CN111944825A - 一种ctla4基因和pd1基因人源化小鼠模型的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种CTLA4基因和PD1基因人源化小鼠模型的应用，涉及动物基因工程和基因遗传修饰领域。本发明构建获得BALB/c背景的CTLA4和PD1免疫检查点人源化模型，该模型可以重现CTLA4抗体药、PD1抗体药以及联用药的毒性反应，解决了其他啮齿类小鼠无法进行毒性评价的问题，同时又不似灵长类动物实验成本高昂，填补了啮齿类进行PD1，CTLA4抗体安全性评价的市场空白。采用本发明提供的模型构建方法构建的模型可以用于评估靶向药物有效性、靶向药物筛选开发、靶向药物联合其他药物抗肿瘤药效评价、或靶向药物的毒理研究。
Description
技术领域
本发明涉及动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体而言，涉及一种CTLA4基因和PD1基因人源化小鼠模型的应用。
背景技术
早在2013年，Science杂志就将肿瘤免疫疗法评为10大科学突破之首，其中以PD1/PDL1为首的免疫检查点疗法(Immuno-checkpoint therapy)已在多种癌症临床治疗中显示出显著的抗肿瘤疗效。目前已有上市并用于临床的成功药物，默沙东公司的PD-1人源化抗体Keytruda(Pembrolizumab，MK-3475)及百时美施贵宝公司的PD-1抗体Opdivo(Nivolumab)于2014年被FDA批准上市的一线肿瘤治疗药物，有稳健的抗肿瘤作用。抗CTLA4单克隆抗体也在小鼠模型和临床病人中取得了卓越的抗肿瘤治疗效果，临床长期追踪证明，Ipilimumab一旦起效，并且突破3年存活期，患者就有极大机会能活到10年，成为“超级幸存者”。在晚期黑色素瘤和晚期非小细胞肺癌患者的治疗中，抗CTLA4抗体Iplimumab与Nivolumab联用，可显著增加有效应答率。另一组抗CTLA4抗体(Tremelimumab)与抗PD1抗体(durvalumab)联用，取得了相似的临床效果。现有研究表明：免疫联合疗法具有巨大的临床开发价值。
然而伴随免疫治疗的免疫相关副反应(irAEs)表型使得部分患者的使用受到限制。有研究表明：PD1抗体治疗后的3-5级irAEs比率为1-2％，而CTLA4抗体治疗后的3-5级irAEs比率为1-11％。《新英格兰杂志》曾指出，PD-1抗体单药使用导致的免疫性心脏炎症发生率约为万分之六，而PD-1抗体和CTLA-4抗体联合使用，这一比例将上升到千分之三左右，一旦发生严重的心肌炎，病死率极高。此外，有研究者调研免疫检查点抑制剂(抗PD1疗法等)治疗之后发生严重心肌炎的101例患者的详细资料后发现，使用该类疗法的患者要高度警惕这种肿瘤免疫治疗导致的免疫性心肌炎，目前没有针对这一症状的有效治疗手段，死亡率高达46％。同样的，在抗CTLA4抗体药物开发过程中，无论是单用还是联用，总是会遇到免疫相关不良反应的阻碍。在部分临床试验中，Iplimumab与Nivolumab联用使超过50％的患者出现了严重的不良反应(3～4级SAE)，这极大的限制了患者的长期免疫治疗。因此，如何在强大的抗癌效果及严重的副作用中取得平衡，获得最好的治疗效果及最小的毒副作用，正是目前免疫检查点抗体药物研发所面临的挑战。
体内人体生物学的研究受到道德和技术的严重限制，越来越需要动物模型来进行人体细胞、组织和器官的体内研究，而不会使个体处于危险之中。构建临床前的抗体安全评价体系对抗体药的临床安全性具有极大的参考意义。
目前，在抗体药研发的临床前实验阶段，对药物的代谢及安全性评价主要依靠灵长类动物模型，使用啮齿类小鼠评价的大部分都是小分子药物的代谢及毒理等。在小鼠模型上进行抗体药安全性评价受限的原因主要有2点：目前尚没有对大分子抗体毒性敏感的小鼠模型，小鼠对于irAEs具有更高的耐受，在人体内具有毒性反应的抗体通常不能在小鼠上体现；受抗体种属差异的限制，人源抗体类药物识别特意靶点具有种属特异性，因此野生型小鼠模型无法直接进行人源抗体的评价。
