CN112794895A - 外源性atg10s蛋白在制备抗病毒药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种外源性ATG10S蛋白在制备抗病毒药物中的应用。所述的外源性ATG10S为rhATG10S蛋白，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，所述的rhATG10S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明还涉及所述的rhATG10S蛋白在制备抑制病毒的药物中的应用；以及，以ATG10S蛋白为靶点，筛选抗病毒药物的方法。

Description

外源性ATG10S蛋白在制备抗病毒药物中的应用
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体的，涉及一种外源性rhATG10S蛋白在制备抗病毒药物中的应用。
背景技术
在人类感染性疾病中病毒性感染仍占据着重要地位，如HIV、ZIKV、HBV、HCV、Ebola、流感病毒、脑炎病毒等仍是影响人类健康的重要病原；尤其新冠肺炎病毒(SARS-COV-2)造成的感染更是十分严重，而针对病毒的治疗手段仍然十分有限。
近年来，自噬机制与疾病的相关性的研究成果引起了医药研发领域的极大关注。自噬基因家族成员众多，分别参与了自噬过程的不同阶段。研究表明，自噬机制除了涉及发育和分化、正常细胞稳态的维持等正常细胞生理外，还涉及一些疾病病理过程，如神经退行性疾病、代谢性疾病、癌症和病原微生物的侵染等方面。研究表明，病毒感染能够激活细胞的自噬过程，而细胞自噬机制对病毒感染具有双重作用：一方面，病毒进入细胞后能够被机体识别，活化自噬相关信号通路，利用自噬过程将病毒粒子或蛋白转运至溶酶体，以降解病毒；自噬过程还可以将病毒核酸和蛋白转运至胞内免疫感受器，激活天然免疫；也可将降解的病毒蛋白递呈至MHC II分子，激活获得性免疫系统。因此，自噬在病毒感染中发挥着重要的抗病毒作用。另一方面，有些病毒可以利用细胞自噬过程进行自身基因组的复制及病毒蛋白的表达，如甲型流感病毒能够通过病毒蛋白M2与自噬蛋白LC3直接相互作用，破坏LC3在细胞内分布，影响自噬双层膜泡结构的形成，维持自身病毒粒子的稳定性以及促进其在机体组织中的传播。研究还发现，细胞不完全的自噬对于HCV的复制过程是至关重要的：HCV病毒感染细胞早期即可迅速活化自噬，上调细胞自噬相关蛋白Beclin-1的表达，通过内质网压力途径激活细胞自噬相关信号通路，诱导双层膜泡结构形成。HCV病毒RNA聚合酶NS5B在感染早期能够与自噬相关蛋白ATG5发生直接相互作用，HCV病毒复制复合体及新合成的病毒RNA定位于由LC3-II分子参与组成的自噬泡双层膜上——病毒基因组的复制场所。下调自噬相关蛋白ATG5、ATG7、LC3、ATG10等，可以有效抑制HCV复制能力。在众多的自噬基因中，ATG10的功能除了作为自噬系统中泛素样E2酶外，最近研究认为ATG10样蛋白在酵母中可能参与在压力应激下阻断细胞周期的过程，并且该蛋白对细胞周期的影响完全不同于自噬机制的作用。临床研究还发现，ATG10还与结直肠癌、乳腺癌患病风险和预后相关。
病毒基因组复制是其生命周期的重要环节之一，也是抗病毒药物研究的热点靶位之一。针对此靶点及病毒生活周期各环节为靶点的宿主抑制因子具有广谱抗病毒的作用。将此类宿主抑制因子研发为抗病毒药物也是针对突发性未知病毒或细菌(来源、分类、感染机制不明)的大面积传播、且暂无针对性特效药、无法及时提供疫苗和抗体等情况下的有效的应对手段。此类药物的作用机理主要是通过激活宿主细胞免疫反应来清除病毒，并通过维护细胞内稳态机制如自噬机制来保护宿主细胞。
根据GenBank登录信息，ATG10基因组序列经注释分析，其转录产物可有五种剪接方式，即有五种mRNA。然而，其编码区只有两种，一种编码220个氨基酸(在我们前一个发明CN201410418997.2中命名为ATG10-L)，一种编码184个氨基酸(在我们前一个发明中命名为ATG10-S)。ATG10(ATG10-L)作为自噬过程中的泛素样E2酶已有相关报道。但未见ATG10S的研究报道。我们前期研究首次实验证明了ATG10S蛋白的存在，根据PDB信息模拟了ATG10S的空间构象(见图1)；研究了内源性ATG10S的功能。我们发现这两种ATG10蛋白对于HCV复制和对宿主免疫系统具有差异性调节作用。atg10s编码的ATG10S蛋白具有激活先天免疫反应、促进自噬溶酶体形成、维护完整自噬活性达到降解HCV病毒蛋白的作用1-4，这些研究成果揭示了ATG10S是一种抗HCV病毒的新的宿主限制因子，为进一步研发其作为广谱抗病毒新药奠定了基础。
参考文献
1.Miao-Qing Zhang,Jian-Rui Li,Zong-Gen Peng and Jing-Pu Zhang*ZhangM-Q,Li J-R,Peng Z-G and Zhang J-P(2018)Differential Effects of Autophagy-Related 10Protein on HCV Replication and Autophagy Flux Are Mediated by ItsCysteine44 and Cysteine135.Front.Immunol.9:2176.doi:10.3389/fimmu.2018.02176
2.Miao-Qing Zhang,Qiong Zhao&Jing-Pu Zhang(2020)A new transcriptionfactor ATG10S activates IFNL2 transcription by binding at an IRF1 site inHepG2 cells,Autophagy,2020Jan 29:1-13.doi:10.1080/15548627.2020.1719681.
