CN109266656A - 一种PD1人源化BALB/c小鼠模型的构建方法及其应用 - Google Patents

一种PD1人源化BALB/c小鼠模型的构建方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种制备PD1人源化BALB/c小鼠模型的方法，该方法利用CRIPSR/Cas9技术，通过构建打靶载体，利用同源重组的方式将小鼠PD1大部分胞外区人源化，胞内区仍为小鼠序列，保留了完整的胞内信号传导能力，应用该方法构建的人源化模型，实现了人源区域(抗体结合域)最大化，避免错过有效的抗体。同时以BALB/c为背景构建的PD1人源化模型，可接种结直肠癌、肝癌、黑色素瘤、乳腺癌、肾癌及淋巴癌等，满足各类实体肿瘤细胞系类型，并且拓展了应用的广泛性。

Description

一种PD1人源化BALB/c小鼠模型的构建方法及其应用
技术领域
本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及基于CRISPR/Cas9技术的PD1基因修饰人源化动物模型的构建方法及其在生物医药的应用。
背景技术
早在2013年，Science杂志就将肿瘤免疫疗法评为10大科学突破之首，其中以PD1/PDL1为首的免疫检查点疗法(Immuno-checkpoint therapy)已在多种癌症临床治疗中显示出显著的抗肿瘤疗效。目前已有上市并用于临床的成功药物，默沙东公司的PD-1人源化抗体Keytruda(Pembrolizumab，MK-3475)及百时美施贵宝公司的PD-1抗体Opdivo(Nivolumab)于2014年被FDA批准上市的一线肿瘤治疗药物，有稳健的抗肿瘤作用。同时国内已有15个PD-1/PD-L1类药物(国产)申报临床，包括10个PD-1单抗和4个PD-L1单抗，1个PD-L1单域抗体。截止目前，恒瑞医药非小细胞肺癌及食管癌研发已进入三期临床，信达生物非小细胞肺癌研发也进入三期临床，而君实生物及百济神州的PD1研发均在二期临床取得显著疗效，主要适应症为实体癌。
临床研究表明，PD1抗体在部分肿瘤或病人体内，无显著响应，而采用PD1与化疗药物联用，会显著提高患者响应。Keytruda二期临床试验中，通过联合标准疗法(紫杉醇、多环比星与环磷酸胺)，对局部晚期的三阴性乳腺癌患者，或HR+/HER2-乳腺癌患者有着积极的疗效。患者的病理完全缓解率从20％上升到了60％。在HR+/HER2-乳腺癌患者中，组合疗法也将该数字从13％提升到了34％。
人源化小鼠模型是指带有人类功能性基因、人类细胞或组织的小鼠模型。人类疾病的发病机制研究，筛选有效的治疗药物，均需要大量的动物模型来进行临床前试验。小鼠因其个体小，饲养管理方便，易于控制，生产繁殖快等特点，广泛被用于生物模型。但由于小鼠生理特征与人存在较多差异，利用动物模型得到的实验结果有时不能适用到人体上。然而利用基因修饰或细胞与组织移植的方法，将人类基因或细胞组织“放置”在小鼠模型上所制备的人源化小鼠模型，极大程度上模拟人类基因或细胞组织的相关活动，大大提高了这类小鼠模型作为模拟某些人类疾病的有效性。
PD1(programmed death 1)为CD28超家族成员，属于免疫球蛋白超家族I型跨膜糖蛋白，是一种重要的免疫抑制分子。大量研究证实，肿瘤微环境中的肿瘤细胞表面PDL1增高，同时与活化的T细胞上的PD1结合，传递负性调控信号，导致肿瘤抗原特异性T细胞的凋亡或免疫无能，从而抑制免疫反应，进而促使肿瘤细胞的逃逸。
PD1人源化小鼠是指将鼠源的PD1基因替换为人源的基因。该小鼠模型可用于抗体及小分子药物的筛选和评价。该模型与普通小鼠相比，关键的靶分子实现了人源化改造，并且保留了完整的免疫系统，可用于筛选和评价针对人类基因的药物，是非常理想的临床前药物测试模型。
BALB/c和C57BL/6均为常用的肿瘤药效评价小鼠，现有的人源化PD1主要是在C57BL/6背景上进行，但从两种背景小鼠可接种的实体瘤对比表(见表一)可见，BALB/c小鼠的种类和多样性更丰富，且BALB/c小鼠常用于免疫相关研究。就前期PD1抑制剂在各类小鼠肿瘤上的敏感度比较，C57BL/6常用荷瘤MC38对PD1抑制剂较为敏感，易被压制。而BALB/c常用荷瘤CT26对于PD1响应度偏低且不均一，更能反应现有药物在不同人体内的真实情况。
