CN101437845A - 细胞凋亡的方法、基因和蛋白 - Google Patents

细胞凋亡的方法、基因和蛋白 Download PDF

Info

Publication number
CN101437845A
CN101437845A CNA2007800134894A CN200780013489A CN101437845A CN 101437845 A CN101437845 A CN 101437845A CN A2007800134894 A CNA2007800134894 A CN A2007800134894A CN 200780013489 A CN200780013489 A CN 200780013489A CN 101437845 A CN101437845 A CN 101437845A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polypeptide
seq
cell
polynucleotide
apoptosis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2007800134894A
Other languages
English (en)
Inventor
巴巴托什·乔杜里
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Morvus Technology Ltd
Original Assignee
Morvus Technology Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Morvus Technology Ltd filed Critical Morvus Technology Ltd
Publication of CN101437845A publication Critical patent/CN101437845A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4747—Apoptosis related proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A61K38/1716—Amyloid plaque core protein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/52—Isomerases (5)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/12—Ophthalmic agents for cataracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y502/00—Cis-trans-isomerases (5.2)
    • C12Y502/01—Cis-trans-Isomerases (5.2.1)
    • C12Y502/01008—Peptidylprolyl isomerase (5.2.1.8), i.e. cyclophilin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2510/00—Detection of programmed cell death, i.e. apoptosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Endocrinology (AREA)

Abstract

W303a酿酒酵母细胞，其含有在整合于LEU2染色体基因座的半乳糖诱导性启动子的调控下编码功能性Bax多肽的多核苷酸。试剂盒，包含所述酵母细胞和适宜将cDNA文库转化至所述酵母细胞的酵母质粒载体。所述酵母细胞在筛选多核苷酸的cDNA文库中的用途，所述多核苷酸是Bax介导的细胞凋亡的抑制剂或者编码Bax介导的细胞凋亡的抑制剂。基因和多肽，其抑制Bax介导的细胞凋亡，且其根据在所述酵母细胞中筛选的人海马cDNA文库进行鉴定。一种利用Bax介导的细胞凋亡的抑制剂在细胞中防止Bax介导的细胞凋亡的方法，所述的Bax介导的细胞凋亡的抑制剂根据在所述酵母细胞中筛选的人海马cDNA文库进行鉴定。利用根据在所述酵母细胞中筛选的人海马cDNA文库鉴定出的抗细胞凋亡多肽的抑制剂或拮抗剂在细胞中促进Bax介导的细胞凋亡的方法。

Description

细胞凋亡的方法、基因和蛋白
技术领域
本发明涉及调节细胞凋亡的基因和蛋白的鉴定。特别是，本发明涉及可用于鉴定细胞凋亡调节剂的方法中的酵母菌株、使用所述酵母菌株的筛选方法以及由此而鉴定的基因和蛋白。本发明还涉及鉴定的基因和蛋白的医疗用途。
背景技术
细胞凋亡调节蛋白的异常表达经常是引起多种疾病如癌症、风湿性关节炎、神经变性和心血管疾病的原因。许多证据都强烈表明，在各种神经变性中，细胞凋亡促进神经细胞的死亡。如在中风、脊髓损伤(spinal cord trauma)、头部损伤(head injury)、脊髓性肌萎缩(spinal muscular atrophy，SMA)、肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、阿尔茨海默氏病(Alzheimer′sdisease，AD)、帕金森氏病(Parkinson′s disease，PD)和亨廷顿病(Huntington′sdisease，HD)中所观察到的，细胞凋亡在人神经变性病中起重要作用。
在营养因子匮乏的情况下，促凋亡分子Bax是交感神经元和运动神经元死亡所必需的。而且，成年Bax缺失性转基因小鼠比其野生型副本具有更多的神经元。这些发现表明，在许多神经元集群(neuronal populations)中，Bax在发育过程中调控自然发生的细胞死亡。也观察到，在胚胎期(embryoniclife)，Bax是外周和CNS神经元自然发生死亡的关键调节剂(Davies，2000)。
在一定的实验条件下，已知的抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL可中和Bax的活性。设想当促凋亡蛋白的浓度超过抗凋亡蛋白的浓度时，会刺激凋亡。此类凋亡包括线粒体中的变化，其最终导致称为半胱天冬酶(caspases)的丝氨酸蛋白酶家族的激活。这导致死亡细胞从内部被消化，这是一种细胞凋亡标志(hallmark of apoptosis)(Cory等，2003)。
对调节细胞凋亡的基因和蛋白特别是负调控(即抑制)细胞凋亡的那些蛋白的更多了解，可以设计出新的治疗法，从而可防止细胞凋亡的不适当激活或细胞凋亡一旦开始便阻止其进行。发现这些抗细胞凋亡基因和蛋白将利于为以不适当的细胞凋亡为特征的疾病包括急性和慢性神经变性病研发新的实践性治疗方法。
细胞凋亡在神经变性中的作用
中风、AD、PD、HD、SMA和包括ALS的运动神经元病都与细胞凋亡有关。和包括细胞膨大、质膜裂解和大量细胞死亡的坏死不同，细胞凋亡包括伴随半胱天冬酶激活、氧化应激、钙稳态紊乱(perturbed calcium homeostasis)以及线粒体功能障碍(mitochondrial dysfunction)的个体细胞凋亡。一些生存信号(survival signals)通过抑制氧自由基和稳定钙稳态以及线粒体障碍，而免受细胞凋亡危害。在多种形式的细胞凋亡中，线粒体的表现是氧自由基产生的增加、线粒体膜上孔的开放以及细胞色素C的释放。作为此的证据，锰超氧化物歧化酶和环孢菌素A(cyclosporine A)，两者抑制氧化应激和膜孔形成，在一些实验模型中也防止神经元死亡(Pong，2003；Sullivan等，2005)。
B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)蛋白家族包括促和抗细胞凋亡成员两者。在神经元中，抗细胞凋亡成员包括Bcl-2和Bcl-xL；促细胞凋亡成员包括Bcl-2相关X蛋白(Bax)和Bcl相关死亡启动子(Bad)。例如，Bcl-2在细胞培养物和转基因小鼠中的过量表达可增加神经元对兴奋性毒性损伤、代谢损伤以及氧化损伤诱发的死亡的抗性。缺少Bax的神经元免遭细胞凋亡的危害。Bcl-2蛋白可通过与和线粒体有关的蛋白的相互作用来调控细胞死亡，导致跨线粒体膜的阴离子发生变化(Soane & Fiskum，2005；Kirkland等，2002)。
半胱天冬酶是丝氨酸蛋白酶。半胱天冬酶-8应答死亡受体(如Fas、p75神经营养素受体)而激活。这些上游的半胱天冬酶激活效应器半胱天冬酶(如半胱天冬酶-3)，且能不依赖线粒体的改变(mitochondrial alterations)而诱发细胞凋亡(Davies，2000)。这些效应器半胱天冬酶也应答线粒体的变化，和释放细胞色素C而激活，随后激活脱氧核糖核酸酶。半胱天冬酶也可切割各种蛋白，如AMPA、肌动蛋白等。Par-4的水平快速增加(Mundle，2005)。Par-4的羰基端亮氨酸拉链结构域对于促凋亡功能以及其与其他蛋白包括蛋白激酶C和Bcl-2的相互作用来说是必需的(Leroy等，2005)。
在细胞凋亡的初始阶段，死亡信号激活细胞内的级联反应，包括氧自由基和Ca2+水平的增加、产生Par-4以及促凋亡Bcl-2家族成员(Bax和Bad)移位至线粒体膜。某些半胱天冬酶(如半胱天冬酶-8)可在细胞死亡过程的早期，在线粒体变化之前或独立于线粒体的变化而起作用。
细胞凋亡的效应器阶段涉及线粒体Ca2+和氧自由基水平的增加、线粒体膜中通透性转运孔(permeability transition pores)的形成以及细胞色素C向细胞溶胶中的释放。细胞色素C与细胞凋亡蛋白酶激活因子1(Apaf-1)和半胱天冬酶-9形成复合体(Hajra & Liu，2004)。
在细胞凋亡的降解阶段，激活的半胱天冬酶-9激活半胱天冬酶-3，导致半胱天冬酶和其他酶底物分解；在质膜上发生变化(在细胞表面形成气泡并暴露磷脂酰丝氨酸)；通过巨噬细胞/小胶质细胞释放刺激细胞吞噬作用的信号；核染色质浓缩和断裂(Budihardjo等，1999)。
在许多情况下，线粒体变化在细胞死亡决定中可能非常关键。
已知在神经元中触发细胞凋亡的信号包括：
[1]缺少神经营养素的支持，Bax是丧失了NGF的交感神经元的凋亡死亡所需的。在NGF剥夺后(NGF withdrawal)，Bax从细胞质移位至这些细胞的线粒体并诱导细胞色素C的释放。NGF从交感神经元中退出导致线粒体衍生的活性氧分子(reactive oxygen species，ROS)增加。抑制这些ROS可抑制细胞凋亡。Bax缺失可阻断死亡，防止ROS爆发，因此，Bax位于增加的ROS的上游(Heaton等，2003)。
[2]谷氨酸受体的过量激活，如，通过钙流入或兴奋性毒性(Johnston，2005)。
[3]氧化应激的增加，如自由基(如过氧化物阳离子自由基、羟基自由基)破坏细胞的脂质、蛋白和核酸(Halliwell & Whiteman，2004)。
[4]代谢应激，如在中风后或者老化期间，ATP产生所需的葡萄糖、氧和其他分子减少(Poon等，2004)。
[5]环境毒素(Valko等，2005；Savolainen等，1998)。
已知是抗凋亡触发剂的因子包括：
[1]端粒酶(tolemerase)由催化性反转录酶亚单位(TERT)，RNA模板和调节蛋白组成。端粒酶活性在发育过程中增加，随后负调节。在研究神经元死亡的发育和神经变性病的实验模型中，端粒酶活性和TERT与神经元对细胞凋亡抗性的增加相关。TERT在神经元中的抗凋亡作用，在线粒体变换和半胱天冬酶激活前的早期步骤会显现出(Sung等，2005)。
[2]应激可诱导神经营养因子和热休克蛋白的表达。神经营养因子反过来以自分泌或旁分泌的方式来激活细胞表面受体介导的激酶信号通路，从而诱导编码蛋白如抗氧化酶的存活促进基因的表达。神经营养因子(脑衍生的神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF))、神经生长因子(nervegrowth factor，NGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)以及细胞因子(肿瘤坏死因子(TNF)-α、纤毛神经营养因子(ciliaryneurotrophic factor，CNTF)以及白血病抑制因子(leukaemia inhibitory factor，LIF))在神经元死亡的实验模型中可防止神经元死亡(Zweifel等，2005)。
[3]热休克蛋白是许多蛋白的伴侣蛋白，维持蛋白的稳定性。它们也直接与半胱天冬酶相互作用，抑制半胱天冬酶的激活(Sreedhar & Csermely，2004)。
[4]钙不但促进神经元死亡也激活4种不同的存活通路(Distelhorst &Shore，2004)。
(a)通过钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激活蛋白激酶B(Yano等，2005；Chong等，2005)。
(b)调节细胞对应激的应答，通过环式AMP应答元件结合蛋白(cyclic-AMP response element-binding protein，CREB)激活转录，其可在细胞死亡发育模型中促进神经元存活(Yano等，2005；Rouaux等，2004)。
(c)激活肌动蛋白切断蛋白凝溶胶蛋白(gelsolin)，其诱导肌动蛋白的解聚作用，导致通过膜NMDA受体和电压依赖性钙通道抑制钙流入。这可通过与NMDA受体和通道蛋白相互作用的调节性肌动蛋白-结合蛋白而发生。
(d)钙和分泌性淀粉样前体蛋白α，其增加环式GMP产生，可诱导钾通道和转录因子NF-κB的激活，并增加神经元对激动性毒性细胞凋亡的抗性(Cardoso & Oliveira，2003)。
很难在遭受神经变性病的患者大脑中展示细胞凋亡。细胞凋亡通常快速发生(几小时)，因此在任一时间点，很少有细胞能表现典型特征。因此，支持细胞凋亡的许多证据都来自动物和细胞培养模型。
在AD中，在海马中观察到早期变化，以后也在皮质中观察到。在此有一些钙介导的蛋白水解和氧化应激的一些证据。DNA损伤和半胱天冬酶活性增加，和细胞凋亡相关基因如Bcl-2家族成员、Par-4和DNA损伤应答基因表达变化已发现于患有AD的患者大脑中与淀粉样沉淀物(amyloid deposits)有关的神经元内。对来自AD患者大脑组织样品的基因表达谱进行分析表明，称为NCKAPI(NCK相关蛋白1)的抗凋亡基因的表达显著降低(Yamamoto &Behl，2001)。
已显示，淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)、Presenilin 1(PS1)和Presenilin 2(PS2)基因中的突变导致AD早期发作。β分泌酶(BACE)切割APP导致40-42肽Aβ以及称为sAPPβ的分泌产物的产生。它的发生几率仅为5-10％。通常α分泌酶(金属蛋白酶的ADAMs家族)切割APP，但不产生Aβ，且分泌神经突促sAPPα(neurite promoting sAPPα)。在培养的神经元中Aβ暴露可直接诱发细胞凋亡，并增强对氧化应激引起的死亡的脆弱性。Aβ可能通过膜脂质过氧化反应来敏化神经元。这会损害ATP酶、葡萄糖和谷氨酸转运蛋白的功能，导致膜去极化、ATP损耗、过量钙流入以及线粒体功能障碍。抑制脂质过氧化反应的抗氧化剂和稳定细胞钙体内平衡的药剂可保护神经元免受Aβ诱导的细胞凋亡。神经营养因子和细胞因子也可抵御Aβ。APP、PS1以及PS2中的突变都可引起Aβ产生的增加，并且在某些情况下，也引起更具毒性的形式的Aβ42的增加。
APP也是半胱天冬酶-3的底物。半胱天冬酶介导的APP切割可释放称为C31的羰基端肽，其是细胞凋亡的有效诱导剂。当突变体PS1在培养的细胞中以及在转基因和基因敲入(knock-in)小鼠中表达时，神经元对各种刺激(insults)包括营养因子剥夺、暴露给Aβ或谷氨酸以及能量丧失诱发的死亡，都变得敏感。突变体PS1在Par-4产生、线粒体功能障碍和半胱天冬酶激活之前的早期阶段起作用。当神经元暴露于可能的破坏性氧化和代谢刺激中时，内质网中的钙稳态会受到破坏，而使更多的钙得到释放。抑制ER钙释放的试剂包括丹曲洛林(dantrolene)和xestospongin，可抵消突变的作用。
在PD中，多巴胺神经元在脑黑质(substantia nigra)中退化。环境和遗传因素可使多巴胺神经元对年龄相关的氧化应激和能量不足的增加变得敏化。环境毒素已经说明——暴露于毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢嘧啶(MPTP)的猴子和人显示出帕金森氏病样症状。患有PD的患者大脑组织在多巴胺神经元的死亡中表现出了细胞凋亡相关的DNA损坏和基因激活。在脑黑质的多巴胺神经元死亡之前，多巴胺神经元中的Par-4水平增加，且Par-4表达的抑制可保护多巴胺神经元免于死亡。在PD模型中，半胱天冬酶-1抑制剂、抑制大分子合成的药剂以及神经营养因子如神经胶质细胞衍生的神经营养因子(glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF)可保护多巴胺神经元。在很少的情况下，α突触核蛋白(α-synuclein，其是Lewy体中的组分)中的突变会引起帕金森氏病病例。在培养细胞终突变的α突触核蛋白的表达会促进细胞凋亡。通常，帕金蛋白(Parkin)和遍在蛋白参与通过细胞凋亡来移除突触核蛋白。如果此过程发生错误，如出现缺陷性帕金蛋白基因，则不会发生细胞凋亡。如果在这些细胞中未除去突触核蛋白，则其逐渐累积且对多巴胺有毒。在此情况下，突触核蛋白在Lewy体内发生聚集。
一些患有PD的患者缺乏线粒体复合体1，这就造成或利于细胞氧化应激的增加。鱼藤酮引起的慢性复合体1抑制会在大鼠中诱发PD的特征，包括选择性的黑质纹状体的多巴胺能退化和具有α突触核蛋白阳性内含物的Lewy体。在鱼藤酮诱导的多巴胺能SH-SY5Y细胞的细胞死亡中，鱼藤酮诱发Bad去磷酸化，而没有改变Bad蛋白的量。鱼藤酮也增加了显示形态变化的细胞中α突触核蛋白的量。鱼藤酮引起BAD的减少和与14-3-3蛋白结合的α突触核蛋白的增加。由神经钙调蛋白引起的去磷酸化会激活Bad。神经钙调蛋白(calcineurin)抑制剂他克莫司(Tacrolimus)(FK506)抑制鱼藤酮诱导的Bad去磷酸化和细胞凋亡。抑制在Bad下游起作用的半胱天冬酶-9可完全抑制鱼藤酮诱导的细胞凋亡。
MPP+抑制线粒体复合体1和顺乌头酸酶活性，从而导致增加H2O2产生、TfR表达以及α突触核蛋白表达和聚集。过量表达α突触核蛋白的细胞加剧MPP+的毒性，而反义α突触核蛋白处理会在成神经细胞瘤细胞中完全中止MPP+诱导的细胞凋亡，而不影响氧化剂的产生。MPP+处理的细胞中α突触核蛋白细胞毒性作用的增加归因于促分裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和蛋白酶体功能的抑制(Kalivendi等，2004)。
作为研究细胞凋亡工具的酵母
如上文所述，仅有少数几种已知的细胞凋亡调节剂，其中一些促进细胞死亡而其他的则防止细胞死亡。在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达的人促凋亡蛋白可以以线粒体不依赖或依赖的方式抑制细胞的生长，并且在功能性线粒体存在时，可引起细胞死亡。在垂死的酵母细胞中表现出了许多哺乳动物细胞凋亡的标志，且已知的抗凋亡蛋白可克服线粒体依赖的酵母死亡。因此，细胞凋亡调节剂的酵母筛选系统可以作为有用的模拟人体系统(human system)，且可调查不能按照哺乳动物试验系统来进行处理的领域(如不依赖线粒体的生长抑制通路)。
在GB 2 326 413和Greenhalf等(1996)中，发明人事先描述了在酿酒酵母菌株HT444中筛选假定的细胞凋亡抑制剂的cDNA的方法。将pRS305酵母整合载体，其含有在GAL10启动子、SUC2转录终止子和LEU2选择性标记基因调控下的编码人Bax蛋白的多核苷酸，整合入HT444细胞，获得酵母菌株HT444_bax。在半乳糖存在时，人Bax蛋白的表达终止了HT444_bax细胞的生长并将其杀死。当HT444_bax细胞用含有编码bcl-2和bcl-xL的多核苷酸的酵母质粒转化时，这些蛋白的表达会在Bax-表达细胞中修复酵母细胞的生长。利用这种系统，筛选人小脑cDNA文库。
Greenhalf等(1996)证明了，尽管Bax诱导总能在任何情况下防止酵母细胞生长，但其不能在“小(petite)”细胞中引起死亡，所述“小”细胞因为缺少功能性线粒体而不能呼吸。这表明，Bax介导的生长抑制和细胞死亡与线粒体功能和呼吸有关。与在缺乏线粒体时候不能存活的哺乳动物细胞不同，酵母有可行替代方式——发酵途径。在酵母中半乳糖是没有葡萄糖有效的呼吸抑制剂。因此，在酵母中在半乳糖诱导性启动子的指导下表达Bax会导致呼吸作用，且比在葡萄糖诱导性启动子的指导下的Bax表达导致意义更深远的细胞死亡(当酵母细胞进行发酵时)。
Manon等(1997)报道了Bax诱导的生长抑制与线粒体细胞色素C氧化酶水平的降低和细胞色素C从线粒体向细胞溶胶的释放增加有关。
后来，Ligr等(1998)证实Bax触发细胞中的细胞凋亡变化，所述变化与哺乳动物细胞中的细胞凋亡变化非常相似。
Xu & Reed(1998)用功能性酵母筛选系统鉴定了哺乳动物细胞凋亡的抑制剂，Bax抑制剂1(BI-1)，所述系统利用Bax在半乳糖诱导性启动子的指导下在酵母菌株BF264-15Dau中表达。
US 2005/0148062描述了在酿酒酵母菌株INVSc1中，表达小鼠Bax-α蛋白的Ty转座子载体用于分析Bax-诱导性细胞死亡中不同基因表达的用途。
Matsuyama等(1999)在1999年回顾了酵母作为细胞凋亡研究工具的用途，Priault等(2003)回顾了酵母在细胞死亡中作为研究Bax/线粒体相互作用的工具。
发明内容
本发明人如今研发了酿酒酵母菌株W303baxleu，其在鉴定调节细胞凋亡的基因和蛋白的功能性筛选系统中特别有用。如下文所述，酵母菌株W303baxleu在筛选细胞凋亡的调节剂方面，具有优于以前报道的任何菌株的特性。特别是，利用W303baxleu，假阳性率惊人地低。实际上，本发明人发现与另外的等同体W303菌株相比，其在ADE2、HIS3或TRP1基因座中已经整合了Bax表达盒，酵母菌株W303baxleu具有非常低的假阳性率。因此，预料，利用W303baxleu将能更快速且费用较低地鉴定出可能的治疗靶标。实际上，利用W303baxleu，本发明人已经鉴定出许多可能的新细胞凋亡调节剂(参阅表1)，本发明人已经独立地证实，其中的一些调节剂在哺乳动物细胞中与Bax介导的细胞凋亡抑制剂具有相同的活性。
第一方面，本发明提供了酿酒酵母细胞，其具有基因型MAT-a、ade2-1、trp1-1、leu2-3、leu2-112、his3-11、his3-15、ura3-1和can1-100，且其含有在整合于LEU2染色体基因座的半乳糖诱导性启动子的调控下编码功能性Bax多肽的多核苷酸。
酿酒酵母CAN1基因是精氨酸透性酶。can1-100突变在具有常规leu、ura或ade标记的菌株中通常是沉默突变，因此不可能知道can1-100突变存在于此类菌株中。然而，can1-100突变在His突变体细胞(如W303a)中会引起一个问题。如果培养于外源性组氨酸中，则这些细胞具有缓慢的生长表型。这种缓慢的生长表型在存在外源性组氨酸时(其在菌株如His3突变体中对于生长绝对是必需的)有助于筛选且排除假阳性。在不期望受理论束缚的情况下，本发明人认为，携带can1-100突变以及人BAX完整拷贝(优选，利用酵母偏爱密码子合成的，且任选地在C末端处的c-myc标签)的其他His突变体酵母菌株，有助于在Bax-介导的细胞凋亡筛选中排除假阳性，特别是在也是Mat-a的菌株中(与Mat-α相反)。
第二方面，本发明提供了酿酒酵母细胞，其具有基因型MAT-a，ade2-1，trp1-1，leu2-3，leu2-112，his3-11，his3-15，ura3-1，can1-100，且含有酵母整合质粒，所述质粒含有在半乳糖诱导启动子的调控下编码功能性Bax多肽的多核苷酸，且其适宜在LEU2染色体基因座处整合。
所谓“适宜在LEU2染色体基因座处整合”，我们意指设计和构建用于在LEU2基因座处靶向整合的质粒。
优选，酿酒酵母细胞是W303 MATa(也称为W303-1A和W303a)。W303是熟知的酵母菌株。该菌株通过用含有HO的质粒转化W301-18A(Rothstein，1983，Meth.Enzymol.101：202-211)，而制备成二倍体。二倍体分裂获得等基因的MATa(W303-1A)和MATalpha(W303-1B)菌株(Thomas & Rothstein，1989，Cell 56：619-630)。
如http://www.yeastgenome.org/straintable.shtml#W303所述，W303具有下列基因型：leu2-3，112；trp1-1；can1-100；ura3-1；ade2-1；his3-11，15；[phi+]。W303-1A具有ybp1-1突变(I7L，F328V，K343E，N571D)，该突变完全破坏了Ybp1p功能，导致对氧化应激的敏感性增加(Veal等，2003)。W303也包含bud4突变，该突变导致单倍体以轴向和两极发芽方式的混合形式发芽(Voth，等，2005)。另外，最初的W303菌株包含rad5-535等位基因(在位置535，G变成R；参阅Fan等，1996，Genetics 142：749)。Bud4和Rad5是细胞分裂周期相关基因。
有关W303的更详细信息可从http://www.yeastgenome.org/community/W303.html获得，将其全部内容以参考的方式并入本文。
功能性人Bax多肽的氨基酸序列列于SEQ ID No：3(图61)中。其他适宜的功能性Bax多肽在本领域内是熟知的，包括描述于GB 2 326 413、Greenhalf等(1996)、Manon等(1997)、Ligr等(1998)以及Xu & Reed(1998)(同上)中的那些。
功能性Bax多肽可以是人Bax序列，或其促凋亡片段或变体。Bax也称为BCL2-相关的X蛋白(BCL2-associated X protein)。
就“功能性”Bax多肽而言，我们意指能在下文所述的实验条件下在酵母细胞中诱导细胞死亡的多肽。适宜的酵母细胞包括W303细胞。
如果功能性Bax多肽在下文所述的实验条件下也能在哺乳动物细胞中诱导细胞死亡，则其是优选的。适宜的哺乳动物细胞是HEK293、COS-1和SH-SY5Y细胞。在大量哺乳动物细胞系中可证实在酵母中观察的结果；选择HEK293细胞，是因为据称它们具有神经元特征。
就“功能性Bax多肽”而言，其包括人Bax基因的基因产物以及其天然存在的变体。人Baxβ转录物变体的mRNA序列——其编码最长的同种型(β)，可见于登录号NM_004324中，且同种型β(isoform β)的相应多肽序列可见于登录号NP_004315中。
与变体β相比，人Baxα转录物变体含有不同的3’编码区和3’URT。与β同种型相比，其编码具有更短且不同C末端的同种型(α)。α变体的mRNA序列，其编码α同种型，见于登录号NM_138761中，且α同种型的相应多肽序列见于登录号NP_620116中。人Bax同种型α与同种型Ψ非常相似。
如果功能性Bax多肽是已知在大多数细胞中存在的α同种型，则其是优选的。Bax α型在杀死细胞方面比β和Δ型更有效。
与变体β相比，人Bax γ转录变体在编码区缺少导致翻译移码的片段。与同种型β相比，所得的γ同种型具有更短且不同的C末端。γ变体的mRNA序列，其编码γ同种型，可见于登录号NM_138762中，且γ同种型的相应多肽序列可见于登录号NP_620117中。
与变体β相比，人Bax Δ转录变体在编码区缺少一片段，且包含不同的3’编码区和3’UTR。翻译依然保留在框内并产生这样一种同种型(Δ)，与同种型β相比，该同种型丢失一内部片段并具有更短且不同的C末端。Δ变体的mRNA序列，其编码Δ同种型，可见于登录号No NM_138763中，且同种型Δ的相应多肽序列可见于登录号No NP_620118中。
与变体β相比，人Bax ε转录变体在编码区含有额外的片段，且具有不同的3’编码区和3’UTR。该额外的片段引起翻译移码，因而导致与同种型β相比具有更短且不同的C末端的同种型(ε)。ε变体的mRNA序列，其编码ε同种型，可见于登陆号NM_138764中，且同种型ε的相应多肽序列可见于登录号NP_620119中。
与变体β相比，人Bax σ转录物变体含有不同的3’编码区和3’UTR。它编码与同种型β相比具有更短且不同C末端的同种型(σ)。σ变体的mRNA序列，其编码σ同种型，可见于登录号NM_138765中，且同种型σ的相应多肽序列可见于登录号NP_620120中。
编码功能性Bax的多核苷酸通常由重组DNA技术制备。适宜克隆、操作、修饰和表达核酸以及纯化表达的蛋白的技术在本领域内是熟知的，并且描述于例如Sambrook等(2001)“Molecular Cloning，a Laboratory Manual”，3rdedition，Sambrook等(编辑)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，USA中。
功能性Bax多肽不必是全长多肽，也不必与野生型Bax多肽具有相同的序列，只要其保留了至少一些野生型Bax的促凋亡活性，即，功能性Bax多肽在下文所述的条件下必须保留至少一些野生型Bax促进凋亡性细胞死亡或抑制细胞生长的能力。
因此，功能性Bax多肽包括全长Bax多肽的衍生物，其保留了至少一些野生型Bax的促凋亡活性。适宜的衍生物包括保留了至少一些野生型Bax促凋亡活性的全长Bax多肽的变体或片段，或全长的多肽的变体或片段。
所谓人Bax的“片段”，我们意指促进凋亡性细胞死亡的多肽的任何部分。这可通过本文所述的方法进行试验，且优选在W303细胞中进行试验。通常，片段具有至少30％的SEQ ID NO：3(列于图61中)的功能性Bax多肽的促凋亡活性。更优选，片段具有至少50％、优选至少70％且更优选至少90％的SEQ ID NO：3的功能性Bax多肽的促凋亡活性。最优选，片段具有100％或更多的SEQ ID NO：3的功能性Bax多肽的促凋亡活性。
全长Bax的变体或其片段变体包括在一个或多个位置处的氨基酸插入、缺失和取代，无论保守或非保守。所谓“保守取代”，意指组合如Gly、Ala；Val、Ile、Leu；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；和Phe，Tyr。此类修饰利用如Sambrook等(2001)(同上)中所述的蛋白质工程和定点诱变的方法来实现。优选，与全长人Bax或各自Bax片段相比，变体Bax或变体Bax片段保留了至少90％的序列同一性。更优选，与全长Bax或各自Bax片段相比，变体Bax或变体Bax片段具有至少91％、92％、93％、94％或95％的序列同一性，且仍然更优选至少96％、97％、98％或99％的序列同一性。优选变体Bax或变体Bax片段保留了至少30％的SEQ ID NO：3的功能性Bax多肽的促凋亡活性。如果变体Bax或变体Bax片段具有至少50％、优选至少70％、更优选至少90％的SEQ ID NO：3的功能性Bax多肽的促凋亡活性，则其是更优选的。最优选，变体Bax或变体Bax片段具有100％或更多的SEQID NO：3(列于图61中)的功能性Bax多肽的促凋亡活性。
应该理解，来自哺乳动物物种而非人的功能性Bax多核苷酸和多肽可用于本发明中，而且还可以构建全长Bax多肽的片段或变体。
优选，如本领域所熟知的(Bennetzen & Hall，1982)，为酵母对编码功能性Bax多肽的多核苷酸的密码子进行优化。SEQ ID NO：2是编码功能性Bax多肽的多核苷酸的实例，其具有为酵母而优化的密码子，且其编码的功能性Bax多肽显示于SEQ ID NO：3(两条序列都列于图61中)中。
半乳糖诱导的启动子可以是GAL1或GAL10启动子(Johnston，1987)。
优选，用SUC2转录终止子序列终止编码酿酒酵母细胞中功能性Bax多肽的多核苷酸(Reeder & Lang，1994)。其他适宜的转录终止子在本领域内是已知的，包括PHO5和ADH1。
出于本发明的目的，在半乳糖存在时，功能性Bax多肽在酿酒酵母细胞中的表达优选导致细胞死亡。但，对于小酵母细胞来说，功能性Bax多肽的表达导致细胞生长的抑制而不是死亡。
在本发明优选的实施方案中，酿酒酵母细胞是如下文所述的菌株W303baxleu。W303 MAT-a菌株用于产生W303baxleu。W303MAT-a((W303-1A))目录号为YSC 1058可从开放系统(Open Systems)获得。
如下文所详细讨论的，当功能性Bax多肽在半乳糖存在的情况下在本发明第一方面或第二方面的酿酒酵母细胞内表达时，功能性Bax多肽的凋亡作用事实上足以抑制所有细胞的生长并杀死它们。因此，这些酵母细胞在筛选Bax介导的细胞凋亡抑制剂的方法中特别有用，因为这些酵母菌株的背景即假阳性水平非常低(参阅图53)。在此筛选方法中，将多个多核苷酸，通常是cDNA文库，引入酵母细胞，诱导多核苷酸的表达。仅含有推断的细胞凋亡抑制剂的细胞能表现出生长，且表现出生长的每一个细胞都含有推断的细胞凋亡抑制剂。含有在半乳糖存在下负调节由GAL1/GAL10启动子介导的转录蛋白的细胞是假阳性。其他可能的假阳性包括含有BAX的自发“非致死”突变体的细胞(其是不可能的)，以及在具体的基因中含有突变的细胞，这些突变使所述细胞对Bax的致死作用有抗性(如酵母UTH1基因中的突变使Bax的作用在酵母细胞中无效)。
因此，本发明提供了试剂盒，其包含本发明第一方面或第二方面的酵母细胞，以及用于进行筛选Bax介导的细胞凋亡抑制剂方法的其他组分。
通常，试剂盒包含适宜将多核苷酸文库转化至酵母细胞的酵母质粒载体。优选，酵母质粒载体在诱导启动子的调控下适宜表达来自文库的多核苷酸。适宜的酵母质粒载体包括pYES2(Stratagene)。可以理解，可使用本领域中已知的任何2-micron(多拷贝)或着丝粒(单拷贝)酵母穿梭载体(yeast shuttlevector)。
试剂盒还可包含诱导来自文库的多核苷酸在酵母细胞中表达的试剂。许多适宜的可诱导启动子以及它们对应的诱导剂在酵母遗传学领域内是已知的。例如，四环素诱导启动子、甲硫氨酸诱导启动子和半乳糖诱导启动子在本领域内都是熟知的。其他适宜的启动子包括ADH2乙醇脱氢酶启动子(在葡萄糖中受到抑制，当葡萄糖耗尽时得以诱导，并产生酒精)，以及CUP1金属硫蛋白启动子(存在Cu2+、Zn2+时，受到诱导)。
如果诱导多核苷酸在酵母细胞中表达的试剂是半乳糖，则其是优选的。在任何情况下，在试剂盒中包含半乳糖是有利的，因为必需要诱导功能性Bax多肽的表达。
试剂盒还可包含实施多核苷酸文库筛选方法的说明书，所述文库通常是Bax介导的细胞凋亡抑制剂的cDNA文库。
如下文实施例中所述，本发明人利用本发明第一方面定义的酵母细胞筛选Bax介导的细胞凋亡的抑制剂。在酵母中编码功能性Bax多肽的多核苷酸受半乳糖诱导的启动子的调控，其在葡萄糖存在时是关闭的(OFF)，但存在半乳糖时是打开的(ON)。因此，功能性Bax多肽仅在存在半乳糖时表达，且在半乳糖存在时杀死所有的酵母细胞。作为此筛选方法的对照，已证实，Bxl-2和Bcl-xL与功能性Bax多肽的共表达，在含有半乳糖作为唯一碳源的培养基中，防止Bax诱导的细胞死亡。半乳糖允许呼吸(即线粒体介导的)生长，而葡萄糖则允许发酵和呼吸生长。因此，在筛选中营救Bax介导的死亡的已鉴定的基因/蛋白是中止经由线粒体的死亡的那些基因/蛋白。换句话说，认为这些已鉴定的基因/蛋白可以保护线粒体的功能。
在酵母表达载体中扩增人海马cDNA文库，获得1.2×106个单个克隆，并转化至W303baxleu酵母细胞中，所述酵母细胞包含完整的Bax盒且不产生“背景”(参阅图53)。在为避免在葡萄糖中生长而含有半乳糖作为唯一碳源的平板上，直接筛选转化体，随后影印培养(replica-plated)。(影印培养很重要，因为直接依赖半乳糖生长的细胞应该是含有目的质粒来源的抗凋亡基因的细胞)。筛选3.8×1010个单个酵母转化体(根据在对照试验中在葡萄糖平板上获得的转化体进行计算，以测定每次转化中获得的细胞数量)。从在半乳糖中，即在存在功能性Bax多肽的情况下，在生长的细胞内分离质粒。将纯化的质粒再转化至含有Bax的酵母细胞中，并再次检查对细胞死亡的预防。将在酵母中明确阻止Bax介导的细胞死亡且产生了目的抗凋亡多核苷酸的那些质粒的多核苷酸插入体进行测序。
如实施例中所述，对人海马cDNA文库实施这种筛选方法鉴定出了在酵母中抑制Bax介导的细胞凋亡和细胞生长的16个多核苷酸(对应于基因或部分基因)。因此在鉴定的16个多核苷酸中，一个是Bcl-2A1，为Bcl-2的同源物，Bcl-2为已知的细胞凋亡抑制剂。作为筛选方法的结果，Bcl-2A1的鉴定完全是原理验证(proof-of-principle)，该方法高度适合且有效地筛选是或编码Bax介导的细胞凋亡抑制剂的多核苷酸。
因此第四方面，本发明提供了筛选多核苷酸的方法，所述多核苷酸是或编码Bax介导的细胞凋亡抑制剂，所述方法包括：
(a)在酵母质粒载体中提供多核苷酸的文库；
(b)将多核苷酸文库转化至本发明第一或第二方面定义的酵母细胞；
(c)将转化的酵母在酵母质粒载体中允许功能性Bax多肽和多核苷酸表达的条件下平板接种；以及
(d)鉴定在步骤(c)的条件下生长的一个或多个酵母菌落。
其中酵母菌落的生长表示酵母质粒载体中的多核苷酸是或编码Bax介导的细胞凋亡的抑制剂。
优选，多核苷酸文库是cDNA文库，其可从如人脑组织、与糖尿病有关的组织或细胞、与风湿性关节炎有关的组织，或从细胞系等来源中产生。cDNA文库也可从癌组织、心脏组织、肌肉组织或病毒或细菌基因组中产生。
通常，酵母质粒载体中的多核苷酸文库受诱导启动子的调控。适宜地，诱导启动子可以是四环素诱导启动子、甲硫氨酸诱导启动子、半乳糖诱导启动子、ADH2乙醇脱氢酶启动子(存在葡萄糖时受到抑制，当葡萄糖耗尽时得以诱导并产生酒精)，或CUP1金属硫蛋白启动子(存在Cu2+，、Zn2+时得以诱导)。通常，半乳糖诱导启动子是GAL1或GAL10。
许多适宜的酵母质粒载体在本领域内是已知的，包括pYES2(Stratagene)和本领域中已知的其他2-micron(多拷贝)或着丝粒(单拷贝)酵母穿梭载体。
如果转化步骤(b)是高效转化则其是优选的。
通常，平板接种步骤(c)包括，在一种已知的标准酵母生长培养基中、在30℃下、以半乳糖作为唯一的碳源，将平板接种的酵母细胞温育至少72小时可能最多7天。显然，如果酵母质粒载体中的多核苷酸受除半乳糖之外的试剂诱导的启动子的调控，则也包括该诱导试剂。
在可选择的实施方案中，Bax多肽可受ADH2启动子而不是GLA启动子的调控，例如，为了筛选出能中止小细胞(其可在没有功能性线粒体的情况下生长)中Bax介导的细胞生长抑制的蛋白。
如同对酵母遗传学领域技术人员是显然易见的，所述方法可以进一步包括一种或多种下列步骤，通常所有三种步骤：
(e)从步骤(d)中鉴定的酵母菌落中分离酵母细胞；
(f)从步骤(d)中鉴定的酵母菌落中或从步骤(e)中分离的酵母细胞中分离酵母质粒载体；以及
(g)对来自步骤(f)中分离的酵母质粒载体的多核苷酸(即插入物)进行测序。
如下文实施例中所述的，所述方法通常还包括步骤：
(h)再次对来自存在于步骤(d)鉴定的酵母菌落中的质粒载体的多核苷酸，或被所述多核苷酸编码的多肽进行在细胞凋亡模型中抑制Bax介导的细胞凋亡的能力检测。
另外或可选地，所述方法还包括步骤：
(i)修饰来自存在于步骤(d)中鉴定的酵母菌落中的质粒载体的多核苷酸，并检测该修饰的多核苷酸，或被所述修饰的多核苷酸编码的多肽在细胞凋亡模型中抑制Bax介导的细胞凋亡的能力。
进一步，所述方法还可以包含步骤：
(j)基于步骤(g)中获得的序列数据，鉴定来自步骤(d)鉴定的酵母菌落中的多核苷酸，并检测对应于鉴定的多核苷酸的多核苷酸，或被所述对应多核苷酸编码的多肽在细胞凋亡模型中抑制Bax介导的细胞凋亡的能力。
因为从步骤(d)鉴定的酵母菌落中获得的多核苷酸可能并不编码全长的天然存在的多肽，因此，对于与鉴定的多核苷酸对应的多核苷酸，我们则包括了鉴定的多核苷酸的全长版本，其编码全长的天然存在的多肽。同时，因为对应于鉴定的多核苷酸的基因可能会编码几种多肽同种型，对于与鉴定的多核苷酸对应的多核苷酸，我们包括编码天然存在的多肽的不同同种型的多核苷酸。另外，因为鉴定的多核苷酸可能具有不同于天然存在的多核苷酸序列的序列，因此，通常，如果cDNA文库是从细胞系中获得的，对于与鉴定的多核苷酸对应的多核苷酸，我们包括天然存在的多核苷酸。另外，由于多核苷酸可能分离自非人cDNA文库，对于与鉴定的多核苷酸对应的多核苷酸，我们包括来自另一物种的鉴定的多核苷酸的同源物，优选人同源物。
细胞凋亡的适宜模型包括细胞凋亡的酵母细胞模型、哺乳动物细胞模型和体内模型。检验多核苷酸是否在细胞内具有抑制Bax介导的细胞凋亡能力的酵母模型可以是上文本发明第一方面所述的一个模型，如W303baxleu。检验多核苷酸是否在细胞内具有抑制Bax介导的细胞凋亡能力的哺乳动物模型可以是几乎任何哺乳动物细胞或细胞系。如下文实施例中所述的，选择HEK293细胞系，因为预料来自海马cDNA文库的已鉴定抗凋亡基因在神经元细胞中有效，而且HEK293还具有一些神经元特征(至少，其通常用作难以利用的典型神经元细胞的替代物)。
例如，可用携带编码指示分子(indicator molecule)的报告基因的指示质粒(indicator plamsid)转染细胞，并通过检测表达的指示分子来测量细胞死亡或凋亡的程度。如，根据制造商的建议，在用表达大肠杆菌β半乳糖苷酶指示剂的指示质粒转染的细胞中，细胞凋亡的程度可通过β半乳糖苷酶ELISA(Boehringer Mannheim)来进行测定。凋亡活性的程度也可通过将细胞用X-gal染色后，在显微镜下，对表达β半乳糖苷酶的蓝色细胞进行可视化计数来测定。作为另一个实例，在用表达绿色荧光蛋白的指示质粒转染的细胞中，细胞凋亡的程度可通过利用流式细胞仪(FACScan，Becton-Dickinson)或荧光显微镜测量总细胞群中荧光细胞的分数(fraction)来进行测定。
在存在CHX时，也可通过将细胞暴露于抗Fas抗体来测量DNA降解，其指示细胞凋亡。之后，提取细胞中的DNA，用常规方案纯化。可利用检测细胞死亡或细胞凋亡的任何方法，如下文或Sellers等(1994)、Telford等(1994)和Poirier，Ed.(1997)Apoptosis Techniques and Protocols，Humana Press，Totowa，NJ，USA中所述的那些方法。
细胞凋亡的时程可通过测量磷脂酰丝氨酸在细胞表面的表达量来分析，如用FITC标记的AnnexinV来检测，和/或通过利用碘化丙啶的染料排除法(dye-exclusion)来分析。这两个试验可以利用可商购试剂盒如ApoAlertAnnexin V细胞凋亡试剂盒(Clontech)，根据制造商的建议，并利用流式细胞仪(FACScan，Becton-Dickinson)或荧光显微镜来进行。
作为神经变性中细胞凋亡的体内模型，可利用化学品(其导致PD或AD)来在小鼠或大鼠脑内诱导细胞凋亡。作为癌症中细胞凋亡的体内模型，可注射导致肿瘤形成的肿瘤细胞，随后测定是否任何试剂都能诱导细胞凋亡(即肿瘤皱缩)。
如本领域熟练的技术人员所理解的，所述方法还可包括将具有在细胞凋亡的体内模型中抑制Bax介导的细胞凋亡能力的多核苷酸或多肽配制成药学可接受组合物的步骤。
如本文所述，可对人海马cDNA文库进行上文所述的筛选多核苷酸的方法，所述多核苷酸是或编码Bax介导的细胞凋亡的抑制剂。鉴定出16种中止酵母细胞凋亡系统中Bax介导的细胞死亡的多核苷酸(对应于基因或部分基因)，并列于表1中。
表1：人海马中鉴定的“Bax拮抗剂”
 
