CN114807238B

CN114807238B - 一种过表达sirt6重组慢病毒质粒载体及其细胞模型的构建方法

Info

Publication number: CN114807238B
Application number: CN202210536111.9A
Authority: CN
Inventors: 李华; 郭振杨; 葛均波
Original assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Current assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Priority date: 2022-05-17
Filing date: 2022-05-17
Publication date: 2023-09-26
Anticipated expiration: 2042-05-17
Also published as: CN114807238A

Abstract

本发明公开了一种过表达SIRT6重组慢病毒质粒载体及其细胞模型的构建方法，重组慢病毒质粒载体中SIRT6DNA双链片段的基因SIRT6蛋白质编码区苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；本发明利用重组慢病毒载体，实现了SIRT6稳定持续性高表达，显著促进内皮细胞的自噬并抑制凋亡，维持了内皮细胞的功能，这为临床上干预内皮细胞功能从而改善心血管疾病带来了新的希望；有助于后续进行更深一步的研究SIRT6与内皮凋亡和自噬之间潜在的分子机制，为治疗由内皮功能障碍所致的心血管疾病提供有用的线索；具有重要的应用价值。

Description

一种过表达SIRT6重组慢病毒质粒载体及其细胞模型的构建方法

技术领域

本发明涉及医学分子生物学和基因工程技术领域，尤其涉及一种过表达SIRT6重组慢病毒质粒载体及其细胞模型的构建方法。

背景技术

目前，尽管近些年来主要治疗手段得到迅速发展，心血管疾病仍是全世界高死亡率的疾病，因此迫切需要寻找新的治疗和干预手段以治疗心血管疾病并改善预后。血管内皮细胞正常功能的维持对于血管健康以及预防治疗心血管疾病至关重。内皮细胞凋亡失衡已被证实是血管内皮屏障受损的重要始动因素，与动脉粥样硬化、心肌梗死、心力衰竭等多种心血管疾病的发生与发展密切相关，阻止内皮细胞的凋亡被认为是维持血管健康和治疗心血管疾病的重要手段。因此，深入探究内皮细胞的凋亡通路，寻找旨在抑制内皮细胞凋亡的干预靶点，能有效预防和治疗心血管疾病。

内皮细胞凋亡，即内皮细胞的程序化死亡，在细胞功能的调节中发挥着关键作用。多种刺激因子包括氧化低密度脂蛋白，血管紧张素II以及炎症因子均能促进内皮细胞凋亡，表现为内皮依赖性血管舒张障碍，血管通透性增强，炎症细胞浸润以及血栓形成。然而，目前临床上缺乏通过针对内皮细胞凋亡来治疗心血管相关疾病的有效干预靶点。因此，阐明内皮细胞凋亡在心血管疾病中的作用机制，研究涉及到的信号通路和调控分子，以期为预防和治疗心血管疾病提供新的干预靶点。

Sirtuin6(SIRT6)是III类NAD⁺依赖性组蛋白去乙酰化酶的sirtuin家族的重要成员，表现出包括去乙酰化，单-ADP核糖基化以及去长链脂肪酰化在内的多种催化活性。这些酶活使得SIRT6与基因组稳定、糖/脂代谢稳态、炎症、衰老等多种细胞生物学过程密切相关。通过参与这些过程，SIRT6能够抑制如动脉粥样硬化、心肌肥厚和纤维化、心衰和心脏缺血再灌注损伤等多种心血管疾病的发生和发展。更重要的是，SIRT6可以延缓血管老化，尤其是可以保护内皮细胞免受炎症、氧化应激以及DNA损伤，从而抑制内皮细胞的凋亡和衰老。已有研究表明，内皮特异性敲除SIRT6后能显著增加内皮细胞凋亡，加剧内皮功能障碍，从而促进了心血管疾病的发生发展。因此，靶向SIRT6可能是抑制内皮细胞凋亡，维持内皮细胞功能的一种创新的治疗策略。

发明内容

本发明的提供一种过表达SIRT6重组慢病毒质粒载体及其细胞模型的构建方法。

一种过表达SIRT6重组慢病毒质粒载体，重组慢病毒质粒载体中SIRT6 DNA双链片段的基因SIRT6蛋白质编码区苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

