CN109876143A - Wip1基因及其表达蛋白在治疗肌萎缩侧索硬化中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了野生型p53诱导的蛋白磷酸酶1基因(Wip1)及其表达蛋白在治疗肌萎缩侧索硬化中的用途。本发明通过体内实验证实在SOD1G93A ALS小鼠中Wip1的表达明显下降且与疾病的发生和发展密切相关，在神经元细胞中通过基因调控过表达Wip1基因，能够通过抑制DNA损伤应答机制促进神经元的存活，提示高表达上述原癌基因Wip1可治疗肌萎缩侧索硬化，本发明还公开了一种用于治疗肌萎缩侧索硬化的聚合物纳米颗粒，通过给药靶向受试者的脑和脊髓的运动神经元，用于治疗肌萎缩侧索硬化。本发明的提出为肌萎缩侧索硬化的预防和治疗提供了新的技术手段。

Description

Wip1基因及其表达蛋白在治疗肌萎缩侧索硬化中的用途

技术领域

本发明涉及一种基因治疗肌萎缩侧索硬化的方法，特别涉及野生型p53诱导的蛋白磷酸酶1(wild-type p53-inducible phosphatase 1,Wip1)基因及其表达蛋白在治疗肌萎缩侧索硬化中的用途，本发明属于神经生物技术领域。

背景技术

肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS),又称“渐冻人症”，是一种致命性的神经退行性疾病。主要累及上、下运动神经元，表现为进行性的肌无力和萎缩，平均生存期3-5年。最新的流行病学统计显示，ALS的患病率约为每年每十万分之五。大约有20％的家族性ALS与SOD1基因突变密切相关。目前研究认为，ALS的发病机制主要与RNA代谢紊乱、蛋白质稳态异常、线粒体功能障碍、氧化应激、兴奋性氨基酸毒性、DNA损伤、胶质细胞病变及细胞内核质运输障碍等有关。最新研究预计到2040年，全球ALS患者将在2015年(222801人)的基础上增加69％。

尽管ALS已经对人类的健康产生了越来越大的威胁，并给家庭和社会带来了沉重的负担，但到目前为止仍然没有控制疾病的有效手段。FDA批准的第一个口服药物利鲁唑(Riluzole)，价格昂贵，且仅能延长患者生命约3-4个月；2017年FDA最新批准的自由基清除药物依达拉奉(Edaravone)，早期临床研究仍存在争议，且目前研究提示依达拉奉似乎不适用于所有类型的ALS患者。由于RNA或蛋白介导的毒性是ALS最常见的致病机制，因此通过基因治疗的手段减少毒性的RNA或蛋白并通过调控基因表达来起到保护运动神经元的作用已经成为了目前研究的前沿。虽然人类的基因治疗仍然处在初始阶段，但一系列早期临床试验已经证实了这种治疗手段的安全性和有效性。目前对于ALS的基因治疗研究主要基于反义寡核苷酸(ASOs)、腺病毒(AAV)/慢病毒(LV)载体以及间充质干细胞慢病毒载体系统。ASOs靶向SOD1的最新研究已经进入了I期临床阶段，研究表明SOD1ALS患者在鞘内给予3mgISIS 333611没有显示出毒性和严重的不良反应；然而对ISIS33611的I期试验发现突变SOD1蛋白的含量并没有减少，而改良的SOD1ASO(BIIB067或IONIS-SOD1Rx)的I期临床试验目前正处于研究阶段。在ALS/FTD患者iPSC(可诱导的多能干细胞)诱导的神经元中用ASOs靶向扩增的C9ORF72减少了毒性RNA的聚集和谷氨酸的毒性。最新研究表明，给予C9ORF72ALS小鼠侧脑室注射ASOs靶向C9ORF72重复扩增片段能够减少RNA聚集和二肽重复蛋白并改善了与衰老相关的行为学表现。目前鞘内给予靶向C9ORF72的ASOs的1期临床试验(NCT03626012)正处于募集受试者阶段。在ALS中以腺病毒/慢病毒为载体的基因治疗目前主要以动物研究为主。多个研究小组的研究证实应用AAV/LV载体投递shRNA能够通过敲减SOD1延长ALS G93A大鼠模型的生存期。肌内给予以AAV/LV为载体的神经营养因子(GDNF、IGF-1和VEGF)，能够延缓ALS SOD1-G93A大鼠的发病，改善其行为和运动功能并延长生存期，而通过直接靶向中枢神经系统的给药方式，如侧脑室注射、椎管内注射或小脑注射投递这些以病毒为载体的神经营养因子也起到了部分挽救疾病表型和延长ALS大鼠生存期的作用。体外实验以LV为载体在细胞中表达抗氧化基因能够减少氧化应激的水平促进细胞的存活。在ALS TDP43小鼠模型中以AAV为载体给予hUPF1基因治疗能够改善大鼠的前肢功能。此外，间充质干细胞治疗方式也受到研究者的普遍关注，研究表明在SOD1-G93A大鼠中移植用LV载体表达GDNF的人间充质干细胞，能够对ALS SOD1-G93A大鼠的骨骼肌、运动神经元和神经肌肉接头起到神经保护作用，并增加存活。另一项研究应用LV载体系统在人间充质干细胞中过表达VEGF和GDNF，能够延长SOD1-G93A ALS大鼠的生存期，维持脊髓前角运动神经元和神经肌肉接头的功能。除此之外，在运动神经元疾病中基因治疗已经取得突破性的进展，一种反义寡核苷酸药物——Spinraza，目前已经获得了FDA的批准用于治疗脊肌萎缩症(SMA)。

综上，尽管目前在基因治疗领域的研究已经受到了越来越多的关注，但基因治疗仍然面临很多挑战：无效的给药方式以及血脑屏障的阻碍严重影响了治疗效果，如反义寡核苷酸不能通过血脑屏障(BBB)而只能通过鞘内注射的方式给药；仍然缺乏靶向中枢神经系统特定部位或者细胞亚型的给药方式；以及生产用于临床的大量病毒载体需要昂贵的成本，此外病毒载体不仅可以激活宿主的免疫系统，还能诱导免疫记忆的产生影响后期再应用病毒载体的疗效。

纳米载体(nano-vectors)是近年来研究的一类安全、高效、理想的新型基因治疗载体，它是以纳米微粒为载体，将目的基因包含于微粒内部或吸附于表面，利用纳米微粒的小尺寸效应、比表面效应、界面效应等性质将目的基因转移到靶细胞内部，释放目的基因，从而达到基因治疗的最终目的。与病毒载体相比，纳米载体通过将质粒DNA压缩成纳米级微粒，不但可以避免核酸降解，而且可以高效的介导DNA向细胞内转染，同时也避免了应用病毒载体带来的细胞毒性、免疫原性及潜在的致瘤性等缺点，更重要的是，利用不同的表面修饰，纳米载体能够有效决定外源基因在体内的走向、定位传递以及高效表达，从而表现出优越的靶向性。因此纳米载体的出现，将在很大程度上改善中枢神经系统给药生物利用度低以及无法通过血脑屏障(BBB)等的情况，但是到目前为止，尽管在阿尔茨海默病(AD)和帕金森病(PD)领域已经有很多基于纳米载体给药系统的研究，但在ALS治疗领域的研究仍非常有限。早期研究表明，通过共价连接将利鲁唑与碳纳米管(CNTs)结合没有影响利鲁唑的药物活性，对细胞也无毒性作用。用固体脂质纳米颗粒(SLNs)包裹利鲁唑制成88nm带负电荷的化合物，通过腹腔注射途径给药，显示出比普通利鲁唑更高的脑组织靶向性和更低的非特异性生物分布。体内实验在ALS SOD1G93A小鼠中通过侧脑室注射的给药方式，将用脂多糖修饰的包裹抗炎药物(米诺环素)的脂质体直接靶向小胶质细胞的TLR4受体，增加了药物的摄取率并减缓了疾病的进展。最新研究表明，磷酸钙脂质纳米颗粒配方包裹SOD1ASO在显微镜下注射在斑马鱼体内，成功的在其脑组织、脊髓和血液中检测到纳米颗粒，证实磷酸钙脂质纳米颗粒是一种安全有效基因载体，改善了ASO到运动神经元的给药途径。将具有抗氧化特性的氧化铈纳米颗粒通过尾静脉注射途径注入ALS SOD1G93A小鼠中，延长了ALS小鼠的平均生存期。目前对于纳米基因载体靶向治疗ALS的相关研究尚未见报道。