# 鉴定的基因 简单描述 SEQ IDNo.  
1 Bcl-2A1 Bcl-2的同源物。已知在海马中表达。 4
2 α-突触核蛋白(SNCA)        突变体形式的α突触核蛋白在PD和AD中起重要作用。野生型蛋白的作用未知。                 5
3 FKBP2(FKBP-13) 内质网驻留FK506结合蛋白，在ER中，在蛋白错折叠期，高度过量产生。                        6
 
4 EEF1A1 真核生物翻译延伸因子1α1。据报道参与致癌基因的转化。早前列腺癌中充当优势致癌基因。       7
5 VAMP3 囊泡相关膜蛋白3(缩纤蛋白(cellubrevin)) 8
6 SNAP25 突触小体相关蛋白 9
7 RIMS3 调节突触膜胞外分泌 10
8 RAB40B RAS致癌基因家族的成员 11
9 HMGCS1 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶1(可溶) 12
10 SCD5 硬脂酰辅酶A去饱和酶5 13
11 Atp2a2 ATPase。转运Ca2+，心肌，慢肌2 14
12 HRMT1L1 hnRNP甲基转移酶样蛋白1，在酿酒酵母中具有同源物。                                         15
13 克隆RP11-605M1 来自功能未知的人染色体3p的序列 16
14 克隆CTA-373H7 来自功能未知的人染色体22q11.22-12.2的序列 17
15 分离物WH6967 来自功能未知的人线粒体分离物WH6967基因组的序列                                       18
16 分离物S1216 来自功能未知的人线粒体分离物S1216基因组的序列                                          19
在哺乳动物细胞凋亡系统中，检测Bcl-2A1、SNCA、FKBP2(FKBP-13)、EEF1A1和VAMP3，且证实每种都具有与Bax介导的细胞凋亡抑制剂一样的活性。已报道Bcl-2A1是细胞凋亡的抑制剂。因此，得出作为筛选方法的结果而鉴定出的其他的11种多核苷酸也是或编码哺乳动物中Bax介导的细胞凋亡的抑制剂这一结论是合理的。
因此，第五方面，本发明提供了在细胞中抵抗Bax介导的细胞凋亡的方法，所述方法包括向细胞施用多肽或任意一种所述多肽的抗凋亡衍生物或编码任意一种所述多肽或衍生物的多核苷酸，所述多肽选自FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1和含有SEQ ID No：16、SEQ ID No：17、SEQ ID No：18或SEQ IDNo：19的多核苷酸编码的多肽。
通常，体外进行所述方法。
通常，细胞是哺乳动物细胞，如人细胞，尽管由实施例来看其是明确的，但细胞可以来自其他物种，如酵母。细胞可以来自已建立的细胞系、原代细胞培养物或存在于离体组织中的细胞。
可选地，体内进行所述方法。
多肽、其促凋亡衍生物以及编码任何所述多肽或衍生物的多核苷酸很明显具有作为研究细胞凋亡的研究工具的用途。它们在筛选调节细胞凋亡的其他治疗剂的方法中也有用，如下文所述。
第六方面，本发明提供了多肽或任意一种所述多肽的促凋亡衍生物或编码任意一种所述多肽或衍生物的多核苷酸在制备抵抗细胞中Bax介导的细胞凋亡的药物中的用途，所述多肽选自FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1和含有SEQ ID No：16、SEQ ID No：17、SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽。
所谓“抵抗细胞中Bax介导的细胞凋亡”，我们意指抑制或阻止细胞中Bax介导的细胞凋亡。
可以理解，本发明第五方面的多肽、衍生物和多核苷酸以及本发明第六方面的药物可适宜地抵抗会发生线粒体功能障碍的任何细胞凋亡，因为Bax的凋亡作用可由其他的蛋白或由外源性/内源性化学品来进行模拟。例如，已知星孢菌素(staurospaurine)能模拟Bax的作用。因此，本发明第五方面的多肽、衍生物和多核苷酸以及本发明第六方面的药物可以适宜地抵抗星孢菌素诱导的细胞死亡。
利用蛋白质化学技术，例如，利用部分蛋白水解(外水解或内水解)，或通过重新合成(de novo synthesis)，可制备任何既定多肽的衍生物。可选地，可通过重组DNA技术来制备所述衍生物。克隆、操作、修饰和表达核酸以及纯化表达的蛋白质的适宜技术在本领域内是熟知的，且描述于例如Sambrook等(2001)“Molecular Cloning，a Laboratory Manual”，3rd edition，Sambrook等(编辑)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，USA中。
这些多肽的适宜“抗凋亡衍生物”包括能抑制细胞内Bax介导的细胞凋亡的其片段以及全长多肽或其片段的修饰物。
就给定多肽的“修饰”而言，我们包括在一个或多个位置处保守或非保守的氨基酸的插入、缺失、和取代。此类修饰物可称为给定多肽的类似物。所谓“保守取代”意指组合，如Gly，Ala；Val，Ile，Leu；Asp，Glu；Asn，Gln；Ser，Thr；Lys，Arg；和Phe，Tyr。此类修饰可利用蛋白质工程和定点诱变的方法制备，如Sambrook等(2001)(同上)所述的。
给定多肽的其他修饰包括添加NH2或COOH末端标签，从而可以让蛋白进入细胞。
海马是已知在神经变性病中遭受细胞凋亡的大脑区域。因为抗凋亡多核苷酸是从人海马cDNA文库中鉴定的，所以得出每一个鉴定的抗凋亡多核苷酸或其编码的抗凋亡多肽在抵抗神经变性病中有用是合理的。
因此，本发明的第七方面提供了多肽或该多肽的抗凋亡衍生物或编码任何所述多肽或其衍生物的多核苷酸在医学中的用途，所述多肽选自FKBP2、SNCA、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、HRMT1L1和由包含SEQ ID No：16、SEQ ID No：17、SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽。
第八方面，本发明提供了药用组合物，其包含选自FKBP2、SNCA、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、HRMT1L1和由包含SEQ ID No：16、SEQ ID No：17、SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽的多肽，或任何这些多肽的抗凋亡衍生物，或编码任何所述多肽或衍生物的多核苷酸，以及药学上可接受载体或赋形剂。
另外，许多其他症状或病症都与细胞或组织中不适当的Bax介导的细胞凋亡有关，如心血管疾病中的心血管细胞(Reeve等，2005)，风湿性关节炎中的滑膜细胞(Baier等，2003)，以及糖尿病中的胰腺B细胞(Cnop等，2005；Millet等，2005)。
因此，第九方面，本发明提供了抵抗患者中选自神经变性病或病症、心血管病、风湿性关节炎和糖尿病的疾病或病症的方法，所述方法包括向患者施用选自FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1和含有SEQ ID No：16、SEQ ID No：17、SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽的多肽，或任何这些多肽的抗凋亡衍生物，或编码任何所述多肽或衍生物的多核苷酸。
心血管病在世界范围内是死亡的主要原因。功能丧失或心肌细胞死亡是世界范围内死亡的主要原因的心血管病的主要贡献性作用。在病症如心力衰竭和心肌梗死中的细胞死亡与细胞凋亡有关。已在非心肌细胞中研究了细胞凋亡途径，并认为在心肌细胞中存在相似途径。这些途径包括由膜结合死亡受体的连接、促凋亡因子从线粒体释放或内质网处的应激发动的死亡。细胞凋亡的关键调节剂包括抑制剂半胱天冬酶(IAPs)、Bcl-2蛋白家族、生长因子、应激蛋白、钙和氧化剂。凋亡信号的高度组织化和前兆性的特性意味着其很易于操作。对细胞凋亡过程的透彻理解能在大多数的适宜点上促进干扰，从而减轻心肌衰竭和功能障碍(Reeve等，2005)。
所谓“抵抗”患者的疾病、不适或病症，我们意指治疗、预防、或改善具体不适或病症的症状。
可利用本发明的治疗方法和用途治疗的神经变性病包括中风、脊髓损伤、头部损伤、脊髓性肌萎缩症(SMA)、包括肌萎缩侧索硬化(ALS)的运动神经元病、阿尔茨海默氏病(ALS)、帕金森氏病(PD)和亨廷顿病(HD)。
因此，第十方面，本发明提供了选自FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1和含有由SEQ ID No：16、SEQ ID No：17、SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽的多肽，或任何这些多肽的抗凋亡衍生物，或编码任何所述多肽或衍生物的多核苷酸，在制备抵抗患者中选自神经变性病或病症、心血管病、风湿性关节炎和糖尿病的疾病或病症的药物中的用途。
FKBP2
FKBP2(也称为FK506结合蛋白2以及FKBP13)是结合免疫抑制剂FK506和雷帕霉素(rapamycin)的蛋白家族的成员。FKBP2基因的长度为3kb，包含6个外显子，并位于人染色体11q13.1-q13.3(DiLella等，1992)上。Partaledis & Berlin(1993)描述了酿酒酵母的FKB2基因，其编码与人FKBP-13具有57％的序列同一性的人FKBP-13同源物，表明FKB2/FKB13在内质网(ER)的蛋白质运输(protein trafficking)中起作用。
根据GenBank登录号NP_476433，FKB2基因编码的蛋白是亲免素(immunophilins)蛋白家族的成员，其在免疫调节和与蛋白折叠和运输有关的基本的细胞过程中起作用。FKB2编码的蛋白是顺反式脯氨酰异构酶(cis-transprolyl isomerase)，其结合免疫抑制剂FK506和雷帕霉素。据认为其功能是作为ER伴侣蛋白，且也可充当膜骨架支架的组分。这个基因具有编码相同的同种型的两种可选择性剪接的变体。已描述了该基因的多个聚酰腺苷酸化位点，但还未确定该基因的全长特性。FKBP2在残基1-21处具信号肽(如NP_476433所界定的)，且成熟的多肽位于残基22-142处。FKBP2是肽基脯氨酰异构酶(EC 5.2.1.8)。
就本发明人的学识而言，FKBP2与细胞凋亡无关。
因此，本发明包括通过向细胞施用FKBP2多肽或其抗凋亡衍生物或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸来抵抗细胞中Bax介导的细胞凋亡。
同样，就本发明人的学识而言，FKBP2与任何神经变性病无关。实际上，根据Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM，Reference No.186946)，FKBP2与任何疾病状态都无关，且就本发明人所知，FKBP2未用于治疗上。
因此，本发明包括FKBP2多肽，或其抗凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸在医学中的用途。
本发明也包括通过向患者施用FKBP2多肽，或其抗凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸来抵抗患者的神经变性病。
就“FKBP2多肽”而言，我们意指包括人FKPB2基因的基因产物，包括其天然存在的变体。对应于人FKBP2 mRNA的cDNA序列可见于GenBank登录号No NM_057092(变体2)和NM_004470(变体1)中。与变体1相比，转录物变体2在5’UTR具有不同的外显子，虽然这两个变体中的编码区相同。人FKBP2多肽包括GenBank登录号NP_476433中发现的氨基酸序列，以及其天然存在的变体。
适宜的FKBP2的“抗凋亡衍生物”包括FKBP2的抗凋亡片段。所谓FKBP2的“抗凋亡片段”，我们意指具有抑制细胞中Bax-介导的细胞凋亡能力的FKBP2多肽的任何部分。通常，该片段具有至少30％的全长人FKBP2的抗凋亡活性。更优选，该片段具有至少50％、优选至少70％以及最优选至少90％的全长人FKBP2活性。最优选，该片段具有100％或更多的全长人FKBP2的抗凋亡活性。
适宜的FKBP2的“抗凋亡衍生物”也包括具有抑制细胞中Bax-介导的细胞凋亡能力的全长FKBP2的修饰物或其片段。优选，与全长FKBP2或其各自的FKBP2片段相比，修饰的FKBP2或修饰的FKBP2片段保留了至少80％或至少85％或至少90％的序列同一性。更优选，与全长FKBP2或其各自的FKBP2片段相比，修饰的FKBP2或修饰FKBP2片段具有至少91％，或至少92％，或至少93％，或至少94％，或至少95％的序列同一性，且仍然更优选，至少96％，或至少97％，或至少98％或至少99％的序列同一性。优选，修饰的FKBP2或修饰的FKBP2片段保留了至少30％的全长人FKBP2的抗凋亡活性。更优选，如果修饰的FKBP2或FKBP2衍生物具有至少50％，优选至少70％，且更优选至少90％的全长人FKBP2的活性。最优选，修饰的FKBP2或修饰的FKBP2片段具有100％或更多的全长人FKBP2的抗凋亡活性。
对于FKBP2，我们也包括了来自其他物种的FKBP2基因的同源基因产物。就“同源基因产物”而言，我们包括与GenBank登录号NP_476433中的人FKBP2氨基酸序列具有至少80％序列同一性的FKBP2多肽。更优选，同源基因产物包括与人FKBP2具有至少85％或至少90％序列同一性的FKBP2多肽。仍然更优选，同源基因产物包括与人FKBP2具有至少91％，或至少92％，或至少93％，或至少94％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％的序列同一性。最优选，同源基因产物包括与人FKBP2氨基酸序列具有至少99％的序列同一性。可以理解，对于FKBP2施用于非人受试者的应用，FKBP2优选来自与该受试者相同的物种。如果将FKBP2施用于人类受试者，则FKBP2优选是人FKBP2，或其抗凋亡片段或变体。
尽管在来自人和酵母的FKBP2蛋白之间，仅有47％的序列同一性(完全匹配)和69％的序列同源性(可接受的保守残基)，但人FKBP2可补足酵母细胞中失活的FKBP2突变(数据未显示)。
就编码FKBP2的多核苷酸而言，我们包括编码人FKBP2多肽以及其天然存在的变体的cDNA。编码人FKBP2 mRNA的cDNA序列可见于NM_057092和NM_004470中。我们也包括其他的序列，其根据遗传密码的简并性，也编码FKBP2多肽。
将最初由本发明人鉴定的编码FKBP2的多核苷酸(SEQ ID No：6)确定为全长片段。通过PCR，从cDNA文库中将这个基因再克隆，并且在C末端加上标签用于蛋白表达。
FKBP2是肽基脯氨酰异构酶(EC 5.2.1.8；也称为肽基脯氨酰顺反式异构酶)。有3种不同的肽基脯氨酰异构酶家族：亲环素(cyclophilins)，FKBPs，和另一个包括来自大肠杆菌的小细胞蛋白的家族。这3种家族结构上不相同，并且可分别通过环孢菌素A、FK-506和5-羟基-1，4-萘醌抑制来区分(http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC5/2/1/8.html)。
不希望受限于任何理论，本发明人认为，由于FKBP2是肽基脯氨酰异构酶(EC 5.2.1.8；也称为肽基脯氨酰顺反式异构酶)，因此肽基脯氨酰异构酶活性有助于其抗凋亡活性是可能的。因此，其他的肽基脯氨酰异构酶，特别是其他的FKBPs以及编码它们的多核苷酸，也可用于抵抗细胞凋亡。这是特别没有预料到的，因为亲环素D，一种肽基脯氨酰异构酶，其过表达已知能够增强细胞凋亡过程(Li等，2004)。而且，抑制肽基脯氨酰异构酶(也称为亲免素)已用作预防神经变性的靶标。
α突触核蛋白(SNCA)
SNCA是突触核蛋白家族的成员，该家族也包括β、γ突触核蛋白。突触核蛋白在大脑中大量表达，且α和β突触核蛋白选择性地抑制磷脂酶D2。SNCA可用于整合突触前信号和膜运输。SNCA缺失与帕金森氏病(PD)的发病机理有关。SNCA肽是患有阿尔茨海默症(PD)患者大脑内淀粉样斑的主要成分。已经鉴定出两种不同的SNCA剪切转录物。
就本发明人的学识而言，以前并未证实SNCA是Bax介导的细胞凋亡的抑制剂。
因此，本发明包括通过向细胞施用SNCA多肽，或其抗凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸来抵抗细胞中Bax介导的细胞凋亡。
同样，尽管SNCA与AD和PD有关(OMIM Reference No.163890)，就本发明人的学识而言，以前并未建议使用SNCA多肽，或其抗凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸来抵抗患者的神经变性病。实际上，就本发明人所知，SNCA并未用于医疗上。
因此，本发明包括SNCA多肽，或其抗凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸，供用于医学中。
本发明也包括通过向患者施用SNCA多肽，或其抗凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸来抵抗患者的神经变性病。
在实施方案中，本发明包括通过向患者施用SNCA多肽，或其抗凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸来抵抗患者除PD的AD之外的神经变性病。
就“SNCA多肽”而言，我们意指括人SNCA基因的基因产物，包括其天然存在的变体。对于人SNCA基因，已经描述了编码不同蛋白同种型的两种可选择的转录物变体。对应于人SNCA mRNA的cDNA序列可见于GenBank登录号NM_000345(同种型NACP140)和Genbank登录号NM_007308(同种型NACP112)中。NACP140转录物是较长的转录物，并编码较长的NACP140同种型(GenBank登录号NP_000336)。与变体NACP140相比，NACP112转录物缺少可选的框内片段，从而产生了与同种型NACP140相比具有不同C末端的较短蛋白(同种型NACP112；GenBank登录号NP_009292)。人SNCA多肽的氨基酸序列包括见于GenBank登录号NP_000336和NP_009292的序列以及其天然存在的变体。在本文所述的筛选实验中鉴定的SNCA序列是来自NACP140变体。
适宜的SNCA“抗凋亡变体”包括SNCA的抗凋亡片段。就SNCA的“抗凋亡片段”而言，我们意指具有抑制细胞中Bax介导的细胞凋亡能力的SNCA多肽的任何部分。通常，该片段具有至少30％的SEQ ID NO：5的SNCA多肽的抗凋亡活性。更优选，该片段具有至少50％，优选至少70％，且更优选至少90％的SEQ ID NO：5的SNCA多肽活性。最优选，该片段具有100％或更多的SEQ ID NO：5的SNCA多肽的抗凋亡活性。
适宜的SNCA“抗凋亡衍生物”，也包括全长SNCA或其片段的修饰物，其具有抑制细胞中Bax介导的细胞凋亡的能力。优选，修饰的SNCA或修饰的SNCA片段保留全长SNCA或各自的SNCA片段的至少80％，或至少85％，或至少90％的序列同一性。更优选，修饰的SNCA或修饰的SNCA片段与全长SNCA或其各自的SNCA片段具有至少91％，或至少92％，或至少93％，或至少94％或至少95％的序列同一性，甚至更优选至少96％，或至少97％，或至少98％或至少99％的序列同一性。优选，修饰的SNCA或修饰的SNCA片段保留至少30％的全长人SNCA的抗凋亡活性。更优选，修饰的SNCA或SNCA衍生物具有至少50％，优选至少70％和更优选至少90％的全长人SNCA的活性。最优选，修饰的SNCA或修饰的SNCA片段具有至少100％或更多的全长人SNCA的抗凋亡活性。
就SNCA而言，我们也包括来自其他物种的SNCA基因的同源基因产物。就“同源基因产物”而言，我们包括与GenBank登录号NP_000336和NP_009292中的人SNCA氨基酸序列具有至少80％序列同一性的SNCA多肽。更优选，同源基因产物包括与人SNCA具有至少85％或至少90％序列同一性的SNCA多肽。仍然更优选，同源基因产物包括与人SNCA具有至少91％，或至少92％，或至少93％，或至少94％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％的序列同一性的SNCA多肽。最优选，同源基因产物包括与GenBank登录号NP_000336或NP_009292中的人SNCA氨基酸序列具有至少99％的序列同一性的SNCA多肽。可以理解，对于向非人类受试者施用SNCA的应用，SNCA优选来自与该受试者相同的物种。如果将SNCA施用于人类受试者，则SNCA优选是人SNCA，或其抗凋亡片段或变体。
就编码SNCA的多核苷酸而言，我们包括编码人SNCA多肽以及其天然存在的变体的cDNA。编码人SNCA mRNA的cDNA序列见于GenBank登录号NM_000345和NM_007308中。我们也包括其他的序列，其根据遗传密码的简并性也编码SNCA多肽。编码SNCA的抗凋亡片段的多核苷酸的实例列于SEQ ID NO：5中。
编码SNCA的多核苷酸(SEQ ID NO：5)，其最初是由本发明人鉴定的，认为是全长的片段：将插入片段从3’端测序，最后读出的几个核苷酸是N’s。随后，利用相同的用于筛选的海马cDNA文库，通过PCR，克隆全长转录物，最初分离的克隆和全长PCR片段的Bax救援能力是相同的。
EEF1A
真核生物延伸因子1A(eEF1A，原来称为EF1α)是蛋白质合成中关键的因子，其中其促进氨酰化的tRNA向核糖体A位点转移。在哺乳动物中可发现两种分化表达的eEF1A同种型，称为eEF1A-1和eEF1A-2。在人类中，eEF1A-1和eEF1A-2同种型具有92.6％的序列同一性(参阅图67)。
根据NP_001393，EEF1A-1基因编码延伸因子1复合体α亚单位的同种型，其负责氨酰化的tRNA向核糖体的酶促递送。这种同种型(α1)表达于大脑、胎盘、肺、肝、肾和胰中，而其他的同种型(α2)则表达于大脑、心脏和骨骼肌中。在66％的患有费尔蒂综合症(Felty syndrome)的患者中，α1同种型被鉴定为自身抗原。eEF1A基因位于人染色体6q14上，但已发现其在许染色体上具有多拷贝，其中的一些，如果非全部，代表了不同的假基因。延伸因子1的α亚单位(EEF1A)与氨酰化的tRNA和80S核糖体的结合有关。在此过程中，GTP水解成GDP。为了实现此功能，EEF1A具有结合鸟嘌呤核苷酸、80S核糖体和氨酰化tRNAs的结构域。同时，EEF1A与EEF1的β亚单位相互作用，将结合的GDP转变成GTP。人EEF1A的初级结构由Brands等(1986)测定。
Ditzel等(2000)将EEF1A1鉴定为66％患有费尔蒂综合症患者的自身抗体，费尔蒂综合症的特征是伴有风湿性关节炎、脾肿大以及嗜中性白细胞的外周破坏而导致的嗜中性白细胞减少症。
根据Lamberti等(2004)所做的综述，EEF1A与细胞凋亡有关(未指明是EEF1A1还是EEF1A2或两者)。Lamberti等也报道了EEF1A2在预防半胱天冬酶3-介导的细胞凋亡中起作用。基于EEF1A2的抗凋亡作用，Thornton等(2003)提出，EEF1A1也可能抑制细胞凋亡。Talapatra等(2001)在筛选预防由白细胞介素剥夺引起的细胞凋亡的基因中，鉴定出EEF1A1。
就本发明人的学识而言，EEF1A1与Bax介导的细胞凋亡无关。
因此，本发明包括通过向细胞施用EEF1A1多肽，或其抗凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸来抵抗细胞中Bax介导的细胞凋亡。
同样，就本发明人的学识而言，EEF1A1与任何神经变性病无关。
因此，本发明包括通过向患者施用EEF1A1多肽或其抗凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸来抵抗患者的神经变性病。
就“EEF1A1多肽”(真核生物翻译延伸因子1α1)而言，我们意指人EEF1A1基因的基因产物，包括其天然存在的变体。对应于人EEF1A1 mRNA的cDNA见于GenBank登录号NM_001402中。人EEF1A1多肽包括见于GenBank登录号NP_001393中的氨基酸序列，以及其天然存在的变体。
适宜的EEF1A1“抗凋亡衍生物”包括EEF1A1的抗凋亡片段。就EEF1A1的“抗凋亡片段”而言，我们意指具有抑制细胞中Bax介导的细胞凋亡能力的EEF1A1多肽的任何部分。通常，所述片段具有至少30％的全长人EEF1A1的抗凋亡活性。更优选，所述片段具有至少50％，优选至少70％以及更优选至少90％的全长人EEF1A1的活性。最优选，所述片段具有100％或更多的全长人EEF1A1的抗凋亡活性。
适宜的EEF1A1“抗凋亡衍生物”也包括具有抑制细胞中Bax介导的细胞凋亡能力的全长EEF1A1的片段，或其片段的全长序列的修饰物。优选，与全长EEF1A1，或各自的EEF1A1片段相比，修饰的EEF1A1或修饰的EEF1A1片段保留了至少93％的序列同一性。更优选，修饰的EEF1A1或修饰的EEF1A1片段与全长EEF1A1，或各自的EEF1A1片段具有至少94％或至少95％的序列同一性，仍然更优选，至少96％，或至少97％，或至少98％或至少99％的序列同一性。优选，修饰的EEF1A1或修饰的EEF1A1片段保留了至少30％的全长人EEF1A1的抗凋亡活性。更优选，修饰的EEF1A1或修饰的EEF1A1衍生物具有至少50％，优选至少70％以及更优选至少90％的全长人EEF1A1的活性。最优选，修饰的EEF1A1或修饰的EEF1A1片段具有100％或更多的全长人EEF1A1的抗凋亡活性。
就EEF1A1而言，我们也包括来自其他物种的EEF1A1基因的同源基因产物。就“同源基因产物”而言，我们包括与GenBank登录号NP_001393中的人EEF1A1氨基酸序列具有至少93％的序列同一性的EEF1A1多肽。更优选，同源基因产物包括与人EEF1A1具有至少94％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％的序列同一性的EEF1A1多肽。最优选，同源基因产物包括与人EEF1A1氨基酸序列具有至少99％的序列同一性的EEF1A1多肽。可以理解，对于向非人类受试者施用于EEF1A1的应用而言，EEF1A1优选来自与所述受试者相同的物种。如果将EEF1A1施用于人类受试者，则EEF1A1优选是人EEF1A1或其抗凋亡片段或变体。
就编码EEF1A1的多核苷酸而言，我们包括编码人EEF1A1多肽以及其天然存在的变体的cDNA。编码人EEF1A1 mRNA的cDNA序列见于GenBank登录号NM_001402。我们也包括其他的序列，其根据遗传密码的简并性也编码EEF1A1多肽。编码EEF1A1抗凋亡片段的多核苷酸的实例列于SEQ ID No：7中(为了证实其作用随后在酵母和HEK293细胞中克隆全长EEF1A1)。
VAMP3
VAMP3是泡囊相关膜蛋白(vesicle-associated membrane protein，VAMP)/突触囊泡蛋白(synaptobrevin)家族的成员。VAMPs以及突触融合蛋白(Syntaxins)，和25KD的突触小体相关蛋白(synaptosomal-associated protein，SNAP 25)是与突触泡囊和突触前膜(presynaptic membrance)的停泊和/或融合有关的蛋白复合体的主要组分。因为VAMP3与其他已知的VAMPs有高度同一性、其广泛的组织分布以及其亚细胞定位，该基因编码的蛋白被认为是啮齿动物缩纤蛋白(cellubrevin)的人等同物。在血小板中，所述蛋白驻留于由于钙或凝血酶刺激而未固定于细胞质膜上的区室(compartment)中。
就本发明人的学识而言，VAMP3与细胞凋亡无关。
因此，本发明包括通过向细胞施用VAMP3多肽，或其抗凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸来抵抗细胞中Bax介导的细胞凋亡。
已发现VAMP3是人染色体1p36上的基因座中的25个基因之一，其与早发性隐性帕金森氏病直接有关(van Duijn等，2001)。然而，VAMP3并不直接与任何神经变性病或症状有关。实际上，根据OMIM Reference No 603657，VAMP3并不与任何疾病状态有关，就本发明人所知，VAMP3并未用于医疗上。
因此，本发明包括VAMP3多肽，或其抗凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸，供用于医学中。
因此，本发明也包括通过向患者施用VAMP3多肽，或其抗凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸来抵抗患者的神经变性病或症状。
就VAMP3多肽(泡囊相关膜蛋白3)而言，我们意指包括人VAMP3基因的基因产物，包括其天然存在的变体。对应于人VAMP3 mRNA的cDNA序列见于GenBank登录号NM_004781中。人VAMP3多肽包括见于GenBank登录号NP_004772中的氨基酸序列以及其天然存在的变体。
适宜的VAMP3“抗凋亡衍生物”包括VAMP3的抗凋亡片段。就VAMP3的“抗凋亡片段”而言，我们意指具有抑制细胞中Bax介导的细胞凋亡能力的VAMP3多肽的任何部分。通常，所述片段具有至少30％的全长人VAMP3的抗凋亡活性。更优选，所述片段具有至少50％，优选至少70％且更优选至少90％的全长人VAMP3的活性。最优选，所述片段具有100％或更多的全长人VAMP3的抗凋亡活性。
适宜的VAMP3“抗凋亡衍生物”也包括具有抑制细胞中Bax介导的细胞凋亡能力的全长VAMP3的片段，或其片段的全长多肽的修饰物。优选，与全长的VAMP3或各自的VAMP3片段相比，修饰的VAMP3或修饰的VAMP3片段保留了至少90％的序列同一性。更优选，修饰的VAMP3或修饰的VAMP3片段与全长的VAMP3或各自的VAMP3片段具有至少91％、92％、93％、94％或95％的序列同一性，更优选至少96％、97％、98％或99％的序列同一性。优选，修饰的VAMP3或修饰的VAMP3片段保留了至少30％的全长人VAMP3的抗凋亡活性。更优选，修饰的VAMP3或VAMP3衍生物具有至少50％，优选至少70％且更优选至少90％的全长人VAMP3的活性。最优选，修饰的VAMP3或修饰的VAMP3片段具有100％或更多的全长人VAMP3的抗凋亡活性。
就VAMP3而言，我们也包括来自其他物种的VAMP3基因的同源基因产物。就“同源基因产物”而言，我们包括与GenBank登录号NP_004772中的VAMP3的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的VAMP3多肽。更优选，同源基因产物包括与人VAMP3具有至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％序列同一性的VAMP3多肽。最优选，同源基因产物包括与人VAMP3氨基酸序列具有至少99％序列同一性的VAMP3多肽。可以理解，对于向非人类受试者施用VAMP3的应用而言，VAMP3优选来自与受试者相同的物种。如果将VAMP3施用于人类受试者，则VAMP3优选是人VAMP3，或其抗凋亡片段或变体。
就编码VAMP3的多核苷酸而言，我们包括编码人VAMP3多肽以及其天然存在的变体的cDNA。编码人VAMP3 mRNA的cDNA序列见于GenBank登录号NM_004781中。我们也包括其他的序列，其根据遗传密码的简并性也编码VAMP3多肽。
编码VAMP3的抗凋亡片段的多核苷酸的实例列于SEQ ID No：8中。
编码VAMP3的多核苷酸(SEQ ID No：8)分离自酵母筛选用作全长片段。
SNAP25
突触泡囊膜停泊和融合由位于泡囊膜(vesicle membrane，v-SNAREs)和靶标膜(target membrane，t-SNAREs)上的SNAREs(可溶性N-乙基顺丁烯二酰亚胺敏感因子附着蛋白受体)介导。组装的v-SNARE/t-SNARE复合体由一束四股螺旋(four helices)组成，其中1个由v-SNARE提供，其他的3由t-SNARE提供。对于细胞质膜上的t-SNAREs而言，突触融合蛋白提供一个螺旋，SNAP25编码的蛋白贡献其他的两个螺旋。因此，SNAP25的基因产物是与神经递质释放的调节有关的突触前细胞质膜蛋白。
就本发明人的学识而言，SNAP25与细胞凋亡无关。
因此，本发明包括通过向细胞施用SNAP25多肽，或其抗凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸来抵抗细胞中Bax介导的细胞凋亡。
就本发明人的学识而言，SNAP25与任何神经变性病或症状无关。实际上，根据OMIM Reference No.600322，SNAP25与任何疾病状态无关，并且就本发明人所知，SNAP25并未用于医疗上。
因此，本发明包括SNAP25多肽，或其抗凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸，供用于医学中。
本发明也包括向患者施用SNAP25多肽，或其抗凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸来抵抗患者的神经变性病或病症。
就SNAP25(突触小体相关蛋白25kDa)而言，我们意指包括人SNAP25基因的基因产物，包括其天然存在的变体。人SNAP25基因的编码不同蛋白同种型的两种可选择转录物变体已有描述。对应于人SNAP25 mRNA的cDNA序列(变体1)见于GenBank登录号NM_003081中。变体1含有8个外显子并编码同种型SNAP25A。对应于人SNAP25 mRNA的cDNA序列(变体2)见于GenBank登录号NM_130811中，并且与转录物变体1相比其含有间隔外显子5(alternate exon 5)。这导致同种型SNAP25 B与同种型SNAP25A的长度相同，并且含有相同的N和C末端，但内部具有9个氨基酸残基的差异。人SNAP25A和SNAP25B多肽的氨基酸序列包括分别见于GenBank登录号NP_003072和NP_570824中的序列，以及其天然存在的变体。本文所述的筛选试验中鉴定的SNAP25序列来自同种型B。
适宜的SNAP25“抗凋亡衍生物”包括SNAP25抗凋亡片段。就SNAP25“抗凋亡片段”而言，我们意指具有抑制细胞中Bax介导的细胞凋亡能力的SNAP25A或SNAP25B多肽的任何部分。通常，所述片段具有至少30％的由SEQ ID No：9的多核苷酸编码的SNAP25多肽片段的抗凋亡活性。更优选，所述片段具有至少50％，优选至少70％且更优选至少90％的由SEQ ID No：9的多核苷酸编码的SNAP25多肽的抗凋亡活性。最优选，所述片段具有至少100％或更多由SEQ ID No：9的多核苷酸编码的SNAP25多肽片段的抗凋亡活性。
适宜的SNAP25“抗凋亡衍生物”也包括具有抑制细胞中Bax介导的细胞凋亡能力的全长SNAP25A或SNAP25B的修饰物，或其片段的修饰物。优选，与全长SNAP25A，SNAP25B或其各自的片段相比，修饰的SNAP25A，SNAP25B或其修饰的片段保留了至少90％的序列同一性。更优选，修饰的SNAP25A，SNAP25B或其修饰的片段与全长SNAP25A，或SNAP25B，或其各自的片段具有至少91％、92％、93％、94％或95％的序列同一性，并且仍然更优选，至少96％、97％、98％或99的序列同一性。优选，修饰的SNAP25或其修饰的片段保留了至少30％的由多核苷酸SEQ ID No：9编码的SNAP25多肽的抗凋亡活性。更优选，修饰的SNAP25或修饰的衍生物具有至少50％，优选至少70％且更优选至少90％的由多核苷酸SEQ ID No：9编码的SNAP25多肽的抗凋亡活性。最优选，修饰的SNAP25或其修饰的片段具有100％或更多的由多核苷酸SEQ ID No：9编码的SNAP25多肽的抗凋亡活性。
就SNAP25而言，我们包括来自其他物种的SNAP25基因的同源基因产物。就“同源基因产物”而言，我们包括与GenBank登录号NP_003072和NP_570824中的人SNAP25氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的SNAP25多肽。更优选，同源基因产物包括与人SNAP25A或SNAP25B具有至少91％，或至少92％，或至少93％，或至少94％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％的序列同一性的SNAP25多肽。最优选，同源基因产物包括与人SNAP25A或SNAP25B氨基酸序列具有至少99％的序列同一性的SNAP25多肽。可以理解，对于将SNAP25施用于非人类受试者的应用而言，SNAP25优选来自与受试者相同的物种。如果将SNAP25施用于人类受试者，则SNAP25优选是人SNAP25同种型，或其抗凋亡片段或变体。
就编码SNAP25的多核苷酸而言，我们包括编码人SNAP25多肽以及其天然存在的变体的cDNA。编码人SNAP25的cDNA序列见于GenBank登录号NM_003081和NM_130811中。我们也包括其他的序列，其根据遗传密码的简并性，也编码SNAP25多肽。编码SNAP25抗凋亡片段的多核苷酸的实例列于SEQ ID NO：9中，其是近全长的片段，丢失了编码最初几个氨基酸的核苷酸。
RIMS3
RIMS3描述于Wang等(2000)和Wang & Sudhof(2003)中。
RIMS1是Rab3s的推断性效应器蛋白，Rabs3为突触GTP结合蛋白。RIM1靠近突触的活性地带(active zone)，在此，其以GTP依赖方式与位于突触泡囊上的Rab3相互作用。RIM2与RIM1高度同源，且也主要在大脑中表达。与RIM1一样，RIM2含有与Rab3结合作为GTP功能的N末端锌指纹结构域、中心PDZ结构域和由长的可选择剪接的序列分开的两个C末端C(2)结构域。RIM2基因的3’末端产生编码称为NIM2的较小蛋白的独立的mRNA。NIM2的组成是独特的N末端序列，紧跟着RIM2的C末端部分。数据库搜索鉴定出第三个RIM/NIM相关基因，其编码称为NIM3N(RIMS3)的NIM同种型。与RIMs一样，NIMs调节胞吐作用。RIMs和NIMs中的保守和可变序列的组合说明，这些蛋白的单个结构域为胞吐过程中相互作用的分子提供结合位点。
就本发明人的学识而言，RIMS3与细胞凋亡无关。
因此，本发明提供了通过向细胞施用RIMS3多肽，或其抗凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸来抵抗细胞中Bax介导的细胞凋亡。
就本发明人的学识而言，RIMS3与任何神经变性病或病症无关。实际上，就本发明人所知，RIMS3与任何疾病状态无关，并且之前也未用于医疗上。
因此，本发明包括RIMS3多肽，或其抗凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸，供用于医学中。
因此，本发明也包括通过向患者施用RIMS3多肽，或其抗凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸来抵抗所述患者的神经变性病或症状。
就“RIMS3多肽”(调节突触膜的胞吐作用3；也称为Rab-3相互作用分子3和Nim3)，我们意指包括人RIMS3基因的基因产物，包括其天然存在的变体。对应于人RIMS3mRNA的cDNA序列见于GenBank登录号NM_014747中。人RIMS3多肽包括见于GenBank登录号NP_055562中的氨基酸序列，以及其天然存在的变体。
适宜的RIMS3“抗凋亡衍生物”包括RIMS3的抗凋亡片段。就RIMS3“抗凋亡片段”而言，我们意指具有抑制细胞中Bax介导的细胞凋亡能力的RIMS3多肽的任何部分。通常，所述片段具有至少30％的由SEQ ID NO：10的多核苷酸编码的RIMS3多肽片段的抗凋亡活性。更优选，所述片段具有至少50％，优选至少70％以及更优选至少90％的由SEQ ID NO：10的多核苷酸编码的RIMS3多肽的抗凋亡活性。最优选，所述片段具有100％或更多的由SEQ ID NO：10的多核苷酸编码的RIMS3多肽的抗凋亡活性。
适宜的RIMS3“抗凋亡衍生物”也包括具有抑制细胞中Bax介导的细胞凋亡能力的全长RIMS3的修饰物或其片段的修饰物。优选，与全长RIMS3或其各自修饰的片段相比，修饰的RIMS3或修饰的RIMS3片段保留了至少90％的序列同一性。更优选，修饰的RIMS3或其修饰的片段与全长RIMS3或各自修饰的片段具有至少91％、92％、93％、94％或95％的序列同一性，并且仍然更优选至少96％、97％、98％或99％的序列同一性。优选，修饰的RIMS3或其修饰的片段保留了至少30％的由多核苷酸SEQ ID NO：10编码的RIMS3多肽的抗凋亡活性。更优选，修饰的RIMS3或修饰的衍生物具有至少50％，优选至少70％以及更优选至少90％的由多核苷酸SEQ ID NO：10编码的RIMS3多肽的抗凋亡活性。最优选，修饰的RIMS3或其修饰的片段具有100％或更多的由多核苷酸SEQ ID NO：10编码的RIMS3多肽的抗凋亡活性。
就RIMS3而言，我们也包括来自其他物种的RIMS3基因的同源基因产物。就“同源基因产物”而言，我们包括与GenBank登录号NP_055562中的人RIMS3的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的RIMS3多肽。更优选，同源基因产物包括与人RIMS3具有至少85％或至少90％序列同一性的RIMS3多肽。仍然更优选，同源基因产物包括与人RIMS3具有至少91％，或至少92％，或至少93％，或至少94％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％的序列同一性的RIMS3多肽。最优选，同源基因产物包括与人RIMS3氨基酸序列具有至少99％的序列同一性的RIMS3多肽。可以理解，对于将RIMS3施用于非人类受试者的应用，RIMS3优选来自与受试者相同的物种。如果将RIMS3施用于人类受试者，则RIMS3优选是人RIMS3或其抗凋亡片段或变体。
就编码RIMS3的多核苷酸而言，我们包括编码人RIMS3多肽的cDNA以及其天然存在的变体。编码人RIMS3的cDNA序列见于GenBank登录号NM_014747中。我们也包括其他的序列，其根据遗传密码的简并性，也编码RIMS3多肽。
从酵母筛选中分离的编码RIMS3的多核苷酸(SEQ ID NO：10)是全长的。
RAB40B
RAB40B是RAS致癌基因家族的成员(也称为RAR或SEC4L)。GTPases的Ras超家族的许多成员与造血细胞的调节有关，在生长、存活、分化、细胞因子的产生、趋化、泡囊运输和吞噬作用中起作用。现在RAS蛋白超家族包括超过150种小GTPase(不同于大的异三聚体GTPase，G蛋白)。它包括6个亚家族：Ras、Rho、Ran、Rab、Arf和Kir/Rem/Rad亚家族。它们表现出显著而全面的氨基酸同一性，特别是与鸟嘌呤核苷酸交换因子相互作用的区域，该区域催化它们的激活。小GTP结合蛋白Rab家族的演化已由Pereira-Leal & Seabra(2001)进行了描述。
