冻30分钟，再放入-80℃冰箱中备用；
步骤五、将无水乙醇倒入干净研钵中，与镊子共同用明火燃烧，该操作在无RNA 污染的超净台中进行；
步骤六、菌体研磨完全后，加入细胞裂解液(600μl RL buffer中加入6μl巯基乙醇)，裂解液与菌体混合研碎，放至室温，久置后如液体体积不足600μl时补细胞裂解液600μl；将菌体与裂解液的混合物吸入干净的EP管中，13000rpm下离心 10分钟；
步骤七、将上清液吸取至黄色的CS过滤柱中(CS过滤柱放在收集管上)，13000rpm下离心8分钟，收集滤液；
步骤八、滤液中加入1倍体积的70％乙醇(无水乙醇420μl+去RNA酶的ddH2O 180μl)约600μl-1ml，混匀后将溶液和沉淀转移至白色的CR3吸附柱中(CR3吸附柱放在收集管上)，12000rpm下离心1分钟，倒去滤液，将吸附柱CR3放回收集管；
步骤九、向CR3吸附柱中加入350μl的去蛋白液RW1，在12000rpm下离心1分钟，倒去滤液，将CR3吸附柱放回收集管；
步骤十、配制DNase I工作液：取10μl的DNase I储存液放入新的干净RNase-free离心管中，加入70μl RDD溶液，轻轻混匀；向吸附柱CR3中央加入80μl 的DNase I工作液，室温下放置15分钟，可适当延长放置时间充分去除DNA；
步骤十一、向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，在12000rpm下离心1分钟，倒去滤液，将CR3吸附柱放回收集管；
步骤十二、向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW(使用前需检查漂洗液中是否已加入乙醇)，放置在室温下2分钟，12000rpm离心1分钟，倒去滤液，将CR3吸附柱放回收集管中。重复操作该步骤一次；
步骤十三、将吸附柱和收集管共同在12000rpm下空转离心2-3分钟，彻底甩干吸附材料中残留的漂洗液，排除后续RT等操作中漂洗液的干扰；
步骤十四、将CR3吸附柱放入新的RNase-free的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加30-100μl的RNase-free ddH2O，室温下放置2分钟，在12000rpm下离心2分钟，得到初提RNA溶液，分装成10μl小管后放置于-80℃冰箱备用。
实施例3反转录合成cDNA及RT-PCR反应
步骤一、以RNA为模板反转录合成cDNA，用赛默飞反转录试剂盒进行操作；
步骤二、对反转录合成的cDNA进行扩增，分别设计两个相邻基因间隔区的引物共28对，正向引物在上游基因的终止密码子的末端200bp内设计，反向引物则在下游基因的起始密码子开始的200bp内设计，引物见序列表1。
表1 RT-PCR引物
Figure RE-GDA0002251266660000051
Figure RE-GDA0002251266660000061
Figure RE-GDA0002251266660000071
RT-PCR反应体系：2μl 10×EasyTaq buffer，1.6μl dNTP(2mM)，1.6μl DMSO， 0.4μl Primer sense(20μM)，0.4μl Primer antisense(20μM)，0.4μl Template cDNA，0.4μlEasyTaq酶，13.2μl dd H2O。
RT-PCR扩增程序：94℃热启动8min→94℃变性30s→67℃退火30s→72℃延伸1min(根据PCR产物选择延长时间，1min/kb)，循环变性、退火、延伸三个步骤35 次→最后72℃保温延伸10min，以4℃终止。结果如图4、图5和图6所示。
实施例4实时定量PCR反应
步骤一、对每个共转录单元的第一个基因进行RT-qPCR反应，分别设计6对引物，引物见序列表2。
表2 RT-qPCR引物
Primers Forward(5’-3’) SEQ ID Reverse(5’-3’) SEQ ID
vanH CACGACTACCGGCTGAACGA NO：59 ACGATGTCGCTCTGCTGGAG NO：60
vtr GCACCGAATCCGATGCCTT NO：61 TTCTCTCCACCGCGTTTGC NO：62
oxyB GACGCCGAAACGCATTGGA NO：63 GCCGTTCGGTCACGATCTGT NO：64
hpgT CGAAGAGCCCGTACGCGTTGTCTT NO：65 AACCTGGCCGAGGACGAGAACA NO：66
vhp GGAACTGCTGGACTCGGTCCTGTT NO：67 AAGTCTCACGGGATTCGGTGCG NO：68
vasABCD GAGCCGGGGAATCCCAATCT NO：69 TTGCTGCCTTTCACCGCGA NO：70
步骤二、将HCCB10007菌株和HHT1475菌株的cDNA以不同浓度稀释，分别稀释 50倍、100倍、200倍和400倍，以不同浓度的两种cDNA作为模板，统一用vanH基因的引物，以控制变量法进行实验，确定模板的合适浓度，每个样品分别做三组求平均值，以16s RNA作为内参基因。
步骤三、根据CT值及标准差综合分析，选用稀释400倍的模板浓度。分别用HCCB10007和HHT1475菌株稀释400倍浓度的cDNA作为模板，和基因vanH、vtr、oxyB、 hpgT、vhp、vasABCD的引物进行实时定量PCR反应。
反应体系为：5μl SYBR Green Master(ROX)，3.4μl ddH2O，1μl Template cDNA，0.3μl Primer sense(20μM)，0.3μl Primer antisense(20μM)。
反应程序为：95℃下3分钟→95℃下30秒→60℃下30秒，后两步循环40次。结果如图7所示。
实施例5蛋白诱导及表达
步骤一、将甘油保存的含有pCold-1475质粒的BL21菌液加入LB液体培养基(加入氨苄青霉素)，在220rpm,37℃恒温摇床中震荡活化14-16h；
步骤二、取活化后菌液以1：100比例加入含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床下震荡培养至OD600＝0.4-0.5。将摇瓶分别加入不同浓度(0，0.1，0.5，1mmol/L) 的IPTG，放入220rpm摇床15℃过夜培养24h；
步骤三、取出各浓度的样品，12000rpm，4℃离心2min，倒去上清；
步骤四、离心管内加入4ml PBS，吹吸混匀，4℃离心2min，倒去上清；该步骤重复一次；
步骤五、最后加入4ml PBS，用细胞超声波破碎仪破碎(低温操作，工作10s，间隔10秒，共10分钟)，取出后离心30分钟，将上清和沉淀分别装于干净的EP 管内，用于SDS-PAGE。
实施例6蛋白纯化
步骤一、蛋白上清用注射器通过0.45μm的膜，其它溶液过0.22μm的膜；
步骤二、温和地颠倒瓶中Ni-NTA Agarose数次，吸取1ml树脂加入离心管，自然沉降，轻柔吸取上清。加入3-5倍体积无菌水，温和地颠倒柱子3min，自然沉降，吸去上清，用至少5倍柱体积的Lysis buffer平衡；
步骤三、过滤后的上清加到柱子上，流出液收集；
步骤四、Wash buffer平衡柱子，冲洗至流出液与G-250液体混合颜色与空白对照相近，一般至少10-15个柱体积，流出液A280<0.01，流出液收集；
步骤五、用5-10倍柱体积Elution Buffer洗脱，洗脱液收集；
步骤六、用3倍柱体积的lysis buffer冲洗；
步骤七、用5倍柱体积的去离子水冲洗；
步骤八、用5倍柱体积的20％乙醇平衡树脂；
步骤九、将树脂保存在20％乙醇的PBS中。结果如图8所示。
实施例7生物膜干涉技术
步骤一、对转录单元上游ATG前的启动子区域附近进行PCR，获得DNA；
步骤二、Ni-NTA传感器与缓冲液共放润湿30分钟；
步骤三、在板孔中依次加入反应样品，蛋白需经过纯化，且浓度需大于1mg/ml；
步骤四、设定程序：baseline 120秒，load/association/dissociation各300 秒，实验温度30℃；
步骤五、对获得的曲线进行拟合，得到解离常数KD值。如图9所示。
结果显示，通过生物膜干涉技术的方法观察蛋白与不同位点PCR的DNA样品间的结合情况及解离常数，发现调控蛋白AORI_1475与基因簇2922-3021bp处结合最紧密，拟合后解离常数KD值小于1.0-12，结合紧密度高，初步推断该处为AORI_1475的调控位点。