最近很多研究以狂犬病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein，RVG)作为靶向脑组织的配体并在传递siRNA载体的表面进行修饰，如三甲烯壳聚糖，甘露糖醇-聚乙烯亚胺，外泌体，以及通过全身注射的方式将siRNA传递到脑组织中。然而，仅仅传递基因穿越血脑屏障是不够的，中枢神经系统中有多种细胞亚型，因此为了确保基因传递的安全性和有效性，我们需要能够靶向神经元的纳米传递基因系统。一个研究小组的最新研究表明，噬菌体展示l肽TGNYKALHPHNG(TGN)能够使PEG-PLGA(聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸共聚物)纳米颗粒易于穿过血脑屏障，因此构建了新型脑靶向药物传递系统，该系统包载蛋白多肽药物后可以保护其不受体内环境降解，提高稳定性，是一种有效、低毒性的脑靶向药物传递系统。另一个研究小组在此研究的基础上，合成TGN的反向异构体CGN肽(d-CGNHPHLAKYNGT)，并证实CGN比TGN显示出更高的脑靶向性。并且该研究小组构建了一种双功能的纳米复合体应用血脑屏障靶向配体-CGN和神经元靶向配体-Tet1双重修饰。Tet1(HLNILSTLWKYR)，通过体外噬菌体展示鉴定的肽，与在神经元上高表达的GT1B神经节苷脂鞘磷脂结合。聚乙二醇-聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯(PEG-PDMAEMA)具有低毒性，高缓冲能力和高转染效率是一个理想的纳米载体，因此该研究组以此PEG-PDMAEMA为核心包装目的基因，再以穿过血脑屏障和靶向神经元配体双重修饰，将CGN-PEG-PDMAEMA和Tet1-PEG-PDMAEMA按照重量比1：1混合，显示出在血液中很好的稳定性，不导致溶血。纳米基因复合体能够通过网格蛋白介导的内吞作用和微饱饮现象进入神经元，而小凹蛋白介导的内吞作用在其进入脑毛细血管内皮细胞中起到重要的作用。此纳米颗粒复合体能够成功的逃脱溶酶体的溶解，直接进入神经元的细胞质中，实现基因的有效转染。

很多流行病学研究报道，在肿瘤患者中神经变性疾病的发病率有所降低，最新研究表明，肿瘤和神经变性疾病中很多基因、蛋白以及信号通路调控障碍呈现出相反的情况，这引起了我们极大的兴趣，本发明发明人通过前期研究发现，与肿瘤生长密切相关的原癌基因Wip1在ALS SOD1G93A小鼠脊髓前角运动神经元中表达明显下降，且与ALS的发生和发展密切相关，原癌基因Wip1与ALS之间的关系尚未见报道。

野生型p53诱导的蛋白磷酸酶1(wild-type p53-inducible phosphatase 1,Wip1)，是PP2C家族成员，在细胞中表达后可使靶蛋白去磷酸化，参与调控细胞凋亡，细胞周期，DNA损伤修复等多条细胞信号通路。Wip1在许多肿瘤中表达增多，包括乳腺癌、卵巢癌、胃癌等，因此，被认为是潜在的与肿瘤细胞生长相关的原癌基因。

发明内容

本发明的目的在于提供野生型p53诱导的蛋白磷酸酶1(wild-type p53-inducible phosphatase 1,Wip1)基因及其表达蛋白在治疗肌萎缩侧索硬化中的新用途。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

首先，本发明提出了野生型p53诱导的蛋白磷酸酶1(wild-type p53-induciblephosphatase 1,Wip1)及其表达蛋白在制备治疗肌萎缩侧索硬化药物中的用途。

其中，所述的野生型p53诱导的蛋白磷酸酶1(wild-type p53-induciblephosphatase 1,Wip1)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

其中，优选的，所述的药物通过抑制DNA损伤应答途径和增加神经元的存活，用于改善由SOD1G93A突变导致的肌萎缩侧索硬化。

其中，优选的，所述的药物为通过纳米载体结合Wip1基因制备得到的纳米颗粒、凝胶或乳剂，所述纳米颗粒包含但不限于聚合物纳米颗粒、脂质纳米颗粒、碳纳米颗粒、金属纳米颗粒。

进一步的，本发明还提出了野生型p53诱导的蛋白磷酸酶1(wild-type p53-inducible phosphatase 1,Wip1)及其表达蛋白的增效剂在制备治疗肌萎缩侧索硬化药物中的用途。

其中，优选的，所述的药物通过抑制DNA损伤应答途径和增加神经元的存活，用于改善由SOD1G93A突变导致的肌萎缩侧索硬化。

其中，优选的，所述的增效剂为激动剂、上调剂或稳定剂。

其中，优选的，所述的增效剂是指任何可提高Wip1基因或蛋白的活性、提高Wip1基因或蛋白的稳定性、上调Wip1基因或蛋白的表达、增加Wip1基因或蛋白有效作用时间的物质，所述的增效剂为化合物、化学小分子或生物分子。

其中，优选的，所述的生物分子可以是DNA或RNA，或是调控Wip1基因或蛋白表达的病毒产品。

更进一步的，本发明还提出了一种用于治疗肌萎缩侧索硬化的聚合物纳米颗粒，通过以下方法制备得到：

(1)合成二嵌段共聚物Mal-PEG-PDMAEMA；

(2)将合成的二嵌段共聚物Mal-PEG-PDMAEMA与巯基CGN或Tet1肽在磷酸盐缓冲液中按摩尔比1：1的比例与室温下作用4小时，反应液用MWCO 5ka的透析袋进行透析，透析液为双蒸水，冷冻干燥后获得CGN-PEG-PDMAEMA和Tet1-PEG-PDMAEMA产品；

(3)将CGN-PEG-PDMAEMA以及Tet1-PEG-PDMAEMA分别于DEPC水中溶解，然后与Wip1基因按N/P为1-10:1的比例混合，涡旋30秒，再在室温中培养20分钟后得到所述的聚合物纳米颗粒。

所述的聚合物纳米颗粒在制备治疗肌萎缩侧索硬化药物中的用途，其中，优选的，所述的聚合物纳米颗粒通过抑制DNA损伤应答途径和增加神经元的存活，用于改善由SOD1G93A突变导致的肌萎缩侧索硬化。

给药方式包括侧脑室、鞘内注射、静脉注射和鼻腔给药。受试者包括哺乳动物和人。

本发明的提出为肌萎缩侧索硬化的预防和治疗提供了新的技术手段。

附图说明

图1为hSOD1G93A阳性小鼠及野生型小鼠脊髓前角运动神经元Wip1免疫荧光双染结果；

其中：在小鼠脊髓前角运动神经元，Wip1阳性染色主要位于细胞质，hSOD1G93A阳性小鼠Wip1的荧光强度(绿色)较对照组(野生型小鼠)明显减弱；DAPI-蓝色(细胞核)；Wip1-绿色；MAP-2-红色(神经元特异性标记)，标尺＝20μm。