作为优选的技术方案，SIRT6基因的特异性引物包括正向引物序列如SEQ ID NO：3所示、反向引物序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明还公开了一种过表达SIRT6重组慢病毒质粒载体的制备方法，包含SEQ IDNO:1所示的目的序列，包括下列步骤：

1)目的基因片段的获取，从人微血管内皮细胞HMEC-1中提取总RNA，反转录合成cDNA，然后以此为模板，利用扩增SIRT6的特异性引物，所述SIRT6的特异性引物如SEQ IDNO：3所示与如SEQ ID NO：4所示，通过聚合酶链式反应扩增获得目的基因片段，目的基因片段为SIRT6的DNA双链片段；

2)目的片段和载体连接，将慢病毒载体质粒pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-puro的EcoRI与BamHI之间的DNA小分子替换为步骤1)中SIRT6的DNA双链片段，得到重组慢病毒载体。

本发明还公开了一种SIRT6高表达的人微血管内皮细胞模型的构建方法，包括下列步骤：

1)将高表达SIRT6重组慢病毒载体质粒联合病毒包装辅助质粒pMD2G与pSPAX2共转染293T细胞，获得病毒上清液；

2)用步骤1)获得的病毒上清液超速浓缩与纯化后，感染微血管内皮细胞系，筛选获得SIRT6高表达的HMEC-1细胞系，即SIRT6高表达的微血管内皮细胞模型。

本发明还公开了一种过表达SIRT6重组慢病毒质粒载体的应用，包括制备用于抑制氧化应激条件下微血管内皮细胞发生凋亡的产品；

制备用于促进氧化应激条件下微血管内皮细胞自噬的产品；

制备用于构建SIRT6高表达的微血管内皮细胞模型的产品；

抑制氧化应激条件下微血管内皮细胞发生凋亡；

促进氧化应激条件下微血管内皮细胞自噬；

构建SIRT6高表达的微血管内皮细胞模型。

本发明还公开了一种SIRT6高表达的人微血管内皮细胞模型的应用，其特征在于：包括制备用于抑制氧化应激条件下微血管内皮细胞发生凋亡的产品；

制备用于促进氧化应激条件下微血管内皮细胞自噬的产品；

制备用于构建SIRT6高表达的微血管内皮细胞模型的产品；

抑制氧化应激条件下微血管内皮细胞发生凋亡；

促进氧化应激条件下微血管内皮细胞自噬。

由于采用了上述技术方案，一种过表达SIRT6重组慢病毒质粒载体及其细胞模型的构建方法，重组慢病毒质粒载体中SIRT6 DNA双链片段的基因SIRT6蛋白质编码区苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明优点：

在本发明中，发现SIRT6能有效促进内皮细胞的自噬，抑制凋亡。因此，通过利用重组慢病毒载体实现内皮细胞的SIRT6高表达，发现能够显著抑制氧化应激下的内皮凋亡，这为临床上抑制内皮细胞凋亡从而改善心血管疾病带来了新的干预靶点。此外，稳定高表达SIRT6的内皮细胞株，可有助于后续进一步的研究SIRT6与内皮凋亡之间潜在的分子机制。

本发明利用重组慢病毒载体，实现了SIRT6稳定持续性高表达，显著促进内皮细胞的自噬并抑制凋亡，维持了内皮细胞的功能，这为临床上干预内皮细胞功能从而改善心血管疾病带来了新的希望；此外，本发明应用慢病毒辅助的基因过表达技术促进微血管内皮细胞中SIRT6基因的表达，构建携带有3xflag标签的SIRT6高表达微血管内皮细胞模型，这有助于后续进行更深一步的研究SIRT6与内皮凋亡和自噬之间潜在的分子机制，为治疗由内皮功能障碍所致的心血管疾病提供有用的线索；具有重要的应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为RT-qPCR鉴定重组慢病毒载体过表达SIRT6的效果图；