综上所述，AORI_1475具有正调控功能。同时本发明还找到了AORI_1475的调控位点。在此基础上，提出了对万古霉素生物合成调节基因进行过表达和利用 AORI_1475调控模式来提高万古霉素菌株产量的方法。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
序列表
<110> 上海交通大学
上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司
<120> 一种提高万古霉素产生菌生产万古霉素的方法
<130> 191088
<141> 2019-10-09
<160> 70
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cccatatgcg ggtggtcgat ggcca 25
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tttctagatt acgcgatcgc tcccgtgg 28
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccgattacgt tccgctcgac ga 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttcgccgaac ttgccgtgca 20
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccaggagacg gccaaggtca tcta 24
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttgtcccgcg ccttttccag 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cacctgtgcg cgatcatgga 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agccgcacac ctttgcagca 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgccgagcgt acgtcttgat 20
<210> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgttctctcc accgcgtttg 20
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggctcgccgt actggagaaa 20
<210> 12
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcccggcaca taggaactca 20
<210> 13
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggatcccttg ctgtggcgaa 20
<210> 14
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aacggagtcg cgacgacgat 20
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
accagatcct cgtgatcgac ggtg 24
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ccatgaattc cacgcgcgga 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
agtgaacacg cgacgtccga 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ccacctgctt ggcgatgatc 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
aaactcgatc accgggcgct 20
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<212> DNA
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<400> 20
tgcagtttca tcagcggcgc 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
caggcgatgg ccaaactgct 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
taggcgaggc attccttgcg 20
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
acgacgtccc gtccaaccac ta 22
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
atcttcggcc ggaagtcctg 20
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaccggacc gcgagatcaa ac 22
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tccaatgcgt ttcggcgtcc 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ctgcgcaccg tgttcacctt 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tgggcctgcc agacgaaatc 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
atgctgcgga cggcctatca 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
aacccggaat tcgccagctc 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
acgacatggt gccgatgttc 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
atcgcgtcga actgcatctc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggaacaccga ccagccgtac tt 22
<210> 34
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agcatgtcct cggccgtcaa 20
<210> 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cccagatcct ggttccccag at 22
<210> 36
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttcttctcgt cgccgggaac 20
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tacgccacgc tggaacgctt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
tgcgatagat ggcgtcgagg 20
<210> 39
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gccagcgggc atatcgacaa 20
<210> 40
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
tccagtgcgg tcatctccca 20
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
aggagctcca ggagatcacc a 21
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<212> DNA