最近的研究表明，10日龄CTLA4人源化幼鼠给予抗CTLA4抗体Ipilimumab处理后，小鼠可以再现部分临床毒副反应(器官炎症、心脏毒性、红细胞发育异常等)。然而，使用该评价方法具有结果不稳定及操作复杂的问题：1)幼龄鼠需要在繁殖笼内进行操作，实验成本高昂；2)幼龄鼠对抗体的毒理反应与临床中用药主体为成年人的毒理反应之间测差异性。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种CTLA4基因和PD1基因人源化小鼠模型的应用以解决上述技术问题。
本发明是这样实现的：
一种CTLA4基因和PD1基因人源化小鼠模型的构建方法，其包括：首先，构建表达针对BALB/c小鼠PD1基因的sgRNA，然后根据得到的sgRNA，构建携带PD1人源序列的载体，然后将针对BALB/c小鼠PD1基因的sgRNA与携带PD1人源序列的载体，以及Cas9mRNA或Cas9蛋白注射至鼠受精卵细胞质或细胞核中，移植入受体母鼠生产PD1基因修饰的人源化鼠模型。
其次，构建表达针对BALB/c小鼠CTLA4基因的sgRNA，然后根据得到的sgRNA，构建携带CTLA4人源序列的载体，然后将针对BALB/c小鼠CTLA4基因的sgRNA与携带CTLA4人源序列的载体，以及Cas9mRNA或Cas9蛋白注射至上述PD1基因修饰的人源化鼠的受精卵细胞质或细胞核中，移植入受体母鼠生产PD1基因和CTLA4基因同时修饰的人源化鼠模型。
为解决如上问题，本发明在BALB/c背景上构建PD1/CTLA4免疫检验点人源化小鼠模型，利用该模型可以有效克服抗体种属差异的限制，用于研究直接识别人体免疫检验点的药物；同时，使用BALB/c背景的成年鼠构建的模型可以用于对大分子抗体毒性更加敏感的毒理评价，使用本发明提供的人源化模型可以更好的再现临床抗体的不良反应，如血液中促炎因子升高，脾脏肿大，心脏白细胞浸润等，进一步扩大了该模型对免疫相关副作用的相关表型的评价。
CTLA4基因和PD1基因人源化BALB/c小鼠既解决了其他啮齿类小鼠无法进行毒性评价的问题，同时又不似灵长类动物实验成本高昂，填补了啮齿类同时进行PD1和CTLA4抗体安全性评价的市场空白。
本发明提供的模型构建方法是在BALB/c背景小鼠模型上进行的基因改造，建立了PD1/CTLA4双靶点的人源化小鼠模型。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述PD1基因修饰的人源化鼠模型的构建方法与专利CN 109266656 A方法一致，构建过程中选用的sgRNA、载体和引物均相同，PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定也相同。
表达针对BALB/c小鼠CTLA4基因的sgRNA、携带CTLA4人源序列的载体与专利CN109022443 A相同，鉴定的引物序列也相同。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述载体能够将鼠源PD1基因的外显子2-3的编码区替换为人源PD1基因的外显子2-3，载体能够将鼠源CTLA4基因的外显子2的编码区替换为人源PD1基因的外显子2，保留了小鼠PD1跨膜区及胞内区。
本发明方法构建的CTLA4基因和PD1基因人源化BALB/c小鼠，将BALB/c小鼠的PD1胞外区替换为相应的人源基因片段，将小鼠CTLA4基因编码胞外区的部分替换为对应的人源基因序列，而胞内区则保留完整的鼠源序列。制作成功的人源化动物模型拥有人源胞外区，可筛选人源免疫检查点药物(如中和性抗体)；而鼠源胞内区则保证其胞内信号传导不受影响，将外部刺激忠实地转化为胞内行为(激活或抑制)。
应用该方法构建的人源化模型，实现了人源区域(抗体结合域)最大化，避免错过有效的抗体。可供更多不同需求的抗体筛选，覆盖所有PD1抑制剂和CTLA4抑制剂生产商对于抗体药效初筛需求。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述在构建载体后还进一步包括对携带PD1人源序列和CTLA4人源序列的载体进行鉴定。对载体进行鉴定可以是PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定中的至少一种。