3.Li Y-C,Zhang M-Q and Zhang J-P(2018)Opposite Effects of Two HumanATG10 Isoforms on Replication of a HCV Sub-genomic Replicon Are Mediated viaRegulating Autophagy Flux in Zebrafish.Front.Cell.Infect.Microbiol.8:109.doi:10.3389/fcimb.2018.00109.
4.Yuan-yuan Ma,Jian-rui Li,Zong-gen Peng,and Jing-pu Zhang.IL28Aprotein homotetramer structure is required for autolysosomal degradation ofHCV-NS5A in vitro.Cell Death Dis.2020Mar；11(3):200.doi:10.1038/s41419-020-2400-9。
5.Linli Li,Shufen Li,Bingya Jiang,Miaoqing Zhang,Jingpu Zhang,BeibeiYang,Li Li,Liyan Yu,Hongyu Liu,Xuefu You,Xinxin Hu,Zhen Wang,Yuhuan Li,Linzhuan Wu.(2019)Isarubrolones Containing a Pyridooxazinium Unit fromStreptomyces as Autophagy Activators,J Nat Prod,2019May 24；82(5):1149-1154.
发明内容
本发明首先涉及一种大肠杆菌表达的rhATG10S蛋白，所述的rhATG10S蛋白的密码子优化后的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，所述的rhATG10S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2：所示序列为人的ATG10S编码序列经过大肠杆菌密码子优化后的两种rhATG10S蛋白的编码序列，并在rhATG10S编码区的5’端添加了编码MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH多肽的编码序列。
SEQ ID NO.3：所示序列为人的ATG10S编码序列经过大肠杆菌密码子优化后的rhATG10S蛋白氨基酸序列，并在N端添加了MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH多肽序列。
本发明还涉及一种用于表达rhATG10S蛋白的大肠杆菌表达载体，所述的载体为：pET-28a(+)，将密码子优化后的rhATG10S的CDS利用NdeI和XhoI位点插入到pET-28a(+)载体上，启动子为T7 promoter，后接lac operator、rbs，在His-tag与ATG10S起始密码子之间有thrombin酶切位点。
本发明还涉及所述的rhATG10S蛋白在制备抑制病毒的药物中的应用，所述的药物为：通过激活细胞免疫活性和激活细胞自噬流，进而通过细胞自噬降解病毒蛋白的药物。
所述的激活细胞免疫活性为：作为转录因子进入细胞核并激活III型干扰素家族基因的转录，剂量依赖的提升III型干扰素的表达量。
所述的激活细胞自噬流为：
剂量依赖的提升LC3B-II蛋白量；
剂量依赖的降低P62蛋白量，所述的降低P62蛋白量包括表达和降解；
并促进自噬溶酶体的形成。
优选的，所述的病毒为：HBV、HCV、HIV、SARS-Cov2、ZIKA。
本发明还涉及以ATG10S蛋白为靶点，筛选抗病毒药物的方法，所述的筛选为筛选上调ATG10S蛋白表达量的化合物；所述抗病毒药物为：通过激活细胞自噬流，进而通过细胞自噬降解病毒蛋白的药物。优选的，所述的病毒为：HBV、HCV、HIV、SARS-Cov2、ZIKA。
本发明还涉及化合物isarubrolone C的如下应用：
(1)制备上调ATG10和ATG10S蛋白的表达的制剂；
(2)制备抗病毒的药物。
本发明的有益效果在于：
1、相比与在先专利(CN201410418997.2)所述的内源性表达的ATG10S蛋白而言，本发明进一步阐明了通过原核宿主表达的rhATG10S蛋白，外源性给药后，同样能够激活细胞自噬流，从而达到抗病毒的效果；并且，本发明的结果显示，rhATG10S不仅可降解病毒结构蛋白，也可降解非结构蛋白
2、外源性给药rhATG10S后，对不同的病毒蛋白的自噬降解，具有一定的选择性，降解效率具体为：HBX＝HCV-NS5B>HIV-RT>ZIKA-NS5≈CoV2-NSP9>CoV2-S>HCV-CORE≈CoV2-NSP5≈CoV2-NSP12>CoV2-N＝CoV2-M；
3、本发明进一步发现，以ATG10S蛋白为靶点，筛选得到的化合物能够有效激活细胞自噬，并具有抗病毒活性。