图2为Western blot鉴定重组慢病毒载体过表达SIRT6的效果图；

图3为RT-qPCR为鉴定重组慢病毒载体过表达SIRT6的人微血管内皮胞HMEC-1在氧化应激下的内皮细胞凋亡和自噬标记物的变化统计分析图；

图4为Western blot鉴定重组慢病毒载体过表达SIRT6的人微血管内皮胞HMEC-1在氧化应激下的内皮细胞凋亡和自噬生物标记图。

具体实施方式

为了弥补以上不足，本发明提供了一种过表达SIRT6重组慢病毒质粒载体及其细胞模型的构建方法以解决上述背景技术中的问题。

本发明提供了一种过表达SIRT6的重组慢病毒质粒载体，包含SEQ ID NO:1所示的目的序列，其制备方法如下：

(1)目的基因片段的获取：

从人微血管内皮细胞HMEC-1中提取总RNA，反转录合成cDNA，然后以之为模板，利用扩增SIRT6的特异性引物，通过聚合酶链式反应扩增获得目的基因DNA双链片段。

(2)目的片段和载体连接：

将慢病毒载体质粒pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-puro的EcoRI和BamHI之间的DNA小分子替换为上述SIRT6的DNA双链片段，得到重组慢病毒载体。

本发明还保护一种SIRT6高表达的人微血管内皮细胞(Human dermalmicrovascular endothelial cells-1,HMEC-1)模型，其制备方法可如下：

(1)将上述获得的重组慢病毒载体质粒联合病毒包装辅助质粒pMD2G和pSPAX2共转染293T细胞，获得病毒上清液；

(2)用步骤(1)获得的病毒上清液超速浓缩及纯化后，感染微血管内皮细胞系，筛选获得SIRT6高表达的HMEC-1细胞系，即SIRT6高表达的微血管内皮细胞模型。

本发明还保护重组慢病毒载体的应用，可为A1)-A6)中的至少一种；

A1)制备用于抑制氧化应激条件下微血管内皮细胞发生凋亡的产品；

A2)制备用于促进氧化应激条件下微血管内皮细胞自噬的产品；

A3)制备用于构建SIRT6高表达的微血管内皮细胞模型的产品；

A4)抑制氧化应激条件下微血管内皮细胞发生凋亡；

A5)促进氧化应激条件下微血管内皮细胞自噬；

A6)构建SIRT6高表达的微血管内皮细胞模型；

本发明还保护SIRT6高表达的微血管内皮细胞模型的应用，可为A1)-A5)中的至少一种；

A3)制备用于构建SIRT6高表达的微血管内皮细胞模型的产品；

A4)抑制氧化应激条件下微血管内皮细胞发生凋亡；

A5)促进氧化应激条件下微血管内皮细胞自噬。

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1、获得SIRT6 DNA双键片段

本发明所涉及的基因SIRT6蛋白质编码区(Coding sequence,CDS)在NCBIGenBank数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)中人源SIRT6基因的转录本NM_001193285中得到。其CDS区核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该序列全长为983bp，编码氨基酸序列如SEQID NO:2所示的蛋白质。

1、设计SIRT6 DNA双链片段

本发明的发明人通过查找NCBI GenBank数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)人源SIRT6基因的转录本NM_001193285，得到SIRT6蛋白质编码区序列(SEQ ID NO：1)如下：

ATGTCGGTGAATTACGCGGCGGGGCTGTCGCCGTACGCGGACAAGGGCAAGTGCGGCCTCCCGGAGATCTTCGACCCCCCGGAGGAGCTGGAGCGGAAGGTGTGGGAACTGGCGAGGCTGGTCTGGCAGTCTTCCAGTGTGGTGTTCCACACGGGTGCCGGCATCAGCACTGCCTCTGGCATCCCCGACTTCAGGGGTCCCCACGGAGTCTGGACCATGGAGGAGCGAGGTCTGGCCCCCAAGTTCGACACCACCTTTGAGAGCGCGCGGCCCACGCAGACCCACATGGCGCTGGTGCAGCTGGAGCGCGTGGGCCTCCTCCGCTTCCTGGTCAGCCAGAACGTGGACGGGCTCCATGTGCGCTCAGGCTTCCCCAGGGACAAACTGGCAGAGCTCCACGGGAACATGTTTGTGGAAGAATGTGCCAAGTGTAAGACGCAGTACGTCCGAGACACAGTCGTGGGCACCATGGGCCTGAAGGCCACGGGCCGGCTCTGCACCGTGGCTAAGGCAAGGGGGCTGCGAGCCTGCAGGAACGCCGACCTGTCCATCACGCTGGGTACATCGCTGCAGATCCGGCCCAGCGGGAACCTGCCGCTGGCTACCAAGCGCCGGGGAGGCCGCCTGGTCATCGTCAACCTGCAGCCCACCAAGCACGACCGCCATGCTGACCTCCGCATCCATGGCTACGTTGACGAGGTCATGACCCGGCTCATGAAGCACCTGGGGCTGGAGATCCCCGCCTGGGACGGCCCCCGTGTGCTGGAGAGGGCGCTGCCACCCCTGCCCCGCCCGCCCACCCCCAAGCTGGAGCCCAAGGAGGAATCTCCCACCCGGATCAACGGCTCTATCCCCGCCGGCCCCAAGCAGGAGCCCTGCGCCCAGCACAACGGCTCAGAGCCCGCCAGCCCCAAACGGGAGCGGCCCACCAGCCCTGCCCCCCACAGACCCCCCAAAAGGGTGAAGGCCAAGGCGGTCCCCAG