表1.BALB/c及C57BL/6背景鼠可接种实体瘤对比
为解决如上问题，本发明在BALB/c背景上建立PD1人源化小鼠，利用CRISPR/Cas9技术将鼠源PD1胞外区替换为人源PD1胞外区。为人源化抗体评价提供更多的肿瘤评价体系，完善PD1抑制剂评价的多样性与稳定性。
我们构建了针对mouse PD1基因的gRNA和携带human PD1基因片段的载体，利用CRISPR/Cas9技术和囊胚注射技术，使用人源PD1序列的Exon2和3替换鼠源PD1的Exon2和3，保留小鼠PD1跨膜区及胞内区。同时，我们对于CRISPR/Cas9技术中用到的各个原件包括gRNA等进行了充分的优化和调整，保证采用该技术制备人源化PD1基因动物模型的成功率和准确率。
发明内容
本发明提供了一种人源化小鼠PD1基因的核酸序列，其特征在于，该核酸序列编码的蛋白含有人PD1蛋白的功能域，其是将小鼠PD1基因的外显子2-3的编码区替换为人PD1基因的外显子2-3，保留了小鼠PD1跨膜区及胞内区。
提供了包含人源化小鼠PD1基因的核酸序列的载体。
提供一种人源化小鼠PD1基因的核酸序列或所述载体在制备PD1基因修饰人源化的动物模型中的用途。
本发明还提供了一种制备PD1人源化BALB/c小鼠模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建表达针对BALB/c小鼠PD1基因的sgRNA的质粒；
(2)构建人源化PD1基因的载体；
(3)将步骤(1)所述质粒体外转录获得的sgRNA与步骤(2)的载体以及Cas9mRNA或Cas9蛋白注射至鼠受精卵细胞质或细胞核中，移植入受体母鼠生产PD1基因修饰人源化鼠模型；
所述载体能够将鼠源PD1基因的外显子2-3的编码区替换为人源PD1基因的外显子2-3，保留了小鼠PD1跨膜区及胞内区。
优选地，其中针对鼠源PD1基因的sgRNA的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO:2所示。
优选地，，其中步骤(2)中构建载体的过程如下：分别扩增三条片段，片段1为外显子2端的同源臂、人的部分Exon2序列及载体骨架，片段2为人的外显子2的其余部分和外显子3，片段三为外显子3端的同源臂，然后将三条片段按顺序连接，构建人源化PD1基因的载体。
优选地，扩增片段1使用的引物为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，扩增片段2使用的引物为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，扩增片段3使用的引物为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
优选地，在构建载体后还进一步包括对载体进行PCR鉴定、酶切鉴定、测序鉴定的步骤，其中PCR鉴定时使用的引物为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。
优选地，进一步包括利用引物鉴定所述动物模型的基因型或者mRNA的步骤。
本发明还提供所述核酸序列、所述载体或者所述制备小鼠模型的方法在评估靶向PD1的药物有效性、PD1靶向药物筛选开发、PD1靶向药物联合其他药物抗肿瘤药效评价、或PD1靶向药物的毒理研究中的应用。
进一步，还提供特异性靶向小鼠PD1基因的sgRNA，其序列如SEQ ID NO:1和SEQIDNO:2所示。
本发明具有以下积极效果：
1、将PD1大部分胞外区人源化，胞内区仍为小鼠序列，保留了完整的胞内信号传导能力，应用该方法构建的人源化模型，实现了人源区域(抗体结合域)最大化，避免错过有效的抗体。可供更多不同需求的抗体筛选，覆盖所有PD1抑制剂生产商对于抗体药效初筛需求。
2、以BALB/c为背景构建的PD1人源化模型，可接种结直肠癌、肝癌、黑色素瘤、乳腺癌、肾癌及淋巴癌等，满足各类实体肿瘤细胞系类型，并且拓展了应用的广泛性，强化了评价体系的准确性。
3、BALB/c-PD1人源化小鼠模型不仅可供于PD1抗体单药评价，同时可用于PD1抗体联合其他药物(小分子或抗体药)抗肿瘤药效评价，对临床前药效评价有着深远的指导意义。