附图说明
图1.人ATG10S蛋白三级结构空间构象。
图2.大肠杆菌表达的rhATG10S蛋白对五种病毒蛋白的降解作用
HepG2细胞分别转染HCV subreplicon、flag-HIV-RT、flag-HBV-X和flag-ZIKA-NS5基因表达构件，30小时后给予大肠杆菌表达的rhATG10S蛋白；24小时后收样。采用Western Blotting方法检测自噬流蛋白p62、LC3B-I/II水平，以及病毒蛋白HBV-X(A)、HCV-CORE/NS5B(B)、HIV-RT(C)和ZIKA-NS5(D)的水平。
图3.大肠杆菌表达的rhATG10S蛋白对新冠肺炎病毒(SARS-Cov2)蛋白的降解作用
肺癌细胞A549分别转染SARS-Cov2相关的病毒蛋白基因表达构件，24小时后给予大肠杆菌表达的rhATG10S蛋白。采用Western Blotting方法检测了自噬流蛋白p62、LC3B-I/II水平，以及SARS-Cov2病毒的S(A)、NSP-5(B)、NSP-9(C)、NSP-12(D)、N(E)、M(F)的蛋白水平。
图4.大肠杆菌表达的rhATG10S蛋白对11种病毒蛋白的降解效果的比较
对图2和图3中rhATG10S浓度为5μM和10μM两组蛋白条带进行灰度扫描，以β-ACTIN条带为上样对照，数据以三个独立实验的平均值±SD表示，绘制柱状图；进行统计学分析，各组间用单因素方差分析进行比较，*p<0.05,***p<0.001。
图5.核质分离实验证明大肠杆菌表达的rhATG10和rhATG10S蛋白均可通过细胞膜，但只有rhATG10S可进入细胞核。
HepG2细胞分别转染flag-HBV-X(A)、HCV replicon(B)、flag-HIV-RT(C)和flag-ZIKA-NS5(D)基因表达构件，24h后给予大肠杆菌表达的his6-rhATG10S蛋白和his6-rhATG10蛋白(均为5μM)。进行细胞的核/质分离；Western blotting检测，用anti-his6-tag抗体检测rhATG10和rhATG10S，用anti-Lamin B1抗体标示细胞核样品，用anti-Hsp90抗体标示细胞质样品。
图6.rhATG10S蛋白进入细胞核促进Ⅲ型干扰素-2的高表达
A.细胞免疫实验显示rhATG10蛋白在细胞质中分布，并不进入细胞核；而rhATG10S大部分蛋白进入细胞核，较少部分分布于细胞质中。B.DNA ChIP实验显示Ⅲ型干扰素-2(IFNL2)基因的启动子序列可与rhATG10S蛋白结合，而不能与rhATG10蛋白结合。C.qRT-PCR检测细胞内源IFNL2基因的表达，rhATG10高表达对IFNL2基因转录无诱导作用，而rhATG10S可以诱导内源性IFNL2高水平转录。D.Western blotting实验显示rhATG10高表达不影响IFNL2蛋白水平，而rhATG10S可以明显提高内源性IFNL2蛋白水平。
图7.外源rhATG10S蛋白促进多个III型干扰素家族基因的高表达
对A549肺癌细胞分别转染不同的SARS-CoV2病毒蛋白(A.CoV2-S,B.CoV2-NSP5,C.CoV2-NSP9,D.CoV2-NSP12)表达构件，并给予不同浓度的大肠杆菌表达的rhATG10S蛋白，用qRT-PCR检测多个IFNL家族成员的转录水平。结果显示Ⅲ型干扰素IFNL1/2/3成员的转录水平随着rhATG10S浓度的增加而明显升高。
图8.内源性的ATG10S促进IFNL2高表达和自噬活性。
Co-IP实验显示，在HCV-subreplicon HepG2细胞中，ATG10S可提高IFNL2蛋白水平，并促进自噬底物受体P62、自噬泡蛋白LC3B、溶酶体膜蛋白LAMP2和IFNL2的相互结合，形成自噬溶酶体，促进了通畅的自噬流(ATG10和ATG10S分别连接了Flag标签)。
图9.III型干扰素的表达水平与完整自噬过程/自噬溶酶体的形成并降解HCV病毒蛋白的相关性。
采用基因过表达和基因下调(Morpholino antisense oligos,MOs)方法，检测IFNL2水平变化对自噬流和HCV病毒粒子蛋白的降解作用。HU7.5细胞感染HCV病毒粒子，Western blotting检测显示IFNL2高表达组自噬流畅通且可降低HCV病毒蛋白(NS3、CORE、NS5A，代表HCV全病毒感染水平)；而抑制IFNL2蛋白水平，则降解病毒蛋白的作用消失，并出现自噬流受阻现象。
图10.ATG10S抗病毒作用机制示意图
图11.化合物Isarubrolone C提高ATG10S和IFNL2水平、降解五种病毒蛋白
以提高ATG10S蛋白水平为指标筛选化合物，获得化合物Isarubrolone C；采用Western blotting检测该化合物降解HBV-X(A)、HCV-CORE(B)、HCV-NS5B(B)、HIV-RT(C)和ZIKA-NS5(D)五种病毒蛋白的作用和自噬流情况。结果显示，Isarubrolone C能明显提高含病毒蛋白细胞的IFNL2、ATG10和ATG10S蛋白水平，增强了自噬活性，降低了这五种病毒蛋白水平。