图2为hSOD1G93A转基因小鼠及野生型小鼠脊髓前角运动神经元Wip1免疫组化染色(A)及定量分析结果(B)；

其中：(A)Wip1主要表达于细胞质，ALS小鼠Wip1染色较对照组小鼠明显减弱；标尺＝50；(B)计算结果示ALS小鼠脊髓前角运动神经元中Wip1平均光密度明显较野生型小鼠减少，差异具有统计学意义(**P<0.01)。

图3为原代培养hSOD1G93A转基因小鼠神经元及hSOD1G93A稳定转染NSC34细胞系wip1表达水平检测；

其中：(A)免疫荧光双染结果，可见hSOD1G93A转基因小鼠原代神经元中Wip1(绿色)荧光染色强度较对照组(野生型胎鼠)明显增强。标尺＝25μm；(B)荧光定量PCR(QPCR)结果，结果可见Wip1mRNA在ALS小鼠神经元中较对照组表达水平增多，差异具有统计学意义(**P<0.01)；(C、E)Western Blot检测NSC34，pLV，WT及mSOD1四种稳定转染细胞系中Wip1蛋白表达水平；(D)荧光定量PCR(qPCR)检测稳定转染细胞系中Wip1mRNA水平，在mSOD1细胞中Wip1蛋白及mRNA表达水平明显较对照组降低，差异具有统计学意义(*P<0.05)。

图4为应用100uM的H2O2作用于NSC34细胞48h后抑制wip1蛋白表达同时激活pATM，pCHK2，p-p53；

其中：(A)应用100uM的H2O2作用NSC34细胞3h，6h，24h，48h，pATM，pCHK2，p-p53蛋白表达水平的变化；(B)pATM，pCHK2，p-p53，cleaved caspase3蛋白水平的定量分析。p-p53，cleaved caspase3以β-actin为内参，pATM，pCHK2以各自的非磷酸化蛋白为内参，比较后再与对照组比较。(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。

图5为慢性H2O2作用原代神经元细胞抑制wip1蛋白；

其中：应用50uM的H2O2作用野生型小鼠来源的原代神经元细胞1h，6h，12h，绿色荧光(wip)强弱变化，红色荧光(MAP2)；标尺＝200μm。

图6为敲除NSC34细胞中Wip1后ATM/CHK2通路激活；

NSC34细胞在含10％胎牛血清的DMEM完全培养基中培养，敲除NSC34细胞中Wip1后应用100uM的H2O2作用NSC34细胞3h，6h，24h，48h，western blot检测pATM，pCHK2，p-p53蛋白表达水平的变化。其中：(A)敲除NSC34细胞中Wip1后pATM，pCHK2，p-p53通路相关信号因子代表性蛋白条带；(B)干扰Wip1后，pATM，pCHK2，p-p53，cleaved caspase3蛋白水平的定量分析。p-p53，cleaved caspase3以β-actin为内参，pATM，pCHK2以各自的非磷酸化蛋白为内参，比较后再与对照组比较。(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。(C)干扰组Wip1后在3h，6h，24h，48h细胞活力较对照组下降(**P<0.01)。

图7为过表达NSC34细胞中Wip1后ATM/CHK2通路受到抑制；

NSC34细胞在含10％胎牛血清的DMEM完全培养基中培养，过表达NSC34细胞中Wip1后应用100uM的H2O2作用NSC34细胞6h，24h，48h，western blot检测pATM，pCHK2，p-p53蛋白表达水平的变化。其中：(A)NSC34细胞中过表达Wip1后pATM，pCHK2，p-p53通路相关信号因子代表性蛋白条带；(B)过表达Wip1后，pATM，pCHK2，p-p53，cleaved caspase3蛋白水平的定量分析。p-p53，cleaved caspase3以β-actin为内参，pATM，pCHK2以各自的非磷酸化蛋白为内参，比较后再与对照组比较。(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。过表达组p-ATM，p-CHK2及p-p53蛋白水平明显降低(*P<0.05，**P<0.01)；(C)CCK8测定细胞活力。可见在wip过表达组6h，24h，48h均可改善细胞活力(*P<0.05，**P<0.01)。

图8为NSC34细胞，pLV细胞，wtSOD1细胞，mSOD1中ATM通路相关信号分子蛋白表达水平；

其中：(A)Western blot检测ATM/CHK2/p53通路相关蛋白表达水平。(B)在mSOD1细胞中p-ATM，p-CHK2及p-p53表达水平明显较NSC34细胞中增多(***P<0.001)。

图9为过表达wtSDO1和mSOD1细胞中WIP1后ATM/CHK2通路受到抑制；

wtSDO1和mSOD1细胞在含10％胎牛血清的DMEM完全培养基中培养，分别转染Flag和Flag-wip1质粒，western blot检测pATM，pCHK2，p-p53蛋白表达水平的变化。其中：(A)过表达wtSDO1和mSOD1细胞中Wip1后pATM，pCHK2，p-p53通路相关信号因子代表性蛋白条带；(B)pATM，pCHK2，p-p53蛋白水平的定量分析。p-p53以β-actin为内参，pATM，pCHK2以各自的非磷酸化蛋白为内参，比较后再与对照组比较。(*P<0.05)；(C)CCK8测定细胞活力。可见mSOD1细胞活力较wtSOD1细胞活力下降(**P<0.01与wtSOD1组比较)。在mSOD1细胞中wip1过表达组可改善细胞活力(###P<0.001与转染Flag质粒mSOD1组比较)，但是在wtSOD1中对细胞活力没有影响。

图10为mSOD1细胞系中干扰HIPK2可增加wip1蛋白表达同时抑制ATM/CHK2通路；

其中：(A)mSOD1细胞转染阴性对照si-con，Wip1siRNA或者HIPK2siRNA 72小时，pATM，pCHK2，Wip1蛋白表达水平的变化；(B)pATM，pCHK2，Wip1，HIPK2蛋白水平的定量分析。以β-actin为内参，所得结果与相应的β-actin比较后再与对照组比较。(和阴性对照Si-con相比较：*P<0.05，#P<0.05，&*P<0.05)。

图11为hSOD1G93A稳定转染细胞系中HIPK2与Wip1之间相互作用增强；

通过免疫共沉淀(CO-IP)方法检测wtSOD1细胞及mSOD1细胞中HIPK2与Wip1相互作用，可见在mSOD1细胞中，HIPK2与Wip1之间相互作用增强。

图12为mSOD细胞wip1泛素化水平增强；

Flag-wip1转染wtSOD1和mSOD1细胞系，MG132处理4h，免疫共沉淀检测wtSOD1和mSOD1细胞系中wip1的泛素化水平。

图13为HIPK2使Wip1泛素化增强；

Flag-wip1与HIPK2siRNA或Flag-wip1与HIPK2分别共转染mSOD1细胞，免疫共沉淀检测HIPK2对wip1泛素化的影响；

图14为干扰HIPK2抑制Wip泛素化水平。

Flag-wip1与si-con或Flag-wip1与HIPK2siRNA分别共转染NSC34细胞，后应用100uM的H2O2作用NSC34细胞6h，24h，48h，免疫共沉淀检测HIPK2对wip1泛素化的影响。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式做详细说明。本领域的普通技术人员可考虑到多种可进行的改进和调整，而不改变本发明的精神或范围。这种改进和调整包括在本发明的范围内。下述实施例不以任何方式限制本发明。

实施例1

一、方法和材料

1、实验动物及试剂

1.1实验动物及细胞

小鼠购自美国Jackson Laboratory公司，进行合笼后，繁殖后代，进行基因型检测后，取转基因C57BL/6J hSOD1G93A基因型阳性小鼠15只，C57BL/6J野生小鼠15只，雌雄各半。

NSC-34细胞系购自于CEDARLANE公司。

前期课题组已经成功构建、流式激光分选并稳定传代pLenti viral-NSC34细胞系、wtSOD1-NSC34细胞系及hSOD1G93A NSC34稳定转染细胞系，分为四组，分别命名为空白对照组(Control组)、空病毒组(pLV组)、野生型组(wtSOD1组)、变异型组(mSOD1组)。