2、cDNA的获得

用RNA提取试剂盒(Vazymel公司)从人微血管内皮细胞HMEC-1中提取总RNA，经逆转录反应体系：PrimeScriptRT Buffer(8μl)、RT primer Mix(8μl)、PrimeScriptRTEnzyme Mix I(2μl)、RNase free dH₂O(2μl)在37℃15min，85℃5s的条件下反应，反转录得到SIRT6 cDNA文库。

3、PCR扩增目的片段

根据设计的SIRT6 DNA双链片段序列，设计并合成针对SIRT6基因的两对特异性引物。其中正向引物序列为5’-TACTAGAGGATCTATTTCCGGTGAATTCGCCACCATGTCGGTGAATTAC-3’(SEQ ID NO：3)；反向引物序列为5’-ACTTAAGCTTGGTACCGAGGATCCGCTGGGGACCGCCTTGGCCTTC-3’(SEQ ID NO：4)。

PCR扩增体系：25ul 2X PCR Buffer，2ul dNTPs mix(10mM each)2μL正向引物(10μM)，2μL反向引物(10μM)，1μL cDNA模板(200ng/uL)，18μL ddH2O，1ul phanta Super-Fidelity DNA Polymerase。设置PCR反应条件进行扩增：预变性95℃ 5min，变性95℃ 30S，退火55℃～72℃ 30S，延伸72℃ 30～60S/kb(27-35次循环)，彻底延伸72℃ 10min，得到SIRT6DNA双链目的片段。

实施例2、SIRT6过表达慢病毒载体构建及其过表达效果的鉴定

1、载体酶切与片段连接

按顺序依次加入以下每种试剂：1μl载体DNA(1μg/μl)、4μl 10*buffer、32μlddH20、1.5μl EcoRI、1.5μl BamHI，轻轻吹打混匀，于37℃水浴锅中反应1-2h对载体质粒进行酶切。酶切结束之后进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段。在HB infusionTM一步克隆连接体系中将SIRT6 DNA双链目的片段目连入酶切后的pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-puro载体，得到SIRT6过表达重组慢病毒载体。

2、病毒浓缩液的制备

参照LipofiterTM转染试剂(上海汉恒生物科技有限公司)的说明书，将10μg上述得到的SIRT6过表达重组慢病毒载体和10μgpHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-puro空载载体分别与病毒包装辅助质粒pSPAX2(10μg)和pMD2G(5μg)转染293T细胞，于48h后收集细胞培养液(即病毒原液上清)离心(4℃，2000×g，10min)去除细胞碎片，再将上清超速离心(4℃，82700×g，120min)，完全培养基重悬病毒沉淀，即获得SIRT6过表达/过表达对照病毒浓缩液，于-80℃冰箱保存。

3、细胞感染

提前传代293T细胞于37℃，5％CO₂的培养箱中，待细胞汇合率达到70-80％时，加入20μl SIRT6过表达/过表达对照病毒浓缩液进行细胞转染；24h后更换含10％胎牛血清FBS的新鲜的完全培养基；48h后使用嘌呤霉素进行筛选，并扩增培养，得到病毒感染筛选后的人微血管内皮细胞系HMEC-1。

4、通过RT-qPCR鉴定SIRT6过表达效果

4.1cDNA的获得

用RNA提取试剂盒(Vazymel公司)分别提取经过表达对照病毒浓缩液和SIRT6过表达病毒浓缩液感染的HMEC-1的RNA，经逆转录反应体系：PrimeScriptRT Buffer(8μl)、RTprimer Mix(8μl)、PrimeScriptRT Enzyme Mix I(2μl)、RNase free dH₂O(2μl)在37℃15min，85℃5s的条件下反应，得到cDNA。