具体实施方式
实验方法
1.常用基本方法：
质粒的提取：按照试剂盒说明书方法(北京天根公司产品)。
琼脂糖凝胶电泳DNA片段的回收：采用Qiagen公司的Qia Quick Gel ExtractionKit回收。
SDS-PAGE电泳检测蛋白的表达：参照汪家政等(2000)编的《蛋白质技术手册》方法。
Western blotting检测：按照马歇克等(1999)方法进行。
qRT-PCR：常规定量检测各靶基因的表达水平。
细胞转染：采用LipofectamineTM 2000Reagent转染试剂盒。按照试剂盒说明书方法。
2.质粒构建
大肠杆菌表达hATG10S的质粒：以pET-28a(+)为载体，将优化后的ATG10S的CDS利用NdeI和XhoI位点插入到pET-28a(+)为载体上。
pIRES2-EGFP和pIRES2-DsRed(Clontech公司产品)，以及HCV subreplicon本实验室保存；pMD19-T购自Taraka公司。
为研究ATG10S蛋白抗病毒的广谱性，鉴于以下病毒蛋白的重要的病理作用，我们构建了这些病毒基因的真核细胞表达载体。
(1)HBV-X蛋白参与HBV病毒的多种病理作用，是导致肝癌的主要因子；
(2)HCV-CORE参与HCV基因组复制和病理过程，是导致肝癌的主要因子；
(3)HCV-NS5B是HCV病毒的RNA依赖的RNA聚合酶，负责基因组复制和基因表达；
(4)HIV-RT蛋白是构成HIV-1RNA 反转录酶复合体的蛋白之一，在HIV病毒单链RNA逆转录为前病毒DNA过程中发挥重要作用；
(5)ZIKA病毒的NS5蛋白含有ZIKA病毒的RNA依赖的RNA聚合酶，参与病毒基因组复制，并可影响宿主免疫反应；
(6)对于SARS-CoV-2病毒，研究了如下结构基因：
1)S蛋白是病毒表面的突起糖蛋白，负责病毒与宿主细胞膜识别和融合，促成病毒侵入细胞；
2)N蛋白是病毒的核衣壳磷蛋白；
3)M蛋白是构成病毒外膜的糖蛋白；
4)NSP5参与病毒多肽的切割和活化；
5)NSP9可结合RNA，形成促进病毒感染的二聚体；
6)NSP12是该病毒的RNA多聚酶，参与病毒基因组的复制。
上述病毒蛋白基因均标记了flag标签，购自上海生工公司。我们以pIRES2-EGFP质粒为基本表达载体，构建了pIRES2-EGFP-HIV/RT-flag、pIRES2-EGFP-ZIKA/NS5-flag、pIRES2-EGFP-HBX-flag、pIRES2-EGFP-CoV2/S-flag、pIRES2-EGFP-CoV2/NSP5-flag、pIRES2-EGFP-CoV2/NSP9-flag、pIRES2-EGFP-CoV2/NSP12-flag、pIRES2-EGFP-CoV2/N-flag、pIRES2-EGFP-CoV2/M-flag九种病毒蛋白表达载体。
构建了N-端标记的flag-ATG10和flag-ATG10S，以及N-端标记的His6-ATG10和His-ATG10S用于核质分离和蛋白检测。
人IFNL2表达构件为本团队前期构建，MO oligos(购自美国GENE TOOLS公司)。(详见参考文献4)
3.Western blotting检测蛋白水平
1)异源rhATG10S蛋白对四种病毒蛋白和自噬流的影响
肝癌细胞株HepG2细胞分别转染HCV subreplicon(含HCV-core和HCV-NS5B基因)、HIV-RT、HBV-X和ZIKA-NS5基因表达构件，30h后在培养基中加入大肠杆菌表达的ATG10S蛋白，ATG10S终浓度分别为0、1、5、10μM。继续培养24h后收集细胞，进行Western blotting检测，检测了自噬流蛋白p62、LC3B-I/II水平，以及病毒蛋白HIV-RT(A)、ZIKA-NS5(B)、HBV-X(C)、HCV-CORE和HCV-NS5B(D)的水平。HCV的CORE和NS5B蛋白是用其自身抗体检测，HIV-RT、HBV-X和ZIKA-NS5病毒蛋白均连接了flag标签，采用抗flag的抗体检测。其它蛋白检测均采用其自身抗体。
2)异源rhATG10S蛋白对SARS-COV-2蛋白和细胞自噬流的作用
肺癌细胞株A549细胞，分别转染SARS-Cov2的病毒蛋白基因(flag-SARS-CoV2-S、flag-SARS-CoV2-NSP5、flag-SARS-CoV2-NSP9、flag-SARS-CoV2-NSP12)表达载体；24h后在培养基中加入大肠杆菌表达的ATG10S蛋白，终浓度分别为0、1、5、10μM；继续培养24h后收集细胞，进行Western blotting检测。因SARS-CoV2蛋白均连接了flag标签，采用抗flag的抗体检测。其它蛋白检测均采用其自身抗体。
3)IFNL2对自噬流蛋白和HCV病毒粒子蛋白的作用