调节内吞和胞吐泡囊运输途径的调节对维持少突细胞的结构和功能组织结构是必需的。泡囊运输途径受以下协同调控：(1)供体室(donorcompartment)中载体泡囊的形成；(2)泡囊沿着细胞骨架的元件运动；以及(3)泡囊靶向受体室(acceptor compartment)并和它融合。真核生物细胞中，调节这些事件的机制是保守的。Rab蛋白是调节泡囊形成、泡囊运动和泡囊靶向机制中的关键组分。Rab蛋白家族的每一个成员都调节具体的泡囊运输途径。
就本发明人的学识而言，RAB40B与细胞凋亡无关。
因此，本发明包括通过向细胞施用RAB40B多肽，或其抗凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸来抵抗细胞中Bax介导的细胞凋亡。
就本发明人的学识而言，RAB40B与任何神经变性病或症状无关。实际上，就本发明人所知，RAB40B与任何疾病状态无关并且之前未用于医疗上。
因此，本发明包括RAB40B多肽，或其抗凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸，供用于医学中。
本发明也包括通过向患者施用RAB40B多肽，或其抗凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸来抵抗所述患者中神经变性病或症状。
就“RAB40B多肽”而言，我们意指包括人RAB40B基因的基因产物，包括其天然存在的变体。对应于人RAB40 mRNA的cDNA序列见于GenBank登录号NM_006822。人RAB40B多肽包括见于GenBank登录号NP_006813中的氨基酸序列，以及其天然存在的变体。
适宜的RAB40B“抗凋亡衍生物”包括RAB40B的抗凋亡片段。就RAB40B“抗凋亡片段”而言，我们意指具有抑制细胞中Bax介导的细胞凋亡能力的RAB40B多肽的任何部分。通常，所述片段具有至少30％的由多核苷酸SEQ ID NO：11编码的RAB40B多肽片段的抗凋亡活性。优选，所述片段具有至少50％，优选至少70％且更优选至少90％的由多核苷酸SEQ IDNO：11编码的RAB40B多肽的抗凋亡活性。最优选，所述片段具有100％或更多的由多核苷酸SEQ ID NO：11编码的RAB40B多肽的抗凋亡活性。
适宜的RAB40B“抗凋亡衍生物”也包括具有抑制细胞中Bax介导的细胞凋亡能力的全长RAB40B的修饰物或其片段的修饰物。优选，与全长RAB40B或其各自的片段相比，修饰的RAB40B或修饰的RAB40B片段保留了至少90％的序列同一性。更优选，修饰的RAB40B或其修饰的片段与全长RAB40B或各自的RAB40B片段具有至少91％、92％、93％、94％或95％的序列同一性，并仍然更优选至少96％、97％、98％或99％的序列同一性。优选，修饰的RAB40B或其修饰的片段保留了至少30％的由多核苷酸SEQ IDNO：11编码的RAB40B多肽的抗凋亡活性。更优选，修饰的RAB40B或修饰的衍生物具有至少50％，优选至少70％并更优选至少90％的由多核苷酸SEQ IDNO：11编码的RAB40B多肽的抗凋亡活性。最优选，修饰的RAB40B或其修饰的片段具有100％或更多的由多核苷酸SEQ ID NO：11编码的RAB40B多肽的抗凋亡活性。
就RAB40B而言，我们也包括来自其他物种的RAB40B基因的同源基因产物。就“同源基因产物”而言，我们包括与GenBank登录号NP_006813中人RAB40B氨基酸序列具有至少90％序列同一性的RAB40B多肽。更优选，同源基因产物包括与人RAB40B具有至少91％，或至少92％，或至少93％，或至少94％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％的序列同一性的RAB40B多肽。最优选，同源基因产物包括与人RAB40B氨基酸序列具有至少99％的序列同一性的RAB40B多肽。可以理解，对于将RAB40B施用于非人类受试者的应用而言，RAB40B优选来自与所述受试者相同的物种。如果将RAB40B施用于人类受试者，则RAB40B优选是人RAB40B或其抗凋亡片段或变体。
就编码RAB40B的多核苷酸而言，我们包括编码人RAB40B多肽以及其天然存在的变体的cDNA。编码人RAB40B的cDNA序列见于GenBank登录号NM_006822中。我们也包括其他的序列，其根据遗传密码的简并性也编码RAB40B多肽。编码RAB40B的抗凋亡片段的多核苷酸的实例列于SEQ ID NO：11中。然而，在从Bax介导的细胞凋亡中营救酵母细胞方面，全长RAB40B比SEQ ID NO：11的这种片段更有效。
HMGCS1
HMGCS1(3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶1)是细胞质酶，其使乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A缩合形成HMG-辅酶A还原酶的底物HMG-辅酶A。
乙酰辅酶A+H2O+乙酰乙酰辅酶A
Figure A200780013489D0047192114QIETU
(S)-3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A+辅酶A。
HMG辅酶A合成酶在合成固醇如胆固醇和类异戊二烯之前也与从HMG辅酶A中产生甲羟戊酸的途径有关。线粒体HMG辅酶A合成酶基因是过氧物酶体增殖激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)的靶标，并且这种受体通过脂肪酸调节这种基因的诱导。人细胞质3-羟基甲基戊二酰辅酶A合成酶已由Rokosz(1994)做了描述。
就本发明人的学识而言，HMGCS1与细胞凋亡无关。
因此，本发明包括通过向细胞施用HMGCS1多肽，或其抗凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸来抵抗细胞中Bax介导的细胞凋亡。
尽管HMG辅酶A还原酶和AD之间有关联，但HMG辅酶A合成酶和AD之间没有已知的关联。就本发明人的学识而言，HMGCS1与任何神经变性病或症状无关。就本发明人的学识而言，HMGCS1与任何神经变性病或症状无关。实际上，根据OMIM Reference No 142940，HMGCS1与任何疾病状态无关，就本发明人所知，HMGCS1未用于医疗上。
因此，本发明包括HMGCS1多肽，或其抗凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸，供用于医学中。
本发明也包括通过向患者施用HMGCS1多肽，或其抗凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸来抵抗所述患者中神经变性病或症状。
就HMGCS1多肽而言，我们意指包括人HMGCS1基因的基因产物，包括其天然存在的变体。对应于人HMGCS1 mRNA的cDNA序列见于GenBank登录号NM_002130中。人HMGCS1多肽包括见于GenBank登录号NP_002121中的氨基酸序列，以及其天然存在的变体。
适宜的HMGCS1“抗凋亡衍生物”包括HMGCS1的抗凋亡片段。就HMGCS1的“抗凋亡片段”而言，我们意指具有抑制细胞中Bax介导的细胞凋亡能力的HMGCS1多肽的任何部分。通常，所述片段具有至少30％的由SEQ ID NO：12的多核苷酸编码的HMGCS1多肽片段的抗凋亡活性。更优选，所述片段具有至少50％，优选至少70％且更优选至少90％的由多核苷酸SEQID NO：12编码的HMGCS1多肽的抗凋亡活性。最优选，所述片段具有100％或更多的由多核苷酸SEQ ID NO：12编码的HMGCS1多肽的抗凋亡活性。
适宜的HMGCS1“抗凋亡衍生物”也包括具有抑制细胞中Bax介导的细胞凋亡能力的全长HMGCS1的修饰物或其片段的修饰。优选，与全长人HMGCS1(如NP_002121中所界定的)或其各自的片段相比，修饰的HMGCS1或修饰的HMGCS1片段保留了至少90％的序列同一性。更优选，修饰的HMGCS1或其修饰的片段与全长HMGCS1或各自的HMGCS1片段具有至少91％、92％、93％、94％或95的序列同一性，并且仍然更优选至少96％、97％、98％或99％的序列同一性。优选，修饰的HMGCS1或其修饰的片段保留了至少30％的由多核苷酸SEQ ID NO：12编码的HMGCS1多肽的抗凋亡活性。更优选，修饰的HMGCS1或修饰的衍生物具有至少50％，至少70％且更优选至少90％的由多核苷酸SEQ ID NO：12编码的HMGCS1多肽的抗凋亡活性。最优选，修饰的HMGCS1或其修饰的片段具有100％或更多的由多核苷酸SEQ ID NO：12编码的HMGCS1多肽的抗凋亡活性。
就HMGCS1而言，我们也包括来自其他物种的HMGCS1基因的同源基因产物。就“同源基因产物”而言，我们包括与GenBank登录号NP_002121中人HMGCS1氨基酸序列具有至少80％序列同一性的HMGCS1多肽。更优选，同源基因产物包括与人HMGCS1具有至少85％或至少90％序列同一性的HMGCS1多肽。仍然更优选，同源基因产物包括与人HMGCS1具有至少91％，或至少92％，或至少93％，或至少94％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％的序列同一性的HMGCS1多肽。最优选，同源基因产物包括与人HMGCS1氨基酸序列具有至少99％的序列同一性的HMGCS1多肽。可以理解，对于将HMGCS1施用于非人类受试者的应用，HMGCS1优选是来自与所述受试者相同的物种。如果将HMGCS1施用于人类受试者，则HMGCS1优选是人HMGCS1或其抗凋亡片段或变体。
就编码HMGCS1的多核苷酸而言，我们包括编码人HMGCS1多肽以及其天然存在的变体的cDNA。编码人HMGCS1的cDNA序列见于GenBank登录号NM_002130中。我们也包括其他的序列，其根据遗传密码的简并性也编码HMGCS1多肽。编码HMGCS1的抗凋亡片段的多核苷酸的实例列于SEQ ID NO：12中，其是HMGCS1的部分3’序列。
SCD5
SCD5(硬脂酰辅酶A去饱和酶5；以前称为酰基辅酶A去饱和酶4同种型a；ACOD4)，与其他的硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD；EC 1.14.99.5)一样，催化从饱和脂肪酸生物合成单不饱和脂肪酸中的关键步骤。这个反应包括在亚甲基间隔的脂肪酰基辅酶A的色谱中在的碳9和10之间引入顺式双键。
就本发明人的学识而言，SCD5与细胞凋亡无关。
因此，本发明包括通过向细胞施用SCD5多肽，或其凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸来抵抗细胞中Bax介导的细胞凋亡。
就本发明人的学识而言，SCD5与任何神经变性病或症状无关。实际上，根据OMIM Reference No 608370，SCD5与任何疾病状态无关，就本发明人所知，SCD5并未用于治疗上。
因此，本发明包括SCD5多肽，或其抗凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸，供用于医学中。
本发明也包括通过向患者施用SCD5多肽，或其抗凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸来抵抗患者中神经变性病或症状。
就“SCD5多肽”而言，我们也意指包括人SCD5基因的基因产物，包括其天然存在的变体。对应于人SCD5 mRNA的cDNA序列见于GenBank登录号BC048971.1中。人SCD5多肽包括见于GenBank登录号AAH48971中的氨基酸序列以及其天然存在的变体。
适宜的SCD5“抗凋亡衍生物”包括SCD5的抗凋亡片段。就SCD5“抗凋亡片段”而言，我们意指具有抑制细胞中Bax介导的细胞凋亡能力的SCD5多肽的任何部分。通常，所述片段具有至少30％的由SEQ ID NO：13的多核苷酸编码的SCD5多肽片段的抗凋亡活性。优选，所述片段具有至少50％，优选至少70％以及更优选至少90％的由多核苷酸SEQ ID NO：13编码的SCD5多肽的抗凋亡活性。最优选，所述片段具有100％或更多的由多核苷酸SEQ ID NO：13编码的SCD5多肽的抗凋亡活性。
适宜的SCD5“抗凋亡衍生物”包括具有抑制细胞中Bax介导的细胞凋亡能力的全长SCD5的修饰物，或其片段的修饰物。优选，与全长人SCD5(如AAH48971中所界定的)或其各种片段相比，修饰的SCD5或修饰的SCD5片段保留了至少90％的序列同一性。更优选，修饰的SCD5或其修饰的片段与全长SCD5或各自的SCD5片段具有至少91％、92％、93％、94％或95％的序列同一性，以及仍然更优选至少96％、97％、98％或99％的序列同一性。优选，修饰的SCD5或其修饰的片段保留了至少30％的由多核苷酸SEQ IDNO：13编码的SCD5多肽的抗凋亡活性。更优选，修饰的SCD5或修饰的衍生物具有至少50％，优选至少70％且更优选至少90％的由多核苷酸SEQ IDNO：13编码的SCD5多肽的抗凋亡活性。最优选，修饰的SCD5或其修饰的片段具有100％或更多的由多核苷酸SEQ ID NO：13编码的SCD5多肽的抗凋亡活性。
就SCD5而言，我们也包括来自其他物种的SCD5基因的同源基因产物。就“同源基因产物”而言，我们包括与GenBank登录号AAH48971中的人SCD5氨基酸序列具有至少80％的序列同一性的SCD5多肽。更优选，同源基因产物包括与人SCD5具有至少85％或至少90％序列同一性的SCD5多肽。仍然更优选，同源基因产物包括与人SCD5具有至少91％，或至少92％，或至少93％，或至少94％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％序列同一性的SCD5多肽。最优选，同源基因产物包括与人SCD5氨基酸序列具有至少99％的序列同一性的SCD5多肽。可以理解，对于将SCD5施用于非人类受试者的应用，SCD5优选来自与所述受试者相同的物种。如果将SCD5施用于人类受试者，则SCD5优选是人SCD5或其抗凋亡片段或变体。
就编码SCD5的多核苷酸而言，我们包括编码人SCD5多肽以及其天然存在的变体的cDNA。编码人SCD5的cDNA序列见于GenBank登录号BC048971.1中。我们也包括其他的序列，其根据遗传密码的简并性也编码SCD5多肽。编码SCD5抗凋亡片段的多核苷酸的实例列于SEQ ID NO：13中。
ATP2A2
ATP2A2(也称为ATP2B和SERCA2)编码一种SERCA Ca2+ATP酶(EC3.6.3.8)，该酶是位于肌肉细胞的肌质网或内质网中的细胞内泵。这种酶催化与钙从胞质溶胶向肌质网腔运输偶联的ATP的水解，并参与收缩/舒张周期的调节。
根据Shull等(2003)，细胞质膜Ca2运输ATP酶(PMCAs)将Ca2+从细胞中排出，且肌质(内质)网Ca2+ATP酶(SERCAs)以及分泌途径Ca2+ATP酶(SPCAs)在胞内器官中螯合Ca2+。然而，单个同种型的具体生理功能依然了解的很少。对这些基因中携带无效突变的小鼠和人的研究，使得这些信息得以公开。在细胞质膜Ca2+ATP酶同种型2(PMCA2)中具有靶向或自发突变的小鼠完全耳聋，并且由于在内耳的感觉毛细胞中缺少PMCA2而具有平衡缺陷。在人类中，SERCA1中的突变(ATP2A1)引起Brody病(Brody disease)，其是骨骼肌舒张损害；缺失一拷贝的SERCA2(ATP2A2)基因会引起达里耶病(Darier disease)，一种皮肤病；并且缺失一拷贝的SPCA1(ATP2C1)基因会引起Hailey-Hailey病(Hailey-Hailey disease)，为另一种皮肤病。在小鼠中，SERCA2无效突变体出生后就死亡，杂合子SERCA2突变体的心脏机能消弱并且鳞状上皮细胞癌的发病率很高。SERCA3无效突变体可以存活且看起来是健康的，但主动脉平滑肌的上皮依赖性舒张受到破坏，并且胰腺β细胞中Ca2+信号受到改变。表型的多样性显示，各种Ca2+运输ATP酶同种型会提供非常不同的生理功能。
达里耶病是罕见的常染色体显性遗传模式的皮肤病。油腻性丘疹(greasypapules)和斑块出现在脂漏性部位(seborrheic area)以及弯曲部位(flexures)中，并且几乎所有的患者都有指甲异常。它的特征是表皮细胞和异常角化(abnormal keratinisation)之间附着的丢失，并且棘层分解现象(acantholysis)和角化不良(dyskeratosis)是典型的组织学发现。根本的缺陷是染色体12q23-24上ATP2A2基因突变的结果，所述基因编码肌质/内质网钙ATP酶(SERCA2)。棘层分解现象被认为是由桥粒断裂(desmosome breakdown)引起。达里耶病(也称为Darier-White病(Darier-White disease)和毛囊角化症(keratosis follicularis))是由单倍体不足(haplo-insufficiency)引起的显性遗传病。口服类维生素是最有效的治疗法，但它们的副作用很麻烦。局部类维生素、局部皮质甾类、外科手术和激光手术都有拥护者，但有效的证据很少(Cooper & Burge，2003)。达里耶病有时伴随情绪病(mood disorder)，如躁郁症(bipolar disorder)(Kato，2001)。ATP2A2在达里耶病中的作用由Foggia & Hovnanian(2004)做了综述。
根据Dhitavat等(2004)，在达里耶病中，桥粒附着的丢失会触发失巢凋亡(anoikis)，这是一种以角质细胞中细胞分离为特征的细胞凋亡。这种细胞凋亡被认为是继发于Ca2+运输活性改变。为了支持它们的假说，Dhitavat等(2004)引用了Jackisch等(2000)的用毒胡萝卜素(thapsigargin)抑制SERCA泵会在多种表皮细胞中触发细胞凋亡这一发现。
Prasad等(2005)描述了ATP2A2单倍体不足使小鼠易于发生鳞状上皮细胞肿瘤。然而，与Dhitavat等(2004)的发现完全相反，Prasad等(2005)引用Qu等(2004)，指出“由SERCA2抑制剂毒胡萝卜素诱导的ER应激表现出能防止p53介导的细胞凋亡”。
因此，就本发明人的学识而言，ATP2A2与Bax介导的细胞凋亡并不直接相关。
因此，本发明包括向细胞施用ATP2A2多肽，或其凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸来抵抗细胞中Bax介导的细胞凋亡。
尽管达里耶病和躁郁症共病，但就本发明人的学识而言，ATP2A2并不与任何神经变性病或症状直接相关。实际上，在本发明中，并不认为双极障碍是神经变性病或症状。
因此，本发明也包括通过向患者施用ATP2A2多肽，或其抗凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸来抵抗所述患者中神经变性病或症状。
就“ATP2A2多肽”而言，我们意指包括人ATP2A2基因的基因产物，包括其天然存在的变体。人ATP2A2基因的编码不同蛋白同种型的两种可选择转录物变体已有描述。对应于人ATP2A2 mRNA(变体1)的cDNA序列见于GenBank登录号NM_170665中。对应于人ATP2A2 mRNA(变体2)的cDNA序列见于GenBank登录号NM_001681中。转录物变体1(NM_170665)编码ATP2A2蛋白的较长同种型。转录物变体2(NM_001681)利用编码区3’末端的可选择剪接位点，而获得比变体1更靠前的终止密码子。同种型2与同种型1相比具有更短的不同C末端。人ATP2A2变体1和ATP2A2变体2多肽的氨基酸序列包括分别见于GenBank登录号NP_733765和NP_001672中的序列，以及其天然存在的变体。
适宜的ATP2A2“抗凋亡衍生物”包括ATP2A2的抗凋亡片段。就ATP2A2“抗凋亡片段”而言，我们意指具有抑制细胞中Bax介导的细胞凋亡能力的ATP2A2多肽(同种型1或同种型2)的任何部分。通常，所述片段具有至少30％的由SEQ ID NO：14的多核苷酸编码的ATP2A2多肽片段的抗凋亡活性。更优选，所述片段具有至少50％，优选至少70％且更优选至少90％的多核苷酸SEQ ID NO：14编码的ATP2A2多肽的抗凋亡活性。最优选，所述片段具有100％或更多的由多核苷酸SEQ ID NO：14编码的ATP2A2多肽的抗凋亡活性。
适宜的ATP2A2“抗凋亡衍生物”也包括具有抑制细胞中Bax介导的细胞凋亡能力的全长ATP2A2(无论是同种型1还是同种型2)的修饰物，或其片段的修饰物。优选，与全长人ATP2A2(如NP_733765或NP_001672中界定的)或其各自的片段相比，修饰的ATP2A2，或修饰的ATP2A2片段保留了至少90％的序列同一性。更优选，修饰的ATP2A2或其修饰的片段与全长ATP2A2或各自的ATP2A2片段具有至少91％、92％、93％、94％或95％的序列同一性，并且仍然更优选至少96％、97％、98％或99％的序列同一性。优选，修饰的ATP2A2或其修饰的片段保留了至少30％的由多核苷酸SEQ IDNO：14编码的ATP2A2多肽的抗凋亡活性。更优选，修饰的ATP2A2或修饰的衍生物具有至少50％，优选至少70％以及更优选至少90％的由多核苷酸SEQ ID NO：14编码的ATP2A2多肽的抗凋亡活性。最优选，修饰的ATP2A2或其修饰的片段具有100％或更多的由多核苷酸SEQ ID NO：14编码的ATP2A2多肽的抗凋亡活性。
就ATP2A2而言，我们也包括来自其他物种的ATP2A2基因的同源基因产物。就“同源基因产物”而言，我们包括与GenBank登录号NP_733765或NP_001672中的人ATP2A2氨基酸序列具有至少90％序列同一性的ATP2A2多肽。更优选，同源基因产物包括与人ATP2A2具有至少91％，或至少92％，或至少93％，或至少94％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％序列同一性的ATP2A2多肽。最优选，同源基因产物包括与人ATP2A2氨基酸序列具有至少99％序列同一性的ATP2A2多肽。可以理解，对于将ATP2A2施用于非人类受试者的应用，ATP2A2优选是来自与所述受试者相同的物种。如果将ATP2A2施用于人类受试者，则ATP2A2优选是人ATP2A2或其抗凋亡片段或变体。
就编码ATP2A2的多核苷酸而言，我们包括编码人ATP2A2多肽和其天然存在的变体的cDNA。编码人ATP2A2的cDNA序列见于GenBank登录号NM_170665和NM_001681中。我们也包括其他的序列，其根据遗传密码的简并性也编码ATP2A2多肽。编码ATP2A2的抗凋亡片段的多核苷酸的实例列于SEQ ID NO：14中。
HRMT1L1
HRMT1L1(异质核核糖核蛋白甲基转移酶样蛋白1；也称为hmtl likel；蛋白精氨酸n-甲基转移酶2；prmt2)是精氨酸甲基转移酶，其作用于RNA结合蛋白如异质核核糖核蛋白。
就本发明人的学识而言，HRMT1L1与细胞凋亡无关。
因此，本发明包括通过向细胞施用HRMT1L1多肽，或其抗凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸来抵抗细胞中Bax介导的细胞凋亡。
就本发明人的学识而言，HRMT1L1与任何神经变性病或症状无关。实际上，根据OMIM Reference No 601961，HRMT1L1与任何疾病状态无关，就本发明人所知，其并未用于医疗上。
因此，本发明包括HRMT1L1多肽，或其抗凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸，供用于医学中。
本发明也包括通过向患者施用HRMT1L1多肽，或其抗凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸来抵抗患者中的神经变性病或症状。
就“HRMT1L1多肽”而言，我们意指包括人HRMT1L1基因的基因产物，包括其天然存在的变体。人HRMT1L1基因的编码相同的蛋白同种型的两种可选择转录物变体已有描述。对应于人HRMT1L1 mRNA(变体1)的cDNA序列，其为较长的转录物，见于GenBank登录号NM_206962中。对应于人HRMT1L1mRNA(变体2)的cDNA序列见于GenBank登录号NM_001535中。变体2与变体1的5’URT不同。人HRMT1L1多肽的氨基酸序列包括见于GenBank登录号NP_996845和NP_001526的序列，以及其天然存在的变体。
适宜的HRMT1L1“抗凋亡衍生物”包括HRMT1L1的抗凋亡片段。就HRMT1L1“抗凋亡片段”而言，我们意指具有抑制细胞中Bax介导的细胞凋亡能力的HRMT1L1多肽的任何部分。通常，所述片段具有至少30％的由SEQ ID NO：15的多核苷酸编码的HRMT1L1多肽的抗凋亡活性。更优选，所述片段具有至少50％，优选至少70％以及更优选至少90％的由SEQ ID NO：15的多核苷酸编码的HRMT1L1多肽的抗凋亡活性。最优选，所述片段具有100％或更多的由SEQ ID NO：15的多核苷酸编码的HRMT1L1多肽的抗凋亡活性。
适宜的HRMT1L1“抗凋亡衍生物”也包括具有抑制细胞中Bax介导的细胞凋亡能力的全长HRMT1L1的修饰物或其片段的修饰物。优选，与全长人HRMT1L1(如NP_996845中所界定的)或其各自的片段相比，修饰的HRMT1L1或修饰的HRMT1L1片段保留了至少90％的序列同一性。更优选，修饰的HRMT1L1或其修饰的片段与全长HRMT1L1或其各自的片段具有至少91％、92％、93％、94％或95％的序列同一性，并且仍然更优选至少96％、97％、98％或99％的序列同一性。优选，修饰的HRMT1L1或其修饰的片段保留了至少30％的由SEQ ID NO：15的多核苷酸编码的HRMT1L1多肽的抗凋亡活性。更优选，修饰的HRMT1L1或修饰的衍生物具有至少50％，优选至少70％以及更优选至少90％的由多核苷酸SEQ ID NO：15编码的HRMT1L1多肽的抗凋亡活性。最优选，修饰的HRMT1L1或其修饰的片段具有100％或更多的由多核苷酸SEQ ID NO：15编码的HRMT1L1多肽的抗凋亡活性。
就HRMT1L1而言，我们也包括来自其他物种的HRMT1L1基因的同源基因产物。就“同源基因产物”而言，我们包括与GenBank登录号NP_996845中的人HRMT1L氨基酸序列具有至少80％序列同一性的HRMT1L多肽。更优选，同源基因产物包括与人HRMT1L1具有至少85％或至少90％序列同一性的HRMT1L1多肽。仍然更优选，同源基因产物包括与人HRMT1L1具有至少91％，或至少92％，或至少93％，或至少94％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％的序列同一性的HRMT1L1多肽。最优选，同源基因产物包括与人HRMT1L1氨基酸序列具有至少99％的序列同一性的HRMT1L1多肽。可以理解，对于将HRMT1L1施用于非人类受试者的应用，所述HRMT1L1优选来自与所述受试者相同的物种。如果将HRMT1L1施用于人类受试者，则HRMT1L1优选是人HRMT1L1或其抗凋亡片段或其变体。
就编码HRMT1L1的多核苷酸而言，我们包括编码人HRMT1L1多肽和其天然存在的变体的cDNA。编码人HRMT1L1的cDNA序列见于GenBank登录号NM_206962和NM_001535中。我们也包括其他的序列，其根据遗传密码的简并性也编码HRMT1L1多肽。编码HRMT1L1的抗凋亡片段的多核苷酸的实例列于SEQ ID NO：15中，其是近乎全长的HRMT1L1多核苷酸。
之前功能未知的来自人染色体3D的序列
如SEQ ID NO：16(参阅图63)所界定的来自人染色体3p的多核苷酸存在于克隆RP11-605M1图谱3p(clone RP11-605M1 map 3p)(GenBank登录号AC087091)和克隆智人(Homo sapiens)3 BAC RP11-114K9(GenBank登录号AC011609)上。克隆RP11-605M1全序列的长度是153013个核苷酸，SEQ IDNO：16从核苷酸91339-91958。克隆RP11-114K9的全序列长度是184680个核苷酸，且SEQ ID NO：16从核苷酸79443-80063。两个可读框存在于SEQ IDNO：16中(如图63中箭头所示)。ORF-2见于SEQ ID NO：16的98-217bp位置处，ORF-3见于SEQ ID NO：16的260-361bp位置处，且这些ORFs可能编码下列两种短的多肽(分别为SEQ ID Nos：20和21)：
蛋白-ORF-2：MLRNLGLVAF VLEKLFLEDE SAVHVILQVM WHLFFKLKM
蛋白-ORF-3：MCQEFKNVSY WCVCALFQES TFSVFQLTAP FPS
就本发明人的学识而言，不但如SEQ ID NO：16中所界定的来自人染色体3p的多核苷酸与细胞凋亡无关，由SEQ ID NO：16的多核苷酸编码的多肽、含有SEQ ID NO：16的多核苷酸编码的多肽的天然存在的多肽也与细胞凋亡无关。
因此，本发明包括通过向细胞施用SEQ ID NO：16的多核苷酸编码的多肽，或含有SEQ ID NO：16的多核苷酸编码的多肽的天然存在的多肽，或其抗凋亡衍生物或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸来抵抗所述细胞中Bax介导的细胞凋亡。
就本发明人的学识而言，以前不但如SEQ ID NO：16中所界定的来自人染色体3p的多核苷酸与任何神经变性病或症状无关，而且由SEQ ID NO：16的多核苷酸编码的多肽、含有SEQ ID NO：16的多核苷酸编码的多肽的天然存在的多肽也与任何神经变性病或症状无关。实际上，就本发明人所知，此类多肽与任何疾病状态无关且以前并未用于医疗上。
因此本发明包括SEQ ID NO：16的多核苷酸编码的多肽，或含有SEQ IDNO：16的多核苷酸编码的多肽的天然存在的多肽，或其抗凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸，供用于医学中。
本发明包括通过向细胞施用SEQ ID NO：16的多核苷酸编码的多肽，或含有SEQ ID NO：16的多核苷酸编码的多肽的天然存在的多肽，或其抗凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸，来抵抗患者中的神经变性病或症状。
适宜的“抗凋亡衍生物”包括SEQ ID NO：16的多核苷酸编码的多肽的抗凋亡片段，或含有SEQ ID NO：16的多核苷酸编码的多肽的天然存在的多肽的抗凋亡片段，或含有SEQ ID NO：16的天然存在的多核苷酸转录物编码的多肽的抗凋亡片段。就“抗凋亡片段”而言，我们意指具有抑制细胞中Bax介导的细胞凋亡能力的所述多肽的任何部分。通常，所述片段具有至少30％的SEQ ID NO：16的多核苷酸编码的多肽片段的抗凋亡活性。更优选，所述片段具有至少50％，优选至少70％以及更优选至少90％的SEQ ID NO：16的多核苷酸编码的所述多肽片段的抗凋亡活性。最优选，所述片段具有100％或更多的SEQ ID NO：16的多核苷酸编码的所述多肽片段的抗凋亡活性。
适宜的“抗凋亡衍生物”也包括SEQ ID NO：16的多核苷酸编码的多肽的修饰物，或含有SEQ ID NO：16的多核苷酸编码的多肽的全长天然存在的多肽的修饰物，或含有SEQ ID NO：16的天然存在的多核苷酸转录物编码的多肽的修饰物，或上述多肽片段的修饰物，所述修饰物具有抑制细胞中Bax介导的细胞凋亡的能力。优选，与SEQ ID NO：16的多核苷酸编码的多肽或其各自的片段相比，修饰的衍生物的对应部分保留了至少90％的序列同一性。更优选，修饰的衍生物的对应部分或其修饰的片段与SEQ ID NO：16的多核苷酸编码的多肽或其各自的片段具有至少91％、92％93％94％或95％的序列同一性，且仍然更优选具有至少96％、97％、98％或99％的序列同一性。优选，修饰的多肽或其修饰的片段保留了至少30％的SEQ ID NO：16的多核苷酸编码的多肽的抗凋亡活性。更优选，修饰的多肽或修饰的片段具有至少50％，优选至少70％且更优选至少90％的SEQ ID NO：16的多核苷酸编码的多肽的抗凋亡活性。最优选，修饰的多肽或其修饰的片段具有100％或更多的SEQ ID NO：16的多核苷酸编码的多肽的抗凋亡活性。
可以理解，对于将这种基因/多肽施用于受试者的应用，优选其来自与所述受试者相同的物种，特别是如果受试者是人类受试者。
以前功能未知的来自人染色体22q11.22-12.2的序列
如SEQ ID NO：17(参阅图64)中所界定的来自人染色体22q11.22-12.2的多核苷酸存在于克隆CTA-373H7(GenBank登录号Z99774)上。克隆CTA-373H7的完整序列长度是73239个核苷酸，且SEQ ID NO：17是从核苷酸41798-42499。4个可读框位于SEQ ID NO：17内(如图64中箭头所示)，其中的两个编码45个残基的的多肽，其他的两个编码30个氨基酸残基的多肽。这4个ORF位于SEQ ID NO：17中的下列位置：ORF-8：149-241；ORF-4：153-290；ORF-9：431-523；以及ORF-5：565-702。
SEQ ID NO：17与智人cDNA FLJ45323 fis(克隆BRHIP3006390)(GenBank登录号AK127256)在5292个核苷酸的4445-5146处具有很强的同源性。
就本发明人的学识而言，之前，不但如SEQ ID NO：17中所界定的来自人染色体22q11.22-12.2的多核苷酸与细胞凋亡无关，SEQ ID NO：17的多核苷酸编码的多肽、或含有SEQ ID NO：17的多核苷酸编码的多肽的天然存在的多肽也与细胞凋亡无关。
因此，本发明包括通过向细胞施用SEQ ID NO：17的多核苷酸编码的多肽，或含有SEQ ID NO：17的多核苷酸编码的多肽的天然存在的多肽，或其抗凋亡衍生物或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸来抵抗细胞中Bax介导的细胞凋亡。
同时，就本发明人的学识而言，之前不但如SEQ ID NO：17中所界定的来自人染色体22q11.22-12.2的多核苷酸与任何神经变性病或病症无关，SEQID NO：17的多核苷酸编码的多肽、或含有SEQ ID NO：17的多核苷酸编码的多肽的天然存在的多肽也与任何神经变性病或病症无关。实际上，就本发明人所知，此类多肽与任何疾病状态无关，并且并未用于治疗上。
因此，本发明包括SEQ ID NO：17的多核苷酸编码的多肽，或含有SEQID NO：17的多核苷酸编码的多肽的天然存在的多肽，或其抗凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸，供用于医学上。
本发明包括通过向细胞施用SEQ ID NO：17的多核苷酸编码的多肽，或含有SEQ ID NO：17的多核苷酸编码的多肽的天然存在的多肽，或其抗凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸来抵抗患者中神经变性病或症状。
适宜的“抗凋亡衍生物”包括SEQ ID NO：17的多核苷酸编码的多肽的抗凋亡片段，或含有SEQ ID NO：17的多核苷酸编码的多肽的天然存在的多肽的抗凋亡片段，或含有SEQ ID NO：17的天然存在的多核苷酸转录物编码的多肽的抗凋亡片段。就“抗凋亡片段”而言，我们意指具有抑制细胞中Bax介导的细胞凋亡能力的多肽的任何部分。通常，所述片段具有至少30％的SEQ ID NO：17的多核苷酸编码的多肽片段的抗凋亡活性。更优选，所述片段具有至少50％，优选至少70％且更优选至少90％的SEQ ID NO：17的多核苷酸编码的多肽片段的抗凋亡活性。最优选，所述片段具有100％或更多的SEQ ID NO：17的多核苷酸编码的多肽片段的抗凋亡活性。
适宜的“抗凋亡衍生物”也包括SEQ ID NO：17的多核苷酸编码的多肽的修饰物，或含有SEQ ID NO：17的多核苷酸编码的多肽的全长天然存在的多肽的修饰物，或含有SEQ ID NO：17的天然存在的多核苷酸转录物编码的多肽的修饰物，或上述多肽片段的修饰物，所述修饰物具有抑制细胞中Bax介导的细胞凋亡的能力。优选，与SEQ ID NO：17的多核苷酸编码的多肽或其各自的片段相比，修饰的衍生物的对应部分保留了至少90％的序列同一性。更优选，修饰的衍生物的对应部分或其修饰的片段与SEQ ID NO：17的多核苷酸编码的多肽或其各自的片段具有至少91％、92％、93％、94％或95％的序列同一性，且仍然更优选具有至少96％、97％、98％或99％的序列同一性。优选，修饰的多肽或其修饰的片段保留了至少30％的SEQ ID NO：17的多核苷酸编码的多肽的抗凋亡活性。更优选，修饰的多肽或修饰的片段具有至少50％，优选至少70％且更优选至少90％的SEQ ID NO：17的多核苷酸编码的多肽的抗凋亡活性。最优选，修饰的多肽或其修饰的片段具有100％或更多的SEQ ID NO：17的多核苷酸编码的多肽抗凋亡活性。
可以理解，对于将这种基因/多肽施用于受试者的应用，其优选来自与所述受试者相同的物种，特别是如果受试者是人类受试者。
以前功能未知的来自人线粒体分离物WH6967的基因组的序列
智人线粒体分离物WH6967(GenBank登录号AY255145)具有16588个核苷酸的完整基因组长度。SEQ ID NO：18(参阅图65)中所界定的多核苷酸是从核苷酸8492-9143。两个可读框位于SEQ ID NO：18中的下列位置(如图65中的箭头所示)ORF-3：25-168和ORF-5：535-651。
就本发明人的学识而言，之前不但如SEQ ID NO：18所界定的来自人线粒体分离物WH6967基因组的多核苷酸与细胞凋亡无关，且SEQ ID NO：18的多核苷酸编码的多肽、或含有SEQ ID NO：18的多核苷酸编码的多肽的天然存在的多肽也与细胞凋亡无关。
因此，本发明包括通过向细胞施用SEQ ID NO：18的多核苷酸编码的多肽，或含有SEQ ID NO：18的多核苷酸编码的多肽的天然存在的多肽，或其抗凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸来抵抗Bax介导的细胞凋亡。
尽管已知某些线粒体蛋白与疾病状态有关，但就本发明人的学识而言，之前不但如SEQ ID NO：18所界定的来自人线粒体分离物WH6967基因组的多核苷酸与任何神经变性病或症状无关，且SEQ ID NO：18的多核苷酸编码的多肽、或含有SEQ ID NO：18的多核苷酸编码的多肽的天然存在的多肽也与任何神经变性病或症状无关。实际上，就本发明人所知，此类多肽与任何疾病状态无关，且并未用于医疗上。
因此本发明包括SEQ ID NO：18的多核苷酸编码的多肽，含有SEQ IDNO：18的多核苷酸编码的多肽的天然存在的多肽，或其抗凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸，供用于医学上。
因此，本发明包括通过向细胞施用SEQ ID NO：18的多核苷酸编码的多肽，或含有SEQ ID NO：18的多核苷酸编码的多肽的天然存在的多肽，或其抗凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸来抵抗患者中的神经变性病或症状。
适宜的“抗凋亡衍生物”包括SEQ ID NO：18的多核苷酸编码的多肽的抗凋亡衍生物，或含有SEQ ID NO：18的多核苷酸编码的多肽的天然存在的多肽的抗凋亡片段，或含有SEQ ID NO：18的天然存在的多核苷酸转录物编码的多肽的抗凋亡片段。就“抗凋亡片段”而言，我们意指具有抑制细胞中Bax介导的细胞凋亡能力的多肽的任何部分。通常，所述片段具有至少30％的SEQ ID NO：18的多核苷酸编码的多肽片段的抗凋亡活性。更优选，所述片段具有至少50％，优选至少70％且更优选至少90％的SEQ ID NO：18的多核苷酸编码的多肽片段抗凋亡活性。最优选，所述片段具有100％或更多的SEQ ID NO：18的多核苷酸编码的多肽片段的抗凋亡活性。
适宜的“抗凋亡衍生物”也包括SEQ ID NO：18的多核苷酸编码的多肽的修饰物，或含有SEQ ID NO：18的多核苷酸编码的多肽的全长天然存在的多肽的修饰物，或含有SEQ ID NO：18的天然存在的多核苷酸转录物编码的多肽的修饰物，或所述多肽的片段的修饰物，所述修饰物具有抑制细胞中Bax介导的细胞凋亡的能力。优选，与SEQ ID NO：18的多核苷酸编码的多肽或其各自的片段相比，修饰的衍生物对应的部分保留了至少90％的序列同一性。更优选，修饰的衍生物的对应部分或其修饰的片段与SEQ ID NO：18的多核苷酸编码的多肽或其各自的片段具有至少91％、92％、93％、94％或95％的序列同一性，且仍然更优选至少96％、97％、98％或99％的序列同一性。优选，修饰的多肽或其修饰的片段保留了至少30％的SEQ ID NO：18的多核苷酸编码的多肽的抗凋亡活性。更优选，修饰的多肽或修饰的片段具有至少50％，优选至少70％且更优选至少90％的SEQ ID NO：18的多核苷酸编码的多肽的抗凋亡活性。最优选，修饰的多肽或其修饰的片段具有100％或更多的SEQ ID NO：18的多核苷酸编码的多肽的抗凋亡活性。
可以理解，对于将这种基因/多肽施用于受试者的应用，其优选是来自与所述受试者相同的物种，特别是如果受试者是人类受试者。
以前功能未知的来自人线粒体分离物S1216的基因组的序列
智人线粒体分离物S1216(GenBank登录号AY289093)具有16569个核苷酸的完整基因组长度。如SEQ ID No：19(参阅图66)所界定的多核苷酸是从核苷酸7717-8283。两个可读框位于SEQ ID No：19中的下列位置(图66中箭头所示)：ORF-2：178-279和ORF-1：355-462。
就本发明人的学识而言，之前，不但如SEQ ID No：19中所界定的来自人线粒体分离物S1216的基因组的多核苷酸与细胞凋亡无关，且SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽、或含有SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽的天然存在的多肽也与细胞凋亡无关。
因此，本发明包括通过向细胞施用SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽，或含有SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽的天然存在的多肽，或其抗凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸，来抵抗细胞中Bax介导的细胞凋亡。