原代神经元细胞取自胎鼠皮层神经元，Neurobasal培养基培养。

1.2主要试剂

1.3主要试剂配制方法

10％细胞培养液配制：DMEM 450ml加入50ml胎牛血清(FBS)，再加入5ml100X的青、链霉素溶液，4℃冰箱保存。

原代神经元培养液配制：500ml Medium(1X)加入10ml B27添加剂，再加入2.5ml配好的青、链霉素溶液，4℃分装保存。

2、实验分组

2.1NSC-34细胞实验分组

分为四组，分别命名为空白对照组(Control组)、空病毒组(pLV组)、野生型组(wtSOD1组)、变异型组(mSOD1组)，即NSC34细胞系、pLenti viral-NSC34细胞系、wtSOD1-NSC34细胞系及hSOD1G93A NSC34稳定转染细胞系。

2.2ALS小鼠实验分组

动物分两组：对照组和模型组，分别为野生小鼠组和SOD1G93AALS转基因小鼠。每组各3只。进行行为学评估，心脏灌注后，取脊髓，置于4％多聚甲醛中固定24h，对脊髓进行石蜡包埋、石蜡切片。

3、NSC-34细胞系培养

3.1NSC-34细胞系的复苏

将冻存管快速放入37℃水浴锅并不停地摇晃。待管中的冻存液全部融化后，移液器吸取冻存管内液于含有10ml 37℃的培养液的离心管中，1000rpm/min离心3min，倒掉上清。加5ml 37℃的10％FBS。1％青链霉素的新鲜培养液，使细胞液分散均匀。移液管移取细胞悬液至细胞培养瓶内，前后左右摇晃细胞培养瓶，使细胞在瓶底均匀分散贴壁，培养瓶放入37℃，5％CO2的细胞培养箱内培养，次日换液。

3.2NSC-34细胞的传代

取出细胞瓶，观察细胞生长密度，细胞生长至90％融合后可进行传代。弃净旧培养液，加入15ml新鲜培养液，用移液管轻轻将细胞从瓶壁吹下，吹打均匀后将细胞悬液平均分到3个培养瓶中。在酒精灯上烧口，旋紧瓶口，放入37℃，5％CO2的细胞培养箱内继续培养。

3.3NSC-34细胞的冻存

选取对数生长期的贴壁细胞，轻轻吹下后，将细胞悬液吸入离心管中，1000rmp离心5min，倒掉上清液加入配好的冻存液。细胞吹打均匀后分装至冻存管中，将冻存管放入冻存盒中，-80℃冰箱保存1日后，放入液氮罐中长期保存。

3.4NSC34细胞siRNA干扰

Wip1-siRNA序列：

5′-GGA AUU CAG GAU GAC CCA ATT-3′

5′-UUG GGU CAU CCU GAA UUC CTT-3′

对照组序列：

5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′

5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3′

转染前一天，接种每孔2×10⁵于6孔板。Opti-MEM200ul稀释的siRNA(终浓度100nmol/L)，室温孵育5min，Opti-MEM200ul稀释5ul Lipofectamine 2000，室温孵育5min，将上两个混合物混合，室温孵育20min，然后逐滴加入6孔板中，6h后换液为含10％血清的培养液。继续培养48h后提取细胞目的RNA和蛋白，通过QPCR或western blot检测干扰效率。

3.5构建质粒、包装慢病毒、转染、筛选并稳定传代pLenti viral-NSC34细胞系、wtSOD1-NSC34细胞系及hSOD1G93A NSC34稳定转染细胞系

发明人前期已成功构建上述三种稳定转染细胞系，通过嘌呤霉素(200μg/ml)筛选后进行后续试验。

4、CCK8检测

(1)在96孔板中接种细胞悬液(1×10³个/孔)，次日对细胞进行不同实验条件的处理；

(2)向每孔加入10ul的CCK-8溶液；

(3)将培养板在培养箱内孵育1-4小时；

(4)用酶标仪测定培养板在450nm处的吸光度，至OD值接近1.0附近时读取数值。

5、质粒小量提取

操作方法按照TIANGEN公司质粒小量提取试剂盒说明书进行。

6、细胞转染

Flag-标记的小鼠Wip1表达载体和小鼠HIPK2表达载体购自GeneCopoeia，Inc(中国广州)。使用p3xFlag-CMV-14构建体(Sigma)作为对照。使用Lipofectamine2000试剂(Invitrogen，Life Technologies)瞬时转染质粒。简而言之，在转染前24小时，将mSOD1细胞或NSC34细胞以每孔1x10⁶个细胞的密度接种到6孔板上。为了在mSOD1细胞中过表达Wip1，将Flag-Wip1质粒(每孔2μg)在200μlOpti-MEM(Invitrogen，Life Technologies)中在单独的管中稀释，并将Lipofectamine2000(10μl/孔)在不同管中的200μlOpti-MEM。孵育5min后，将Lipofectamine2000加入DNA溶液中以形成Lipofectamine2000/DNA复合物。室温孵育20min后，将混合物逐滴加入到细胞培养板中。细胞在5％CO2中孵育6小时。转染后，用含有10％FBS的新鲜DMEM代替细胞培养基，随后培养48小时以进行随后的实验。

7、原代神经元培养

7.1多聚赖氨酸包被培养板

取多聚赖氨酸包被液加入并完全覆盖培养板，37℃过夜，回收多聚赖氨酸包被夜，置于无菌操作台中晾干备用。

7.2原代皮层神经元培养

(1)C57BL6野生雌鼠与hSOD1G93A转基因雄性小鼠合笼，将18-21天左右孕鼠取出，脱颈处死后浸入75％酒精中消毒1min。将消毒好的孕鼠置于超净台内冰盒上剖腹取出胚胎。依次分离胚胎头部，冰上操作，剥去头部皮肤，颅骨及血管膜，最后取得完整的脑部组织，同时留取一部分胎鼠组织进行后续基因型的鉴定

(2)脑部组织置于DMEM中。用眼科剪将组织剪成1mm大小的碎片，用1ml枪将组织块轻轻吹打至小细胞团块，吹打时间不宜过长

(3)将吹散的细胞悬液过220目灭菌筛网，用15ml离心管中接细胞悬液。

(4)将细胞悬液800rmp，离心3min.转移至超净台中，弃去上清后使用神经元培养基(Neurobasal A+B27+L-谷氨酰胺)重悬细胞。

(5)将细胞接种至多聚赖氨酸包被过的6孔培养板或24孔板中

(6)以后隔日半量更换神经元培养基，一周左右后，使用神经元特异性标记蛋白MAP2进行免疫荧光染色，鉴定神经元纯度合格后进行后续试验。

8、免疫组化染色

(1)石蜡切片，烘箱烘烤2h，二甲苯脱蜡，酒精脱水。

(2)抗原修复

(3)3％H2O2，室温8min。PBS冲洗5min。

(4)用免疫组化笔圈出组织，滴加5％山羊血清，37℃封闭30min。

(5)滴加稀释的一抗Wip1(1:200)4℃过夜。PBS冲洗5min，重复3次。

(6)滴加二抗工作液，37℃孵育20min。PBS冲洗5min，重复3次。

(7)滴加辣根酶标记的工作液，37℃孵育15min。PBS冲洗5min3次。

(8)使用DAB显色剂室温显色，显微镜下观察显色情况，待显色适合流水冲洗切片终止显色。

(9)苏木素复染。中性树脂封片。

(10)显微镜下采集图像。

9、计算机辅助蛋白定量分析

使用Image Pro Plus 6.0(Media Cybernetics,Inc.USA)分析系统，于200倍下测量脊髓前角运动神经元细胞的阳性染色平均光密度(OD)，每组共取200个细胞数进行统计学分析。