将人IFNL2基因表达构件、IFNL2-MO1、IFNL2-MO2(IFNL2-MO1、IFNL2-MO2是两种反义oligos，可与IFNL2 mRNA翻译起始区配对、形成局部双链，抑制IFNL2翻译)分别转染HU7.5细胞，培养12小时后，再用HCV全病毒粒子(J6/JFH/JC,45IU/cell)感染细胞，继续培养72h后收集细胞，用Western blotting检测HCV NS3、CORE和NS5A蛋白(代表HCV全病毒粒子)水平，并自噬活性相关蛋白(LC3B、P62和LAMP2)和IFNL2蛋白水平。详见参考文献4。
4)化合物Isarubrolone C对自噬和5种病毒蛋白的作用
肝癌细胞株HepG2细胞分别转染HCV subreplicon、HIV-RT、HBV-X和ZIKA-NS5基因表达构件，30h后在培养基中加入Isarubrolone C化合物，终浓度为10μM。继续培养24h后收集细胞，进行Western blotting检测。HCV的CORE和NS5B蛋白是用其自身抗体检测，HIV-RT、HBV-X和ZIKA-NS5病毒蛋白均连接了flag标签，采用抗flag的抗体检测。同时，检测ATG10S蛋白、自噬活性(自噬流)相关蛋白(ATG10、LC3B、P62和LAMP2)和IFNL2蛋白水平。
4.免疫共沉淀(Co-IP)
以未经转染的HepG2细胞为对照，对含有HCV亚复制子的HepG2细胞分别转染ATG10和ATG10S基因表达载体，继续培养30h后收集细胞，分两部分，一部分作为“input”组，进行常规的Western blotting实验，检测IFNL2、P62、LC3B、LAMP2、GAPDH的蛋白水平；另一部分用非变性裂解液(Applygen Technologies,P1261-1)处理细胞，再分别用anti-FLAG(沉淀flag-ATG10,flag-ATG10S)和anti-LAMP2抗体进行免疫沉淀；然后将此免疫沉淀复合物分别进行常规Western blotting检测IFNL2、P62、LC3B、LAMP2、ATG10/ATG10S的蛋白水平1。
5.核质分离实验检测异源表达的ATG10和ATG10S蛋白进入细胞和入核：
HepG2细胞分别转染HCV replicon、HIV-RT、HBV-X和ZIKA-NS5基因表达构件。细胞培养24h后分组：以未给予ATG10蛋白的转染病毒蛋白的HepG2细胞为对照组，培养基中分别给予大肠杆菌表达的His6-ATG10S蛋白和His6-ATG10蛋白的细胞为实验组，两种his6-ATG10蛋白浓度均为5μM。继续培养24h后收集细胞，利用NE-PER Nuclear and CytoplasmicExtraction Reagents kit(Thermo Fisher Scientific,78835)做核质分离，获得细胞质样品和细胞核样品。将样品进行Western blotting蛋白检测。采用anti-His抗体检测ATG10和ATG10S；anti-Lamin B1抗体检测核纤层蛋白B1，作为细胞核上样量对照；anti-Hsp90抗体检测热休克蛋白90，作为细胞质上样量对照。
6.细胞免疫荧光实验检测ATG10/ATG10S蛋白的亚细胞定位
HepG2细胞分别转染flag-atg10和flag-atg10S的真核表达质粒后继续培养30小时，进行细胞免疫染色：采用TRITC-anti-FLAG抗体显示ATG10 or ATG10S蛋白的亚细胞位置，DAPI染料显示细胞核。荧光显微镜下拍照。红色荧光显示ATG10和ATG10S的亚细胞定位，
7.DNA ChIP实验检测ATG10S蛋白与IFNL2启动子的直接结合
我们前期研究中已克隆了IFNL2启动子片段IFNL2P1-1。以未转染细胞为对照，将IFNL2P1-1片段和flag-atg10 mRNA或flag-atg10S mRNA共转染到HepG2细胞，继续培养30小时，收集细胞，加入1％甲醛在37C下10分钟，使得蛋白与DNA交联，1mM PMSF洗涤3次，离心取上清液，加入anti-flag抗体分别沉淀Flag-ATG10/DNA和Flag-ATG10S/DNA两种DNA-蛋白复合物。用IFNL2P1-1序列的引物，RT-PCR检测与Flag-ATG10或Flag-ATG10S蛋白免疫沉淀下来的IFNL2P1-1片段。IFNL2P1-1正向引物：5’-CGTGGTGGTGCATGCCTATA-3’，反向引物：5’-TAACTGCAACCTCCACCTCC-3’；PCR片段大小：407bp。
8.qRT-PCR检测基因转录水平
1)ATG10S过表达对细胞内源Ⅲ型干扰素-2基因(IFNL2)表达的影响
以未经转染处理的HepG2细胞为对照，将HepG2细胞分别转染flag-atg10和flag-atg10s的真核表达质粒后继续培养30小时，收集细胞，用TRIZOL提取总RNA，进行反转录(M-MLV reverse transcriptase(Promega,M1708))获得cDNA1st链为PCR模板,进行qPCR检测IFNL2 mRNA。qRT-PCR引物序列见表1.