4.2qPCR验证SIRT6的表达

配制qPCR反应体系：5μl TB Green Premix Ex TaqII(Tli RNaseH Plus)、0.3μl上游引物、0.3μl下游引物、4ulRNase free dH₂O和0.4μl步骤4.1获得cDNA模板，将配制好的反应体系在荧光定量PCR仪上进扩增反应。以β-actin基因为内参基因，采用2-ΔΔCT法，计算SIRT6过表达病毒感染的HMEC-1中SIRT6的相对表达量。

扩增SIRT6基因的上游引物为：5’-GCCTGGTCATCGTCAACCTG-3’(SEQ ID NO：5)，下游引物为5’-TCATGACCTCGTCAACGTAGC-3’(SEQ ID NO：6)。

扩增β-actin基因的上游引物为5’-GTTGTCGACGACGAGCG-3’(SEQ ID NO：7)，下游引物为5’-GCACAGAGCCTCGCCTT-3’(SEQ ID NO：8)。

4.3实验结果

检测结果如图1所示：在SIRT6过表达病毒浓缩液感染HMEC-1后,其SIRT6mRNA的表达显著高于对照组(P值＜0.001)，说明SIRT6过表达效果显著。

5、通过Western blot鉴定SIRT6的过表达效果

5.1Western blot具体步骤：

利用细胞裂解液RIPA提取经SIRT6过表达病毒浓缩液和过表达对照病毒浓缩液感染后的HMEC-1中细胞总蛋白，经99℃10min变性后，120V，60min SDS-PAGE电泳；300mA，60min转膜；快速封闭液封闭PVDF膜40min；1000：1稀释的β-actin兔一抗(美国abcam公司)和1000：1稀释的SIRT6兔一抗(美国abcam公司)4℃孵育过夜；回收一抗，用1×TBST溶液在摇床上洗膜3次，每次10min；5000：1稀释的兔二抗(美国Cell Signaling Technology公司)室温孵育1h；用1×TBST溶液于摇床上洗膜3次，每次10min；显影。

5.2实验结果

检测结果如图2所示：在SIRT6过表达病毒浓缩液感染HMEC-1后，其SIRT6的蛋白量显著高于对照组，说明SIRT6过表达效果显著。

实施例3、SIRT6过表达对氧化应激诱导的人微血管内皮细胞HMEC-1发生凋亡和自噬的影响

1、人微血管内皮细胞HMEC-1氧化应激造模

将实施例2中构建的SIRT6过表达HMEC-1稳定细胞系和对照细胞系在5％CO₂，95％N₂，无血清培养基条件下培养12小时后，换新鲜含10％胎牛血清FBS的新鲜培养基，在400uM浓度H₂O₂的条件下培养6小时。

2、通过RT-qPCR验证SIRT6过表达的HMEC-1在氧化应激诱导的凋亡和自噬生物标记物(Bax和Beclin-1)的变化：

2.1cDNA的获得

2.2qPCR验证Beclin-1和Bax的表达：

配制qPCR反应体系：5μl TB Green Premix Ex TaqII(Tli RNaseH Plus)、0.3μl上游引物、0.3μl下游引物、4ulRNase free dH₂O和0.4μl步骤2.1获得cDNA模板，将配制好的反应体系在荧光定量PCR仪上进扩增反应。以β-actin基因为内参基因，采用2-ΔΔCT法，分别计算SIRT6过表达病毒和过表达对照病毒感染的HMEC-1经氧化刺激后Beclin-1和Bax的相对表达量。

扩增Beclin-1基因的正向引物为：5’-CCATGCAGGTGAGCTTCGT-3’(SEQ ID NO：9)，反向引物引物为5’-GAATCTGCGAGAGACACCATC-3’(SEQ ID NO：10)；

扩增Bax基因的正向引物为：5’-CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG-3’(SEQ ID NO：11)，反向引物为5’-CCAGCCCATGATGGTTCTGAT-3’(SEQ ID NO：12)；

扩增β-actin基因的上游引物为5’-GTTGTCGACGACGAGCG-3’(SEQ ID NO：7)，下游引物为5’-GCACAGAGCCTCGCCTT-3’(SEQ ID NO：8)