4、我们建立的BALB/c-PD1人源化小鼠模型填补了市场在该背景领域小鼠模型的空白，同时提供了PD1抗体评价平台。从经济角度与社会角度均带来显著效益。
5、本发明提供了优化的制备人源PD1基因动物模型的具体操作方法，该方法中优化了sgRNA、载体的制备，确保了动物模型的成功率。
附图说明
图1为PCR鉴定Pdcd1-E2E3-KI载体的结果，泳道1-10为编号1-10样品，其中编号1/3/5/6/8鉴定为阳性。
图2为酶切鉴定Pdcd1-E2E3-KI载体的结果，泳道3为3号质粒ApaLI酶切；泳道4为3号质粒KpnI酶切。
图3为对Pdcd1-E2E3-KI载体测序的结果。
图4为F0代小鼠Pdcd1-E2E3-KI-target电泳鉴定图。A图显示了Pdcd1-E2E3-KI-target 5’端鉴定结果，B图显示了Pdcd1-E2E3-KI-target 3’端鉴定结果。其中阴性对照为B6基因组DNA；水为空白对照，无模板的对照；DL：DL20002000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp。
图5为F1代小鼠Pdcd1-E2E3-KI-target电泳鉴定图。其中A图为Pdcd1-E2E3-KI-target 5’端鉴定结果，B图显示了Pdcd1-E2E3-KI-target 3’端鉴定结果。阴性对照为B6基因组DNA；水为空白对照，P为阳性鼠尾对照，BALB&B6为阴性鼠尾对照；DL：DL2000 2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp。引物(mouse Pdcd1-5RTF1、human Pdcd1-5RTR1)位于鼠源Pdcd1musExon1外侧、人源Pdcd1huExon3内，引物(Human Pdcd1-3RTF1、mouse Pdcd1-3RTR1)位于人源Pdcd1huExon2、鼠源Pdcd1musExon5内。
图6为PD1mRNA及其引物示意图。
图7为人源化PD1mRNA PCR产物电泳图。A图为huPdcd1和mus pdcd1mRNA的5`endPCR，引物为mouse Pdcd1-5RTF1、human Pdcd1-5RTR1。泳道1/2为huPdcd1mRNA的5`endPCR，泳道4/5为mus pdcd1mRNA的5`end PCR；B图为huPdcd1和mus pdcd1mRNA的3`end PCR，引物为Human Pdcd1-3RTF1、mouse Pdcd1-3RTR1。泳道1/2为huPdcd1mRNA的3`end PCR，泳道4/5为mus pdcd1mRNA的3`end PCR；C图为huPdcd1和mus pdcd1mRNA全长PCR，引物为mouse Pdcd1-5RTF1、mouse Pdcd1-3RTR1。泳道1/2为huPdcd1mRNA的全长PCR，泳道4/5为mus pdcd1mRNA的全长PCR。注：图中箭头标出的为测序的目的片段；DL为Marker DL2000，条带：2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp。
图8为人源化PD1mRNA测序结果图。
图9为脾脏中PD1表达的流式检测结果。
图10为胸腺中PD1表达的流式检测结果。
图11为脾脏中淋巴细胞检测结果。
图12为荷瘤小鼠的治疗组和对照组的体重情况对比图。
图13为荷瘤小鼠的治疗组和对照组的肿瘤生长曲线对比图。
图14为荷瘤小鼠的治疗组和对照组的肿瘤中免疫细胞分类流式图。
图15为荷瘤小鼠的各种治疗组和对照组的小鼠体重生长变化图。
图16为荷瘤小鼠的各种治疗组和对照组的肿瘤生长曲线图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例1：BALB/c-PD1人源化小鼠模型建立
1、确定人源片段替换区域及插入的人源序列
根据人源PD1与PDL1蛋白结合功能域，我们选取人源PD1序列的Exon2和3替换鼠源PD1的Exon2和3(PD1基因的第11633到123333)，保留小鼠PD1跨膜区及胞内区，选取的人源PD1基因序列为SEQ No.1所示。