10、免疫组织荧光双重染色

(1)石蜡切片，烘箱烘烤2h，二甲苯脱蜡，酒精脱水。

(2)3％H2O2，室温10min。PBS冲洗5min×3次。

(3)滴加山羊血清，室温20min。

(4)滴加兔抗Wip1抗体(1:200)和小鼠抗MAP2抗体(1:100)混合液加到标本上。4℃过夜；

(5)切片用PBS漂洗10min×3次，滴加荧光标记二抗，Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG(1:200)、Alexa Fluor 594标记抗山羊抗小鼠IgG(1:200)，室温避光孵育1h。

(6)PBS漂洗10min×3次，用含DAPI的防荧光淬灭的封片剂封片。

(7)导致荧光显微镜下观察，采集图像。

11、细胞免疫荧光检测

(1)细胞用4℃预冷的PBS洗3次，每次10min。

(2)4％的多聚甲醛室温固定30min。

(3)PBS摇床洗细胞洗3次，每次10min。

(4)0.2％Triton X-100穿透细胞膜2min。

(5)PBS摇床洗细胞洗3次，每次10min。

(6)山羊血清室温封闭30min。

(7)加一抗，4℃过夜。

(8)回收一抗，PBS摇床洗细胞洗3次，每次10min。

(9)加相应荧光二抗室温闭光孵育1h。

(10)PBS摇床洗细胞3次，每次10min。

(11)DAPI染细胞核3min。

(12)PBS摇床避光洗细胞洗3次，每次10min。

(13)荧光显微镜下观察，采集图像

12、Western Blot检测

12.1hSOD1G93A-NSC34稳定转染细胞系蛋白的提取

(1)培养中的细胞倒掉培养液。用预冷的PBS清洗细胞三次，弃净PBS。

(2)每小瓶细胞加200μl含PMSF及磷酸酶抑制剂的的IP裂解液(有效裂解成份为Triton X-100)，将贴壁细胞在冰上迅速刮下收集到1.5mlEP管中，于4℃放入旋转混合器上充分裂解30min。

(3)细胞裂解结束，4℃，120000rpm，离心10min。

(4)离心后取上清液。

(5)取2μl检测蛋白浓度，将所有样品调整到相同浓度，加入5×loading buffer，煮沸10min。

12.2SDS-PAGE电泳、转膜、封闭，抗原抗体反应

加电泳液后上样，然后电泳、转膜。将NC膜沿maker所对应的位置减下目的条带，然后放置于5％脱脂奶粉中室温封闭1小时。将特定的一抗体按比例稀释：Wip1-1(1:1000)、ATM(1:1000)、p-ATM(pSer1981)(1:1000)、CHK2(1:1000)、p-CHK2(Thr68)(1:1000)、p-p53(pSer15)(1:1000)、Ub(1:10000)、β-actin(1:1000)，将膜放于稀释的一抗溶液中，4℃摇床过夜。第二日，将膜取出，室温摇床上用TBST清洗10min×3次。将洗过的膜置于稀释的对应的荧光二抗中(1:10000)，室温于摇床上避光孵育1小时。TBST 10min×3次洗膜后，扫膜仪扫NC膜获取目的条带图像。

13、免疫共沉淀实验

(1)生长状态良好的wtSOD1细胞及mSOD1细胞在培养皿中培养至融合度达到80％左右，使用Lipofectamine2000转染Flag-Wip1，转染24小时后，20uM MG132处理8小时。弃上清，用冷的PBS漂洗3次，弃净PBS；

(2)每个皿中加入预冷的IP细胞裂解液(有效裂解成份为1％Triton X-100)500μl，用细胞刮把细胞刮下来，移至EP管中。

(3)4℃，旋转混合器中裂解30min，使其充分裂解。30min后在4℃，12000rpm离心10min，取上清置于新的EP管中，同时取出50ul上清作为input以检测外源转染或内源内白的表达，余下液体用于免疫共沉淀。

(4)余下蛋白上清中加入1ug的IgG抗体(与IP所用抗体同种属来源)，10μlProtein A/G Agarose磁珠，4℃旋转混合器4h，以去除非特异蛋白的结合；

(5)用磁力架吸附磁珠，将上清转移至新的EP管。

(6)BCA法测定蛋白浓度，加入Flag抗体，对照组加入与抗体相同来源IgG。4℃缓慢旋转过夜。

(7)加入20μl Protein A/G Agarose磁珠，4℃缓慢旋转2h

(8)用磁力架吸附珠子，吸弃上清

(9)用预冷PBS洗珠子5次

(10)加入5X上样缓冲液，轻轻混匀。

(11)上样样品100℃煮沸10min，以游离抗原，抗体，琼脂糖珠，磁力架吸附磁珠，取上清进行电泳，行Western Blot检测结合情况。

14、Q-PCR检测

14.1NSC34细胞及ALS小鼠原代神经元总RNA提取

应用提取的细胞总RNA，具体步骤按照Tiangen公司的RNA提取试剂盒说明书。

14.2RNA逆转录合成DNA(Q-PCR一步法)

Q-PCR配对引物(大连宝生物公司)

mouse Wip1-1F：5′-CAA TTG GCC TTG TGC CTA CT-3′

mouse Wip1-1R：5′-TCT TTC GCT GTG AGG TTG TG-3′

Mouseβ-actin(forward)：5′-CCA GCC TTC CTT GGG TAT-3′

Mouseβ-actin(reverse)：5′-TGC TGG AAG GTG GAC AGT GAG-3′

按照表1配置如下反应体系：

表1Q-PCR反应体系配比

将反应体系加入PCR八连排管中，短暂离心混匀后放入罗氏定量PCR仪器中进行逆转录及扩增反应。

采用以下反应程序：

Hold

42℃5min

95℃10sec

Pattern 2：定量反应

Cycle：40

95℃5sec

60℃30sec

Pattern 3：Dissociation

反应结束后记录扩增曲线，读取CT值。

15、ALS转基因模型鼠的繁育及鉴定

15.1ALS转基因模型鼠的配种繁殖及饲养

按照购买的ALS小鼠说明书进行繁殖传代，将C57BL/6J hSOD1G93A转基因阳性半合子雄鼠与C57BL/6J阴性雌鼠交配。待新生小鼠出生，每只新生小鼠都要打上耳标做好标记。新生小鼠到30天龄时提取DNA对其基因型进行鉴定。

15.2ALS转基因模型鼠子代基因型鉴定

15.2.1基因组DNA提取

按照天根生化科技公司说明书提取

15.2.2PCR反应

转基因小鼠基因型鉴定配套引物(美国Jackson Lab)

内参IL-2(forward)：CTAGGCCACAGAATTGAAAGATCT

内参IL-2(reverse)：GTAGGTGGAAATTCTAGCATCATCC

目的基因SOD1(forward)：CATCAGCCCTAATCCATCTGA

目的基因SOD1(reverse)：CGCGACTAACAATCAAAGTGA

表2PCR反应体系配比

试剂(冰上)	使用量	终浓度
			10×PCR缓冲液	5μl	1×
4条PCR引物(10μM)	2μl×4	0.4μM
			Taq DNA mix	0.5μl	1～5U/μl
Total DNA	2μl	<500ng
			RNase Free dH2O	31.5μl
Total	50μl