尽管，已知线粒体基因组在一些疾病状态中会受到影响，但就本发明人的学识而言，之前不但如SEQ ID No：19中所界定的来自人线粒体分离物S1216的基因组的多核苷酸与任何神经变性病或症状无关，且SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽、或含有SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽的天然存在的多肽也与任何神经变性病或症状无关。实际上，就本发明所知，此类多肽与任何疾病状态无关，且以前并未用于医疗上。
因此，本发明包括SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽，或含有SEQ IDNo：19的多核苷酸编码的多肽的天然存在的多肽，或其抗凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸，供用于医学上。
本发明包括通过向细胞施用SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽，或含有SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽的天然存在的多肽，或其抗凋亡衍生物，或编码所述多肽或衍生物的多核苷酸，来抵抗患者中的神经变性病或症状。
就本发明人的学识而言，之前不但如SEQ ID No：19中所界定的来自人线粒体分离物S1216的基因组的多核苷酸与细胞凋亡或任何神经变性病无关，且SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽、或含有SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽的天然存在的多肽也与细胞凋亡或任何神经变性病无关。
适宜的“抗凋亡衍生物”包括SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽的抗凋亡片段，或含有SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽的天然存在的多肽的抗凋亡片段，或含有SEQ ID No：19的多核苷酸的天然存在的多核苷酸转录物编码的多肽的抗凋亡片段。就“抗凋亡片段”而言，我们意指具有抑制细胞中Bax介导的细胞凋亡的多肽的任何部分。通常，所述片段具有至少30％的SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽片段的抗凋亡活性。更优选，所述片段具有至少50％，优选至少70％且更优选至少90％的SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽片段的抗凋亡活性。最优选，所述片段具有100％或更多的SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽片段的抗凋亡活性。
适宜的“抗凋亡衍生物”也包括SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽的修饰物，或含有SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽的全长天然存在的多肽的修饰物，或含有SEQ ID No：19的天然存在的多核苷酸转录物编码的多肽的修饰物，或所述多肽片段的修饰物，所述修饰物具有抑制细胞中Bax介导的细胞凋亡的能力。优选，与SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽或其各自的片段相比，修饰的衍生物的对应部分保留了至少90％的序列同一性。更优选，修饰的衍生物的对应部分或其修饰的片段与SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽或其各自的片段具有至少91％、92％、93％、94％或95％的序列同一性，且仍然更优选至少96％、97％、98％或99％的序列同一性。优选，修饰的多肽或其修饰的片段保留了至少30％的SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽的抗凋亡活性。更优选，修饰的多肽或修饰的片段具有至少50％，优选至少70％且更优选至少90％的SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽的抗凋亡活性。最优选，修饰的多肽或其修饰的片段具有100％或更多的SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽的抗凋亡活性。
可以理解，对于将这种基因/多肽施用于受试者的应用，其优选来自与所述受试者相同的物种，特别是如果受试者是人类受试者。
可以理解，可用于本发明的第五至第十方面的上述多肽的进一步修饰物可包括含有上文所述的多肽或其片段或编码所述多肽的多核苷酸或其片段的化合物以及另一个试剂。优选，所述化合物保留了至少30％的上文所述的各自人多肽的抗凋亡活性。更优选，所述化合物具有至少50％，优选至少70％且更优选至少90％，或100％或更多的如上文所述的各自人多肽的抗凋亡活性。所述试剂可用于与所述多肽或多核苷酸融合、组合、结合、连接或其他形式的结合，如本领域中所所熟知的。
可用的试剂包括可将多肽或多核苷酸靶向于靶组织如海马的靶向部分(targeting moieties)。适宜的靶向部分包括蛋白转导结构域如HIV-Tat、触角足(antennapedia)、PTD-5和赖氨酸同聚体。
第十一方面，本发明提供了提高细胞中Bax介导的细胞凋亡的方法，所述方法包括使细胞与多肽的抑制剂或拮抗剂接触，所述多肽选自FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1和含有SEQ ID No：16、SEQ ID No：17、SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽。
通常，体外进行所述方法。
通常，所述细胞是哺乳动物细胞，如人细胞，尽管其根据实施例是清楚的，但所述细胞可来自其他的物种如酵母。所述细胞可来自构建的细胞系、原发细胞培养物，或离体组织中存在的细胞。
可选地，可体内进行所述方法。
第十二方面，本发明提供了多肽的抑制剂或拮抗剂在制备用于提高患者细胞中Bax介导的细胞凋亡的药物中的用途，所述多肽选自FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1和含有SEQ ID No：16、SEQ ID No：17、SEQ ID No：18或SEQ IDNo：19的多核苷酸编码的多肽。
第十三方面，本发明提供了多肽的抑制剂或拮抗剂，所述多肽选自FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1和含有SEQ ID No：16、SEQ ID No：17、SEQ IDNo：18或SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽；或编码任何所述抑制剂或拮抗剂的多核苷酸，供用于医学中。
第十四方面，本发明提供了药用组合物，其含有：多肽的抑制剂或拮抗剂，所述多肽选自FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1和含有SEQ ID No：16、SEQ ID No：17、SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽；或编码任何所述抑制剂或拮抗剂的多核苷酸；以及药学上可接受的载体或赋形剂。
提高Bax介导的细胞凋亡可用于抵抗癌症，特别是脑瘤。癌细胞是永生性，因为当正常的细胞应该经历细胞凋亡的时候，它们却不能经历细胞凋亡。通过从特定组织发现细胞凋亡抑制剂，我们可以通过负调节抑制细胞凋亡过程的蛋白的表达来治疗癌症。
第十五方面，本发明提供了抵抗患者癌症的方法，所述方法包括向患者施用：多肽的抑制剂或拮抗剂，所述多肽选自FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1和含有SEQ ID No：16、SEQ ID No：17、SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽；或编码任何所述抑制剂或拮抗剂的多核苷酸。
第十六方面，本发明提供了多肽的抑制剂或拮抗剂，所述多肽选自FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1和含有SEQ ID No：16、SEQ ID No：17、SEQ ID
No：18或SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽，或编码任何所述抑制剂或拮抗剂的多核苷酸，在制备用于抵抗患者癌症的药物中的用途。
适宜的上述多肽的抑制剂或拮抗剂包括与所述多肽选择性结合的抗体。适宜的抗体可由熟练的技术人员利用本领域建立已久的技术来制备。抑制上述多肽的抗凋亡活性的抗体特别优选用于抗癌疗法，且利用本领域中已知的和本文所述的方法来选择它们的活性。
就选择性结合指定的多肽的抗体而言，我们意指抗体分子以比不相关的多肽更强的亲和力结合该多肽，如人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)。优选，抗体以比不相关的多肽大至少5，或至少10或至少50倍的亲和力结合指定的多肽。更优选，抗体分子以比不相关的多肽大至少100，或至少1,000，或至少10,000倍的亲和力结合指定的多肽。所述结合可用本领域中熟知的方法来测定，如
Figure A200780013489D0065193000QIETU
系统之一。优选，抗体分子选择性结合指定的多肽，而不会显著地结合体内的其他多肽。尽管具有更高亲和力的抗体甚至更优选，但优选，抗体对于指定多肽上的靶表位的亲和力是至少10-8M。。
就“抗体”或“抗体分子”而言，我们不但包括本领域所熟知的全免疫球蛋白分子也包括其片段如Fab、F(ab’)2、Fv以及保留抗原结合位点的其他片段。同样，术语抗体也包括抗体的遗传工程衍生物，如含有分离的V结构域的单链Fv分子(scFv)和单结构域抗体(dAbs)。术语也包括抗体样分子，其可利用噬菌体展示技术或其他的结合指定多肽或指定多肽的具体区域的分子的随机选择技术来制备。因此，术语抗体包括含有结构，优选肽结构的所有分子，所述结构是天然抗体的识别位点(即结合或连接表位或抗原的抗体的一部分)的一部分。有关保留抗体特异性结合位点的抗体片段的合成技术的一般综述，见Winter & Milstein(1991)Nature 349，293-299。
就“ScFv分子”而言，我们意指其中VH和VL伴侣结构域(partner domains)经由可变寡肽连接的分子。基因工程的抗体，如ScFv抗体可利用下列文献中描述的技术和方法来制备：Huston等(1988)“Protein engineering of antibodybinding sites：recovery of specific activity in an anti-digoxin single chain Fvanalogue produced in E.coli”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，pp.5879-5883，和A.Pluckthun，(1991)“Antibody engineering；Advances from use of E.coliexpression systems”，Bio/technology 9(6)：545-51。
利用抗体片段而不是全抗体的优势是多方面的。较小尺寸的片段可导致药学特性的改善，如更好地渗透到靶位点。除去了全抗体的效应子功能，如补体(complement)结合。Fab、Fv、ScFv和dAb抗体片段可表达于大肠杆菌内或从大肠杆菌中分泌，从而可以很容易地产生大量抗体片段。全抗体和F(ab′)2片段是二价的。就“二价的”而言，我们意指抗体和F(ab′)2片段具有两个抗原结合位点。相反，Fab、Fv、ScFv和dAb片段是单价的，仅有一个抗原结合位点。
优选，抗体是单克隆抗体。在某些情况下，特别是如果将抗体重复施用于人类患者，优选单克隆抗体是人单克隆抗体或人源化的单克隆抗体。本文所述的活性的适宜单克隆抗体可通过已知的技术来制备，如“MonoclonalAntibodies；A manual of techniques”，H Zola(CRC Press，1988)和“MonoclonalHybridoma Antibodies：Techniques and Application”，SGR Hurrell(CRC Press，1982)中的那些技术。
优选，抗体是人源化的抗体。以已知的方式，可将适当制备的非人源化的抗体进行“人源化”，例如，通过将小鼠抗体的CDR区插入到人抗体的构架内。利用Verhoeyen等(1988)Science，239，1534-1536和Kettleborough等，(1991)Protein Engineering，14(7)，773-783中记载的技术和方法，可制备人源化的抗体。利用重组技术，可制备完全人源化的抗体。通常，使用含有上亿不同抗体的大文库。与以前采用例如鼠抗体的嵌合或人源化不同，这种技术不依赖动物的免疫来产生特异性抗体。相反，重组文库含有大量的预制备的抗体变体，这样该文库就很可能会具有至少一种对任何抗原具有特异性的抗体。因此，利用此类文库，可鉴定具有期望结合特性的现有抗体。为了以有效的方式发现文库中的优良结合体，我们设计了将表型即抗体或抗体片段与其基因型即编码基因相联系的各种系统。最常用的此类系统就是所谓的噬菌体展示系统，其中抗体片段作为与噬菌体包被蛋白的融合物表达、显示于丝状噬菌体颗粒的表面，同时携带编码所展示的分子的遗传信息(McCafferty等，1990，Nature 348：552-554)。可以通过结合正讨论的抗原来挑选出对特定抗原具有特异性的噬菌体展示抗体片段。随后，对分离的噬菌体进行扩增，并将编码选择的抗体可变区的基因任选地转换成其他的抗体形式，如全长的免疫球蛋白，并利用本领域中熟知的适当的载体和宿主细胞进行高量表达。
展示的抗体对噬菌体颗粒的特异性的形式可以不同。最常用的形式是Fab(Griffiths等，1994.EMBO J.13：3245-3260)和单链(scFv)(Hoogenboom等，1992，J Mol Biol.227：381-388)，两者都含有抗体的可变抗原结合结构域。单链形式是由经由柔性连接体连接于可变的轻结构域(VL)的可变重结构域(VH)组成(US 4,946,778)。在作为治疗剂使用之前，可将抗体转变成可溶的形式，如Fab或scFv，并进行同样的分析。在以后的步骤中，可将确定具有期望的特性的抗体片段转变成其他的形式，如全长抗体。
WO 98/32845和Soderlind等(2000)Nature BioTechnol.18：852-856，描述了在抗体文库中产生变异性的技术。来自这种文库的抗体片段都具有相同的构架区且仅在它们的CDRs之间有不同。因为构架区是种系序列(germlinesequence)，因此，预料来自文库或利用相同的技术产生的相似的文库的抗体的免疫原性特别低(Soderlind等，2000)。这种特性对于治疗性抗体来说是非常有价值的，其降低了患者形成针对施用抗体的抗体的风险，据此降低了变态反应的风险，阻断了抗体的出现，且能形成较长的抗体细胞质半寿期。因此，当开发用于人的治疗性抗体时，如今，优先于早期的杂交瘤技术，而利用现代的重组文库技术(Soderlind等，2001，Comb.Chem.& High ThroughputScreen.4：409-416)。
上述多肽的其他适宜的抑制剂或拮抗剂包括对编码上述多肽的核苷酸具有特异性且阻止它们表达的siRNA、反义多肽以及核酶分子。
小型干扰RNA由Hannon等.Nature，418(6894)：244-51(2002)、Brummelkamp等，Science 21，21(2002)以及Sui等，Proc.Natl Acad.Sci.USA99，5515-5520(2002)作了描述。RNA干扰(RNA interference，RANi)是在动物中由双链RNA(dsRNA)引发的序列特异性转录后基因沉默过程，所述双链RNA与钙沉默基因在序列上同源。序列特异性mRNA降解调节剂通常是21和22个核苷酸的小型干扰RNA(siRNAs)，其在体内可通过核糖核酸酶III从较长的dsRNAs切割下而产生。已证明，21个核苷酸的siRNA双链体能特异性地抑制内源和异源基因的表达(Elbashir等(2001)Nature 411：494-498)。在哺乳动物细胞中，认为siRNA必须是由如下文所述的两个互补的21mers所组成，因为较长的双链(ds)RNAs将激活PKR(dsRNA-依赖性蛋白激酶)并抑制全部的蛋白合成。
通过参考其cDNA序列，可很容易地设计对编码任何上述多肽的多核苷酸具有选择性的双链体siRNA分子。例如，通过参考上文所列的GenBank登录号中的cDNA序列，或鉴定为实施例中所述筛选结果的cDNA序列(图62-66中的SEQ ID Nos：5-19)，来进行设计。通常，选择以AA双核苷酸为起始的第一个21mer的序列，所述21mer序列为从抑制剂甲硫氨酸密码子下游起的至少120个核苷酸。优选与其互补的RNA序列成为第一个RNA寡核苷酸。第二个RNA序列应该优选与第一个在其3’端具有额外的UU双核苷酸的最初19个残基互补。一旦设计完，可利用本领域中熟知的方法合成准备合成的RNA分子。
利用任何如本文所述的适宜方法，可将siRNAs引入患者的细胞。通常，例如通过包含于适宜的载体或运载工具，来保护RNA免受细胞外环境破坏。优选，脂质体介导的转移。特别优选，使用oligofectamine法。
通过参考其cDNA或基因序列，如本领域中所知的，可很容易地设计对编码任何上文所列的多肽的多核苷酸具有选择性的反义核酸。反义核酸，如寡核苷酸，是单链核酸，其可特异性地结合互补的核酸序列。通过结合于适当的靶序列，形成RNA-RNA、DNA-DNA或RNA-DNA双链。因为它们与基因的有义链或编码链互补，因此经常将这些核酸称为“反义”。近来，已证明形成三螺旋是可能的，其中寡核苷酸与DNA双链结合。据发现，寡核苷酸会识别DNA双螺旋的大沟内的序列。从而，形成三螺旋。这表明，合成经由识别大沟的氢结合位点而特异性结合双链DNA的序列特异性分子是可能的。通过结合于靶核苷酸，上述寡核苷酸可抑制靶核苷酸的功能。其可能的结果是例如阻断了转录、加工、poly(A)添加、复制、翻译或促进细胞抑制机制如促进RNA降解。
在实验室内制备反义寡核苷酸，随后引入细胞，例如通过从细胞培养基微注射或吸收而进入细胞，或在用携带反义基因的质粒或逆转录病毒或其他的载体转染后，让它们在细胞中表达。首先发现反义寡核苷酸在细胞培养物中抑制下列病毒的病毒复制或表达：劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)、水泡口炎病毒(vesicular stomatitis virus)、1型单纯疱疹病毒(herpes simplex virustype1)、猴病毒(simian virus)和流感病毒(influenza virus)。此后，在包括兔网状细胞裂解物和小麦胚芽提取物的无细胞系统中，对反义寡核苷酸抑制mRNA翻译进行了广泛研究。利用与AIDS HIV反转录病毒RNA互补的寡核苷酸，已经离体证明了翻译寡核苷酸对病毒功能的抑制(Goodchild，J.1988“Inhibition of Human Immunodeficiency Virus Replication by AntisenseOligodeoxynucleotides”，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85(15)，5507-11)。Goodchild的研究表明，与Poly(A)信号互补的寡核苷酸最有效；靶向RNA5’末端，特别是帽和5N未翻译区、邻近引物结合位点和位于引物结合位点的寡核苷酸也有效。帽、5’未翻译区和Poly(A)信号位于在反转录病毒RNA末端(R区)重复的序列内，且与它们互补的寡核苷酸可与RNA结合两次。
通常反义寡核苷酸的长度为15-35个碱基。例如，显示20mer寡核苷酸会抑制表皮生长因子受体mRNA的表达(Witters等.，Breast Cancer Res Treat53：41-50(1999))，且25mer寡核苷酸会降低促肾上腺皮质激素表达高于90％(Frankel等.，J Neurosurg 91：261-7(1999))。然而，应该理解，可以利用长度在此范围外的寡核苷酸，例如10、11、12、13或14个碱基，或36、37、38、39或40个碱基。
反义寡核苷酸可全身施用。可选地，且优选，通过体内限制多核苷酸对其既定基因座的有效性，提高以碱基配对为特征的该多核苷酸的固有结合特异性，从而允许施用更低的剂量且使全身效果最小化。因此，可将多核苷酸局部施用于癌症，以实现期望的效果。在期望的基因座上，多核苷酸的浓度比全身施用多核苷酸时高的多，且可利用显著较低的总量，来获得治疗效果。局部高浓度的多核苷酸提高了靶向细胞的渗透，且有效阻断了靶核苷酸序列的翻译。
可以理解，反义试剂也包括较大的分子，其结合编码任何上述多肽的多核苷酸(mRNA或基因)，且实质阻止该蛋白的表达。因此，基本上与各自mRNA互补的反义分子也是可以预料到的。
较大的分子可从任何适宜的基因构建体(genetic construct)中表达且递送至患者。通常，表达反义分子的基因构建体含有至少可操作地连接于可在细胞中表达反义分子的启动子的cDNA或基因的一部分。优选，该基因构建体适于递送至人细胞。
核酶是RNA或RNA蛋白复合体，其以位点特异性方式切割核酸。核酶具有特异性的催化结构域，其具有核酸内切酶活性。例如，大量核酶高度特异性地加速磷酸酯转移反应，经常仅切割寡核苷酸底物中几个磷酸酯中的一个。这种特异性归因于底物需要在化学反应之前经由特异性的碱基配对相互作用先结合核酶的内部引导序列(internal guide sequence，IGS)。
作为涉及核酸的序列特异性切割/连接反应的一部分，首先观察了核酶的催化作用。例如，美国专利第5,354,855号报道了某些核酶可充当核酸内切酶，其序列特异性比已知的核酸内切酶更强，且接近了DNA限制酶的序列特异性。因此，基因表达的序列特异性核酶介导的抑制可特别适宜于治疗应用，且可通过参考上文给出的GenBank登录号中列出的cDNA序列或参考SEQ ID NOs：5-19来设计。
也可设计抑制编码任何上述多肽的基因转录的其他制剂，例如利用Isalan等(Nat Biotechnol，19(7)：656-60(2001))和Urnov(Biochem Pharmacol，64(5-6)：919(2002))所述的基因工程转录抑制剂。它们也可另外选择，例如利用本发明稍后方面所述的筛选方法。
治疗(治疗)可作用于人或动物。优选，本发明的方法用于治疗人。
为了施用于个体，通常将上文本发明的第五至第十六方面所述的各种治疗剂配制成药用组合物，即与药学上可接受载体或赋形剂一起使用。
就“药学上可接受的”而言，包括无菌和无热源配制剂。适宜的药学上载体在药学领域是熟知的。
载体必须是与治疗剂一致意义上的“可接受的”，且对其接受者无害。通常，载体是无菌且无热源的水或盐水；然而其他的可接受载体也可使用。
在一实施方案中，本发明的药用组合物或配制剂是用于非肠道施用，更特别是用于静脉内施用，例如通过注射。适宜非肠道施用的配制剂包括含水或不含水的无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使该制剂与既定的接受者血液等渗的溶质；和含水和不非含水的无菌悬浮液，其可包括悬浮剂和增稠剂。
在可选的优选实施方案中，药用组合物适宜局部施用于患者。
优选，配制剂是含有每日剂量或单位、每日亚剂量或其适当部分的单位剂量的活性成分。
治疗剂可以下列形式口服或通过任何非肠道途径施用：以含有活性组分的药用配制剂的形式，任选地以非毒性有机或无机酸或碱、加成盐的形式，以药学上可接受剂量的形式。依赖于待治疗的疾病和患者，以及施用途径，组合物可以以变化的剂量施用。
在本文中，术语“治疗剂”包括多肽，和多核苷酸和其它分子，除非本文另外说明外。例如，在某些情况下，术语“治疗剂”是仅指多肽或仅指多核苷酸，且会在文中进行清楚的说明。
在人治疗中，治疗剂可单独施用，但通常以与根据既定的施用途径和标准的药学实践选择的适宜药用赋形剂、稀释剂或载体的混合物的形式来施用。
例如，治疗剂可以片剂、胶囊、卵形囊剂(ovules)、酏剂(elixirs)、溶液或悬浮液的形式口服、口腔或舌下施用，上述制剂可含有增味剂或着色剂用于速释、缓释或控释施用。本发明的化合物也可经由阴茎海绵体注射施用。
此类片剂可含有赋形剂，如微晶纤维、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙、和甘氨酸；崩解剂，如淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、羧甲淀粉钠(sodium starch glycollate)、交联羧甲基纤维素纳(croscarmellose sodium)和某些复合硅酸盐；以及颗粒粘合剂(granulation binders)，如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(hydroxypropylmethylcellulose，HPMC)、羟丙基纤维素(hydroxy-propylcellulos，HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯树胶。另外，也可包括润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯和滑石。
也可使用相似类型的固体组合物作为明胶胶囊中的填充物。在此情况下，优选的赋形剂包括乳糖、淀粉、纤维素、乳糖或高分子量聚乙二醇。对于含水悬浮液和/或酏剂来说，治疗剂也可以与各种甜味剂、或调味剂、着色剂或染料组合；与乳化剂和/或悬浮剂组合；以及与稀释剂如水、乙醇、丙二醇和丙三醇或其组合进行混合。
治疗剂也可以非肠道施用，例如，静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内(intrathecally)、心室内、胸骨内、头颅内、肌肉内或皮下施用，或它们可通过输注技术施用。它们最好以无菌含水溶液的形式使用，所述溶液可含有其他的物质，如足够的盐或葡萄糖，以使该溶液与血液等渗。如果需要，该含水溶液可适当地进行缓冲处理(优选处理为pH3-9)。在无菌的条件下制备合适的非肠道制剂可通过本领域熟练的技术人员熟知的标准药学技术来实现。
适宜非肠道施用的配制剂包括含水或不含水的无菌注射溶液，其可含有使该配制剂与既定的接受者的血液等渗的抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和溶质；以及含水和不含水无菌悬浮液，其可包括悬浮剂和增稠剂。该配制剂可存在于单位剂量或多剂量容器内，如密封的安瓿和小瓶，并且保存冷冻干燥(冻干)的条件下，仅需要在要使用前加入无菌液体载体(例如注射用水)。
可根据上文所述的无菌粉、颗粒和片剂型来制备临时注射溶液和悬浮液。
为了给人类患者口服或非肠道施用，治疗剂的日剂量水平通常是从1-1000mg/成人(即约0.015-15mg/kg)，以单次剂量或多次剂量来施用。
因此，例如，如果适当，治疗剂的片剂或胶囊可含有1mg-1000mg的活性试剂用于每次单独、两次或多次施用。医师可在任何情况下决定何种实际剂量最适合每位个体患者，并且随着具体患者的年龄、体重和应答而变化。上述剂量是平均情况的示例。当然，存在个别的情况，其中更高或更低的剂量范围是更有利的，并且在本发明的范围内。
治疗剂可以鼻内施用，或通过吸入施用，并且便利地以干粉吸入器或气雾剂喷射呈递的形式，用适宜的推进剂从加压容器、泵、喷雾器(spray)或雾化器中递送，所述的推进剂为如二氯二氟甲烷、三氯一氟甲烷、二氯四氟乙烷、氢氟烷(hydrofluoroalkane)如1，1，1，2-四氟乙烷(HFA134A3或1，1，1，2，3，3，3，-七氟丙烷(HFA 227EA3)、二氧化碳或其他适宜的气体。在加压气雾剂的情况下，可通过阀门递送计量的量来测定剂量单位。加压容器、泵、喷雾器或喷雾器可含有活性化合物的溶液或悬浮液，例如，使用乙醇和推进剂的混合物作为溶剂，其可另外含有润滑剂，如山梨醇三油酸酯(sorbitantrioleate)。可将吸入器或吹药器(insufflator)中使用的胶囊和药筒(例如由明胶制成)，配成含有治疗剂和适宜的粉末基质(如乳糖、或淀粉)的粉末混合物。
优选配制气雾剂剂或干粉剂，而使得每一次计量的剂量或“喷出”(puff)含有至少1mg递送至患者的治疗剂。应当认识到，气雾剂形式的日总剂量针对不同患者而不同，并且在一天内以单次剂量或通常多次剂量施用。
可选地，以栓剂或阴道栓剂的形式施用治疗剂，或它们也可以以洗剂、溶液、乳剂、软膏(ointment)或爽身粉形式局部应用。治疗剂也可以透皮施用，例如，通过使用皮肤贴(skin patch)。它们也可以通过眼睛途径施用，特别是对于治疗眼睛疾病。可以根据本发明治疗的眼睛疾病包括青光眼、色素性视网膜炎(retinitis pigmentosa)、白内障形成(cataract formation)、视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)、视网膜缺血(retinal ischemia)以及糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy)。
对于眼科应用，治疗剂可配制为等渗的pH调节的无菌生理盐水形式的微粉化悬浮液，或优选，等渗的pH调节的无菌生理盐水形式的溶液，任选地与防腐剂如苯扎氯铵组合。可选地，它们也可配制成药膏，如凡士林药膏。
对于局部应用于皮肤，可将治疗剂配制为含有活性化合物的适宜的软膏，所述的适宜化合物悬浮于或者溶解于例如具有下列一种或多种物质的混合物中：矿物油、液体凡士林(liquid petrolatum)、白色凡士林(whitepetrolatum)、丙二醇、聚乙烯聚丙烯化合物、乳化蜡(emulsifying wax)和水。可选地，可将其配制成适宜的洗剂或乳剂，悬浮或溶解于例如一种或多种下列物质的混合物中：矿物油、山梨醇单硬脂酸酯(sorbitan monostearate)、聚乙二醇、液体石蜡、聚山梨醇酯60(polysorbate 60)、十六醇酯蜡(cetyl esterswax)、鲸蜡醇(cetearyl alcohol)、2-辛基十二烷醇(octyldodecanol)、苯甲醇和水。
适宜在口腔中局部施用的配制剂包括，含有在调味成分通常为蔗糖和阿拉伯树胶或黄芪胶中的活性成分的锭剂(lozenges)；含有在惰性成分如明胶和丙三醇或蔗糖和阿拉伯树胶中的活性成分的软锭剂(pastilles)；以及含有在适宜的液体载体中的活性成分的漱口液(mouth-washes)。
对于兽医学应用来说，可依据常规兽医学实践将治疗剂以适宜的可接受配制剂施用，且兽医学外科医生可以决定最适宜于具体动物的给药方案和施用途径。
在一实施方案中，多肽递送可利用可注射的维持释放药物递送系统来进行。对它们进行特别设计以减少注射频率。此类系统的实例是NutropinDepot，其将重组人生长激素(recombinant human growth hormone，rhGH)封装于生物可降解的微滴中，该微滴一旦注射，则在维持期缓慢释放rhGH。
可通过直接将药物释放于所需部位的外科植入装置来施用多肽。例如，Vitrasert直接将更昔洛韦(ganciclovir)释放入眼睛中来治疗CMV视网膜炎。直接将这种有毒药剂应用于疾病部位可以实现有效地治疗，而没有药物的明显全身副作用。
电穿孔治疗(electroporation therapy，EPT)系统也可用来施用多肽。递送脉冲电场至细胞的装置增加细胞膜对药物的渗透性，而导致显著提高细胞内药物递送。
多肽也可通过电引入(electroincorporation，EI)来递送。当皮肤表面直径高至30μm的小颗粒进行与电穿孔所用相同或类似的电脉冲时，会出现EI。在EI中，这些颗粒穿过角质层(stratum corneum)，进入皮肤的更深层。颗粒可负载或包被有药物或基因，或可仅充当在皮肤上产生孔的“子弹”，药物通过所述孔进入。
多肽递送的可选择方法是热敏感的ReGel注射系统。低于体温时，ReGel是可注射液体，而在体温时，其立即形成凝胶储库(gel reservior)，该储库缓慢消蚀并溶解为已知安全的生物可降解多聚体。随着生物多聚体逐渐溶解，活性药物就得以递送。
多肽药物也可口服递送。这个方法利用体内维生素B12口服吸收的自然过程来共同递送蛋白和肽。通过摆脱维生素B12吸收系统，蛋白或肽可穿过肠壁。在维生素B12类似物和药物之间合成复合物，该复合物既保留了对复合物的维生素B12部分中固有因子(intrinsic factor，IF)的显著亲和力，也保留了复合物药物部分的显著生物活性。
多核苷酸可通过任何有效方法来施用，例如非肠道(如静脉内、皮下、肌肉内)，或通过口服、鼻腔或其他允许寡核苷酸进入患者血流并在其中循环的其他方式。除了局部施用的多核苷酸外，还提供了优选全身施用的多核苷酸，但其在不进行局部施用时也有效用。通常范围为每次施用给成人约0.1-约10g的剂量对于此目的是有效的。
如下文所述，可将多核苷酸作为如适宜的基因构建体来施用，且递送至患者中表达它们的地方。通常，将基因构建体中的多核苷酸可操作地连接于可在细胞中表达化合物的启动子。利用本领域中熟知的方法，例如Sambrook等(2001)中的方法，可制备本发明的基因构建体。
尽管递送多核苷酸的基因构建体可以是DNA或RNA，但优选它们是DNA。
优选，使基因构建体适应递送于人细胞。
将基因构建体引入动物细胞体内细胞的方式和方法在本领域内是已知的。例如，本发明的构建体可通过任何常规的方法引入细胞，如包含反转录病毒的方法以便将构建体插入细胞的基因组。如在Kuriyama等(1991，CellStruc.and Func.16，503-510)中，施用纯化的反转录病毒。利用本领域熟知的方法，可制备含有上文所述多核苷酸的反转录病毒DNA构建体。为了从此类构建体中产生活性反转录病毒，通常使用培养于含有10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)中的亲嗜性psi2包装细胞系(ecotropic psi2 packaging cell line)。细胞系的转染可便利地利用磷酸钙共沉淀的方式，且通过添加G418至终浓度1mg/ml，来选择出稳定的转化体(假定反转录病毒构建码头含有neoR基因)。分离并扩大独立的菌落，并除去培养物的上清液，通过0.45μm的孔尺寸过滤器过滤，并保存于-70℃下。对于向肿瘤细胞引入反转录病毒来说，例如，直接注射反转录病毒上清液是很方便的，该上清液中已经加入了10μg/ml的聚季胺(polybrene)。对于直径超过10mm的肿瘤来说，注射0.1ml-1ml的反转录病毒上清液是合适的，优选0.5ml。
可选地，如Culver等(1992，Science 256，1550-1552)所述，可注射产生反转录病毒的细胞。可对引入的产生反转录病毒的细胞进行基因改造，从而产生反转录病毒载体颗粒，以便连续的载体产生会出现于原位肿瘤块(tumormass)中。因此，如果与反转录病毒载体产生细胞混合，就可成功地体内转导增殖的上皮细胞。
靶向性反转录病毒也可用于本发明，例如，可将赋予特异性结合亲和性的序列基因改造成预先就有病毒env基因(对于这种以及其他基因治疗的靶向载体，参阅Miller & Vile(1995)Faseb J.9，190-199)。
其他的方法包括将构建体简易地递送至细胞，用于在限定的时间内表达，或者在整合于基因组后，在更长的时间内表达。后一个方法的实例包括脂质体((
Figure A200780013489D0075193434QIETU
等(1992)Cancer Res.52，646-653))。
其他的递送方法包括作为载体的经由抗体-聚赖氨酸桥携带外源DNA的腺病毒(参阅Curiel(1993)Prog.Med.Virol.40，1-18)以及运铁蛋白-聚阳离子共轭物(Wagner等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，3410-3414)。这些方法的第一个方法中，聚阳离子-抗体复合物是与本发明的DNA构建体或其他的基因构建体形成的，其中所述抗体对野生型腺病毒或变体腺病毒是特异性的，所述变体腺病毒引入了新的结合抗体的表位。聚阳离子部分经由与磷酸盐骨架的相互作用结合DNA。腺病毒，因为其含有未改变的纤维蛋白和腺病毒亚单位蛋白，因此被引入细胞内部，且与本发明的DNA构建体一起携带进入细胞。优选，聚阳离子为聚赖氨酸。
在可选的方法中，采用利用受体介导的内吞作用来携带DNA大分子进入细胞的高效核酸递送系统。这可由将离子运输蛋白运铁蛋白与结合核酸的聚阳离子结合来实现。将人运铁蛋白或鸡同源物伴清蛋白或其组合通过二硫键共价连接于小型DNA结合蛋白精蛋白或各种大小的聚赖氨酸。这些修饰性运铁蛋白分子维持了其结合其相关受体和有效地介导将铁运输到细胞的能力。不依赖核酸大小(从短寡核苷酸到21,000bp的DNA)，运铁蛋白-聚阳离子分子与本发明的DNA构建体或其他的基因构建体形成电泳稳定的复合体。当将运铁蛋白-聚阳离子和本发明的DNA构建体或其他的基因构建体的复合体提供给肿瘤细胞时，预料构建体可在细胞中高水平表达。
可以利用由Cotten等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，6094-6098所述方法产生的缺陷性或化学灭活的腺病毒颗粒的内体破裂活性(endosome-disruption activity)，来高效地受体介导递送本发明的DNA构建体或其他的基因构建体。这种方法显然依赖于下列事实：即腺病毒适合从内体中释放其DNA而无需经溶酶体的通道，且在存在例如连接于本发明的DNA构建体或其他的基因构建体的运铁蛋白时，细胞以与腺病毒颗粒相同的途径，吸收构建体。这种方法的优势在于：不需要使用复杂的反转录病毒构建体；不存在与如用反转录病毒感染时发生的永久性基因组修饰；以及靶向性表达系统偶联了靶向递送系统，因而降低了对其他细胞类型的毒性。
可以理解，“裸DNA”和与阳离子和中性脂质复合的DNA也可用于将本发明的DNA引入待治疗的单个细胞中。基因治疗的非病毒方法描述于Ledley(1995，Human Gene Therapy 6，1129-1144)中。
可选的靶向递送系统也是已知的，如WO 94/10323中所述的修饰性腺病毒系统，其中，通常DNA携带于腺病毒或腺病毒样颗粒中。Michael等(1995)Gene Therapy 2，660-668描述了修饰腺病毒，从而来将细胞选择性部分添加到纤维蛋白中。在p53缺陷性人肿瘤细胞中选择性复制的突变体腺病毒，如Bischoff等(1996)Science 274，373-376所描述的那些，也可用于将本发明的基因构建体递送至细胞。因此，可以理解，本发明的进一方面提供了含有本发明基因构建体的病毒或病毒源颗粒。其他适宜的病毒、病毒载体或病毒样颗粒包括慢病毒载体、HSV、腺相关病毒(adeno-associated viral，AAV)、基于AAV的载体、疫苗和细小病毒。
向患者递送多核苷酸的方法对本领域技术人员来说是熟知的，包括使用免疫脂质体、病毒载体(包括疫苗、修饰的疫苗和腺病毒)，以及通过直接递送DNA，例如利用基因枪和电穿孔。而且，将多核苷酸递送至患者靶组织的治疗方法在本领域内也是熟知的。
对于涉及治疗神经变性病的应用，优选，将治疗剂或配制剂直接施用于患者的大脑或大脑的具体区域如海马。
将治疗剂直接靶向或递送于身体的具体区域包括大脑的方法，对本领域技术人员而言是熟知的。如，美国专利第6,503,242号描述了用于直接将治疗剂递送至海马的植入性导管装置。
在一个实施方案中，通过例如腰椎穿刺(lumbar puncture)(参阅例如Kapadia等(1996)Neurosurg 10：585-587)，注射入脑脊液，来将包括载体的治疗剂分布于CNS的广泛区域。可选地，使用立体定向微注射技术(stereotacticmicroinjection techniques)，可指导治疗剂向大脑具体位点的准确递送。例如，将正治疗的受试者安置于立体定向框架基座(stereotactic frame base)(MRI兼容)，然后，利用高分辨率的MRI成像，来测定待治疗的具体区域的三维定位。随后将MRI图像转移至具有适当的立体定向软件的计算机中，使用大量图像来测定治疗剂微注射的靶位点和轨道。这种软件将轨道转换成三维坐标，从而精确记录立体框架。对于头颅内递送的情况来说，暴露头骨，并在入口位点钻孔，用立体定向装置对针进行定位并且确保在预定深度植入。可将治疗剂递送至CNS区域，如海马、脊髓细胞、脑干(骨髓、脑桥和中脑)、小脑、中脑(丘脑、视丘下部)、终脑(纹状体、大脑皮层，或皮质、枕叶、颞叶、顶叶或额叶内)，或其组合。在另一个实施方案中，利用其他的适宜局部递送的递送方法，如血脑屏障的局部渗透，来递送治疗剂。
将病毒或非病毒载体递送至中枢神经系统的细胞。在一个实施方案中，本发明使用腺相关病毒(adeno-associated viral，AAV)载体，用于递送编码治疗剂或就是治疗剂的多核苷酸。产生病毒载体如AAV载体的方法在本领域中是熟知的(参阅Sambrook等，2001，同上)。
利用已知的技术构建AVV载体，提供至少可操作连接的调控元件组分，包括转录起始区、为治疗剂或者编码治疗剂的多核苷酸、转录终止区以及至少一种转录后调节序列。选择在靶向细胞中有功能的调控元件。
美国专利申请第20050025746号描述了将编码治疗剂的腺相关载体(AAV)局部递送至与神经变性病有关的大脑具体区域如海马、基底节的丘脑核、mesaphilia和丘脑的递送系统。
优选，利用中枢神经系统(central nervous system，CNS)特异性启动子，如神经元特异性启动子(如神经丝启动子(Byrne和Ruddle，1989)和神经胶质特异性启动子(Morii等，1991))来指导多核苷酸优先在CNS细胞中表达。优选，启动子是组织特异性的且在中枢神经系统外基本上是没有活性的，或者启动子的活性在中枢神经系统要比在其他的细胞或组织中高。例如，对脊髓细胞、脑干(骨髓、脑桥和中脑)、小脑、中脑(丘脑、视丘下部)、终脑(纹状体、大脑皮层，或皮质、枕叶、颞叶、顶叶或额叶内)或其组合具有特异性的启动子。启动子可以是对具体细胞型特异性的，如CNS中的神经元或神经胶质细胞。如其在神经胶质细胞是有活性的，则其可能是对星形胶质细胞、少突角质细胞、室管膜细胞(ependymal cells)、雪旺细胞(Schwann cells)、或微胶质(microglia)特异性的。如果其在神经元中是有活性的，则其可能是对具体类型神经元特异性的，如运动神经元、感觉神经元或中间神经元。优选，启动子对大脑具体区域如皮质、stratium、黑质和海马中的细胞是特异性的。
适宜的神经元特异性启动子包括但不限于，神经元特异性烯醇酶(NSE；Olivia等(1991)；GenBank登录号X51956)和人神经丝轻链启动子(NEFL；Rogaev等(1992)；GenBank登录号L04147)。神经胶质特异性启动子包括但不限于，神经胶质纤维状酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)启动子(Morii等(1991)；GenBank登录号M65210)、S100启动子(Morii等(1991)；GenBank登录号M65210)和谷氨酸合成酶启动子(Van den等(1991)；GenBank登录号X59834)。在优选的实施方案中，神经元特异性烯醇酶(neuron specificenolase，NSE)启动子位于基因上游(即5’)的侧翼。在另一个优选的实施方案中，延伸因子1α(EF)启动子位于目的基因上游(即5’)的侧翼。可用的海马特异性启动子是海马特异性糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor，GR)基因启动子。