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cggaatctcc agctgacgct 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gatgatgtcg gcgatgatgc 20
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<212> DNA
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catggtgatc acgcggaatc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaggcctacc gctcgatcaa 20
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<212> DNA
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<400> 46
gtccagcatg tggcgtttgc 20
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<212> DNA
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<400> 47
cgagcacacc gacggaaatc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
ttgcggtgct ggtcctgttc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
gcgtggagct ggagaaggaa 20
<210> 50
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
tcaccgtggg tctgcaggta 20
<210> 51
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
agacgcactc gctggacgat 20
<210> 52
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
tggaacaacc gctggtacgc 20
<210> 53
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<212> DNA
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<400> 53
aaccacggag gcaggcagtt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
agtacgtaac ccgcgccgat 20
<210> 55
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
catcatcggc aagttcgtcg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
tcctcgaaac cccattggtc 20
<210> 57
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
ccacctgcgt ggagatcgaa 20
<210> 58
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
tcaggaagac cgagcggatc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
cacgactacc ggctgaacga 20
<210> 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
acgatgtcgc tctgctggag 20
<210> 61
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
gcaccgaatc cgatgcctt 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
ttctctccac cgcgtttgc 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
gacgccgaaa cgcattgga 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gccgttcggt cacgatctgt 20
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<212> DNA
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<400> 65
cgaagagccc gtacgcgttg tctt 24
<210> 66
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
aacctggccg aggacgagaa ca 22
<210> 67
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
ggaactgctg gactcggtcc tgtt 24
<210> 68
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
aagtctcacg ggattcggtg cg 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
gagccgggga atcccaatct 20
<210> 70
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
ttgctgcctt tcaccgcga 19

Claims (7)

1.一种提高万古霉素产生菌生产万古霉素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、克隆生物合成调节基因AORI_1475至载体，并转入感受态细胞培养富集；
步骤二、构建包含AORI_1475基因序列的质粒，并转入大肠杆菌JM110去甲基化并过表达；
步骤三、提取步骤二中所述过表达的质粒，转入万古霉素生产菌株，获得AORI_1475基因过表达的重组菌株。
2.如权利要求1所述的提高万古霉素产生菌生产万古霉素的方法，其特征在于，所述步骤一的生物合成调节基因AORI_1475以东方拟无枝酸菌HCCB10007基因组为模板，分别用如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物通过PCR调取AORI_1475片段的方式获得。
3.如权利要求1所述的提高万古霉素产生菌生产万古霉素的方法，其特征在于，所述生物合成调节基因AORI_1475上调vanH基因的表达。
4.如权利要求3所述的提高万古霉素产生菌生产万古霉素的方法，其特征在于，生物合成调节基因AORI_1475上调vanH基因的表达的步骤为：将所述生物合成调节基因AORI_1475连接载体并导入万古霉素生产菌株中。
5.一种生物合成调节基因AORI_1475用于生产万古霉素的应用。
6.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求1所述的生物合成调节基因AORI_1475。
7.一种AORI_1475基因过表达的重组菌株用于生产万古霉素的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112430608A (zh) * 2020-12-04 2021-03-02 浙江大学 一种构建奥利万星前体高产工程菌的方法及应用
CN114317580A (zh) * 2022-01-13 2022-04-12 上海交通大学 一种含有双sgRNA的特异性基因敲除的CRISPR/Cas9编辑质粒及其应用

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