设置好PCR反应温度，将配好的反应体系加入PCR管中放入逐一放入PCR仪进行扩增反应。

15.2.3PCR产物鉴定

(1)配2％琼脂糖凝胶

(2)待凝胶稍稍冷却，加入1ul溴乙啶(0.5mg/ml)，摇荡混匀。

(3)凝胶倒入配胶槽，插好梳子，至完全凝固。

(4)拨出梳子，取下凝胶放入水平电泳槽。

(5)PCR扩增产物上样，120V电泳20min后，取出凝胶取出，置核酸扫描仪下照相。

16、统计学分析

所得实验数据用均数±标准差表示，应用SPSS19.0软件系统进行统计分析。细胞实验部分采用单因素的方差分析，两两比较对相应数据进行统计学处理，动物实验部分组间对比采用ANOVA分析及独立样本t检验。P<0.05认为有统计学显著性差异。

17、合成PDMAEMA衍生物

PEG-PDMAEMA和Mal-PEG-PDMAEMA(MPEG-PDMAEMA)二嵌段共聚物按照之前的文献合成(Y.Qian,Y.Zha,B.Feng,Z.Pang,B.Zhang,X.Sun,J.Ren,C.Zhang,X.Shao,Q.Zhang,X.Jiang,PEGylated poly(2-(dimethylamino)ethyl methacrylate)/DNA polyplexmicelles decorated with phage-displayed TGN peptide for brain-targeted genedelivery,Biomaterials.34(2013)2117-2129.)。Mal-PEG-PDMAEMA载体与巯基CGN肽(d-CGNHPHLAKYNGT)或Tet1肽(HLNILSTLWKYR)在磷酸盐缓冲液中(PBS，pH7.0)按1：1(mol/mol)比例与室温下作用4小时。反应液用双蒸水(MWCO 5ka)透析，冷冻干燥后获得CGN-PEG-PDMAEMA和Tet1-PEG-PDMAEMA产品。

18、制备纳米基因复合体

PDMAEMA衍生物，包括MPEG-PDMAEMA(M)，CGN-PEG-PDMAEMA(C)，Tet1-PEG-PDMAEMA(CT，1:1，w/w)分别于DEPC水中溶解，然后与Wip-1按不同N/P比例(1:1，2:1，5:1或10:1)混合，这种纳米基因复合体先涡旋30秒，再在室温中培养20分钟后得到。纳米基因复合体的颗粒的大小和zeta电位应用动态光散射技术(DLS)在N/P＝10测定。纳米基因复合体的形态应用投射电子显微镜(TEM)进行观察。TEM样品准备是通过吸取一滴复合物溶液在一个标准的网格铜栅上并使它在空气中自然干燥。这些网格用磷钨酸(2％，w/v)负染并在检测前干燥。高分子聚合物浓缩Wip-1的能力通过琼脂糖凝胶电泳进行评估，并用紫外照明在302nm检测并用氟化学成像系统拍照。

二、实验结果

1.Wip1在hSOD1G93A转基因小鼠运动神经元及hSOD1G93A稳定转染神经元细胞模型中表达量降低

为了研究Wip1在ALS中的作用，我们选用hSOD1G93A转基因小鼠及hSOD1G93A稳定转染神经元细胞模型作为研究对象，通过免疫组织化学染色、免疫细胞荧光染色、WesternBlot等方法检测Wip1的表达情况。通过免疫荧光染色可见，在ALS小鼠终末期颈髓及腰髓前角中，Wip1阳性染色主要在运动神经元的细胞质中，呈绿色荧光，MAP-2是神经元特异性标记物，呈红色荧光，核染色DAPI呈蓝色荧光。在ALS小鼠颈髓及腰髓的前角运动神经元中，绿色荧光(Wip1)强度明显低于对照组，结果如图1所示。进一步对上述石蜡切片进行Wip1免疫组织化学染色可见在hSOD1G93A转基因小鼠脊髓中，Wip1在神经元细胞质内呈棕褐色，且在ALS小鼠中Wip1阳性染色明显较对照组浅，并应用image pro-plus 6软件对神经元内Wip1阳性染色进行定量分析，统计学分析示在ALS小鼠脊髓前角神经中Wip1表达量较野生型小鼠明显减低，结果如图2所示，差异具有统计学意义(**P<0.01)。我们进一步在原代培养的神经元中做进一步验证，hSOD1G93A阳性雄鼠与野生型雌鼠进行合笼，待雌鼠孕19-21天左右时，提取胎鼠皮层神经元进行原代培养。培养第7天左右通过MAP-2染色鉴定纯度后进行后续试验。同时对胎鼠进行基因型鉴定，分析hSOD1G93A阳性和阴性的原代神经元。免疫荧光染色结果如图3A所示，可见在hSOD1G93A阳性胎鼠来源的皮层原代神经元中Wip1荧光染色(绿色)强度较对照组增强，且以细胞核内表达为主。QPCR结果如图3B所示，可见mSOD1阳性小鼠皮层神经元中Wip1mRNA水平较对照组亦增高，差异具有统计学意义(**P<0.01)。最后我们再次应用细胞模型验证，结论与动物试验结果一致，Wip1在mSOD1组中表达量较对照组明显减少(图3C、3E)，差异具有统计学意义(P<0.05)。荧光定量PCR(QPCR)检测Wip1mRNA在mSOD1稳定转染细胞系中的表达变化情况，结果如图3D所示，可见Wip1mRNA水平在携带hSOD1G93A稳定转染神经元细胞模型中表达水平较对照组明显减少，差异具有统计学意义(*P<0.05)。

2.Wip1在原代神经元及NSC34细胞系受到持续H2O2随作用时间延长表达水平逐渐下降

在原代神经元中Wip1蛋白表达量明显升高，而且细胞定位主要为细胞核内为主，这与ALS小鼠终末期运动神经元及mSOD1细胞模型wip1表达明显减少的结果相反，我们使用100uM H2O2处理NSC34细胞系作为神经元慢性氧化应激损伤模型来研究神经元在受到慢性氧化应激DNA损伤过程中的Wip1的变化过程及与细胞损伤之间的关系。结果如图4所示，结果显示NSC34细胞系在受到H2O2刺激后6h时会使Wip1表达增多，差异具有统计学意义(***P<0.001)，随后在24h时减弱，而在48小时进一步减少差异具有统计学意义(***P<0.001)。我们进一步研究Wip1的激活是否参与到DNA损伤的条件下保护细胞避免细胞凋亡，正如100uMH2O2处理NSC34细胞系前6h时Wip1表达明显增多时，而与此同时发现cleaved caspase3(细胞凋亡指标)水平没有发生明显变化，而在H2O2刺激24-48小时，当Wip1表达逐渐下降，而此时cleaved caspase 3(细胞凋亡指标)表达逐渐增多伴随pATM，pCHK2，p-p53的表达增多，差异具有统计学意义(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。随后我们使用原代神经元检测慢性氧化损伤条件下wip1表达水平的变化，使用50uM H2O2作用野生小鼠原代神经元，结果表明在作用于1h后wip1表达水平增多，6h是表达减少，12h表达进一步减少(图5)。

3.敲除Wip1导致NSC34细胞活力降低，并可诱导ATM/CHK2/p53信号通路提前激活

为了确定Wip1和H2O2处理期间细胞凋亡水平变化的直接关系，在培养的NSC34细胞中，通过lipofectamine2000转染针对Wip1的干扰序列siRNA，敲除Wip1后，对细胞进行H2O2处理后检测细胞活力的变化，同时提取细胞内蛋白，检测ATM/CHK2/p53通路关蛋白及凋亡指标cleaved caspase 3的表达变化。NSC34细胞在含10％胎牛血清的DMEM完全培养基中培养，待细胞融合50-70％左右时，对细胞进行瞬时转染Wip1siRNA序列，对照组进行对照siRNA的瞬时转染，48小时后使用100um H2O2分别处理6h，24h，48h提取细胞蛋白进行western blot检测Wip1及ATM/CHK2/p53通路相关蛋白及凋亡蛋白cleaved caspas3表达水平。结果如图6A-B所示，可见转染Wip1siRNA干扰序列后，NSC34细胞中Wip1表达量明显减少，ATM/CHK2/p53信号通路中，p-ATM、p-CHK2及p-p53表达量在6h，24h，48h与对照组相比均增多，差异具有统计学意义(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)，提取对照组及干扰组细胞的蛋白检测cleaved caspase 3，结果显示cleaved caspase 3在干扰组不同时间点与对照组相比均明显增多，差异具有统计学意义(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。