3、Western blot鉴定SIRT6过表达的人微血管内皮细胞HMEC-1在氧化应激诱导的内皮凋亡和自噬生物标记物的变化：

利用细胞裂解液RIPA分别提取SIRT6过表达病毒浓缩液和过表达对照病毒浓缩液感染后的人中细胞总蛋白，变性后120V，60min SDS-PAGE电泳；300mA，65min转膜；快速封闭液封闭PVDF膜40min；1000：1稀释的Bax兔一抗(美国Cell Signaling Technology公司)、1000：1稀释的Becline-1兔一抗(美国Cell Signaling Technology公司)、1000：1稀释的SIRT6兔一抗(美国abcam公司)、1000：1稀释的β-actin一抗(美国abcam公司)、4℃孵育过夜；回收一抗，用1×TBST溶液在摇床上洗膜3次，每次10min；5000：1稀释的兔二抗(美国Cell Signaling Technology公司)室温孵育1h；用1×TBST溶液在摇床上洗膜3次，每次10min；显影。

3、实验结果

凋亡和自噬的生物标记物表达情况见图3和图4(SIRT6 OE为SIRT6过表达的HMEC-1细胞系，SIRT6 OENC为对照细胞系)。结果表明，与SIRT6 OENC相比，SIRT6 OE能显著增加自噬标志物Becline-1的表达，并降低凋亡标志物Bax的生物表达，即在氧化应激诱导的人微血管内皮细胞中，SIRT6过表达能显著促进自噬，抑制凋亡。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学附属中山医院

<120> 一种过表达SIRT6重组慢病毒质粒载体及其细胞模型的构建方法

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 983

<212> DNA

<213> homo species

<400> 1

atgtcggtga attacgcggc ggggctgtcg ccgtacgcgg acaagggcaa gtgcggcctc 60

ccggagatct tcgacccccc ggaggagctg gagcggaagg tgtgggaact ggcgaggctg 120

gtctggcagt cttccagtgt ggtgttccac acgggtgccg gcatcagcac tgcctctggc 180

atccccgact tcaggggtcc ccacggagtc tggaccatgg aggagcgagg tctggccccc 240

aagttcgaca ccacctttga gagcgcgcgg cccacgcaga cccacatggc gctggtgcag 300

ctggagcgcg tgggcctcct ccgcttcctg gtcagccaga acgtggacgg gctccatgtg 360

cgctcaggct tccccaggga caaactggca gagctccacg ggaacatgtt tgtggaagaa 420

tgtgccaagt gtaagacgca gtacgtccga gacacagtcg tgggcaccat gggcctgaag 480

gccacgggcc ggctctgcac cgtggctaag gcaagggggc tgcgagcctg caggaacgcc 540

gacctgtcca tcacgctggg tacatcgctg cagatccggc ccagcgggaa cctgccgctg 600

gctaccaagc gccggggagg ccgcctggtc atcgtcaacc tgcagcccac caagcacgac 660

cgccatgctg acctccgcat ccatggctac gttgacgagg tcatgacccg gctcatgaag 720

cacctggggc tggagatccc cgcctgggac ggcccccgtg tgctggagag ggcgctgcca 780

cccctgcccc gcccgcccac ccccaagctg gagcccaagg aggaatctcc cacccggatc 840

aacggctcta tccccgccgg ccccaagcag gagccctgcg cccagcacaa cggctcagag 900

cccgccagcc ccaaacggga gcggcccacc agccctgccc cccacagacc ccccaaaagg 960

gtgaaggcca aggcggtccc cag 983

<210> 2

<211> 328

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Ser Val Asn Tyr Ala Ala Gly Leu Ser Pro Tyr Ala Asp Lys Gly