2)外源rhATG10S对含病毒蛋白细胞的内源多个Ⅲ型干扰素基因表达的影响
以未经转染处理的肺癌细胞A549为对照，对A549细胞分别转染4个SARS-Cov2病毒蛋白(CoV2-S、CoV2-NSP5、CoV2-NSP9、CoV2-NSP12)的基因表达构件，24h后培养基中给予大肠杆菌表达的ATG10S蛋白，浓度分别为0、5、10μM，继续培养24h后收集细胞，用灭菌PBS洗涤2-3次后，使用TRIZOL提取总RNA。按照试剂盒(Thermo)说明书，以总RNA为模板、Oigo dT18为引物，进行反转录反应，获得cDNA1st链为PCR模板，进行qPCR，检测多个Ⅲ型干扰素(IFNL1、IFNL2和IFNL3)mRNA水平。qRT-PCR引物序列见表1。
表1、RT-PCR引物表
Figure BDA0002885919590000071
注1：IFNL2/3引物对可同时检测IFNL2和IFNL3 mRNA(编码200个氨基酸和196个氨基酸)水平；
注2：IFNL2v/3v引物对可同时检测因选择性拼接产生的较短的IFNL2和IFNL3变体mRNA(编码196个氨基酸)水平。
9.统计学分析
数据分析采用GraphPad Prism 7软件。实验数据以SD表示，n≥3。各组间用单因素方差分析进行比较，P<0.05表示有统计学差异。
实施例1、大肠杆菌表达的rhATG10S蛋白通过激活细胞的自噬活性降解病毒蛋白
发明人前期研究已经证明：细胞内源性ATG10S蛋白可以通过促进自噬溶酶体的形成来降解HCV病毒蛋白2-4。
在本发明中，我们检测了大肠杆菌异源表达的rhATG10S蛋白是否也具有内源性蛋白的功能。
实验中，发明人在分别含有5种病毒的11种病毒蛋白的细胞(HBV-X、HCV-CORE/NS5B、HIV-RT、ZIKA-NS5、SARS-CoV2-S/N/M/NSP5/NSP9/NSP12)(每个HepG2细胞转一个外源蛋白，共测试11种转化了不同外源病毒蛋白的HepG2细胞。)的培养基中添加由大肠杆菌表达的rhATG10S蛋白，采用Western Blotting检测病毒蛋白和自噬流相关蛋白的水平。
结果显示，给予rhATG10S蛋白后，11种病毒蛋白中有9种蛋白(HBV-X、HCV-CORE/NS5B、HIV-RT、ZIKA-NS5、SARS-CoV2病毒的S、NSP5、NSP9和NSP12蛋白)水平出现rhATG10S浓度依赖性降低，同时自噬流(LC3B-II升高)和自噬活性(P62降低)呈现rhATG10S浓度依赖性的增强(图2，图3)。而SARS-CoV2-N和SARS-CoV2-M两蛋白水平未变，其自噬流受阻(图3)。
此外，rhATG10S蛋白可以浓度依赖性地抑制HCV病毒粒子的复制。将蛋白带灰度扫描，并以beta-ACTIN为上样对照，分析rhATG10S蛋白(10μM)对这些蛋白的降解效果，依次为HBX＝HCV-NS5B>HIV-RT>ZIKA-NS5≈CoV2-NSP9>CoV2-S>HCV-CORE≈CoV2-NSP5≈CoV2-NSP12>CoV2-N＝CoV2-M＝Control(图4)。所测五种病毒的11种病毒蛋白中，有9种蛋白和HCV病毒粒子被自噬机制降解与rhATG10S蛋白相关。上述结果显示，异源表达的rhATG10S蛋 白具有通过激活自噬活性进而抗病毒的作用。
实施例2、大肠杆菌表达的ATG10S能够进入细胞核激活Ⅲ型干扰素家族基因表达
发明人前期研究已经证实：
(1)在含有HCV的细胞中内源性ATG10S蛋白可以作为一新的转录因子进入细胞核，激活Ⅲ型干扰素-2(IFNL2)基因启动子，促进IFNL2的高表达2；
(2)IFNL2蛋白可以直接识别并促进自噬泡与溶酶体的融合，增强自噬降解病毒蛋白的活性；
(3)IFNL2的下调则可阻止自噬溶酶体的形成和病毒降解2,4。
为了进一步了解异源细胞来源的rhATG10S抗病毒的机制，本发明中，我们检测了rhATG10S蛋白是否可以同样从细胞外进入细胞及其相关亚细胞定位区域。
1、在转染了HBV-X、HCV-CORE/NS5B、HIV-RT、ZIKA-NS5基因的细胞的培养基中分别加入大肠杆菌表达的rhATG10S蛋白或其同源蛋白rhATG10(也由大肠杆菌表达)后，进行核质分离和蛋白检测实验。结果证明，在分别含有这5种病毒蛋白的HepG2细胞中，大肠杆菌表达的rhATG10和rhATG10S两种蛋白均可进入真核细胞，但只有rhATG10S蛋白可进入细胞核(图5A-D)。ATG10蛋白定位于细胞质，呈分散性分布；而ATG10S蛋白有少量在细胞质中分布，大多数蛋白进入细胞核，定位在整个细胞核区内(图6A)。
2.1、进一步用DNA-Chip实验也验证了rhATG10S可与IFNL2启动子的直接结合，而rhATG10不与IFNL2启动子的结合(图6B)；qRT-PCR也显示rhATG10S可激活内源IFNL2的转录，而rhATG10无此功能(图6C)；Western blotting检测结果显示，rhATG10S过表达可明显提高IFNL2蛋白水平，而rhATG10过表达对IFNL2水平无影响(图6D)。这些结果表明，rhATG10S蛋白可以作为转录因子激活IFNL2基因的转录。