可选地，对于治疗心血管疾病来说，Svensson等(1999)描述了通过心肌内注射或冠状动脉内输注亲心性载体如重组腺相关病毒载体，来递送重组基因至心肌细胞，导致转基因在鼠心肌细胞体内表达。Melo等(2004)评述了心脏病的基于基因和细胞的治疗法。可选的优选施用途径是经由导管或支架(stent)。支架是一种局部基因递送的有利方式，因为它们为延长基因洗脱(geneelution)和相对动脉壁(opposed arterial walls)的高效转导(efficient transduction)提供了平台。这种基因递送策略具有降低病毒载体全身传播的潜力，因而降低了宿主的免疫应答。已显示，合成的和天然存在的支架包被(stent coatings)都有潜力延长基因洗脱，而没有显著的副反应(Sharif等，2004)。优选，将编码抗体分子的多核苷酸可操作地连接于靶向和/或调节序列，靶向和/或调节序列指导抗体表达至动脉且优选动脉壁。因此，多核苷酸可以在侵染的个体内产生特异性抗体。适宜的靶向和调节序列对技术人员而言是已知的。
可能需要能暂时调节多核苷酸在细胞中的表达。因此，期望多核苷酸的表达直接或间接地(参阅下文)受可由小分子的浓度调节的启动子的调控，当期望激活或更有可能抑制(依赖于小分子是否影响所述启动子的激活或抑制)抗体由多核苷酸表达时，将所述小分子施用于患者。如果表达构建体是稳定的，即能在细胞内表达抗体(在存任何必需的调节分子的情况下)至少1周、1、2、3、4、5、6、8个月或1或多年的时期，则这特别有利。因此，可将多核苷酸可操作地连接于调节启动子。调节启动子的实例包括下列文献中提到的那些：Rivera等(1999)Proc Natl Acad Sci USA 96(15)，8657-62(由雷帕霉素(rapamycin)，一种口服的生物有效性药物，利用两个分离的腺病毒或腺相关病毒(AAV)来调控，一种为编码可诱导的人生长激素(human growth hormone，hGH)靶基因，另一种为双向雷帕霉素调节的转录因子)；Magari等(1997)JClin Invest100(11)，2865-72(由雷帕霉素调控)；Bueler(1999)Biol Chem380(6)，613-22(腺相关病毒载体综述)；Bohl等(1998)Blood 92(5)，1512-7(由腺相关病毒载体中的强力霉素调控)；Abruzzese等(1996)J Mol Med 74(7)，379-92(评述了诱导因子，如激素、生长因子、细胞因子、细胞抑制剂、辐射、热休克和相关应答元件)。
另一个将治疗剂靶向胰腺细胞用于治疗糖尿病、靶向滑膜细胞用于治疗风湿性关节炎，或靶向具体癌症的方法是将细胞凋亡抑制性多肽与由抗原而产生的抗体结合，所述抗体由这些疾病状态中的相关细胞大量产生。
第十七方面，本发明提供了鉴定能调节基因表达的化合物的方法，所述基因是选自FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1和转录信息具有含有SEQ ID No：16、SEQ ID No：17、SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的cDNA序列的基因，所述方法包括：
提供含有可操作地连接于启动子和/或基因的调节部分的报道基因，所述的基因是选自FKBP2、EEF1A1、SNCA、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1和转录信息具有含有SEQ ID No：16、SEQ ID No：17、SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的cDNA序列的基因；
将细胞与候选化合物接触；以及
测量报道基因的表达。
其中报道基因对应候选化合物的表达改变能鉴定出能调节基因表达的化合物，所述基因选自FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1和转录信息具有含有SEQID No：16，SEQ ID No：17，SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的cDNA序列的基因。
报道基因表达的增加表明，鉴定的化合物能增加从天然存在的启动子的各种多肽的体内表达。
报道基因表达的减少表明，鉴定的化合物降低从其天然存在的启动子的各自多肽的体内表达。
本领域中许多报道基因是已知的，包括β-GAL、GFP和水母发光蛋白(其依赖细胞内钙的增加而发光)。
就“选自FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1的基因和转录信息具有含有SEQ IDNo：16，SEQ ID No：17，SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的cDNA序列的基因的基因”而言，我们意指天然基因组序列，其当转录时能编码多肽。基因的天然基因组序列可含有内含子。
启动子是由DNA序列形成的表达调控元件，该DNA序列允许RNA聚合酶的结合和转录发生。测定基因启动子区序列的方法在本本领域内是熟知的。通过鉴定已知的基元，可测定启动子区的存在，并通过已鉴定序列的突变分析来证实。优选，启动子序列位于基因转录起始位点和转录起始位点上游(5’)5kb之间的区域，所述基因选自FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1和转录信息具有含有SEQ ID No：16，SEQ ID No：17，SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的cDNA序列的基因。更优选，其位于转录起始位点和起始位点上游(5’)的3kb或2kb或1kb或500bp之间的区域，且仍然更优选，其位于转录起始位点上游(5’)的250bp内。
调节区或转录元件如增强子，比启动子相对于基因的位置更难预测。然而许多指示调节区的基元得到充分的表征，且此类影响相关基因转录水平的区域可根据这些基元来鉴定。此类区域的功能可由熟知的方法来证明，如突变分析和体外DNA结合分析，包括DNA足迹法(DNA footprinting)和凝胶迁移率变动分析(gel mobility shift assays)。
影响基因转录的调节区可能位于转录起始点和相对转录起始点上游5’的20kb或10kb或7kb或5kb或3kb，或更优选1kb处之间的区域，或位于该基因的内含子中，所述基因选自FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1和转录信息具有含有SEQ ID No：16，SEQ ID No：17，SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的cDNA序列的基因。
人SNCA基因的基因组序列可见于人PAC27M07中，且α-突触核蛋白翻译起始位点上游10.7kbDNA片段(位置19040-29776)可用作功能性启动子序列(Touchman等，2001)。SNCA基因登录号是AF163864，转录起始位点在该PAC中的位置29777处。通过参考有关该基因组序列中启动子和调节区的位置的序列数据和上述位置信息，可容易地鉴定人SNCA基因中的其他适宜的启动子和/或调节部分。
人FKBP2基因的基因组序列(智人11号染色体基因组重叠群)可见于GenBank登录号NT_033903中，且基因组全序列(外显子和内含子)开始于该基因组序列的位置9314208。因此，通过参考有关该基因组序列中启动子和调节区的位置的序列数据和上述位置信息，可容易地鉴定FKBP2基因中的适宜启动子和/或调节部分。
人EEF1A1基因的基因组序列可见于GenBank登录号AL603910(来自6号染色体中克隆RP11-505P4的人DNA序列)中，且基因组全序列(外显子和内含子)开始于该基因组的位置113397(互补物)。因此，通过参考有关该基因组序列中启动子和调节区的位置的序列数据和上述位置信息，可鉴定人EEF1A1基因中的适宜启动子和/或调节部分。
人VAMP3基因的基因组序列可见于GenBank登录号Z98884(来自染色体1p36.21-36.33中RP3-467L1的人DNA序列)，且转录起始位点在该基因组序列的位置50661处。因此，通过参考有关该基因组序列中启动子和调节区的位置的序列数据和上述位置信息，可容易地鉴定人VAMP3基因中适宜的启动子和/或调节部分。
人SNAP25基因的基因组序列见于GenBank登录号NT 011520(智人22号染色体基因组重叠群)中，且基因组全序列(外显子和内含子)开始于该基因组序列中的位置9347813处。因此，通过参考有关该基因组序列中启动子和调节区的位置的序列数据和上述位置信息，可容易地鉴定人SNAP25基因中的适宜启动子和/或调节部分。
人RIMS3基因的基因组序列可见于GenBank登录号AL031289(来自染色体1p33-34.2中克隆RP4-739H11的人DNA序列)，且基因组全序列(外显子和内含子)开始于该基因组序列中的位置56606处。因此，通过参考有关该基因组序列中启动子和调节区的位置的序列数据和上述位置信息，可容易地鉴定人RIMS3基因中的适宜启动子和/或调节部分。
人RAB40B基因的基因组序列见于GenBank登录号NT_086886(智人17号染色体的重叠群)中，且基因组全序列开始于该基因组序列中的位置17680884处。因此，通过参考有关该基因组序列中启动子和调节区的位置的序列数据和上述位置信息，可容易地鉴定人RAB40B基因中的适宜启动子和/或调节部分。
人HMGCS1编码区上游的其他序列可见于GenBank登录号NoBC000297中，其是mRNA序列的延伸。编码区开始于该序列的位置106处。人HMGCS1基因的适合启动子和/或调节部分位于GenBank登录号BC000297中的序列的最初105个核苷酸处。不管怎样，通过参考有关该基因组序列中启动子和调节区的位置的序列数据和上述位置信息，技术人员可容易地鉴定有关人HMGCS1启动子区域的其他信息。
人SCD5编码区上游的其他序列可见于GenBank登录号NoNM_001037582中，其是mRNA序列的延伸。编码区开始于该序列的位置236处。人SCD5基因的适合启动子和/或调节部分位于GenBank登录号NM_001037582中的序列的最初235个核苷酸处。不管怎样，通过参考有关该基因组序列中启动子和调节区的位置的序列数据和上述位置信息，技术人员可容易地鉴定有关人SCD5启动子区域的其他信息。
人ATP2A2基因的基因组序列可见于GenBank登录号NT_009775(智人12号染色体的基因组重叠群)。人ATP2A2基因的适合启动子和/或调节部分，通过参考有关该基因组序列中启动子和调节区的位置的序列数据和上述位置信息，技术人员可很容易地鉴定。
人HRMT1L1基因的基因组序列可见于GenBank登录号AP001761(智人21q染色体基因组DNA)，且其基因组全序列(外显子和内含子)开始于该基因组序列的558处。因此，通过参考有关该基因组序列中启动子和调节区的位置的序列数据和上述位置信息，可容易地鉴定人HRMT1L1基因中的适宜启动子和/或调节部分。
通常，报道基因表达的增加表示，该化合物是Bax介导的细胞凋亡的抑制剂，而报道基因表达的降低则表示，该化合物是Bax介导的细胞凋亡的启动子。
因此，本发明包括鉴定能调节细胞中Bax介导的细胞凋亡的化合物的方法，如本发明的第十七方面所述，所述方法包括鉴定调节基因表达的化合物，所述基因选自FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1和转录信息具有含有SEQ ID No：16，SEQ ID No：17，SEQ ID No：18或SEQID No：19的cDNA序列的基因；并在Bax介导的细胞凋亡分析中检测已鉴定的化合物。在上文和实施例中描述了适宜的基于细胞的和体内细胞凋亡分析。
第十八方面，本发明提供了鉴定能调节Bax介导的细胞凋亡的化合物的方法，所述方法包括：
提供在可诱导启动子的调控下表达功能性Bax多肽且在天然存在的启动子和/或调节序列的调控下表达选自如下多肽的细胞：FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1和含有SEQ ID No：16、SEQ ID No：17、SEQ ID No：18或SEQ IDNo：19的多核苷酸编码的多肽；
将细胞在诱导功能性Bax多肽表达的条件下与候选化合物接触；以及
进行细胞凋亡分析，
其中，与未和候选化合物接触的细胞相比，细胞凋亡水平的变化表示该化合物能调节Bax介导的细胞凋亡。
上文和实施例中描述了适宜的基于细胞的和体内细胞凋亡分析。
本发明人认为，细胞凋亡水平的增加表示，该化合物抑制从其天然存在的启动子开始的多肽表达，因此是一种促凋亡化合物。细胞凋亡水平的降低表示，该化合物增强或促进了从其天然存在的启动子开始的多肽表达，因此是Bax介导的细胞凋亡的抑制剂。
在本发明的这一方面，细胞通常是哺乳动物细胞，优选人细胞。细胞优选来自已用构建体转染的细胞系，该构建体含有在可诱导或组成型启动子的调控下编码功能性Bax多肽的多核苷酸。优选，细胞是脑细胞，更优选海马细胞。适宜的细胞系包括SH-SY5Y和PC3细胞。另外，大鼠和小鼠海马衍生性原发细胞可购买获得。
优选，细胞在多肽的天然存在的启动子和/或调节序列的调控下，在缺少候选化合物时，表达选自FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1和含有SEQ IDNo：16、SEQ ID No：17、SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽的多肽。这样，候选化合物可上调或下调多肽的表达，分别导致Bax介导的细胞凋亡水平的降低或增加。
可选地，细胞在天然存在的启动子和/或调节序列的调控下，在缺少候选化合物时，可不表达选自FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1和含有SEQ IDNo：16、SEQ ID No：17、SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽的多肽。这样，仅候选化合物上调多肽的表达可被检测到，从而，鉴定出抑制Bax介导的细胞凋亡的化合物。
第十九方面，本发明提供了筛选与多肽结合的化合物的方法，所述多肽选自FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1，和含有SEQ ID No：16、SEQ ID No：17、SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽，或其适宜的抗凋亡衍生物，所述方法包括：
将多肽与候选化合物接触；
检测含有多肽和候选化合物的复合体的存在；以及
任选地，鉴定任何结合于多肽的化合物。
优选，FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2和HRMT1L1多肽，以及含有SEQ ID No：16、SEQ ID No：17、SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽，是如上文所述的人多肽。这些多肽的适宜的抗凋亡衍生物也如上文所述。
可以理解，与选自FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1和含有SEQ ID No：16、SEQ ID No：17、SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽的多肽或其适宜的抗凋亡衍生物结合的化合物可调节所述多肽的活性。通常，与多肽结合的化合物将抑制或拮抗多肽的活性。然而，在某些情况下，与多肽结合的化合物将增强或促进多肽的活性。
在优选的实施方案中，候选化合物其本身就是肽或多肽。
与这些多肽结合的适宜肽或多肽可使用本领域中已知的方法来鉴定。一种方法，其由Scott和Smith(1990)Science 249，386-390 and Cwirla等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，6378-6382公开，包括筛选大量丝状噬菌体的文库，如M13或fd，所述文库的每一个成员具有不同的与该噬菌体表面上的蛋白融合的肽。利用重复结合方案，选择出那些与多肽结合的文库的成员，且一旦将结合最紧密的噬菌体纯化，则可通过对编码表面蛋白融合的DNA测序来简单地测定多肽的序列。另一个可用的方法是可从Novagen，Inc.，597Science Drive，Madison，WI 53711购买获得的NovaTope(TM)系统。该方法基于产生细菌克隆的文库，其中每一个克隆都稳定地表达从候选蛋白衍生的小肽，认为结合肽存在于该候选蛋白中。通过标准的提升法(standard lift methods)利用抗体或其他结合剂作为探针，来筛选所述文库。通过DNA测序来测定结合肽的准确氨基酸序列，可直接分析阳性克隆。
利用Lam等(1991)Nature 354，82-84公开的与单个物种多肽结合的玻璃珠文库或Houghten等(1991)Nature 354，84-86所公开的合成多肽组合文库或Pirrung等在US 5143854中公开的固体支持物上的单个合成多肽序列矩阵的进一步方法也可用于鉴定结合的肽。
可以理解，特别优选能高通量操作的筛选分析。实例包括基于细胞的分析和蛋白-蛋白结合分析。可以使用基于SPA的系统(亲近闪烁检测(Scintillation Proximity Assay)；Amersham International)。例如，可按如下进行鉴定能调节蛋白激酶活性的化合物的检测。制备含有闪烁体和可磷酸化的多肽的玻璃珠。将所述玻璃珠与含有蛋白激酶和32P-ATP或33P-ATP的样品以及试验化合物混合。通常，在96孔板中完成这个步骤。随后，利用适宜的闪烁计数器，用适合32P或33P SPA分析的已知参数，对平板进行计数。仅与闪烁体结合的32P或33P，即仅仅和多肽结合的32P或33P，可以得到检测。也可利用此类分析的变体，如其中，多肽是通过与抗体结合而固定于闪烁玻璃珠上。
检测多肽/多肽相互作用的其他方法包括，超过滤和电喷雾质谱(ion spraymass spectroscopy)/HPLC法或其他的物理和分析方法。可以利用例如本领域熟练的技术人员熟知的荧光能量共振转移(Fluorescence Energy ResonanceTransfer，FRET)法，其中，两种荧光标记的实体的结合可通过测量彼此相互接近时荧光标记的相互作用进行测量。
检测多肽与大分子例如DNA、RNA、蛋白和磷脂的结合的可选方法，包括表面等离子体共振检测(surface plasmon resonance assay)，例如，Plant等(1995)Analyt Biochem226(2)，342-348所述的。可利用对多肽进行标记的方法，如用放射性或荧光标记的多肽。
鉴定能与选自FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1和含有SEQ ID No：16、SEQ ID No：17、SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽的多肽或其适宜的抗凋亡衍生物结合的化合物的另一种方法是这样一种方法：其中让多肽与化合物接触，并检测和/或测量任何与所述多肽结合的化合物。可测定所述化合物与多肽的结合常数。检测和/或测量(定量)化合物与多肽结合的适宜方法对本领域技术人员而言是熟知的，并且可利用如能高通量操作的方法如基于芯片的方法来进行。Newer VLSIPSTM技术能产生非常小的芯片，其含有数以万计或更多的不同分子探针。这些生物芯片或阵列将探针排成阵列，每一个探针分配以具体的位置。产生的生物芯片在每个位置都具有例如10μm的等级(scale)。芯片可用于测定候选化合物是否能与芯片上的任何探针相互作用。在选定的试验条件下，将阵列暴露于候选化合物中后，扫描装置可检查阵列中的每个位置并测定候选化合物是否与该位置的探针相互作用。
生物芯片或阵列可用于各种筛选技术，用于获得有关探针或候选化合物的信息。例如，肽文库可用作探针来筛选药物。可将肽暴露于受体中，并鉴定与受体结合的那些探针(美国专利5,874,219)。
靶向结合和调节这些多肽活性的蛋白的另一种方法是酵母双杂交系统(Fields & Song(1989)Nature 340：245-246)，其中可用本发明的多肽“捕获”结合蛋白。
期望体内鉴定出调节选自FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1和含有SEQ IDNo：16、SEQ ID No：17、SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽的多肽。因此，可以理解，可选择用于所述方法中的试剂和条件，以便选自FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1和含有SEQ ID No：16、SEQ ID No：17、SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽的多肽，或其适宜的抗凋亡衍生物，与相互作用多肽之间的相互作用，与天然存在的多肽和天然存在的相互作用多肽之间的相互作用在体内实质上是相同的。
可选地，所述方法可用作“文库筛选”方法，其是本领域中技术人员熟知的术语。因此，例如，本发明的筛选方法可用于检测(且任选地鉴定)能体内表达多肽的多肽活化剂的多核苷酸，所述多肽选自FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1和含有SEQ ID No：16、SEQ ID No：17、SEQ ID No：18或SEQ IDNo：19的多核苷酸编码的多肽。在适宜载体内的表达文库的等分试样可用于检测产生所需结果的能力。
可以理解，在本文所述的筛选方法中，鉴定的化合物可以是类药化合物(drug-like compound)或用于研发类药化合物的先导化合物(lead compound)。
术语“类药化合物”对本领域熟练的技术人员而言是熟知的，并包括的意思是具有使其适宜在医学上使用的特征的化合物，如作为药物中的活性成分。因此，例如，类药化合物可以是有机化学技术，较不优选分子生物学或生物化学技术合成的分子，且优选是小于5000道尔顿且水溶性的小分子。类药化合物可额外地具有与具体蛋白或多种蛋白选择性相互作用的特征，并且是生物可利用的和/或能渗透靶细胞膜，但可以理解，这些特征并非必需的。
术语“先导化合物”同样对于本领域熟练的技术人员而言是熟知的，包括的意思是尽管自身不适宜用作药物(例如，因为其对既定的靶标具有很弱的效力，在其作用具有非选择性，不稳定，难溶，难以合成，或具有不良的生物有效度)但可为设计具有更多期望特征的其他化合物提供起始点的化合物。
因此，本发明筛选方法的实施方案提供了鉴定药类化合物或用于研发类药化合物的先导化合物的方法，所述化合物会在体内调节多肽的活性，所述多肽选自FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1和含有SEQ ID No：16、SEQ ID No：17、SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽，所述方法包括将试验化合物与多肽或其适宜的抗凋亡变体接触，测定多肽的活性与在缺少试验化合物的情况下的多肽或其抗凋亡片段的活性相比是否改变。
本发明第十七、十八和十九方面的筛选方法还包括检测鉴定的化合物在细胞凋亡模型或适宜的疾病模型中抑制Bax介导的细胞凋亡的能力。
另外或可选地，本发明第十七、十八和十九方面的筛选方法还包括修饰鉴定的化合物并在细胞凋亡模型或适宜的疾病模型中检测修饰的化合物。
上文或实施例中描述了细胞凋亡的适宜模型。
来自阿尔茨海默氏病动物模型的细胞培养物，其可用于筛选和检测药效，描述于美国专利申请第20050172344号中。刺激性神经系统疾病的动物模型尤其是AD描述于美国专利申请第20050102708中。神经变性病的其他模型，包括阿尔茨海默氏病的动物模型、亨廷顿病的动物模型、帕金森氏病的啮齿和灵长类动物模型，以及遗传/非遗传髓鞘形成障碍(dysmyelination)模型，已由Boulton，Baker & Butterworth(1992)在Animal Models ofNeurological Disease，I：Neurodegenerative Diseases(Human Press，ISBN：0-89603-208-6)中做了描述。
糖尿病、癌症、心血管疾病的适宜动物模型在本领域内是熟知的，包括化学诱导的糖尿病模型；癌症裸鼠SCID模型，其将小鼠或人癌症细胞注射入动物中；以及心血管疾病的心室压力肥厚超负荷模型(ventricularhypertrophy pressure overload models)。
如本领域人员可理解的，所述方法可还包括将具有在细胞凋亡模型中特别是在体内模型中抑制Bax介导的细胞凋亡能力的化合物配制成药学上可接受的组合物。
同样，所述方法还可包括将在疾病模型特别是体内模型中具有治疗效用的化合物配制成药学上可接受组合物的方法。
将本文引用的所有文献的全部内容以参考的方式并入本文。
本说明书中所列和讨论的以前公开的文献，不必理解为承认该文献是本领域状态的一部分或公知常识。
结合下列附图和实施例，将对本发明进行更详细的描述。
附图说明
图1是构建体pBGAL1Ms的示意图。
图2是构建体yIPLEUG1的示意图。
图3是构建体yIPADEG1的示意图。
图4是构建体yIPTRPG1的示意图。
图5是构建体yIPHISG1的示意图。
图6是构建体iLEUBAX的示意图。
图7是构建体iADEBAX的示意图。
图8是构建体iTRPBAX的示意图。
图9是构建体iHISBAX的示意图。
图10是构建体pcDNA3.1/Bax的示意图。
图11是构建体pIRESEGFP/BAX的示意图。
图12是构建体pSYI214的示意图。
图13是构建体pRS426/GAL1MS的示意图。
图14是构建体pRS426/PGKMS的示意图。
图15是构建体pRS416/GAL1MS的示意图。
图16是构建体pRS416/PGKMS的示意图。
图17是构建体426/GALBcl2的示意图。
图18是构建体426/GALBcl-xL的示意图。
图19是构建体426/PGKBcl2的示意图。
图20是构建体426/PGKBcl-xL的示意图。
图21是构建体416GAL/Bcl2的示意图。
图22是构建体416GAL/Bcl-xL的示意图。
图23是构建体416PGK/Bcl2的示意图。
图24是构建体416PGK/Bcl-xL的示意图。
图25.对2-micron和着丝粒质粒上产生的Bcl-2和Bcl-xL营救Bax介导的细胞生长抑制的比较(图17-24)。通过转化或经由杂交(mating)将Bcl-2和Bcl-xL基因引入不同的Bax菌株(参阅表4)。制作不同Bax菌株、质粒和其组合的不同观察结果。
A板(PanelA)：SD或SG上的斑点试验。
B板：通过(背景时间—生长时间)/生长时间，来获得“生长”得分，其中“生长时间”是在SG培养基上观察到全部阳性斑点的天数。“背景”意指用空质粒转化的菌株(图13-16)。“背景时间”通过观察到第一个假阳性克隆的时间天数对“背景时间”进行评分。
和其他的菌株相比，W303baxleu为低背景和高生长。两种不同的启动子GAL1和PGK1在所有菌株中都不产生任何显著的差别，P>0.05。
图26是构建体BluKS/p21-HA的示意图。
图27是构建体Blu/Bcl2A1-HA的示意图。
图28是构建体Blu/FKBP2-HA的示意图。
图29是构建体Blu/SNCA-HA的示意图。
图30是构建体Blu/VAMP3-HA的示意图。
图31是构建体Blu/EEF1A1-HA的示意图。
图32是构建体Blu/Bclxl-HA的示意图。
图33是构建体pcD/Bcl2A1-HA的示意图。
图34是构建体pcD/FKBP2-HA的示意图。
图35是构建体pcD/SNCA-HA的示意图。
图36是构建体pcD/VAMP3-HA的示意图。
图37是构建体pcD/EEF1A1-HA的示意图。
图38是构建体pcD/BclxL-HA的示意图。
图39(A)是构建体pSYE224的示意图。
图39(B)是构建体pYES2(Invitrogen)的示意图。
图40是构建体pSYE239的示意图。
图41是构建体224/Bcl2A1-HA的示意图。
图42是构建体224/FKBP2-HA的示意图。
图43是构建体224/SNCA-HA的示意图。
图44是构建体224/VAMP3-HA的示意图。
图45是构建体224/EEF1A1-HA的示意图。
图46是构建体224/BclxL-HA的示意图。
图47是构建体239/Bcl2A1-HA的示意图。
图48是构建体239/FKBP2-HA的示意图。
图49是构建体239/SNCA-HA的示意图。
图50是构建体239/VAMP3-HA的示意图。
图51是构建体239/EEF1A1-HA的示意图。
图52是构建体239/BclxL-HA的示意图。
图53.在转化入Bax菌株W303baxleu后，检验这些基因的营救能力。通过将5μl等分试样(即相同数目的细胞)点样于SD和SG板上进行斑点试验。共表达新基因和BAX的细胞在SG板上的成长程度不同。这与仅含BAX但不含空载体的细胞进行了对比。如预料的那样，这些细胞并不会生长。相似的结果在正在GALl和PGKl启动子调控下表达的新基因中获得。
图54是存在HA标记性蛋白的免疫细胞化学的代表性图。
图55.A板示出Bax转染后指示时间内的死亡细胞百分比。B板示出Bax或载体转染后第三天的存活细胞的相对百分比。
图56.新蛋白对Bax介导的死亡的营救能力。
在Bax转染后，在光学显微镜下，用血球计数器对含有或不含有营救蛋白的存活细胞(胎盘蓝(trypan blue)阴性细胞)进行计数。根据上述公式计算Bax介导的死亡。与仅含有载体的细胞系相比，表达新近发现的抗凋亡基因的细胞表现出Bax介导死亡的显著降低(P<0.01)。在该图中，在缺少或存在新近发现的抗凋亡基因时，对每一个经历了Bax介导的死亡的细胞系中的细胞百分比进行了注释。
图57.Bax-转染后在稳定表达人Bcl-2A1、FKBP2、SNCA、VAMP3、EEF1A1和Bcl-xL的HEK293细胞中的细胞凋亡的定量TUNEL-FACS分析。如实施例中所述，培养和分析细胞，并通过流式细胞仪检测DNA断裂(其导致细胞凋亡)。在该图中，对存在或缺少新近发现的抗凋亡蛋白的情况下经历了细胞凋亡的细胞的百分比进行了注释。将H2O2处理的细胞作为阳性对照，因为已知H2O2在所有的真核细胞中都会诱导完全的细胞凋亡。Y轴表示FITC-dUTP的荧光强度，而X轴表示DNA含量。
图58.新基因抑制Bax诱导的细胞色素c释放。转染后第三天，将细胞用抗细胞色素c单克隆抗体标记，随后用Alexa488共轭的羊抗鼠IgG标记。通过荧光显微镜，利用FITC特异性过滤器，将标记的细胞可视化。点状的细胞色素C标记模式代表细胞色素C的线粒体定位，而弥散的标记模式代笔了其胞质溶胶的定位。用Bax转染后但不含Bax营救蛋白的细胞观察到了胞质溶胶细胞色素C的强烈标记。另一方面，共表达Bcl-2A1、FKBP2、SNCA、VAMP3、EEF1A1或Bcl-xL以及Bax的细胞系显示了胞质溶胶细胞色素C定位模式的降低。
图59.新Bax营救基因抑制Bax诱导的ΔΨm损失。
在新基因表达或不表达的情况下，将Bax转染至HEK293细胞系。如所述，将转染体(transfectants)温育72小时。通过流式细胞仪用DiOC6(3)染色，评估ΔΨm。用H2O2处理的HKE293触发了阴性或阳性对照。在流式细胞仪特征谱中，y轴表示分析的事件(10,000)，x轴表示荧光强度的对数；百分比表示ΔΨm损失。
图60.新基因降低Bax诱导的细胞内ROS。与仅用空载体(Vector)表达Bax的细胞相比，Bcl-2A1、FKBP2、SNCA、VAMP3、EEF1A1和Bcl-xL的表达导致荧光强度降低。用pcDNA3.1(+)转染的亲本HEK293细胞为阴性对照，表示为100％(CTL)，而H2O2处理的HEK293为阳性对照。
图61.GAL1MS构建体的多核苷酸序列—XhoI-SacI片段(SEQ ID No：1)；利用酵母偏爱密码子合成的人BaxαBglII-XbaI片段(SEQ ID No：2)；以及人BaxαBglII-XbaI片段编码的多肽序列(SEQ ID No：3)。
图62.从Bax介导的细胞凋亡抑制剂酵母筛选中获得的“命中(hits)”多核苷酸序列。列举的序列为SCNA(SEQ ID No：5)、FKBP2(SEQ ID No：6)、SNAP25(SEQ ID No：9)、EEF1A1(SEQ ID No：7)、VAMP3(SEQ ID No：8)、RIMS3(SEQ ID NO：10)、RAB40B(SEQ ID No：11)、HMGCS1(SEQ ID NO：12)、SCD5(SEQ ID No：13)、ATP2A2(SEQ ID No：14)和HRMT1L1(SEQ IDNo：15)。对于ATP2A2而言，分离的片段为～3200bp，其已部分测序。利用5’和3’引物获得的序列与参照数据库序列在显示区域相互匹配。
图63.如SEQ ID NO：16中所界定的来自之前功能未知的人染色体3p的多核苷酸序列。如箭头所示，两个可读框存在于SEQ ID NO：16中。也示出了限制酶位点。
图64.如SEQ ID NO：17中所界定的来自之前功能未知的人染色体22q11.22-12.2的多核苷酸序列。如箭头所示，4个可读框存在于SEQ ID NO：17中。也表示出了限制酶位点。
图65.如SEQ ID NO：18中所界定的来自人线粒体分离物WH6967的多核苷酸序列。如箭头所示，两个可读框存在于SEQ ID NO：18中。也示出了限制酶位点。
图66.如SEQ ID NO：19中所界定的来自人线粒体分离物S1216的多核苷酸序列。如箭头所示，两个可读框存在于SEQ ID NO：19中。也示出了限制酶位点。
图67.人EEF1A1(SEQ ID No：22)和人EEF1A2的氨基酸序列的比较，显示92.6％的序列同一性(SEQ ID No：23)。
具体实施方式
实施例1：产生DNA构建体
产生允许促凋亡Bax表达的构建体DNA
可诱导Bax在酵母中从不同的染色体基因座表达的构建体
从ATCC(LGC Promochem，Middlesex，UK)购买酵母整合载体pRS305(具有作为选择性标记的酿酒酵母LEU2基因)、pRS402(具有作为选择性标记的酿酒酵母ADE2基因)和pRS404(具有作为选择性标记的酿酒酵母TRP1基因)。
XhoI-SacIGAL1p-MS片段，其含有酿酒酵母GAL1基因启动子片段和c-myc标签片段(M)居前的SUC2基因终止子片段(S)，分离自构建体pBGAL1MS(一种pBlueScript KS(+)衍生物；图1；图61中SEQ ID NO：1所示的GAL1MS序列)，并且连接于XhoI-SacI消化的pRS305、pRS402和pRS404载体，从而可以在LEU2，ADE2，TRP1和HIS3染色体基因座处整合。4种所得的质粒yIPLEUG1(图2)，yIPADEG1(图3)，yIPTRPG1(图4)和yIPHISG1(图5)在GAL1启动子的3’端和连接于SUC终止子的c-myc标签的5’端之间具有唯一的BamHI，SpeI和/或XbaI限制位点。
用BamHI和SpeI消化质粒yIPLEUG1(图2)、yIPADEG1(图3)、yIPTRPG1(图4)和yIPHISG1(图5)，并且将它们各自连接于Bax基因的BglII-XbaI片段，该片段分离自质粒pUC19A/Bax-MS(其中利用酵母偏爱密码子已经合成了BAX基因，SEQ ID No：2(Bennetzen & Hall，1982))。将所得的含Bax质粒(BAX-harbouring plasmid)命名为iLEUBAX(图6)，iADEBAX(图7)，iTRPBAX(图8)和iHISBAX(图9)。所有的4种质粒在它们的酵母选择标记中具有唯一的限制位点，从而可以为了让这些质粒整合入各自的染色体基因座而将这些质粒线性化。
哺乳动物细胞中组成型表达Bax的构建体
在pcDNA3.1(+)中亚克隆从SHSY-5Y成神经细胞瘤细胞中分离的BAX 基因
BAX基因的EcoRI-XbaI片段是用反转录酶介导的(RT)PCR，从总mRNA克隆，从人成神经细胞瘤细胞系SHSY-5Y分离。分离的BAX基因一旦被翻译，就会精确对应NCBI数据库中报道的Bax α蛋白。该片段用于在用EcoRI和XbaI消化的pBluescriptKS(+)(Stratagene)中进一步亚克隆，以获得质粒pKS(+)/EcoRI-XbaI/Bax。
从构建体pKS(+)/EcoRI-XbaI/Bax中分离编码包括起始和终止密码子的全长BAX基因的EcoRI-XbaIBax基因插入片段，并连接于EcoRI-XbaI消化的载体pcDNA3.1(+)(Invitrogen，Paisley，UK)，以获得pcDNA3.1/Bax(图10)。
在pIRES2-GFP中亚克隆分离于SHSY-5Y成神经细胞瘤细胞的BAX基 因
质粒pIRES2-EGFP(Clontech Laboratories，Inc.，Oxford，UK)是双顺反子载体(bicistronic vector)，其允许快速且有效的选择表达人Bax蛋白以及选择标记、增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)的阳性克隆，以便让所有表达EGFP的转染细胞(荧光显微镜监控)也有效地表达Bax蛋白。pIRES2-EGFP载体含有脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus，EMCV)的核糖体内部进入位点(internal ribosome entry site，RES)，该位点允许一种信使RNA(Clontech Laboratories)开始两个可读框翻译。核糖体可在5’端进入双顺反子mRNA而翻译BAX，或在ECMV IRES处进入而翻译选择标记EGFP。
从构建体pKS(+)/EcoRI-XbaI/Bax中分离EcoRI-XbaIBAX基因插入片段，其编码分离于SHSY-5Y(参阅1.1.2.1)的全长BAX基因且包括起始密码子(ATG)和终止密码子(TAG)，并将其连接于EcoRI-XbaI消化的载体pSP73(Promega)，以获得质粒pSP73/EcoRI-XbaI/Bax。
从pSP73/EcoRI-XbaI/Bax(BglII位点位于EcoRI的上游，且XhoI位于pSP73中XbaI的下游)中分离BglII-XhoI BAX基因片段，并将其连接于BglII-SalI消化的pIRES2-EGFP载体。所得的质粒pIRES2-EGFP/Bax(图11)可以同时表达Bax和EGFP。
产生其他用于酵母细胞凋亡筛选(yeast apoptosis screen，YAS)的允许表达抗凋亡蛋白的DNA构建体
从构建体pBGAL1MS(图1)和pSYI214(图12)中分离GAL1p-MS片段(即GAL1启动子以及c-myc标签序列居先的SUC2终止片段，所述c-myc标签序列以终止密码子结束)和PGKp-MS片段(即PGK1启动子以及c-myc标签序列居先的SUC2终止片段，所述c-myc标签序列以终止密码子结束)的XhoI-SacI片段。将该片段连接于XhoI-SacI消化的载体pRS416和pRS426(两种质粒都从ATCC获得)，以获得质粒pRS426/GAL1MS(图13)、pRS426/PGKMS(图14)、pRS416/GAL1MS(图15)和pRS416/PGKMS(图16)。质粒pRS416是单拷贝着丝粒载体，而pRS426是多拷贝2-micron载体。
将从质粒pSP73/BglII-XbaI/Bcl2和pSP73/BglII-XbaI/Bcl-xL中分离的、编码人Bcl-2和人Bcl-xL基因的BglII-XbaI消化的片段连接于BamHI-SpeI-消化的pRS426/GAL1pMS或pRS426/PGKpMS，以获得质粒426GAL/Bcl2(图17)、426GAL/Bcl-xL(图18)、426PGK/Bcl2(图19)、426PGK/Bcl-xL(图20)。
同样，将编码人Bcl-2和人Bcl-xL基因的BamHI-XbaI消化的片段连接于BamHI-SpeI消化的pRS416/GAL1pMS或pRS416/PGKpMS，获得质粒16GAL/Bcl2(图21)、416GAL/Bcl-xL(图22)、416PGK/Bcl2(图23)、416PGK/Bcl-xL(图24)。
实施例2：优化用于从人海马中选择新抗凋亡基因的酵母筛选系统 (YAS)
酵母生长条件
YPD(1％ Bacto酵母膏、2％ Bacto蛋白胨和2％葡萄糖)是丰富培养基。合成的最低培养基(SC)由0.67％酵母氮源(Difco)和2％葡萄糖(SD)或2％半乳糖(SG)组成。向依赖于菌株所携带的质粒而供具体菌株生长的SD或SG中加入适当的生长补充物(腺嘌呤、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、尿嘧啶或色氨酸)。将补充物保存为母液并加入到适当体积的培养基中。下文给出的母液浓度和母液体积是制备1升培养基所需的。腺嘌呤、尿嘧啶、色氨酸、组氨酸的终浓度是20mg/l，赖氨酸、酪氨酸是30mg/l，亮氨酸是100mg/l。
建立酵母抗凋亡筛选系统
为了选出适合酵母细胞凋亡筛选(YAS)的最佳酵母菌株，进行了大量平行试验。
Bax整合菌株
用4种酿酒酵母菌株整合人BAX基因(SEQ ID：2)，该基因是在酵母基因组的不同染色体基因座中利用酵母偏爱的密码子化学合成的。该酵母菌株是：
(1)HT444(MAT-a，leu2-3，leu2-2，112his4-519，ura3，lys2)，
(2)W303a(MAT-a ade2-1，trp1-1，leu2-3，leu2-112，his3-11，his3-15，ura3-1)，
(3)W303alpha(MATα，ade2-1，trp1-1，leu2-3，leu2-112，his3-11，his3-15，ura3-1)以及
(4)JL20(MAT-a leu2-3，leu2-2，leu2-112，his4-519，ade1-100，ura3-52)。
用于在不同的染色体基因座整合的质粒是：
(1)iLEUBAX(图6)
(2)iADEBAX(图7)
(3)iTRPBAX(图8)
(4)iHISBAX(图9)
在可诱导的GAL1启动子的调控下，在酵母染色体基因座上，其中LEU2、ADE2、TRP1和HIS3基因天然地位于该基因座上，该整合产生了单拷贝的BAX表达盒(expression cassette)。
整合后获得的所得酵母菌株列于表2中。
表2：在酵母基因组不同的染色体基因座上含有BAX表达盒或空质粒的酵母菌株
 