1 5 10 15

Lys Cys Gly Leu Pro Glu Ile Phe Asp Pro Pro Glu Glu Leu Glu Arg

20 25 30

Lys Val Trp Glu Leu Ala Arg Leu Val Trp Gln Ser Ser Ser Val Val

35 40 45

Phe His Thr Gly Ala Gly Ile Ser Thr Ala Ser Gly Ile Pro Asp Phe

50 55 60

Arg Gly Pro His Gly Val Trp Thr Met Glu Glu Arg Gly Leu Ala Pro

65 70 75 80

Lys Phe Asp Thr Thr Phe Glu Ser Ala Arg Pro Thr Gln Thr His Met

85 90 95

Ala Leu Val Gln Leu Glu Arg Val Gly Leu Leu Arg Phe Leu Val Ser

100 105 110

Gln Asn Val Asp Gly Leu His Val Arg Ser Gly Phe Pro Arg Asp Lys

115 120 125

Leu Ala Glu Leu His Gly Asn Met Phe Val Glu Glu Cys Ala Lys Cys

130 135 140

Lys Thr Gln Tyr Val Arg Asp Thr Val Val Gly Thr Met Gly Leu Lys

145 150 155 160

Ala Thr Gly Arg Leu Cys Thr Val Ala Lys Ala Arg Gly Leu Arg Ala

165 170 175

Cys Arg Asn Ala Asp Leu Ser Ile Thr Leu Gly Thr Ser Leu Gln Ile

180 185 190

Arg Pro Ser Gly Asn Leu Pro Leu Ala Thr Lys Arg Arg Gly Gly Arg

195 200 205

Leu Val Ile Val Asn Leu Gln Pro Thr Lys His Asp Arg His Ala Asp

210 215 220

Leu Arg Ile His Gly Tyr Val Asp Glu Val Met Thr Arg Leu Met Lys

225 230 235 240

His Leu Gly Leu Glu Ile Pro Ala Trp Asp Gly Pro Arg Val Leu Glu

245 250 255

Arg Ala Leu Pro Pro Leu Pro Arg Pro Pro Thr Pro Lys Leu Glu Pro

260 265 270

Lys Glu Glu Ser Pro Thr Arg Ile Asn Gly Ser Ile Pro Ala Gly Pro

275 280 285

Lys Gln Glu Pro Cys Ala Gln His Asn Gly Ser Glu Pro Ala Ser Pro

290 295 300

Lys Arg Glu Arg Pro Thr Ser Pro Ala Pro His Arg Pro Pro Lys Arg

305 310 315 320

Val Lys Ala Lys Ala Val Pro Ser

325

<210> 3

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tactagagga tctatttccg gtgaattcgc caccatgtcg gtgaattac 49

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acttaagctt ggtaccgagg atccgctggg gaccgccttg gccttc 46

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcctggtcat cgtcaacctg 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcatgacctc gtcaacgtag c 21

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gttgtcgacg acgagcg 17

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcacagagcc tcgcctt 17

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccatgcaggt gagcttcgt 19

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gaatctgcga gagacaccat c 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cccgagaggt ctttttccga g 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccagcccatg atggttctga t 21

Claims

1.一种过表达SIRT6重组慢病毒质粒载体，其特征在于：重组慢病毒质粒载体中SIRT6编码区苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。

2.如权利要求1所述的一种过表达SIRT6重组慢病毒质粒载体，其特征在于：SIRT6基因的特异性引物包括正向引物序列如SEQ ID NO：3所示、反向引物序列如SEQ ID NO：4所示。

3.一种如权利要求1所述的过表达SIRT6重组慢病毒质粒载体的制备方法，其特征在于，包含SEQ ID NO: 1所示的目的序列，包括下列步骤：

1）目的基因片段的获取，从人微血管内皮细胞HMEC-1中提取总RNA，反转录合成cDNA，然后以此为模板，利用扩增SIRT6的特异性引物，所述SIRT6的特异性引物如SEQ ID NO：3所示与如SEQ ID NO：4所示，通过聚合酶链式反应扩增获得目的基因片段，目的基因片段为SIRT6的DNA双链片段；

2）目的片段和载体连接，将慢病毒载体质粒pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-puro的EcoRI与BamHI之间的DNA小分子替换为步骤1）中SIRT6的DNA双链片段，得到重组慢病毒载体。

4.一种SIRT6高表达的人微血管内皮细胞模型的构建方法，其特征在于，包括下列步骤：

1）将权利要求1所述的过表达SIRT6重组慢病毒质粒载体联合病毒包装辅助质粒pMD2G与pSPAX2共转染293T细胞，获得病毒上清液；

2）用步骤 1）获得的病毒上清液超速浓缩与纯化后，感染微血管内皮细胞系，筛选获得SIRT6高表达的HMEC-1细胞系，即SIRT6高表达的微血管内皮细胞模型。