2.2、为进一步检测rhATG10S是否可激活更多的IFNL家族基因，将肺癌A549细胞分别转染4个SARS-CoV2基因(SARS-CoV2-S/NSP5/NSP9/NSP12)表达构件，用qRT-PCR检测Ⅲ型干扰素家族的IFNL1、IFNL2和IFNL3三个基因的转录水平。结果显示，在含有四种不同SARS-CoV2病毒蛋白的A549细胞中，rhATG10S均可浓度依赖性地促进这三种Ⅲ型干扰素基因的转录水平(图7)。上述结果提示，rhATG10S具有广义的激活Ⅲ型干扰素家族基因高表达的作用，即具有提高免疫力的潜在功能。
实施例3、ATG10S抗病毒机制
为进一步了解ATG10S抗病毒机制，我们基于HCV亚复制子细胞模型采用Co-IP实验检测了ATG10S与IFNL2蛋白和自噬流蛋白之间的相互作用。结果显示，
1、与模型组和模型组+ATG10相比，ATG10S可以明显增强自噬流和提高IFNL2蛋白水平；当用LAMP2(一种溶酶体膜蛋白)抗体免疫沉淀时，发现ATG10S促使了溶酶体与IFNL2、P62和LC3B(自噬泡标志)的结合，当用flag(在此代表flag-ATG10和flag-ATG10S蛋白)抗体免疫沉淀时，发现ATG10S促进了其与溶酶体和IFNL2蛋白的结合。而ATG10无此作用(图8)1。
2、采用HCV全病毒粒子感染实验，检测了IFNL2的抗全病毒的作用。以无感染细胞为对照，HCV粒子的感染可刺激宿主细胞产生一定水平的IFNL2；以HCV粒子感染组为对照，加入IFNL2后，HCV蛋白NS3、CORE和NS5A蛋白水平均明显降低，自噬流畅通；而当加入IFNL2的morphalino oligos(抑制IFNL2的翻译，相当于RNAi作用)时，3种病毒蛋白明显高于HCV粒子感染组，同时自噬流受阻(图9)4。说明，IFNL2蛋白在ATG10S抗病毒作用中发挥了重要作用。
综上，推测ATG10S抗病毒机制基于其两个功能：一是作为一种新的转录因子入核，识别并激活Ⅲ型干扰素素基因的高表达，后者发挥抗病毒作用；二是ATG10S在细胞质中与IFNL协同作用促成完整的自噬过程/自噬溶酶体的形成，导致病毒蛋白被溶酶体降解(图10)。
实施例4、基于激活ATG10的广谱抗病毒化合物的发现
以同时提高ATG10和ATG10S两蛋白水平为指标筛选化合物，筛选化合物库获得化合物isarubrolone C(结构式见式1)5。采用Western blotting检测该化合物降解HBV-X、HCV-CORE、HCV-NS5B、HIV-RT和ZIKA-NS5五种病毒蛋白的作用和自噬流情况。
结果显示，isarubrolone C(10μM)能明显增加含这五种病毒蛋白细胞的IFNL2、ATG10和ATG10S蛋白水平，并增强自噬活性，降低这五种病毒蛋白水平(图11)。
Figure BDA0002885919590000091
最后需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用于限定本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国医学科学院医药生物技术研究所
<120> 外源性ATG10S蛋白在制备抗病毒药物中的应用
<160> 3
<210> 1
<211> 567
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
catatggagg aagatgagtt catcggcgag aaaaccttcc agcgttactg cgcagaattc 60
atcaagcaca gccagcagat cggtgatagc tgggaatggc gtccatctaa agaggctttc 120
gaactgcctc tggatgattg tgaagtgatc gaaacggcag ctgcgtctga agtaatcaag 180
tacgaatacc acgtcctgta ctcctgctct taccaggtgc cagtactgta cttccgtgcg 240
tcttttctgg acggtcgtcc gctgactctg aaagacattt gggaaggtgt tcatgaatgc 300
tataaaatgc gcctgctgca gggtccgtgg gacactatta ctcaacagga acacccgatt 360
ctgggccaac cgtttttcgt actgcatccg tgtaaaacca acgaatttat gaccccggtt 420
ctgaaaaact cccagaaaat caacaaaaac gtcaactata tcacctcctg gctgagcatt 480
gtgggcccgg ttgttggcct gaacctgccg ctgtcttatg ccaaagcgac ctcccaggac 540
gaacgcaatg ttccgtaata actcgag 567
<210> 2
<211> 567
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
catatggaag aagacgaatt catcggtgaa aaaaccttcc agcgttactg cgctgaattc 60
atcaaacact ctcagcagat cggtgactct tgggaatggc gtccgtctaa agaagctttc 120
gaactgccgc tggacgactg cgaagttatc gaaaccgctg ctgcttctga agttatcaaa 180