亲本酵母菌株 用于整合的质粒 所得的酵母菌株名称
HT444 iLEUBAX(图6) HT444baxleu
HT444 yIPLEUG1(图2) HT444leu
HT444 iADEBAX(图7) HT444baxade
HT444 yIPADEG1(图3) HT444ade
HT444 iTRPBAX(图8) HT444baxtrp
HT444 yIPTRPG1(图4) HT444trp
HT444 iHISBAX(图9) HT444baxhis
HT444 yIPHISG1(图5) HT444his
W303a iLEUBAX(图6) W303baxleu
W303a yIPLEUG1(图2) W303leu
W303a iADEBAX(图7) W303baxade
W303a yIPADEG1(图3) W303ade
W303a iTRPBAX(图8) W303baxtrp
W303a yIPTRPG1(图4) W303trp
W303a iHISBAX(图9) W303baxhis
W303a yIPHISG1(图5) W303lhis
W303α iLEUBAX(图6) W303alpbaxleu
W303α yIPLEUG1(图2) W303alpleu
W303α iADEBAX(图7) W303alpbaxade
 
W303α yIPADEG1(图3) W303alpade
W303α iTRPBAX(图8) W303alpbaxtrp
W303α yIPTRPG1(图4) W303alptrp
W303α iHISBAX(图9) W303alpbaxhis
W303α yIPHISG1(图5) W303alphis
JL20 iLEUBAX(图6) JL20baxleu
JL20 yIPLEUG1(图2) JL20leu
JL20 iADEBAX(图7) JL20baxade
JL20 yIPADEG1(图3) JL20ade
JL20 iTRPBAX(图8) JL20baxtrp
JL20 yIPTRPG1(图4) JL20trp
JL20 iHISBAX(图9) JL20baxhis
JL20 yIPHISG1(图5) JL20his
筛选含优化BAX的菌株用于筛选
理想地，所有的菌株应该在SD(即含有葡萄糖以及适当的生长补充物的最低生长培养基)上生长，但不在SG(含有半乳糖以及适当生长补充物的最低生长培养基)上生长，因为半乳糖会诱导Bax蛋白表达，从而中止细胞生长和杀死酵母细胞。当将～106细胞接种于直径10cm的平板上时，在半乳糖中在正常的生长调节下(30℃，72h)，列于表2中的所有菌株不能像对照菌株(其含有空载体而没有BAX)一样生长。然而，为了获得用于从由任何选择的人组织制备的cDNA文库中筛选潜在的抗凋亡基因的严紧选择系统，应该有这样一种菌株，其当将相对大量的细胞接种于平板上(即将>108的细胞接种于直径10cm的平板上)并在30℃下温育72h时，不显示任何生长，如在筛选方法中所做的。令人意想不到的是，发现菌株W303baxleu非常适宜筛选，如表3中的结果所示。它即使在30℃将>108的细胞温育7天后，在半乳糖中也不会生长。
Table3：选择YAS酵母菌株
 