PD1人源化序列tccccagacaggccctggaacccccccaccttctccccagccctgctcgtggtgaccgaaggggacaacgccaccttcacctgcagcttctccaacacatcggagagcttcgtgctaaactggtaccgcatgagccccagcaaccagacggacaagctggccgccttccccgaggaccgcagccagcccggccaggactgccgcttccgtgtcacacaactgcccaacgggcgtgacttccacatgagcgtggtcagggcccggcgcaatgacagcggcacctacctctgtggggccatctccctggcccccaaggcgcagatcaaagagagcctgcgggcagagctcagggtgacaggtgcggcctcggaggccccggggcaggggtgagctgagccggtcctggggtgggtgtcccctcctgcacaggatcaggagctccagggtcgtagggcagggaccccccagctccagtccagggctctgtcctgcacctggggaatggtgaccggcatctctgtcctctagctctggaagcaccccagcccctctagtctgccctcacccctgaccctgaccctccaccctgaccccgtcctaacccctgacctttgtgcccttccagagagaagggcagaagtgcccacagcccaccccagcccctcacccaggccagccggccag
2、确定用于模型制备的sgRNA序列
根据替换片段确定sgRNA大概区域，针对目的片段选取脱靶率最低几组序列，如下序列作为待选sgRNA(见下表)。设计并合成识别5’端靶位点和3’端靶位点，并构建sgRNA表达载体。两端sgRNA识别位点分别位于小鼠PD1基因的第二个和第三个外显子上，各sgRNA在PD1上的靶位点序列为：
sgRNA名称 序列
PDCD1-E2-5-S1 CATTTCAGAGGTCCCCAA
PDCD1-E2-5-S2 TCCCCAATGGGCCCTGG
PDCD1-E2-5-S3 TAGAAGGTGAGGGACCTCCA
PDCD1-E2-5-S4 GACCTCCAGGGCCCATT
PDCD1-E2-5-S5 ACAAGCTGCAGGTGAAGG
PDCD1-E3-S1 ATGCCTTGAAACCGGCCTTC
PDCD1-E3-S2 GCCTTCTGGTTTGGGCGA
PDCD1-E3-S3 GGGCTGGGATATCTTGTTG
PDCD1-E3-S4 ATATCTTGTTGAGGTCTCC
PDCD1-E3-S5 CCCATCTAAAATAGTCCCT
sgRNA转录制备方法：以PrimerStar或PrimerStar Max体系，sgRNA-F、sgRNA-R为引物，测序正确的puc57-sgRNA质粒(1：30稀释)为模板进行PCR，PCR产物进行纯化，制备sgRNA转录制备模板。使用T7-ShortScript体外转录试剂盒(AM1354)进行sgRNA的转录。
sgRNA筛选：将5’端靶位点和3’端靶位点sgRNA两两配对，组合成4对sgRNA。分别将4对sgRNA与Cas9蛋白进行孵育后，将混合液注射至0.5天的受精卵中，培养至囊胚阶段后，进行小鼠PD1基因的ko阳性率的鉴定，以此筛选切割活性高的sgRNA对。
sgRNA切割鉴定方法：对收集的囊胚进行巢式PCR扩增(PCR引物以及扩增方案如下表所示)，将扩增条带进行二代测序，与wt条带比对，统计发生突变的概率(鉴定结果见下表)，最终选择PDCD1-E3-S2和PDCD1-E2-5-S4。
巢式PCR扩增引物：
sgRNA鉴定结果：
sgRNA名称 切割效率 备注
PDCD1-E2-5-S1 50％
PDCD1-E2-5-S2 50％
PDCD1-E2-5-S3 68.4％
PDCD1-E2-5-S4 87％ 选用
PDCD1-E2-5-S5 62.5％
PDCD1-E3-S1 44.1％
PDCD1-E3-S2 84.4％ 选用
PDCD1-E3-S3 80％
PDCD1-E3-S4 41.7％
PDCD1-E3-S5 72％
3、载体及移植产物构建