由上述构建方法构建的CTLA4基因和PD1基因人源化小鼠模型可以在评估靶向药物有效性、靶向药物筛选开发、靶向药物联合用药药效评价、或靶向药物的毒理研究中得到广泛应用。人源化小鼠模型为人源化BALB/c小鼠模型。应用的直接目的为非疾病的诊断和治疗为目的。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述靶向药物的毒理研究为血液中促炎因子研究，脾脏形态或心脏白细胞浸润研究。
本发明在BALB/c背景的免疫检查点人源化成年小鼠模型上成功再现了抗CTLA4抗体及抗PD1抗体临床上用药引起的免疫相关不良反应，该不良反应包括血液炎症因子升高，脾脏肿大，心脏白细胞浸润增加。也就是说本发明提供的CTLA4基因和PD1基因人源化BALB/c小鼠模型是理想的用于评价PD1抗体和CTLA4抗体单用或者联用毒性的临床前评价模型。
靶向药物为大分子药物，优选的，大分子药物为CTLA4靶向药物、PD1靶向药物或CTLA4靶向药物与PD1靶向药物的联用药物。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述CTLA4靶向药物为Yervoy抗体或CP657206，PD1靶向药物为Keytruda抗体、Opdivo抗体或Libtayo抗体。
在其他实施方式中，PD1抗体还可以是REGN2810，BMS-936558，SHR1210，IBI308，PDR001，BGB-A317，BCD-100或JS001。
在其他实施方式中，CTLA4靶向药物也可以是Yervoy抗体的类似物。
在其他实施例中，靶向药物可以是曲妥珠单抗-药物共轭物(商品名Kadcyla)、阿特珠单抗(Tecentriq)、阿仑单抗(Campath)、贝伐单抗(Avastin)、双特异性抗体(Blincyto)、本妥昔单抗(Adcetris)、西妥昔单抗(Erbitux)、地诺塞麦(Xgeva)、纳武单抗(Opdivo)、奥法木单抗(Arzerra)、帕尼单抗(Vectibix)、利妥昔单抗(Rituxan)、司妥昔单抗(Sylvant)、托西莫单抗(Bexxar)和曲妥珠单抗(Herceptin)中的任意一种或者多种的联用药物。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种CTLA4基因和PD1基因人源化小鼠模型的应用，通过BALB/c背景的CTLA4和PD1免疫检查点人源化模型可以重现CTLA4抗体药、PD1抗体药以及联用药的毒性反应，解决了其他啮齿类小鼠无法进行毒性评价的问题，同时又不似灵长类动物实验成本高昂，填补了啮齿类进行PD1，CTLA4抗体安全性评价的市场空白。构建的模型可以用于评估靶向药物有效性、靶向药物筛选开发、靶向药物联合其他药物抗肿瘤药效评价、或靶向药物的毒理研究。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为小鼠血液中D9、D21细胞因子表达水平；
图2为第九天G1组(非药物处理组)和G6组(Yervoy analog+Keytruda联合用药组)脾脏图；
图3为G1-G6(D9)和G7-G12(D21)小鼠脾脏重量与体重比例；
图4为D21小鼠心脏炎症细胞浸润IHE染色图；
图5为mCD45表达评分图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种CTLA4基因和PD1基因人源化BALB/c小鼠模型的构建方法，其包括如下的模型构建方法：