整合后的酵母菌株         在SD中生长：72h，30℃ 在SG中生长：106个细胞，72h，30℃ 在SG中生长：>108个细胞，72h，30℃
HT444baxleu ++++ — +
HT444leu ++++ ++++ +++++
 
整合后的酵母菌株         在SD中生长：72h，30℃ 在SG中生长：106个细胞，72h，30℃ 在SG中生长：>108个细胞，72h，30℃
HT444baxade ++++ —/+ +
HT444ade ++++ ++++ +++++
HT444baxtrp ++++ —/+ +
HT444trp ++++ ++++ +++++
HT444baxhis ++++ —/+ +
HT444his ++++ ++++ +++++
W303baxleu ++++ — —
W303leu ++++ ++++ +++++
W303baxade ++++ — —/+
W303ade ++++ ++++ +++++
W303baxtrp ++++ —/+ +
W303trp ++++ ++++ +++++
W303baxhis ++++ — +
W303lhis ++++ ++++ +++++
W303alpbaxleu ++++ — —/+
W303alpleu ++++ ++++ +++++
W303alpbaxade ++++ —/+ +
W303alpade ++++ ++++ +++++
W303alpbaxtrp ++++ —/+ +
W303alptrp ++++ ++++ +++++
W303alpbaxhis ++++ —/+ +
W303alphis ++++ ++++ +++++
JL20baxleu ++++ — +
JL20leu ++++ ++++ +++++
JL20baxade ++++ —/+ +
JL20ade ++++ ++++ +++++
JL20baxtrp ++++ —/+ +
JL20trp ++++ ++++ +++++
JL20baxhis ++++ —/+ +
JL20his ++++ ++++ +++++
营救Bax介导的酵母细胞致死
人Bcl-xL和Bcl-2是已知的抗凋亡蛋白。在GAL1(强诱导型)和PGK1(强组成型)启动子(图17-24中所述的质粒)的调控下，已在着丝粒(单拷贝)和2-micron(多拷贝)载体中亚克隆了人Bcl-2和Bcl-xL基因。所有的质粒都携带用于在酵母中选择的URA3基因。将质粒在含Bax菌株、W303baxleu以及W303alpha中转化。出于杂交试验的目的，单独进行后者的转化，其中将BAX基因引入Mat-a杂交型菌株内，而营救抗凋亡基因Bcl-2和Bcl-xL则由另一个相反的Mat-α杂交型菌株产生。
为了将含抗凋亡基因的质粒直接转化入含BAX的酵母菌株，收集W303baxleu菌株的5×107个细胞，并洗涤细胞团(cell pellet)，除去用于过夜培养的YPD培养基。将100μg变性鲑鱼精子DNA(Sigma)和0.5μg质粒DNA(含抗凋亡基因Bcl-2或Bcl-xL；图17-24)加入成团的细胞中，随后加入500μl PEG(聚乙二醇)-3500溶液(40％ PEG；0.1M醋酸锂pH7.5；10mMTris-HCl pH7.5；1mM EDTA pH7.5)，并加入DMSO直到5％(v/v)的终浓度。在Thermo搅拌器(Eppendorf)上温育15分钟后，400rpm、25℃离心，将细胞在42℃、10％乙醇(终浓度)中热休克15分钟。用500μl的TE pH7.5洗涤两次后，将细胞重悬浮于相同体积的pH7.5TE中。将200μl重悬浮细胞直接涂布于含必需氨基酸和核苷补充物的SD和SG平板上。将所述平板在30℃温育3天(SD)和约20天(SG)。
将含人Bcl-2和Bcl-xL基因(图17-24)的质粒转化入W303α(Mat-α)酵母菌株中，以便转化体可与W303baxleu细胞杂交，据此可测量杂交后它们营救BAX的能力。首先将含Bcl-2和Bcl-xL的质粒转化体(URA3+)在SD培养基中30℃下培养3天，所述培养基含有亮氨酸、组氨酸、腺嘌呤和色氨酸。将来自每次转化的6个单个菌落的一小勺细胞与100μlTE混合。将W303baxleu(Mat-a，BAX+)中相似数量的细胞加入到Mat-α细胞混合物(Bcl-2+orBcl-xL+)中，并充分混合。将混合物接种于YPD平板，30℃温育24h，随后在仅含有组氨酸、腺嘌呤和色氨酸的SD平板上选择。
检验所有转化体(直接或杂交后)中止Bax介导的细胞生长抑制的能力。比较菌株的(a)营救功效和(b)生长速度。结果显示于表4和图25中。
表4：用于测定供筛选来自任何人组织、细胞或任何生物体基因组的cDNA文库的最佳组合的Bax菌株
 
名称 描述 加入SD/SG*的补充物
HT444baxleu HT444::pRS305/GAL1p-Bax(LEU2) HKU
W303baxleu W303a::pRS305/GAL1p-Bax(LEU2) HAWU
W303alpbaxleu W303αlphα::pRS305/GAL1p-Bax(LEU2)                       HAWU
JL 20baxleu JL20::pRS305/GAL1p-Bax(LEU2) HAU
W303baxade W303a::pRS402/GAL1p-Bax(ADE2) LHWU
W303baxtrp W303a::pRS404/GAL1p-Bax(TRP1) LHAU
W303alpha W303αlphα LHAWU
*A＝腺嘌呤，H＝组氨酸，K＝赖氨酸，L＝亮氨酸，U＝尿嘧啶，W＝色氨酸
实施例3：在人海马中筛选抗凋亡基因
建立和扩增人海马cDNA文库
利用BioCat GmbH(Heidelberg，Germany)，常规合成人海马cDNA文库。该cDNA文库由全部的人成年人正常脑海马mRNA制成。利用oligo(dT)-NotI引物和M-MLV-RNase H-反转录酶进行第一条链cDNA的合成。用随机连接体引物和Klenow Exo-DNA聚合酶进行第二条链的合成。对于定向克隆，粘末端cDNA首先用Not I消化，随后在1.3％琼脂糖凝胶上进行大小分级。在洗脱cDNA后，将大于0.6kb的cDNA连接入NotI和BsaBI消化的酵母表达载体pSYE224(图39)中。获得质粒cDNA文库作为甘油保藏物(glycerolstock)。为了保持这个文库的所有遗传信息，采用利用半固体扩增的方法。将1000ml高压灭菌的2×LB琼脂糖(溶于双蒸水中的0.27％ SeaPrep琼脂糖(FMC)，2％蛋白胨，1％酵母膏，1％ NaCl)在37℃的水浴中冷却2h。加入1.22×106个初级cDNA转化体(其代表甘油保藏溶液)和0.2g氨苄青霉素，并在搅动板(strirrer plate)上完全混合2min。在冰上温育1h后，将培养瓶轻轻地移入放置于30℃的重力流式孵化器(gravity flow incubator)中，并无扰动温育45h。随后用QIAGEN质粒Maxi-prep试剂盒收集细胞，并制备纯化的DNA。在DNA纯化前，保存甘油保藏物溶液。
海马cDNA文库的高效转化和筛选Bax抗性转化体
收集SD(含有组氨酸、腺嘌呤、尿嘧啶和色氨酸)液体培养基中处于对数生长中期的(mid-logarithmic phase)的酵母菌株W303baxleu的培养物，并用100mM醋酸锂溶液洗涤。将转化混合物加入含有1×109个细胞的细胞团中。转化混合物含有240μl PEG-3500(50％w/v，Sigma)、36μl 1.0M醋酸锂、50μl单链DNA(新煮沸的，2.0mg/ml，Sigma)、33μl无菌双蒸水和1μl(1μg/μl)cDNA文库DNA。在使用前，充分混合该混合物。将细胞悬浮物在30℃振荡温育30min。收获转化体，并在含有半乳糖的合成缺陷型培养基上直接选择，该培养基缺少亮氨酸和尿嘧啶但含有组氨酸、腺嘌呤和色氨酸(即SG+HAW)。将转化混合物的等分试样也涂布于SD+HAW平板上，以测定转化效率。随后通过复制平板，利用切成正方形碎片的无菌绒布(velvet cloth)，在SD+HAW上，筛选该SD+HAW平板上的转化体。重复转化几次，直到获得单个的转化体，该转化体是存在于最初cDNA文库中的代表性克隆数量的3倍多。以此方式，可以确定在酵母细胞凋亡检测(yeast apoptosis assay，YAS)中筛选出了存在于cDNA文库中的所有cDNAs。单独收集SG+HAW平板中的Bax抗性菌落。
从Bax抗性转化体中分离质粒DNA
从SG+HAW平板中挑选Bax抗性菌落，并在1ml YPD液体培养基中30℃下过夜培养。在离心机中离心，收获细胞，并重悬浮于500μl的1M山梨醇、0.1M Na2EDTA(pH7.5)中。在与20μl 2.5mg/ml Zymolyase100T(Fisher Scientific)37℃下一起温育1h后，离心细胞，并重悬浮于500μl的50mM Tris-Cl(pH7.5)、20mM Na2EDTA和50μl 10％ SDS中。将混合物在65℃下300rpm振荡温育30min。在加入200μl 5M醋酸钾后，将细胞在冰上进一步温育1h。随后13,000rpm离心细胞5min，且将上清液在1体积100％异丙醇中沉淀。将空气干燥团重悬浮于300μl的TE(pH7.5)中，并与75μg RNase一起温育，随后加入30μl 3M醋酸钠和200μl 100％异丙醇。将成团的DNA重悬浮于30μl的TE(pH7.5)中，并转化入感受态的DH5α细菌细胞中。因此，来自所有酵母菌落的质粒DNA，该酵母菌落含有Bax营救基因，通过细菌细胞得以扩增并利用QIAGEN质粒Mini-prep试剂盒得以纯化。这些质粒在理论上应该含有新Bax拮抗剂(即新抗凋亡基因)，该Bax拮抗剂存在于人海马中。
从Bax营救筛选中排除假阳性
将分离于Bax抗性酵母细胞的所有质粒都转化回W303baxleu细胞中，如上文实施例2中所述，并接种于SD+HAW平板上。通过将来自每一次转化的10个单个菌落的～100个细胞接种于SD+HAW平板上和SG+HAW平板上，来检测转化体真实的Bax营救能力。将平板于30℃温育2-5天。认为在SD和SG平板上都生长的质粒转化细胞是斑点试验阳性的，因此含有能真正营救Bax介导的细胞生长抑制的质粒。斑点试验阴性质粒视作假阳性。这些质粒含有的基因不能营救Bax，因此从试验中排除。
对在SG平板上存活的酵母细胞进行是否存在Bax基因的检测，以完全确定斑点试验阳性质粒确实含有抗凋亡基因。在含有100pmol每一种引物、0.8mM dNTPs、2mM MgCl2和2.5U Taq聚合酶(ABG)的100μl反应体积中进行PCR。在7min、99℃的最初变性期后，进行30次循环，其由95℃变性1min、60℃退火1min 30sec和72℃延伸3min组成。将25μl反应物加样于1％ TAE琼脂糖凝胶上，并通过溴化乙锭染色可视化。用于鉴定Bax的引物是：
5’引物：5’-GGAAGATCTATGGACGGTTCCGGT GAACAA-3’(SEQID No：24)。
3’引物：5’-CTAGTCTAGAACCCATCTTCTTCCAGATGGTC-3’(SEQ IDNo：25)。
对抗凋亡基因进行测序
利用ABI的BigDye终止子测序化学法(terminator sequencing chemistry)(PNACL DNA sequencing service，Leicester University)，将显示Bax营救功能的23个质粒进行DNA测序。用于对插入片段进行测序的引物，其在pSYE224(图39)克隆中得以鉴定，是：
5’引物：5’-CCTCTATACTTTAACGTCAAGGAG-3’(SEQ ID No：26)。
3’引物：5’-CGTGAATGTAAGCGTGACATAAC-3’(SEQ ID No：27)。
利用BLAST测定DNA序列的同源性，BLAST是一种由国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/中进行支持的软件。
结果
在鉴定Bax抗性菌落的YAS筛选中，3.808×106个转化体的106个菌落在SG平板上存活。再试验鉴定假阳性后，保留的23个质粒(21.70％)仍然展示了Bax营救功能。基因列于上文的表1中。
蛋白#1 to #5的HA标记性DNA序列进一步在酵母和哺乳动物细胞中表达。
Bcl-2A1是已知的Bax拮抗剂。我们不清楚有关任何列于表1中的其他基因具有抗凋亡功能的任何报道。
实施例4：从人海马cDNA文库中鉴定的新抗凋亡基因的表达构建体
含HA标记的基本质粒
通过在XhoI-EcoRI消化的pBlueScriptKS(+)载体(Stratagene)中，亚克隆含有p21WAF1/CIP1基因(下文称为p21)的EcoRI-XhoI片段和编码HA标签的DNA序列，来制备基本质粒BluKS/p21-HA(图26)。通过SalI限制位点，将p21WAF1/CIP1基因连接于HA标签序列。HA标签序列后是终止密码子。
用SpeI-SalI或BamHI-SalI消化上述质粒BluKS/p21-HA，以便亚克隆感兴趣的SpeI-SalI或BamHI-SalI抗凋亡基因片段(即新基因或用作对照的已知基因)，从而可以让它们在3’端被HA DNA序列标记。该基因片段不含有3’终止密码子。终止密码子在HA序列的3’端。
哺乳动物/酵母表达构建体
从相同的人海马cDNA文库中，通过PCR扩增人Bcl-2A1、FKBP2、SNCA(α-突触核蛋白)、VAMP3和EEF1A1的全长SpeI-XhoI片段，根据所述cDNA文库，所述片段最初被鉴定为抗凋亡基因序列。将扩增的片段克隆至SpeI-SalI消化的BluKS/p21-HA载体中，该载体缺失p21。用于PCR的有义引物含有与编码序列5’末端互补的6个密码子、SpeI限制位点和共有序列翻译起始序列(即冈崎序列GCCACC)。用于PCR的反义引物含有与编码序列3′末端互补的6个密码子和XhoI限制位点。由Invitrogen(Paisley，UK)合成所有的引物，并列于表5中。
在限制酶消化后，将SpeI-XhoI PCR片段克隆至BluKS/p21-HA载体，该载体首先用SpeI和SalI消化，随后分离缺失p21的载体。将所得的质粒称为Blu/Bcl2A1-HA(图27)，Blu/FKBP2-HA(图28)，Blu/SNCA-HA(图29)，Blu/VAMP3-HA(图30)和Blu/EEF1A1-HA(图31)。从构建体pSP73/BglII-XbaI/Bcl-xL中分离编码全长人Bcl-xL的BglII-XhoI消化的插入片段，并连接于BamHI-SalI消化的BluKS/p21-HA载体片段，以获得质粒Blu/BclxL-HA(图32)。
用SpeI-XhoI消化上述pBlueScript衍生的质粒(图27-32)，且分离HA-标记的全长Bcl-2A1、FKBP2、SNCA、VAMP3、EEF1A1和Bcl-xL基因片段。将它们亚克隆至NheI-XhoI消化的哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1(+)(Invitrogen，Paisley，UK)中。将所得的质粒称为pcD/Bcl2A1-HA(图33)、pcD/FKBP2-HA(图34)、pcD/SNCA-HA(图35)、pcD/VAMP3-HA(图36)、pcD/EEF1A1-HA(图37)和pcD/BclxL-HA(图38)。
用SpeI-XhoI消化pBlueScript衍生的质粒(图27-32)，且分离HA-标记的全长Bcl-2A1、FKBP2、SNCA、VAMP3、EEF1A1和Bcl-xL基因片段。也将它们亚克隆至SpeI-XhoI消化的2-micron多拷贝酵母表达载体pSYE224(图39)、pSYE239(图40)。质粒pSYE224和pSYE239分别含有GAL1启动子(GAL1p)和PGK1启动子(PGK1p)。两个质粒都含有URA3基因，作为营养缺陷型选择标记。
将衍生于pSYE224(图39A)的质粒，其含有在GAL1启动子调节下的HA标记性抗凋亡基因，称命名为224/Bcl2A1-HA(图41)，224/FKBP2-HA(图42)、224/SNCA-HA(图43)、224/VAMP3-HA(图44)、224/EEF1A1-HA(图45)和224/BclxL-HA(图46)。
将衍生于pSYE239(图40)的质粒，其含有在PGK1启动子调控下的HA标记性抗凋亡基因，命名为239/Bcl2A1-HA(图47)、239/FKBP2-HA(图48)、239/SNCA-HA(图49)、239/VAMP3-HA(图50)、239/EEF1A1-HA(图51)和239/BclxL-HA(图52)。
可以理解，可以用Invitrogen载体pYES2(图39B)替代pSYE224。我们已用SpeI-NotI位点将我们的cDNA文库单向克隆入pSYE224中。NotI是8bp的限制位点(包括5’突出端)，并且是少见的切割工具。我们倾向于将8bp的PacI限制位点(包括3’突出端)引入pYES2，用于单向克隆，和NotI一样8bp的PacI限制位点也是很少见的切割工具。这样，PacI位点就可以代替6bp的限制位点SpeI，用于单向克隆。
表5：用于克隆从筛选人海马cDNA文库中获得的5个新抗凋亡基因的引物(分别为SEQ ID NOs：28-37)
Figure A200780013489D01061
实施例5：选择的基因在酵母细胞中的抗凋亡功能
从相同的人海马cDNA文库中，PCR扩增全长人Bcl-2A1、FKBP2、SNCA、VAMP3和EEF1A1，从而构建图41-图45和图47-图51中展示的质粒，该质粒含有受GAL1启动子(图41-图45)调控，或受PGK1启动子调控(图47-图51)的作为HA标签的所有基因。如上文实施例2中所述，将这些质粒转化入W303baxleu，以分析它们在酵母中的抗凋亡功能。
5种新基因的Bax营救能力
斑点试验
将一小勺单菌落细胞(即转化体)，其含新基因，重悬浮于200μl的水中，且这些转化体的5μl等分试样点样于含有适当补充物的SD和SG平板上。
新基因增强抗Bax的菌落形成能力
新抗凋亡基因允许酵母幸免于Bax介导的死亡
从人脑海马cDNA文库中扩增全长基因，并插入酵母表达质粒pSYE224(图39)和pSY239(图40)中的GAL1和PGK1启动子的下游。所有的基因在其3’端具有HA标签。受GALI驱动的基因典型结果显示于图53中(即pSYE224衍生物；图41-图46)。用pSYE239衍生物，获得相似的结果(即图47-52)。
实施例6：选择的基因在哺乳动物细胞中的抗凋亡功能
哺乳动物细胞培养物分析
细胞
在5％湿润的CO2空气中、37°下、25或75cm2组织培养瓶(Corning，NY14831，USA)内，将人胚胎肾细胞((HEK293，ATCC CRL-1573，LGCPromochem，Middlesex，UK)培养于Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM；Gibco BRL，Grand Island，NY，USA)中，该DMEM补充了10％的胎牛血清(FBS；Bio Whittaker，Walkersville，MD，USA)和2mM L-谷氨酸。为了分析蛋白的稳定表达，将细胞培养于含有浓度为1mg/ml的G418(GIBCO BRL)的相同培养基中，以便选择转染的细胞。为了进行免疫细胞化学分析，将细胞在盖玻片(cover-slips)上培养24-48h。
胰蛋白酶消化(trypsination)
以70％-80％融合度(confluency)，在磷酸盐缓冲液(PBS)中，用0.05％胰蛋白酶、0.04％ EDTA，在37°下，分离细胞用于次培养或Nucleofector介导转染(Amaxa，Cologne，Germany)。5min后，用双倍量的生长培养基中止胰蛋白酶消化，并转移至新的烧瓶或具有盖玻片的6孔板上。
瞬时转染
根据制造商的说明书，利用QIAGEN无内毒素质粒Maxi试剂盒(QIAGEN，C-12362，West Sussex，UK)，制备用于转染的DNA。对于Nucleofector介导的转染来说，洗涤亲本HKK293细胞或其稳定地表达目的基因的转染体都用PBS，并吸出以丢掉PBS。吸取生长培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)将培养的粘附细胞洗涤一次，并直接用胰蛋白酶/EDTA分离，170xg，离心5min。将1×106个细胞重悬浮于100μl Nucleofector Solution V(Amaxa，Cologne，Germany)中。此后，加入5μg pcDNA3.1(+)(Invitrogen)或pIRES2-EGFP(Clontech，Palo Alto，CA，USA)载体DNA或含有Bax片段的载体(图10，图11)，将混合物转移至电穿孔玻璃管(electroporation cuvette)，并置于Nucleofector装置(Amaxa)中。转染使用Q-01程序。(进一步的详细内容是Amaxa Biosystems，Cologne，Germany的私有权信息)。核转染(Nucleofection)后，将悬浮物转移至T-25(Corning)中，其含有4ml预热的培养基。15-12h后，更换培养基。24h后，通过在荧光显微镜下对10个随机挑选区域内的eGFP阳性细胞的数量进行计数，来测定转染细胞的效率。
建立稳定表达人Bcl-2A1，FKBP2，SNCA，VAMP3，EEF1A1和Bcl-xL的细胞系
用G418抗性选择克隆
将衍生于pcDNA3.1(+)且携带HA标记的全长Bcl-2A1、FKBP2、SNCA、VAMP3、EEF1A1和Bcl-xL基因片段的质粒DNA转染至HEK293细胞(参阅实施例2)。将转化体接种于含有8ml预热培养基的100mm组织培养皿(Corning)上。在温育2天后，在含有1mg/ml G418(Gibco/BRL LifeTechnologies)的培养基中选择G418抗性的转化细胞。10-15天后，用克隆环(cloning rings)挑选存活的单菌落(G418抗性菌落)，并转移至24孔器皿上，用含有200mg/ml G418的培养基进行进一步的选择。利用抗-HA-荧光素(Roche，Penzberg，Germany)，利用免疫细胞化学，测定人Bcl-2A1、FKBP2、SNCA、VAMP3、EEF1A1和Bcl-xL的表达。通过重复亚克隆，确保转染体的一致性。
分离稳定的克隆
通常，瞬时转染的效率分别是90％。
将稳定的转化体设计为HEK293/Bcl2A1、HEK293/FKBP2、HEK293/SNCA、HEK293/VAMP3、HEK293/EEF1A1和HEK293/Bcl-xL，其分别表达HA标记的Bcl-2A1、FKBP2、SNCA、VAMP3、EEF1A1和Bcl-xL。作为模拟对照，将pcDNA3.1(+)引入HEK293并命名为HEK293pc0(表6)。
表6：转染体的特征
 
转化体的名称 表达的蛋白       G418抗性克隆的编号     抗HA荧光阳性克隆     Western印迹阳性克隆
HEK293pc0 --- 3 --- ---
HEK293/Bcl2A1 Bcl-2A1 14 克隆3，4 克隆3，4
HEK293/FKBP2 FKBP2 10 克隆3，5 克隆3，5
HEK293/SNCA SNCA 6 克隆2，3，4，5 克隆2，3，4，5
HEK293/VAMP3 VAMP3 10 克隆2，4 克隆2，4
HEK293/EEF1A1 EEF1A1 10 克隆2，5 克隆2，5
HEK293/Bcl-xL Bcl-xL 10 克隆1，5 克隆1，5
免疫细胞化学
免疫细胞化学(ICH)是鉴定细胞和组织中蛋白的重要方法。约24-28h后，将转化的细胞接种于包含无菌盖玻片的6孔板上，所述平板预先包被了0.001％聚赖氨酸(Sigma)，用预热的PBS将细胞洗涤两次，并用4％多聚甲醛(PFA)(Sigma)/PBS在37℃下固定15min。将细胞洗涤两次，并用0.3％Triton X-100/10mM磷酸钠/0.5M NaCl，pH7.4在室温下渗透化5min。随后，将细胞与抗HA标记性重组蛋白的荧光素-耦联单克隆抗体(Roche，Penzberg，Germany(1:50稀释))一起温育1小时。室温下在含有10μg/100ml DAPI的PBS中洗涤5分钟后，用甘油中的抗荧光淬灭封片液(anti-fade mountingmedium)(0.1％ P-苯二胺(PPD)(Sigma)，将盖玻片上的细胞封装于玻璃载玻片上。随后，用Analysis 5.5B软件，通过奥林巴斯IX-70荧光显微镜，分析载玻片，并用光电数码成像相机(Optronics digital imaging camera)捕获图像。用DAPI将细胞复染色，以鉴定核DNA。代表性图显示于图54中。
表6概括了免疫细胞化学获得的结果，该结果证实存在HA标记性蛋白。
Western印迹
用10％ PAGE，将来自细胞裂解物的20μg蛋白进行分级。识别HA标签的单克隆抗体用于显示HA标记的蛋白。
表6概括了Western印迹获得的结果，该结果证实存在HA标记性蛋白。
在HEK293中Bax介导的细胞死亡
利用质粒pcDNA3.1/Bax(图10)和pIRESEGFP/Bax(图11)将Bax转染入HEK293后，用台盼蓝拒染法(trypan blue exclusion assay)测定细胞存活力，以检测Bax介导的细胞死亡。
实验
用pcDNA3.1/Bax(图10)、对照质粒cDNA3.1(Invitrogen)、pIRESEGFP/Bax(Figure11)和对照质粒pIRES2-EGFP(Clontech)转染HEK293细胞。将每一次转染都相等地接种于6孔板的6个孔中。每一次转染采用完全相同量的细胞和质粒DNA。如上文实施例6中所述，温育转染体。15-20h后，更换培养基。转染后的最初5天，每天都单独收获所有6个孔的相同转染体。漂洗细胞、轻轻地挂擦、通过离心使之成团、重悬浮于500μl含有0.1％台盼蓝的培养基中、载入血球计数器内，并通过光学显微镜检查。随后计数可视或不可视的(蓝细胞)细胞，所得的得分将死细胞表示为总细胞的百分比。也计算相对存活(即成活)率。重复此实验3次。
结果
Bax转染后，在HEK293中发生细胞死亡.含有质粒pcDNA3.1/Bax(图10)和pIRESEGFP/Bax(图11)的Bax瞬时转染后，在光学显微镜下，利用血球计数器，评估存活细胞的台盼蓝拒染。这些结果清晰地显示细胞存活力降低。收集培养的细胞并计数，以测定Bax转染后在指定的时间内死亡细胞的百分比(图55，A版)。从第一至第五天，对细胞进行计数。将结果与用空载体(即pcDNA3.1和pIRES2-EGFP)转染的细胞进行比较。用pcDNA3.1/Bax(图10)和pIRESEGFP/Bax(图11；在图55中标记为pIRES2-EGFP/Bax)转染的细胞显示，死亡细胞的百分比增加(P<0.001)。这表明，细胞死亡不依赖于所用的载体(P>0.05)。板B(图55)显示Bax或载体转染后第三天的存活细胞相对百分比。
YAS选择的新基因在人细胞中的抗凋亡功能
新基因表达的蛋白对Bax介导的死亡的抑制
利用相似的台盼蓝拒染法测定Bcl-2A1、FKBP2、SNCA、VAMP3、EEF1A1和Bcl-xL蛋白保护HEK293免遭Bax介导的死亡的能力。
将pIRES2-EGFP/Bax转染至Bcl-2A1、FKBP2、SNCA、VAMP3、EEF1A1、Bcl-xL和载体转染的稳定细胞系中。进行载体转染作为阴性对照。对于每一次转染，使用完全相同量的细胞和质粒DNA。如上文实施例6中所述，温育转染体。15-20h后，更换培养基，并评估转染效率。温育3天后，如上文所述，对存活细胞进行计数。获得的得分可以获得正经历Bax介导的细胞百分比，并根据下列公式计算。将实验重复6次，且结果示于图56中。
Bax介导的细胞死亡(0％)＝[(V0-VBax)/(Ft×V0)]×100％
V0代表无Bax的情况下即载体转染后的存活细胞的数量；VBax表示仅用Bax转染后的存活细胞的数量；Ft表示平均转染效率。
利用TUNEL分析检测DNA片段
通过TUNEL(末端脱氧核糖核酸转移酶[TdT]介导的dUTP缺口末端标记)，利用FACS(荧光激活的细胞分选)分析，来定量Bax介导的细胞凋亡。
将pIRES2-EGFP/Bax转染至稳定表达人Bcl-2A1、FKBP2、SNCA、VAMP3、EEF1A1和Bcl-xL的HEK293细胞。温育3天后，收获转染体并在PBS中洗涤。随后，在15-25℃下将细胞固定在新鲜制备的PBS中的2％多聚甲醛中。再次用PBS洗涤后，在冰上，将细胞用1％ Triton X-100在1％醋酸钠中渗透化2min，随后用PBS洗涤两次。随后根据制造商的说明书，在最终用PBS洗涤和重悬浮于PI/RNase溶液(PBS中的0.001％碘化丙啶，0.05％ RNase A)之前，将细胞与含末端脱氧核糖核酸转移酶和FITC-dUTP的Apotag(Roche，East Sussex，UK)酶促反应混合物一起，在37℃、湿润的空气中避光温育60min。随后，利用装备488nm氩激光器作为光源的Beckmann-Coulter流式细胞仪(Epic-Altra)进行FACS分析。碘化丙啶(DNA)在623nm发荧光(其决定细胞的总量)，而FITC在520nm发荧光(其决定细胞凋亡的细胞)。总共分析了10,000次目的事件。结果示于图57中。
用原位免疫荧光法测定细胞色素c从线粒体中的释放
已显示，为了诱导细胞凋亡，促凋亡Bax会从线粒体中释放细胞色素C。利用酵母筛选从人海马中新近发现的抗凋亡蛋白，如果它们真的是抗凋亡的，应该防止人细胞中的细胞色素c释放。
将pcDNA3.1/Bax转化至稳定表达人Bcl-2A1、FKBP2、SNCA、VAMP3、EEF1A1、Bcl-xL和空载体的HEK293细胞中(参阅上文)。将一定量的转染细胞直接接种于包括无菌盖玻片的6孔板上，该板预先包被了0.001％聚赖氨酸(Sigma)。温育3天后，根据制造商的说明书，利用SelectFXTM Alexa Fluor
Figure A200780013489D0111195025QIETU
 488 Cytochrome c Apoptosis Detection Kit(Molecula rProbes)标记细胞色素C。简单而言，让细胞生长于盖玻片上、用预热的PBS洗涤两次，并用新鲜制备的4％的多聚甲醛(PFA)(Sigma)/PBS在37℃下固定15min。在室温下将细胞洗涤两次，用0.3％ Triton X-100/10mM磷酸钠/0.5M NaCl，pH7.4，渗透化5min。用封闭溶液(blockin gsolution)(用PBS洗涤两次后，在PBS中的10％热失活羊血清)封闭样品。在该封闭溶液中，将初级抗细胞色素C小鼠IgG1稀释500倍，并与载玻片上的细胞在室温下在湿气箱子(wet box)中一起温育1h。用封闭溶液漂洗样品两次，并在室温下与Alexa 488羊抗小鼠第二抗体(Molecular Probes)一起避光温育30min。将样品在PBS中漂洗三次，用抗荧光淬灭封片液(甘油中的0.1％ P-苯二胺(PPD)(Sigma))封装于玻璃载玻片上。随后通过奥林巴斯IX-70荧光显微镜分析载玻片，并通过光电数码成像相机捕获图像。所得结果显示于图58中。
测量线粒体膜电势
用碘代3，3′-二己氧基羰花青(3，3’dihexyloxacarbocyanine iodide[DiOC6(3)])染色的细胞，通过流式细胞计数分析来定量线粒体膜电势(ΔΨm)。这项分析利用亲脂性的阳离子荧光燃料DiOC6(3)，其通过线粒体膜负电势转运至线粒体，并且因而在线粒体基质内浓缩。线粒体膜电势的降低导致细胞荧光的减少。
将pcDNA3.1/Bax转染至稳定表达人Bcl-2A1、FKBP2、SNCA、VAMP3、EEF1A1、Bcl-xL和空载体的HEK293细胞中。将一定量的转染细胞直接接种于包括无菌盖玻片的6孔板上，该板包被有0.001％聚赖氨酸(Sigma)。将细胞在37℃下用DiOC6(3)(PBS中40nM；Molecular Probes，Inc.)染色15min，并用PBS洗涤一次，随后用流式细胞仪(Beckmann-Coulter Epic-Altra；488nm下激发，525nm下发射)分析。结果显示于图59中。
细胞内产生活性氧分子(Reactive Oxygen Species，ROS)
用荧光染料2′，7′-二氯双氢荧光素二乙酸酯(H2DCFDA；Molecular Probes，Paisley，UK)，监控Bax介导的ROS产生。该染料是稳定的非极性化合物，其易于扩散入细胞中并产生DCFH。在存在过氧化物酶时，细胞内的H2O2或其他的低分子量过氧化物将DCFH氧化为高荧光的化合物DCF。因此DCF发射的荧光直接反映了总的细胞氧化状态(Wang & Joseph，1999)。
将pcDNA3.1/Bax转染至稳定表达人Bcl-2A1、FKBP2、SNCA、VAMP3、EEF1A1、Bcl-xL和空载体的HEK293细胞中。Bax转染后的第四天，吸出培养基，并将培养的细胞用生理缓冲液(140mM NaCl，5mM KCl，1mM CaCl2，1.2mM NaHPO4，5mM葡萄糖和20mM Hepes，pH7.4)洗涤两次，用胰蛋白酶/EDTA直接分离，随后在5％ CO2/95％空气中、37℃下温育于2ml不含FBS但含有5μM H2DCFDA的细胞培养基中30min。用PBS洗涤细胞两次，以除去细胞外H2DCFDA。随后，将1×106个细胞重悬浮于1ml的PBS中。将100μl来自每一次处理的细胞装载至具有黑色载玻片的96孔板上。在波长492nm(激发)和520nm(发射)下，检测细胞荧光。用SynergyTM HTMulti-Detection Microplate Reader(Bio-Tek Instruments，Winooski，Vermont，USA)，监控相对荧光强度。用
Figure A200780013489D0112195131QIETU
 KC4软件，计算10次独立测量的数值，求平均值。结果示于图60中。
在上文的实验中，除非另有说明，数据表示为平均值±SD。对于所有的统计计数，我们采用SPSS 12.0软件。在所有的试验中，相同的实验至少重复3次(n≥3)，如果p值<0.05，则认为差别是有统计意义的。
参考文献
Baier et al(2003)“Apoptosis in rheumatoid arthritis”.Curr Opin Rheumatol.15(3)：274-9.
Bennetzen & Hall(1982)“Codon selection in yeast”.J Biol Chem.257(6)：3026-31.
Brands et al(1986)The primary structure of the alpha subunit of human elongation factor 1：structural aspects of guanine-nucleotide-binding sites.Europ.J.Biochem.155：167-171，1986.
Budihardo et al(1999)“Biochemical pathways of caspase activation during apoptosis”.Annu Rev Cell Dev Biol.15：269-90.
Burtnick et al(2004)“Structure of the N-terminal half of gelsolin bound to actin：roles insevering，apoptosis and FAF”.EMBO J.23(14)：2713-22.
Byrne and Ruddle(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5473-5477
Cardoso & Oliveira(2003)“Inhibition of NF-kB renders cells more vulnerable toapoptosis induced by amyloid beta peptides”.Free Radic Res.37(9)：967-73.
Chong et al(2005)“Activating Akt and the brain′s resources to drive cellular survivaland prevent inflammatory injury”.Histol Histopathol.20(1)：299-315.
Cnop et al(2005)“Mechanisms of Pancreatic {beta}-Cell Death in Type 1 and Type 2Diabetes：Many Differences，Few Similarities”.Diabetes.54 Suppl 2：S97-S107.
Cooper & Burge(2003)“Darier′sdisease：epidemiology，pathophysiology，andmanagement.”Am J Clin Dermatol.4(2)：97-105
Cory et al(2003)“The Bcl-2 family：roles in cell survival and oncogenesis.Oncogene22(53)：8590-607.
Davies(2000)“Neurotrophins：more to NGF than just survival.”Curr Biol.10(10)：R374-6
Dhitavat et al(2004)Calcium pumps and keratinocytes：lessons from Darier’s diseaseand Hailey-Hailey disease.British J ournal of Dermatology 150：821-828.
DiLella et al(1992)“Chromosomal band assignments of the genes encoding humanFKBP12 and FKBP13”.Biochem.Biophys.Res.Commun.189(2)：819-23.
Distelhorst & Shore(2004)“Bcl-2 and calcium：controversy beneath the surface”.Oncogene.23(16)：2875-80.
Ditzel et al(2000)Cloning and expression of a novel human antibody--antigen pair associatedwith Felty′s syndrome.Proc.Nat.Acad.Sci.USA 97：9234-9239.
Fan et al(1996)Mutations in the RNA polymerase II transcription machinery suppressthe hyperrecombination mutant hprl delta of Saccharomyces cerevisiae.Genetics.142(3)：749-59.
Foggia & Hovnanian(2004)Calcium pump disorders of the skin.Am.J.Med Genet.C(Semin.Med.Genet)131 C：20-31.
Greenhalf et al(1996)Role of mitochondria and C-terminal membrane anchor of Bcl-2in Bax induced growth arrest and mortality in Saccharomyces cerevisiae.FEBSLett.380(1-2)：169-75.
Hajra & Liu(2004)“Apoptosome dysfunction in human cancer”.Apoptosis.9(6)：691-704.
Halliwell & Whiteman(2004)“Measuring reactive species and oxidative damage in vivoand in cell culture：how should you do it and what do the results mean？”Br JPharmacol.142(2)：231-55.
Harms et al(2004)“Neuronal gelsolin prevents apoptosis by enhancing actindepolymerization”.Mol Cell Neurosci.25(1)：69-82.
Heaton et al(2003)“Effects of ethanol on neurotrophic factors，apoptosis-relatedproteins，endogenous antioxidants，and reactive oxygen species in neonatalstriatum：relationship to periods of vulnerability”.Brain Res Dev Brain Res.140(2)：237-52.
Jackisch et al(2000)Delayed micromolar elevation in intracellular calcium precedesinduction of apoptosis in thapsigargin-treated breast cancer cells.Clin CancerRes 6：2844-50.
Johnston(1987)“A model fungal gene regulatory mechanism：the GAL genes ofSaccharomyces cerevisiae”.Microbiol Rev.51(4)：458-76.
Johnston(2005)“Excitotoxicity in perinatal brain injury”.Brain Pathol.15(3)：234-40.Kalivendi et al(2004)Alpha-synuclein up-regulation and aggregation during MPP+induced apoptosis in neuroblastoma cells：intermediacy of transferrin receptoriron and hydrogen peroxide.J Biol Chem279(15)：15240-7.
Kato(2001)“Molecular genetics of bipolar disorder”Neurosci Res.40(2)：105-13.Kirkland et al(2002)“A Bax-induced pro-oxidant state is critical for cytochrome crelease during programmed neuronal death”.J Neurosci.22(15)：6480-90.
Lamberti et al(2004)The translation elongation factor 1A in tumorigenesis，signaltransduction and apoptosis：Review article.Amino Acids 26：443-448.
Leroy et al(2005)“Protein kinase C zeta associates with death inducing signallingcomplex and regulates Fas ligand-induced apoptosis”.Cell Signal.17(9)：1149-57.
Li et al(2004)“Cyclophilin-D promotes the mitochondrial permeability transition buthas opposite effects on apoptosis and necrosis”.Biochem J.383(1)：101-9.
Ligr et al(1998)Mammalian Bax triggers apoptotic changes in yeast.FEBS Lett.438(1-2)：61-65.
Manon et al(1997)Release of cytochrome c and decrease of cytochrome c oxidase inBax-expressing yeast cells，and prevention of these effects by coexpression ofBcl-xL.FEBS Lett.415(1)：29-32.
Matsuyama et al(1999)Yeast as a tool for apoptosis research.Curr Opin Microbiol.2(6)：618-23.
Melo LG et al，(2004)Gene and cell-based therapies for heart disease.FASEB J.18(6)：648-63.
Millet et al(2005)“Targeted expression of the anti-apoptotic gene CrmA to NODpancreatic islets protects from autoimmune diabetes.Targeted expression ofthe anti-apoptotic gene CrmA to NOD pancreatic islets protects fromautoimmune diabetes”.J Autoimmun.Dec 6；[Epub ahead of print]
Morii et al(1991)Biochem.Biophys Res.Commun.175：185-191
Mundle(2005)“Par-4：A common facilitator/enhancer of extrinsic and intrinsic pathwaysof apoptosis”.Leuk Res.Nov 10；[Epub ahead of print]
Olivia et al(1991)Genomics 10：157-165
Partaledis & Berlin(1993)The FKB2 gene of Saccharomyces cerevisiae，encoding theimmunosuppressant-binding protein FKBP-13，is regulated in response toaccumulation of unfolded proteins in the endoplasmic reticulum.Proc NatlAcad Sci USA.90(12)：5450-4.
Pereira-Leal & Seabra(2001)Evolution of the Rab family of small GTP-binding proteins.JMol Biol.313(4)：889-901.
Poirier，Ed.(1997)Apoptosis Techniques and Protocols，Humana Press，Totowa，NJ，USA.
Pong(2003)“Oxidative stress in neurodegenerative diseases：therapeutic implications forsuperoxide dismutase mimetics”.Expert Opin Biol Ther.3(1)：127-39.
Poon et al(2004)“Free radicals and brain aging”.Clin Geriatr Med.20(2)：329-59.
Prasad et al(2005)Haploinsufficiency of Atp2a2，Encoding the Sarco(endo)plasmicReticulum Ca2+-ATPase Isoform 2 Ca2+ Pump，Predisposes Mice to SquamousCell Tumors via a Novel Mode of Cancer Susceptibility.Cancer Res 65(19)：8655-61.
Priault et al(2003)Yeast as a tool to study Bax/mitochondrial interactions in cell death.FEMS Yeast Res.4(1)：15-27.
Qu et al(2004)Endoplasmic reticulum stress induces p53 cytoplasmic localization andprevents p53-dependent apoptosis by a pathway involving glycogen synthasekinase-3h.Genes Dev 18：261-77.
Reeder & Lang(1994)“The mechanism of transcription termination by RNA polymeraseI”.Mol Microbiol.12(1)：11-5.
Reeve et al(2005)“Don′t lose heart--therapeutic value of apoptosis prevention in thetreatment of cardiovascular disease.”J Cell Mol Med.9(3)：609-22.
Rogaev et al(1992)Hum.Mol.Genet.1：781
Rokosz et al(1994)“Human cytoplasmic 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A synthase：expression，purification，and characterization of recombinant wild-type and Cys 129mutant enzymes.Arch.Biochem.Biophys.312(1)：1-13.
Rothstein(1983)One-step gene disruption in yeast.Meth.Enzymol.101：202-11.
Rouaux et al(2004)“Targeting CREB-binding protein(CBP)loss of function as atherapeutic strategy in neurological disorders”.Biochem Pharmacol.68(6)：1157-64.
Savolainen et al(1998)“Interactions of excitatory neurotransmitters and xenobiotics inexcitotoxicity and oxidative stress：glutamate and lead”.Toxicol Lett.102-103：363-7.
Sellers et al(1994)J.Immunol.Meth.172，255-264.
Sharif F，et al(2004)“Current status of catheter-and stent-based gene therapy.”Cardiovasc Res.64(2)：208-16.
Shull et al(2003)Physiological functions of plasma membrane and intracellular Ca2+pumps revealed by analysis of null mutants.Ann N Y Acad Sci.986：453-60.
Soane & Fiskum(2005)“Inhibition of mitochondrial neural cell death pathways byprotein transduction of Bcl-2 family proteins”.J Bioenerg Biomembr.37(3)：179-90.
Sreedhar & Csermely(2004)“Heat shock proteins in the regulation of apoptosis：newstrategies in tumor therapy：a comprehensive review”.Pharmacol Ther.101(3)：227-57.
Sullivan et al(2005)“Mitochondrial permeability transition in CNS trauma：cause oreffect of neuronal cell death？”J Neurosci Res 79(1-2)：231-9.
Sung et al(2005)“The pleiotropy of telomerase against cell death”.Mol Cells.19(3)：303-9.
Svensson EC，et al.(1999)Efficient and stable transduction of cardiomyocytes afterintramyocardial injection or intracoronary perfusion with recombinantadeno-associated virus vectors.Circulation.99：201—5.
Talapatra & Thompson(2001)Growth factor signalling in cell survival：implications forcancer treatment.J Pharmacol Exp Ther 298(3)：873-8.
Talapatra et al(2001)Elongation factor-1 alpha is a selective regulator of growth factorwithdrawal and ER stress-induced apoptosis.Cell Death Differ 9：856-861.
Telford et al(1994)J.Immunol.Meth.172，1-16，
Thomas & Rothstein(1989)Elevated recombination rates in transcriptionally activeDNA.Cell 56：619-630.
Thornton et al(2003)Not just for housekeeping：protein initiation and elongationfactors in cell growth and tumorigenesis.J Mol Med 81：536-548
Touchman et al(2001)Human and Mouse α-Synuclein Genes：Comparative GenomicSequence Analysis and Identification of a Novel Gene Regulatory Element.Genome Research 11(1)：78-86
Valko et al(2005)“Metals，toxicity and oxidative stress”.Curr Med Chem.12(10)：1161-208.
Van den et al(1991)Biochem.Biophys.Acta.2：249-251.
van Duijn et al(2001)PARK7，a novel locus for autosomal recessive early-onsetparkinsonism，on chromosome 1p36.Am.J.Hum.Genet.69：629-634
Veal et al(2003)Ybp1 is required for the hydrogen peroxide-induced oxidation of theYapl transc ription factor.J Biol Chem.278(33)：30896-904.Erratum in：J BiolChem.(2004)279(47)：49562.
Voth et al(2005)ACE2，CBK1，and BUD4 in budding and cell separation.Eukaryot Cell.4(6)：1018-28.
Wang & Joseph(1999)“Quantifying cellular oxidative stress by dichlorofluoresceinassay using microplate reader.”Free Radic Biol Med.27(5-6)：612-6.
Wang & Sudhof(2003)Genomic definition of RIM proteins：evolutionary amplification of afamily of synaptic regulatory proteins.Genomics.81(2)：126-37.
Wang et al(2000)The RIM/NIM family of neuronal C2 domain proteins.Interactionswith Rab3 and a new class of Src homology 3 domain proteins.J Biol Chem.275(26)：20033-44.
Xu & Reed(1998)Bax inhibitor-1，a mammalian apoptosis suppressor identified byfunctional screening in yeast.Mol Cell.1(3)：337-46.
Yamamoto & Behl(2001)“Human Nck-associated protein 1 and its binding proteinaffect the metabolism of beta-amyloid precursor protein with Swedishmutation”.Neurosci Lett.316(1)：50-4.
Yano et al(2005)“Functional proteins involved in regulation of intracellular Ca(2+)fordrug development：role of calcium/calmodulin-dependent protein kinases inischemic neuronal death”.J Pharmacol Sci.97(3)：351-4.
Zweif el et al(2005)“Functions and mechanisms of retrograde neurotrophin signalling”.NatRev Neurosci.6(8)：615-25.