tacgaatacc acgttctgta ctcttgctct taccaggttc cggttctgta cttccgtgct 240
tctttcctgg acggtcgtcc gctgaccctg aaagacatct gggaaggtgt tcacgaatgc 300
tacaaaatgc gtctgctgca gggtccgtgg gacaccatca cccagcagga acacccgatc 360
ctgggtcagc cgttcttcgt tctgcacccg tgcaaaacca acgaattcat gaccccggtt 420
ctgaaaaact ctcagaaaat caacaaaaac gttaactaca tcacctcttg gctgtctatc 480
gttggtccgg ttgttggtct gaacctgccg ctgtcttacg ctaaagctac ctctcaggac 540
gaacgtaacg ttccgtaata actcgag 567
<210> 3
<211> 184
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Glu Glu Asp Glu Phe Ile Gly Glu Lys Thr Phe Gln Arg Tyr Cys
1 5 10 15
Ala Glu Phe Ile Lys His Ser Gln Gln Ile Gly Asp Ser Trp Glu Trp
20 25 30
Arg Pro Ser Lys Glu Ala Phe Glu Leu Pro Leu Asp Asp Cys Glu Val
35 40 45
Ile Glu Thr Ala Ala Ala Ser Glu Val Ile Lys Tyr Glu Tyr His Val
50 55 60
Leu Tyr Ser Cys Ser Tyr Gln Val Pro Val Leu Tyr Phe Arg Ala Ser
65 70 75 80
Phe Leu Asp Gly Arg Pro Leu Thr Leu Lys Asp Ile Trp Glu Gly Val
85 90 95
His Glu Cys Tyr Lys Met Arg Leu Leu Gln Gly Pro Trp Asp Thr Ile
100 105 110
Thr Gln Gln Glu His Pro Ile Leu Gly Gln Pro Phe Phe Val Leu His
115 120 125
Pro Cys Lys Thr Asn Glu Phe Met Thr Pro Val Leu Lys Asn Ser Gln
130 135 140
Lys Ile Asn Lys Asn Val Asn Tyr Ile Thr Ser Trp Leu Ser Ile Val
145 150 155 160
Gly Pro Val Val Gly Leu Asn Leu Pro Leu Ser Tyr Ala Lys Ala Thr
165 170 175
Ser Gln Asp Glu Arg Asn Val Pro
180

Claims (7)

1.一种大肠杆菌表达的rhATG10S蛋白，所述的rhATG10S蛋白的密码子优化后的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，所述的rhATG10S蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。
2.包含权利要求1所述的rhATG10S蛋白的编码核苷酸的大肠杆菌表达载体，所述的载体为：pET-28a(+)，将SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列利用NdeI和XhoI位点插入到pET-28a(+)载体上，启动子为T7 promoter，后接lac operator、rbs，在His-tag与ATG10S起始密码子之间有thrombin酶切位点。
3.权利要求1所述的rhATG10S蛋白在制备抑制病毒的药物中的应用，所述的药物为：通过激活细胞自噬流，进而通过细胞自噬降解病毒蛋白的药物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的rhATG10S蛋白激活细胞自噬流的途径为：
(1)剂量依赖的提升LC3B-II蛋白量，
(2)剂量依赖的降低P62蛋白量，所述降低P62蛋白量为降低表达量和降解P62蛋白；
(3)作为转录因子进入细胞核激活IFNL家族基因的转录。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述的病毒包括：HIV、ZIKA、HBV、HCV、SARS-Cov2。
6.以ATG10S蛋白为靶点，筛选抗病毒药物的方法，其特征在于，
所述的筛选为筛选上调ATG10S蛋白表达量的化合物；
所述抗病毒药物为：通过激活细胞自噬流，进而通过细胞自噬降解病毒蛋白的药物；
优选的，所述的病毒包含：HIV、ZIKA、HBV、HCV、SARS-Cov2。
7.化合物isarubrolone C的如下应用：
(1)制备上调ATG10和ATG10S蛋白的表达的制剂；
(2)制备抗病毒的药物。
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