接下来为了检测敲除细胞Wip1蛋白后NSC34细胞系细胞活力的变化，我们在NSC34细胞系中干扰Wip1的表达后使用H2O2进行损伤处理，使用CCK8检测细胞活力变化。NSC34细胞在含10％胎牛血清的DMEM完全培养基中培养，细胞分为两组，分别为对照组(NC)，干扰组(si-Wip1)，对于这两组细胞，待细胞融合60％左右时，对干扰组细胞进行瞬时转染Wip1siRNA序列，对照组顺瞬时转染对照siRNA，6小时后更换为2％FBS的DMEM继续培养24小时，随后100um H2O2分别处理3h，6h，24h，48h。上述细胞进行CCK8测定细胞凋亡率。结果如图6C所示，可见在敲除Wip1后H2O2处理的不同时间点，细胞活力均减弱差异具有统计学意义(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。在干扰组使用H2O2处理30min时超过60％的细胞发生死亡，而对照组因为Wip1的激活在此时仍然可以耐受H2O2的损伤作用。

4.过表达Wip1后可抑制NSC34细胞中ATM/ChK2/p53信号通路，同时增强NSC34细胞对H2O2损伤的耐受性

为了进一步验证wip1与细胞活力之间的相关性及Wip1对DNA损伤应答通路ATM/CHK2/p53的影响，通过lipofectamine2000转染对细胞进行瞬时转染对照质粒(p3xFlag-CMV-14)和过表达质粒(Flag-Wip1)，进行H2O2处理后检测细胞活力的变化，同时提取细胞内蛋白，检测ATM/CHK2/p53通路关蛋白及凋亡指标cleaved caspase 3的表达变化。在随后的实验中NSC34细胞在含10％胎牛血清的DMEM完全培养基中培养，细胞分为两组，分别为对照组，过表达组，待细胞融合60-70％左右时，随后使用100um H2O2处理6h，24h，48h后提取细胞蛋白进行western blot检测ATM/CHK2/p53通路相关蛋白及凋亡蛋白cleavedcaspase3表达水平。结果如图7A、B所示，结果显示ATM/CHK2/p53信号通路中，在使用H2O2处理处理后，过表达组p-ATM、p-CHK2及p-p53表达量在不同的时间点较对照组相比均减少，凋亡蛋白cleaved caspas3在各个时间点也明显减少，差异具有统计学意义(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。同时过表达后使用100um H2O2处理3h，6h，24h，48h。上述细胞进行CCK8测定细胞活力。结果显示在wip过表达组6h，24h，48h均可改善细胞活力(图7C)，差异具有统计学意义(*P<0.05,**P<0.01)

5.hSOD1G93A稳定转染NSC34细胞模型中ATM/CHK2/p53通路激活

我们进一步研究在本实验G93A SOD1细胞模型ATM/CHK2/p53通路的变化情况。NSC34细胞，pLV细胞，wtSOD1细胞，mSOD1细胞在含有10％FBS的DMEM完全培养基中培养，提取四种细胞系蛋白进行Western blot检测结果显示mSOD1组pATM，pCHK2，p-p53蛋白均增多，差异具有统计学意义(***P<0.001)，结果如图8所示。

6.在wtSDO1细胞系和mSDO1细胞系分别转染Flag-Wip1可抑制ATM/CHK2/p53通路；

wtSOD1和mSOD1细胞在含10％胎牛血清的DMEM完全培养基中培养，待细胞融合70-80％左右时，对细胞进行瞬时转染对照质粒(3*Flag)和Wip1过表达质粒(Flag-Wip1)，48h后提取细胞蛋白进行western blot检测ATM/CHK2/p53通路相关蛋白及细胞活力改变。结果如图9A-C所示，结果显示在wtSOD1和mSOD1细胞中过表达Wip1对ATM/CHK2/p53通路磷酸化蛋白均有抑制作用，差异具有统计学意义(*P<0.05)。mSOD1组细胞活力较wtSOD1组下降，差异具有统计学意义(**P<0.01)，mSOD1细胞中瞬时转染Flag-Wip1可改善细胞活力，差异具有统计学意义(###P<0.001与转染Flag质粒mSOD1组比较)，但对空病毒组(pLV)及野生组(wtSOD1)的细胞活力没有明显改变。

7.mSOD1细胞系中干扰HIPK2可增加wip1蛋白表达同时抑制ATM/CHK2通路

mSOD1细胞转染阴性对照si-con，Wip1siRNA或者HIPK2siRNA 72小时，检测pATM，pCHK2，Wip1蛋白表达水平的变化，结果如图10所示，该结果显示，.mSOD1细胞系中干扰HIPK2可增加wip1蛋白表达同时抑制p-ATM及p-CHK2的表达。

8.hSOD1G93A稳转细胞系中HIPK2与Wip1之间相互作用增强

免疫共沉淀(CO-IP)方法检测wtSOD1细胞及mSOD1细胞中HIPK1与Wip1相互作用，可见在mSOD1细胞中，HIPK1与Wip1之间相互作用增强，结果如图11所示。

9.在mSOD1细胞中HIPK2通过促进Wip1泛素—蛋白酶体系统降解

Wip1表达受到转录，转录后及蛋白水平的精确协调的调控，在DNA损伤不同阶段发挥其生物学功能。在前面的实验我们的结果显示在mSOD1中Wip1的蛋白水平及mRNA表达均下降，在转录水平CREB作为Wip1的转录因子在ALS中表达下降已得到证实。但是Wip1蛋白水平的稳定性还受到泛素—蛋白酶体的调控。在生理条件下HIPK2可使Wip1磷酸化促进其泛素化降解途径的增强，在DNA损伤的中晚期，Wip1磷酸化水平逐渐减弱，泛素化水平逐渐减弱，Wip1稳定性增强以终止DNA损伤应答通路。但是ALS等慢性氧化损伤情况下Wip1蛋白水平的表达下降是否受到泛素—蛋白酶体的影响加速其降解过程，所以我们进一步研究在慢性损伤条件下Wip1的调控机制。

Flag-wip1转染wtSOD1和mSOD1细胞系，MG132处理4h，免疫共沉淀检测wtSOD1和mSOD1细胞系中wip1的泛素化水平，结果如图12所示，结果显示mSOD细胞中wip1泛素化水平增强。

我们推测，在ALS等应激条件下HIPK2可以在蛋白水平调控Wip1水平。为了检测mSOD1诱导的应激条件下HIPK2与Wip1关系，我们分别敲除Wip1或HIPK2检测mSOD1细胞中DDR信号蛋白的磷酸化水平的改变及HIPK2与Wip1的变化关系，具体的，将Flag-wip1与HIPK2siRNA或Flag-wip1与HIPK2分别共转染mSOD1细胞，免疫共沉淀检测HIPK2对wip1泛素化的影响。结果如图13和14所示，结果表明，敲除Wip1后导致ATM，CHK2，p53的磷酸化水平增加，但HIPK2的蛋白水平没有发生明显变化，而敲除HIPK2后导致Wip1表达增加并随之导致ATM和CHK2的去磷酸化，差异具有统计学意义(*P<0.05，#P<0.05，&*P<0.05)。免疫共沉淀实验表明在wtSOD1细胞和mSOD1细胞中内源性Wip1与HIPK2均存在相互作用，而在mSOD1细胞中Wip1与HIPK2的相互作用增多。Wip1蛋白通过泛素化蛋白酶体途径被降解，我们在wtSOD1细胞和mSOD1细胞中转染Flag-Wip1质粒24小时后，MG132作用4小时，使用Flag抗体进行免疫沉淀，Ub抗体进行免疫印迹，结果显示wtSOD细胞相比，mSOD1细胞中Wip1的多聚泛素化水平增加。接下来，我们检测Wip1的多聚泛素化水平是否为HIPK2依赖的方式。免疫印迹分析显示MG132处理后Wip1的多聚泛素化水平在转染野生型HIPK2质粒时增加。同时发现Flag-Wip1的多聚泛素化水平在敲除HIPK2后受到抑制。最后我们使用100umol H2O2处理NSC34细胞，Wip1的多聚泛素化水平水处理时间的延长而逐渐增多，但是在HIPK2敲除的细胞中，多聚泛素化Wip1的水平在H2O2处理24小时及48小时与未敲除HIPK2组相比明显减少。