Claims (75)

1.酿酒酵母细胞，其具有基因型MAT-a、ade2-1、trp1-1、leu2-3、leu2-112、his3-11、his3-15、ura3-1和can1-100，且含有在整合于LEU2染色体基因座中的半乳糖诱导性启动子的调控下编码功能性Bax多肽的多核苷酸。
2.酿酒酵母细胞，其具有基因型MAT-a、ade2-1、trp1-1、leu2-3、leu2-112、his3-11、his3-15、ura3-1和can1-100，且含有酵母整合质粒，所述质粒含有在半乳糖诱导性启动子的调控下编码功能性Bax多肽的多核苷酸，且适宜在LEU2染色体基因座中整合。
3.根据权利要求1或2所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞是菌株W303-1A。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的酵母细胞，其中所述功能性Bax多肽含有人Bax多肽或其促凋亡片段或其变体。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的酵母细胞，其中编码所述功能性Bax多肽的所述多核苷酸的密码子已经优化用于酵母中。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的酵母细胞，其中编码所述功能性Bax多肽的所述多核苷酸含有序列SEQ ID No：2。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的酵母细胞，其中所述半乳糖诱导性启动子是GAL1或GAL10。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的酵母细胞，其中编码所述功能性Bax多肽的所述多核苷酸由SUC2转录终止序列终止。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的酵母细胞，其中在存在半乳糖时，所述功能性Bax多肽的表达导致细胞死亡。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的酵母细胞，其是菌株W303baxleu。
11.试剂盒，其含有权利要求1-10中任一项所述的酵母细胞和适宜将多核苷酸文库转化至所述酵母细胞的酵母质粒载体。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其中所述酵母质粒载体在可诱导启动子的调控下适宜表达多核苷酸文库中的多核苷酸。
13.根据权利要求11或12所述的试剂盒，其中所述酵母质粒载体是pYES2(Stratagene)。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的试剂盒，其还含有在所述酵母细胞中在所述诱导性启动子的调控下诱导多核苷酸表达的试剂。
15.根据权利要求14所述的试剂盒，其中在酵母细胞中诱导所述多核苷酸表达的所述试剂是半乳糖。
16.根据权利要求11-14中任一项所述的试剂盒，其还含有半乳糖。
17.根据权利要求11-16中任一项所述的试剂盒，其中所述多核苷酸文库是cDNA文库。
18.根据权利要求11-17中任一项所述的试剂盒，其还含有用于筛选Bax介导的细胞凋亡的抑制剂的多核苷酸文库的方法的说明书。
19.筛选Bax介导的细胞凋亡的抑制剂的多核苷酸或筛选编码Bax介导的细胞凋亡的抑制剂的多核苷酸的方法，所述方法包括：
(a)在酵母质粒载体中提供多核苷酸文库；
(b)将多核苷酸文库转化至权利要求1-10中任一项所定义的酵母细胞中；
(c)将转化的酵母在允许酵母质粒载体中的功能性Bax多肽和多核苷酸表达的条件下平板接种；以及
(d)鉴定生长的酵母菌落；
其中酵母菌落的生长表示，酵母质粒载体中的多核苷酸是Bax介导的细胞凋亡的抑制剂或是编码Bax介导的细胞凋亡的抑制剂。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述多核苷酸文库是由人脑组织、与糖尿病有关的组织、癌组织、心脏组织、与风湿性关节炎有关的组织、细胞系或细菌基因组或病毒基因组产生的cDNA文库。
21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述酵母质粒载体中的所述多核苷酸文库受诱导性启动子的调控。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述诱导性启动子是四环素诱导性启动子、甲硫氨酸诱导性启动子、半乳糖诱导性启动子、ADH2启动子或金属硫蛋白启动子。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述半乳糖诱导性启动子是GAL1或GAL10。
24.根据权利要求19-23中任一项所述的方法，其中所述酵母质粒载体是pYES2。
25.根据权利要求19-25中任一项所述的方法，其中所述转化步骤(b)为高效转化。
26.根据权利要求19-25中任一项所述的方法，其中平板接种步骤(c)包括在存在半乳糖的情况下将接种的酵母细胞于30℃温育至少72小时。
27.根据权利要求19-26中任一项所述的方法，还包括获得步骤(d)所鉴定的酵母菌落中的酵母质粒载体内的多核苷酸序列。
28.根据权利要求19-27中任一项所述的方法，还包括再次检测步骤(d)所鉴定的酵母菌落中的质粒载体内的多核苷酸或所述多核苷酸编码的多肽，检测其在细胞凋亡模型中抑制Bax介导的细胞凋亡的能力。
29.根据权利要求19-28中任一项所述的方法，还包括修饰步骤(d)所鉴定的酵母菌落中的质粒载体内的多核苷酸，并检测修饰的多核苷酸或所述修饰的多核苷酸编码的多肽在细胞凋亡模型中抑制Bax介导的细胞凋亡的能力。
30.根据权利要求27所述的方法，还包括基于获得的序列数据鉴定多核苷酸，并检测对应于鉴定的多核苷酸的多核苷酸或所述对应多核苷酸编码的多肽在细胞凋亡模型中抑制Bax介导的细胞凋亡的能力。
31.根据权利要求28-30中任一项所述的方法，其中细胞凋亡模型选自细胞凋亡的酵母细胞模型、哺乳动物细胞模型和体内模型。
32.根据权利要求31所述的方法，还包括将具有抑制Bax介导的细胞凋亡能力的多核苷酸或多肽配制成药学上可接受组合物的步骤。
33.抵抗细胞中Bax介导的细胞凋亡的方法，所述方法包括将细胞与多肽接触，所述多肽选自：FKBP2(FKBP-13)；α-突触核蛋白(SNCA)，真核生物翻译延伸因子1α1(EEF1A1)；囊泡相关膜蛋白3(VAMP3)；突触小体相关蛋白(SNAP25)；RIMS3；RAB40B；3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶1(HMGCS1)；硬脂酰辅酶A去饱和酶5(SCD5)；ATPase Atp2a2(ATP2A2)；hnRNP甲基转移酶-样蛋白1(HRMT1L1)；和含有SEQ ID No：16，SEQ ID No：17，SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽，或任意一种所述多肽的抗凋亡衍生物，或与编码任意一种所述多肽或衍生物的多核苷酸接触。
34.根据权利要求33所述的方法，其是体外进行的。
35.多肽或任意一种所述多肽的抗凋亡衍生物或编码任意一种所述多肽或衍生物的多核苷酸在制备抵抗细胞中Bax介导的细胞凋亡的药物中的用途，所述多肽选自FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1和含有SEQ ID No：16，SEQ ID No：17，SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽。
36.多肽或任意一种所述多肽的抗凋亡衍生物或编码任意一种所述多肽或衍生物的多核苷酸在医学中的用途，所述多肽选自FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1和含有SEQ ID No：16，SEQ ID No：17，SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽。
37.药用组合物，其含有：多肽，其选自FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1和含有SEQ ID No：16、SEQ ID No：17、SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽；或任意一种所述多肽的抗凋亡衍生物；或编码任意一种所述多肽或衍生物的多核苷酸；和药学上可接受载体或赋形剂。
38.抵抗选自神经变性疾病或病症、心血管疾病、风湿性关节炎和糖尿病的疾病或病症的方法，所述方法包括向患者施用：多肽，其选自FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1和含有SEQ ID No：16、SEQ ID No：17、SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽；或任意一种所述多肽的抗凋亡衍生物；或编码任意一种所述多肽或衍生物的多核苷酸。
39.多肽或任意一种所述多肽的抗凋亡衍生物，或编码任意一种所述多肽或衍生物的多核苷酸，在制备抵抗选自神经变性疾病或病症、心血管疾病、风湿性关节炎和糖尿病的疾病或病症的药物中的用途，所述多肽选自FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1和含有SEQ ID No：16、SEQ ID No：17、SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽。
40.根据权利要求38或39所述的方法或用途，其中所述的神经变性疾病或病症选自：中风、脊髓损伤、头部损伤、脊髓性肌萎缩症(SMA)、包括肌萎缩侧索硬化(ALS)的运动神经元病、阿尔茨海默氏病(AD)、帕金森氏病(PD)和亨廷顿病(HD)。
41.增强细胞中Bax介导的细胞凋亡的方法，所述方法包括将细胞与多肽的抑制剂或拮抗剂接触，所述多肽选自：FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1和含有SEQ ID No：16、SEQ ID No：17、SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽。
42.根据权利要求41所述的方法，其在体外进行。
43.多肽的抑制剂或拮抗剂在制备增强患者细胞的Bax介导的细胞凋亡的药物中的用途，所述多肽选自：FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1和含有SEQ ID No：16、SEQ ID No：17、SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽。
44.多肽的抑制剂或拮抗剂或编码任意一种所述抑制剂或拮抗剂的多核苷酸在医学中的用途，所述多肽选自：FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1和含有SEQ ID No：16、SEQ ID No：17、SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽。
45.药用组合物，其含有：多肽的抑制剂或拮抗剂或编码任意一种所述抑制剂或拮抗剂的多核苷酸和药学上可接受载体或赋形剂，所述多肽选自FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1和含有SEQ ID No：16、SEQ ID No：17、SEQ IDNo：18或SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽。
46.抵抗患者癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用多肽的抑制剂或拮抗剂或编码任意一种所述抑制剂或拮抗剂的多核苷酸，所述多肽选自FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1和含有SEQ ID No：16、SEQ ID No：17、SEQ IDNo：18或SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽。
47.多肽的抑制剂或拮抗剂或编码任意一种所述抑制剂或拮抗剂的多核苷酸在制备抵抗患者癌症的药物中的用途，所述多肽选自：FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1和含有SEQ ID No：16、SEQ ID No：17、SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽。
48.根据权利要求41-47中任一项所述的方法或用途，其中所述抑制剂或拮抗剂是与所述多肽选择性结合的抗体。
49.根据权利要求41-47中任一项所述的方法或用途，其中所述抑制剂或拮抗剂是核酶、反义多核苷酸或siRNA分子。
50.根据权利要求41-47中任一项所述的方法或用途，其中所述抑制剂或拮抗剂是权利要求51-71任意一种方法可鉴定的或由权利要求51-71任意一种方法鉴定的。
51.鉴定调节基因表达的化合物的方法，所述基因选自：FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1，和转录信息具有含有SEQ ID No：16、SEQ ID No：17、SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的cDNA序列的基因，所述方法包括：
提供含有报道基因的细胞，所述报道基因可操作地连接于以下基因的启动子和/或调节部分，所述基因选自：FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1，和转录信息具有含有SEQ ID No：16、SEQ ID No：17、SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的cDNA序列的基因，
将细胞与候选化合物接触；以及
检测报道基因的表达，
其中报道基因应答候选化合物的表达变化鉴定出能调节以下基因表达的化合物，所述基因选自：FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1，和转录信息具有含有SEQID No：16、SEQ ID No：17、SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的cDNA序列的基因。
52.根据权利要求51所述的方法，其中增强所述报道基因表达的鉴定出的化合物能增强由其天然存在的启动子引起的各自基因编码的多肽的体内表达。
53.根据权利要求51所述的方法，其中降低所述报道基因表达的鉴定出的化合物能降低由其天然存在的启动子引起的各自基因编码的多肽的体内表达。
54.根据权利要求51所述的方法，其中所述报道分子选自β-GAL、GFP和水母发光蛋白。
55.根据权利要求51-54中任一项所述的方法，其中基因的所述启动子部分含有该基因转录起始位点上游(5’)5kb的区域，所述基因选自：FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1，和转录信息具有含有SEQ ID No：16、SEQ ID No：17、SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的cDNA序列的基因。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述启动子位于所述基因转录起始位点上游(5’)3kb或2kb或1kb或500bp的区域中。
57.根据权利要求51-56中任一项所述的方法，其中所述基因的调节部分含有所述基因转录起始位点上游(5’)20kb的区域，所述基因选自：FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1，和转录信息具有含有SEQ ID No：16、SEQ ID No：17、SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的cDNA序列的基因。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述调节区域位于所述基因转录起始位点5’上游10kb或7kb或5kb或3kb，或更优选1kb的区域中。
59.鉴定调节细胞中Bax介导的细胞凋亡的化合物的方法，所述方法包括：
根据权利要求51-58任一项所述的方法，鉴定调节以下基因表达的化合物，所述基因选自：FKBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1，和转录信息具有含有SEQID No：16、SEQ ID No：17、SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的cDNA序列的基因，以及
在Bax介导的细胞凋亡分析中检验所述鉴定的化合物。
60.根据权利要求59所述的方法，其中细胞凋亡模型选自细胞凋亡的酵母细胞模型、哺乳动物细胞模型和体内模型。
61.根据权利要求59或60所述的方法，其中增强所述报道基因表达的化合物是Bax介导的细胞凋亡的抑制剂。
62.根据权利要求59或60所述的方法，其中降低所述报道基因表达的化合物是Bax介导的细胞凋亡的启动子。
63.鉴定调节Bax介导的细胞凋亡的化合物的方法，所述方法包括：
提供在诱导性启动子的调控下表达功能性Bax多肽，且在其天然存在的启动子和/或调节序列的调控下表达下述多肽的细胞：KBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1和含有SEQ ID No：16、SEQ ID No：17、SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽；
将所述细胞与候选化合物在诱导功能性Bax多肽表达的条件下接触；以及
进行细胞凋亡分析，
其中与未接触候选化合物的细胞相比，细胞凋亡水平发生变化表示该化合物能调节Bax介导的细胞凋亡。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞，优选人细胞。
65.根据权利要求63或64所述的方法，其中所述细胞来自脑细胞优选海马细胞的初级培养物或是衍生自脑细胞优选海马细胞的细胞系。
66.根据权利要求63-65中任一项所述的方法，其中所述细胞来自已经转染了含有在诱导性启动子的调控下编码功能性Bax多肽的多核苷酸的构建体的人细胞系。
67.根据权利要求63-66中任一项所述的方法，其中所述细胞在缺少候选化合物时，在其天然存在的启动子和/或调节序列的调控下表达下述多肽：KBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1和含有SEQ ID No：16、SEQ ID No：17、SEQ IDNo：18或SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽。
68.根据权利要求63-67中任一项所述的方法，其中所述细胞凋亡模型选自细胞凋亡的酵母细胞模型、哺乳动物细胞模型和体内模型。
69.筛选与多肽结合的化合物的方法，所述多肽选自：KBP2、SNCA、EEF1A1、VAMP3、SNAP25、RIMS3、RAB40B、HMGCS1、SCD5、ATP2A2、HRMT1L1和含有SEQ ID No：16、SEQ ID No：17、SEQ ID No：18或SEQ ID No：19的多核苷酸编码的多肽，或其适宜的抗凋亡衍生物，所述方法包括：
将所述多肽与候选化合物接触；
检测含有所述多肽和候选化合物的复合物的存在；以及
任选地，鉴定与所述多肽结合的任何化合物。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述候选化合物是肽或多肽。
71.根据权利要求69或70所述的方法，其是高通量筛选分析。
72.根据权利要求51-71中任一项所述的方法，其中所述鉴定的化合物是类药化合物或用于研发类药化合物的先导化合物。
73.根据权利要求51-72中任一项所述的方法，其中在细胞凋亡模型和/或适宜的疾病模型中检验所述鉴定的化合物。
74.根据权利要求51-73中任一项所述的方法，其中修饰所述鉴定的化合物，且在细胞凋亡模型和/或适宜的疾病模型中检验所述修饰的化合物。
75.根据权利要求51-74中任一项所述的方法，还包括将所述鉴定的化合物配制成药学上可接受的组合物。
CNA2007800134894A 2006-02-15 2007-02-15 细胞凋亡的方法、基因和蛋白 Pending CN101437845A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0602992.0A GB0602992D0 (en) 2006-02-15 2006-02-15 Methods, genes and proteins
GB0602992.0 2006-02-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101437845A true CN101437845A (zh) 2009-05-20

Family

ID=36141842

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2007800134894A Pending CN101437845A (zh) 2006-02-15 2007-02-15 细胞凋亡的方法、基因和蛋白

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20090258794A1 (zh)
EP (1) EP1984393A2 (zh)
JP (1) JP2009526541A (zh)
CN (1) CN101437845A (zh)
CA (1) CA2642856A1 (zh)
GB (1) GB0602992D0 (zh)
WO (1) WO2007093807A2 (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104244966A (zh) * 2011-11-15 2014-12-24 昆西生物科学有限公司 水母发光蛋白用于减少缺血导致的神经损伤
CN108866145A (zh) * 2018-06-01 2018-11-23 河南德邻生物制品有限公司 酿酒酵母与don互作降低ipec-j2细胞凋亡的检测步骤及其应用
CN110373428A (zh) * 2016-10-08 2019-10-25 杭州电子科技大学 一种促进细胞移植和基因表达的转基因载体系统及其应用
CN111499742A (zh) * 2013-11-21 2020-08-07 豪夫迈·罗氏有限公司 抗-α-突触核蛋白抗体及使用方法
CN113846122A (zh) * 2021-08-16 2021-12-28 中国医学科学院医学生物学研究所 一种过表达snca的腺相关病毒载体aav-snca、制备方法及其应用

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2356883B1 (es) * 2008-07-24 2012-02-22 Bcn Peptides, S.A. Composición para el tratamiento del dolor y/o la inflamación.
EP2331135A4 (en) * 2008-08-06 2013-01-02 St Vincents Inst Med Res METHOD FOR THE TREATMENT AND PREVENTION OF GLUCOSE TOXICITY
WO2010138869A1 (en) * 2009-05-29 2010-12-02 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Modulation of phospholipase d for the treatment of neurodegenerative disorders
CN105911275B (zh) 2009-08-14 2018-06-29 加利福尼亚大学董事会 诊断自闭症的试剂盒
WO2011048589A2 (en) * 2009-10-23 2011-04-28 Ben Gurion University Of The Negev Research And Development Authority Ion exchangers and methods of use thereof
US8895511B2 (en) 2009-11-24 2014-11-25 St. Jude Children's Research Hospital Use of sarcoplasmic CA2+-ATPase type 2 protein for diagnosing and treating learning or mental disorders
CA2989882A1 (en) 2015-06-26 2016-12-29 The Regents Of The University Of California Antigenic peptides and uses thereof for diagnosing and treating autism
JP7136790B2 (ja) 2017-02-17 2022-09-13 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー アルファ－シヌクレインに対する抗体およびその使用
US11162122B2 (en) * 2017-07-11 2021-11-02 Adisseo France S.A.S. Methionine-producing yeast
CN113005150A (zh) * 2019-12-20 2021-06-22 复旦大学附属华山医院 一种新型的动物快动眼睡眠行为障碍模型的制备方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4946778A (en) * 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4987071A (en) * 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
US5143854A (en) * 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
CA2063195C (en) * 1991-03-20 2000-06-27 Susan A. Henry Inositol-excreting yeast
US5545531A (en) * 1995-06-07 1996-08-13 Affymax Technologies N.V. Methods for making a device for concurrently processing multiple biological chip assays
US5846220A (en) * 1996-04-30 1998-12-08 Medtronic, Inc. Therapeutic method for treatment of Alzheimer's disease
US5989897A (en) * 1997-03-24 1999-11-23 University Technology Corporation Yeast silencing genes proteins and methods
GB2326413A (en) * 1997-06-20 1998-12-23 Novartis Ag Screening apoptosis inhibitors using the BAX gene
KR100676218B1 (ko) * 1999-07-01 2007-02-28 얀센 파마슈티카 엔.브이. 효모 및 진균에서 세포 사멸 관련 약물 표적
US7695959B2 (en) * 2000-05-23 2010-04-13 Neurologix, Inc. Glutamic acid decarboxylase (GAD) based delivery systems
AU2003237172A1 (en) * 2002-05-03 2003-11-17 New York State Department Of Mental Hygiene Office Of Mental Health Cell cultures from animal models of alzheimer's disease for screening and testing drug efficacy
AU2004220522A1 (en) * 2003-03-12 2004-09-23 Georgetown University Animal model simulating neurologic disease

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104244966A (zh) * 2011-11-15 2014-12-24 昆西生物科学有限公司 水母发光蛋白用于减少缺血导致的神经损伤
CN104244966B (zh) * 2011-11-15 2019-01-11 昆西生物科学有限公司 水母发光蛋白用于减少缺血导致的神经损伤
CN111499742A (zh) * 2013-11-21 2020-08-07 豪夫迈·罗氏有限公司 抗-α-突触核蛋白抗体及使用方法
CN111499742B (zh) * 2013-11-21 2024-05-07 豪夫迈·罗氏有限公司 抗-α-突触核蛋白抗体及使用方法
CN110373428A (zh) * 2016-10-08 2019-10-25 杭州电子科技大学 一种促进细胞移植和基因表达的转基因载体系统及其应用
CN108866145A (zh) * 2018-06-01 2018-11-23 河南德邻生物制品有限公司 酿酒酵母与don互作降低ipec-j2细胞凋亡的检测步骤及其应用
CN108866145B (zh) * 2018-06-01 2022-03-08 河南德邻生物制品有限公司 酿酒酵母与don互作降低ipec-j2细胞凋亡的检测步骤及其应用
CN113846122A (zh) * 2021-08-16 2021-12-28 中国医学科学院医学生物学研究所 一种过表达snca的腺相关病毒载体aav-snca、制备方法及其应用
CN113846122B (zh) * 2021-08-16 2023-08-25 中国医学科学院医学生物学研究所 一种过表达snca的腺相关病毒载体aav-snca、制备方法及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2007093807A2 (en) 2007-08-23
US20090258794A1 (en) 2009-10-15
CA2642856A1 (en) 2007-08-23
JP2009526541A (ja) 2009-07-23
EP1984393A2 (en) 2008-10-29
WO2007093807A3 (en) 2007-11-29
GB0602992D0 (en) 2006-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101437845A (zh) 细胞凋亡的方法、基因和蛋白
RU2761564C2 (ru) Композиции и способы деградации неправильно упакованных белков
KR20200044793A (ko) Aav의 전달을 위한 조성물 및 방법
WO2014046481A1 (ko) 세포 투과성 펩티드, 그를 포함한 컨쥬게이트 및 그를 포함한 조성물
CN109362223A (zh) 高转导hsv载体
JPH10504446A (ja) Ｆａｓ会合タンパク質
US20110224133A1 (en) Highly Potent Peptides To Control Cancer And Neurodegenerative Diseases
CN105209617B (zh) 微囊泡及其制造方法
CN109563130A (zh) 用于治疗神经退行性疾病的tdp-43线粒体定位抑制剂
US7314864B1 (en) Humanin, a polypeptide suppressing neuronal death
US20130316958A1 (en) Highly potent peptides to control cancer and neurodegenerative diseases
US20160030510A1 (en) Methods of treating alzheimer&#39;s disease and other tauopathies with inhibitors of microtubule affinity regulating kinase
CN106659911A (zh) 治疗或预防神经退行性病症的组合物和方法
CN113373176A (zh) 一种基因治疗载体构建方法及在阿尔兹海默症药物的应用
EP2531609A1 (en) Methods for the diagnosis and therapy of retinitis pigmentosa
CN109876143A (zh) Wip1基因及其表达蛋白在治疗肌萎缩侧索硬化中的用途
KR101697771B1 (ko) Itm2a 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 핵산을 유효성분으로 하는 항암용 조성물
US20120244123A1 (en) Therapeutic agents
WO2012120129A1 (en) Methods and pharmaceutical composition for the treatment of infectious diseases
CN111718939B (zh) 铁转运蛋白在治疗帕金森疾病的应用
CN115414485B (zh) uN2CpolyG蛋白抑制剂的用途
JP2003040801A (ja) Ｃｎｓ障害の治療および治療薬の開発におけるニューロンカルシウムセンサー１（ｎｃｓ−１）の新規使用
Mayoral A Diverse Toolkit: Studies on Secreted Proteins from the Parasite Toxoplasma gondii
WO2024073093A2 (en) Arrdc1-mediated microvesicle-based delivery of therapeutic agents to cells and tissues of the eye
EP2465928A1 (en) Treatment of Th17-mediated diseases

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20090520