按照专利CN 109266656 A的方法构建PD1基因修饰的人源化鼠模型，然后按照专利CN 109022443 A的方法构建表达针对BALB/c小鼠CTLA4基因的sgRNA，然后根据得到的sgRNA，构建携带CTLA4人源序列的载体，然后将针对BALB/c小鼠CTLA4基因的sgRNA与携带CTLA4人源序列的载体，以及Cas9mRNA或Cas9蛋白注射至上述(专利CN 109266656 A)PD1基因修饰的人源化鼠的受精卵细胞质或细胞核中，移植入受体母鼠生产PD1基因和CTLA4基因同时修饰的人源化鼠模型。将得到的小鼠模型命名为BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠(即本申请所述的balb/c小鼠)。实验分别获得BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠120只，用于人类PD-1抑制剂(Keytruda抗体)、CTLA4抑制剂(Yervoy抗体)以及两者联的毒性评价。
本实施例中PD1基因修饰的人源化鼠模型的构建方法与专利CN 109266656 A方法一致，构建过程中选用的sgRNA、载体和引物均相同，PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定也相同。
表达针对BALB/c小鼠CTLA4基因的sgRNA、携带CTLA4人源序列的载体与专利CN109022443 A相同，鉴定的引物序列也相同。
实施例2
采用实施例1构建的BALB/c-hPD1/hCTLA4成年小鼠进行毒理评价试验，120只，5-6周龄，雌性。所有数据通过GraphPad Prism进行作图。两组间数据通过unpaired two-tailed Student’s t-test进行差异性分析。Yervoy analog的供货商BIOINTRON，Keytruda的供货商MSD Ireland，Yervoy的供货商Bristol-Myers Squibb。
5-6周龄的BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠分别单独给予Keytruda抗体、Yervoy抗体、Yervoy analog，或者Keytruda抗体和Yervoy抗体联合给药，Keytruda抗体和Yervoyanalog联合给药处理。通过腹腔注射(i.p.)的方式，每3天一次，给药次数参照表1所示。给药后第9天或者第21天，小鼠安乐死，进行血清、组织器官收集，并进行毒理学相关指标检测。
IgG 1、IgG 4是无关抗体，用于空白对照；“Q3D x 3”表示每3天一次，共给予3次；Q3D×7表示每3天给药一次，共给予7次。给药体积：10ul/g。
表1给药处理表。
实施例3
本实施例给出了给药后模型小鼠血浆中炎症细胞因子的表达。第1组(G1)至第6组(G6)在D0，D9进行眼眶采血；G7-G12组在D0，D21进行眼眶采血，血液分离血浆，利用CBA(Cytometric Bead Array)试剂盒(BD，560485)进行细胞因子检测。
细胞因子检测结果参照图1所示，相较于对照组，第9天和第21天，Yevoy+Keytruda联合给药组处理的BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠血浆中炎症因子IL-4，IL-6，IFN-r，IL-17A的表达升高，预示着PD1/CTLA4抗体联合处理后，小鼠表现出免疫相关的炎症反应，与临床上hPD1/hCTLA4抗体药治疗后在病人身上引发的免疫相关副作用表型类似。
实施例4
本实施例进行了给药后模型小鼠脾脏炎症反应的评价。
终点取材时，打开腹腔，对小鼠脾脏进行拍照，并进行称重，计算脾脏重量和小鼠体重比例。
参照图2所示，D9，与G1组非药物处理组相比，G6组Yervoy analog+Keytruda联合用药处理组小鼠脾脏增大。