在上述实施例的基础上，我们将已制备的Wip1的纳米基因复合体通过尾静脉注射的方式(80μg/只)注入SOD1G93A ALS小鼠体内，每五天注射一次，连续四次，在最后一次注射两天后对SOD1G93A ALS小鼠和对照组小鼠进行发病时间、生存期观察和行为学实验(悬尾实验、体重和转棒实验)(Wang P,Zheng X,Guo Q,Yang P,Pang X,Qian K,Lu W,ZhangQ,Jiang X.Systemic delivery of BACE1siRNA through neuron-targetednanocomplexes for treatment of Alzheimer's disease.J Control Release.279(2018):220-233.)，在上述实施例的实验数据基础上，我们认为这种纳米基因复合物能够起到推迟ALS小鼠的发病时间，延长生存期及改善行为功能的作用。

序列表

<110> 哈尔滨医科大学

<120> Wip1基因及其表达蛋白在治疗肌萎缩侧索硬化中的用途

<130> KLPI181066

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1818

<212> DNA

<213> human

<400> 1

atggcggggc tgtactcgct gggagtgagc gtcttctccg accagggcgg gaggaagtac 60

atggaggacg ttactcaaat cgttgtggag cccgaaccga cggctgaaga aaagccctcg 120

ccgcggcggt cgctgtctca gccgttgcct ccgcggccgt cgccggccgc ccttcccggc 180

ggcgaagtct cggggaaagg cccagcggtg gcagcccgag aggctcgcga ccctctcccg 240

gacgccgggg cctcgccggc acctagccgc tgctgccgcc gccgttcctc cgtggccttt 300

ttcgccgtgt gcgacgggca cggcgggcgg gaggcggcac agtttgcccg ggagcacttg 360

tggggtttca tcaagaagca gaagggtttc acctcgtccg agccggctaa ggtttgcgct 420

gccatccgca aaggctttct cgcttgtcac cttgccatgt ggaagaaact ggcggaatgg 480

ccaaagacta tgacgggtct tcctagcaca tcagggacaa ctgccagtgt ggtcatcatt 540

cggggcatga agatgtatgt agctcacgta ggtgactcag gggtggttct tggaattcag 600

gatgacccga aggatgactt tgtcagagct gtggaggtga cacaggacca taagccagaa 660

cttcccaagg aaagagaacg aatcgaagga cttggtggga gtgtaatgaa caagtctggg 720

gtgaatcgtg tagtttggaa acgacctcga ctcactcaca atggacctgt tagaaggagc 780

acagttattg accagattcc ttttctggca gtagcaagag cacttggtga tttgtggagc 840

tatgatttct tcagtggtga atttgtggtg tcacctgaac cagacacaag tgtccacact 900

cttgaccctc agaagcacaa gtatattata ttggggagtg atggactttg gaatatgatt 960

ccaccacaag atgccatctc aatgtgccag gaccaagagg agaaaaaata cctgatgggt 1020

gagcatggac aatcttgtgc caaaatgctt gtgaatcgag cattgggccg ctggaggcag 1080

cgtatgctcc gagcagataa cactagtgcc atagtaatct gcatctctcc agaagtggac 1140

aatcagggaa actttaccaa tgaagatgag ttatacctga acctgactga cagcccttcc 1200

tataatagtc aagaaacctg tgtgatgact ccttccccat gttctacacc accagtcaag 1260

tcactggagg aggatccatg gccaagggtg aattctaagg accatatacc tgccctggtt 1320

cgtagcaatg ccttctcaga gaatttttta gaggtttcag ctgagatagc tcgagagaat 1380

gtccaaggtg tagtcatacc ctcaaaagat ccagaaccac ttgaagaaaa ttgcgctaaa 1440

gccctgactt taaggataca tgattctttg aataatagcc ttccaattgg ccttgtgcct 1500

actaattcaa caaacactgt catggaccaa aaaaatttga agatgtcaac tcctggccaa 1560

atgaaagccc aagaaattga aagaacccct ccaacaaact ttaaaaggac attagaagag 1620

tccaattctg gccccctgat gaagaagcat agacgaaatg gcttaagtcg aagtagtggt 1680

gctcagcctg caagtctccc cacaacctca cagcgaaaga actctgttaa actcaccatg 1740

cgacgcagac ttaggggcca gaagaaaatt ggaaatcctt tacttcatca acacaggaaa 1800

actgtttgtg tttgctga 1818

Claims (10)

1.野生型p53诱导的蛋白磷酸酶1(wild-type p53-inducible phosphatase 1,Wip1)及其表达蛋白在制备治疗肌萎缩侧索硬化药物中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物通过抑制DNA损伤应答途径和增加神经元的存活，用于改善由SOD1G93A突变导致的肌萎缩侧索硬化。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物为通过纳米载体结合Wip1基因制备得到的纳米颗粒、凝胶或乳剂，所述纳米颗粒包含但不限于聚合物纳米颗粒、脂质纳米颗粒、碳纳米颗粒、金属纳米颗粒。

4.野生型p53诱导的蛋白磷酸酶1(wild-type p53-inducible phosphatase 1,Wip1)及其表达蛋白的增效剂在制备治疗肌萎缩侧索硬化药物中的用途。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的药物通过抑制DNA损伤应答途径和增加神经元的存活，用于改善由SOD1G93A突变导致的肌萎缩侧索硬化。

6.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的增效剂为激动剂、上调剂或稳定剂。

7.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的增效剂是指任何可提高Wip1基因或蛋白的活性、提高Wip1基因或蛋白的稳定性、上调Wip1基因或蛋白的表达、增加Wip1基因或蛋白有效作用时间的物质，所述的增效剂为化合物、化学小分子或生物分子。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的生物分子可以是DNA或RNA，或是调控Wip1基因或蛋白表达的病毒产品。

9.一种用于治疗肌萎缩侧索硬化的聚合物纳米颗粒，其特征在于，通过以下方法制备得到：

(1)合成二嵌段共聚物Mal-PEG-PDMAEMA；

(2)将合成的二嵌段共聚物Mal-PEG-PDMAEMA与巯基CGN或Tet1肽在磷酸盐缓冲液中按摩尔比1：1的比例与室温下作用4小时，反应液用MWCO 5ka的透析袋进行透析，透析液为双蒸水，冷冻干燥后获得CGN-PEG-PDMAEMA和Tet1-PEG-PDMAEMA产品；

(3)将CGN-PEG-PDMAEMA以及Tet1-PEG-PDMAEMA分别于DEPC水中溶解，然后与Wip1基因按N/P为1-10:1的比例混合，涡旋30秒，再在室温中培养20分钟后得到所述的聚合物纳米颗粒。

10.权利要求9所述的聚合物纳米颗粒在制备治疗肌萎缩侧索硬化药物中的用途，其中，优选的，所述的聚合物纳米颗粒通过抑制DNA损伤应答途径和增加神经元的存活，用于改善由SOD1G93A突变导致的肌萎缩侧索硬化。