脾脏重量与小鼠体重之比的统计数据参照图3所示，与非药物处理组相比，Keytruda抗体、Yervoy抗体、Yervoy analog，或者Keytruda抗体和Yervoy抗体联合给药，Keytruda抗体和Yervoy analog联合给药处理组，小鼠脾脏重量占小鼠体重的比例显著增高。这表明，PD1和CTLA4抗体药的处理使小鼠发生了炎症反应，也证明了BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠可对PD1抗体、CTLA4抗体单用或者联用进行毒理学评价。G1-G6:***p<0.001vs.G1；G7-G12：***p<0.001vs.G7。
实施例5
本实施例进行了给药后模型小鼠心脏淋巴细胞浸润检测。
G7-G12组D21终点时心脏取材，生理盐水透心灌注清洗后泡KCl，进行IHC染色检测免疫细胞CD45在小鼠心脏中的浸润表达情况。样品制备过程如下：
(1)脱蜡复水
(2)抗原修复：柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中高温热修复30min，自然冷却至室温，PBS冲洗3次，每次5min；
(3)内源性过氧化物酶封闭：3％H2O2封闭液孵育10min，PBS冲洗3次，每次5min；
(4)血清封闭：即用型山羊血清(博士德，AR0009)孵育30min；
(5)一抗孵育：滴加一抗CD45(1:2000)，4度冰箱孵育过夜；
(6)二抗孵育：PBS冲洗3次，每次5min，生物素标记的羊抗兔IgG(UltraSenstiveTMS-P超敏-兔，KIT-9707，福州迈新)孵育10min，PBS冲洗3次，每次5min；
(7)过氧化酶孵育：链霉菌抗生素蛋白-过氧化酶室温孵育10min，PBS冲洗3次，每次5min；
(8)DAB显色液(DAB Kit，福州迈新，DAB-0031)显色45s，蒸馏水阻断显色；
(9)染核：苏木素浸染：15s-30s，自来水冲洗数秒；1％分化液过3s，自来水冲洗数秒；返蓝液5-10s，自来水冲洗数秒；
(10)脱水透明；
(11)封片：中性树胶封固，晾干。
D21小鼠心脏炎症细胞浸润IHE染色参照图4所示，箭头指示浸润的白细胞，mCD45表达评分参照图5所示。D21，与G7对照组相比，CTLA4抗体药单用及CTLA4抗体药与PD1抗体药联用组，显著增加了小鼠心脏白细胞(CD45阳性细胞)的浸润，表明小鼠心脏发生了炎症反应，与临床上CTLA4和PD1抗体药引起的心肌炎表型类似，说明BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠可用于评价CTLA4和PD1抗体药的毒性。数据以Mean±SD展示。*p<0.05,***p<0.001vs G7。
本发明在BALB/c背景小鼠模型上进行基因改造，建立了PD1/CTLA4双靶点的人源化小鼠模型，并在该模型上重现了PD1/CTLA4抗体药的毒性反应，即促炎因子增高，脾脏肿大，心脏白细胞浸润增加等，该系列毒副作用与临床上该类药物表现出的免疫相关副作用症状相似，因此提供了一种在啮齿类动物上评价PD1/CTLA4抗体毒性的方法和平台。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种CTLA4基因和PD1基因人源化小鼠模型的构建方法构建的CTLA4基因和PD1基因人源化小鼠模型在评估靶向药物有效性、靶向药物筛选开发、靶向药物联合用药药效评价或靶向药物的毒理研究中的应用，所述人源化小鼠模型为人源化BALB/c小鼠模型，所述应用的直接目的为非疾病的诊断和治疗为目的。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述靶向药物的毒理研究为血液中促炎因子研究，脾脏形态或心脏白细胞浸润研究。
3.根据权利要求2所述的应用，所述靶向药物为CTLA4靶向药物、PD1靶向药物或CTLA4靶向药物与PD1靶向药物的联用药物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述CTLA4靶向药物为Yervoy抗体或CP657206，所述PD1靶向药物为Keytruda抗体、Opdivo抗体或Libtayo抗体。
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