3.1载体构建：使用Pdcd1-E2plasmid PCR扩增片段一(Exon2端同源臂、人的部分Exon2序列及donor骨架)，使用Pdcd1-hE2-hE3plasmid PCR扩增片段二(人的部分Exon2和Exon3)，使用PDCD1-homoE2Vector A plasmid扩增片段三(Exon3端同源臂)，并将三组片段按顺序slic连接，构建Pdcd1-E2E3-KI donor载体。
片段一PCR扩增方案
引物名称 引物序列(5’→3’)
Pdcd1-E2E3-pF ATCTCTAGAGGATCCCCGGGTAC
Pdcd1-E2E3-pR CTCTGAAATGCAGAAGAACAAAGAGCT
Productsize 3538bp
Template Pdcd1-E2plasmid
片段二PCR扩增方案
片段三PCR扩增方案
3.2载体鉴定：
3.2.1PCR鉴定
Pdcd1-E2E3-KI donor PCR鉴定方案
引物名称 引物序列(5’→3’)
M13R GAGCGGATAACAATTTCACACAGG
Pdcd1-E2E3-seqF1 GACAGAATAGTAGCCTCCAGACC
Productsize 1887bp
PCR程序:95℃for 5min；然后30cycles of 95℃for 30s；58℃for 30s；72℃for1min；72℃for 5min。
图1为PCR鉴定Pdcd1-E2E3-KI载体的结果，泳道1-10为编号1-10样品，其中编号1/3/5/6/8鉴定为阳性。
3.2.2酶切鉴定
挑选PCR鉴定阳性的3号质粒做酶切鉴定，图2为酶切电泳图。
酶切条带大小：
ApaLI:3359,1246,497
KpnI:3641,1461
DL:DL2000Marker,2000,1000,750,500,200,100
T14:EcoT14I digest Marker,19329,7743,6223,4254,3472,2690,1882,1489
图2中，泳道3为3号质粒ApaLI酶切；泳道4为3号质粒KpnI酶切。酶切结果符合预期。
3.2.3测序验证
测序验证方案
引物名称 引物序列(5’→3’)
M13F GCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA
M13R GAGCGGATAACAATTTCACACAGG
Pdcd1-E2E3-seqF1 GACAGAATAGTAGCCTCCAGACC
Pdcd1-E2E3-seqR1 TGGCTGATGACCAGACCTCC
测序结果见图3。测序序列如下所示，其中，下划线部分第158-第1001bp为5端同源臂区域，第1686-第2565bp为3端同源臂区域测序区域，第1002-第1685bp为人源插入序列。测序结果表明载体构建成功。
TGGCAGCCCAGACAGAGTTGAGGCCAGAGCAGCTTCAAAGATGTCTTGGTGCCTGTTTCCTGTGTGCATGTCAGTCTCCTCTGGGTAAGGCCCACATGTGTGTGCTCAGCAAGTCTGTATTTCCTTGACCCTGAGCCTTCTGACCGTACCTACATACCCAACCGCACCTATATACCCGACCGCAGGTTCAACTGCTGACATCATATGGGTCCCAGTAGTGGGT ACTTTTGAGTGCTGGTGGAATGTTATGTGTTATGTGTCAGTGTGCATTTATGTGGCAAGAAGCTTGCCAGTGCGGCA GGCATTTCCTGAGAAGAGCCATGAGACCCTGCATGCTGCCTGACCCTGGCAGTACCACCCAGAACACTTTATTTGGG TGAGCCTAGACCTTCTGTCCACTTGAGAGACAATGACACAGCTGATCTTTGGAGGCTTCTTGCTGTGACCTCTGATC TGGCTGGAAGACATGACTGCTACCCTATGCCTTCTGCTACTCAGGGTAGCTCTGACATGCTTGGTGGGCTCCCTGGG ACAAAATACTGCCTGGACCCCAAGCTTACTAAAGAATCCACCCTCTCCAAGTCTGAGGTTTCCATGGAAACCCTACA CTCCCACCTCACTATCCCACTGACCCTTCAGACAGAACTAGGCTAGCCAACCAGAAGTCTAAGACTGGAACATTCAG GTCAGGCCTGGAACATCTTGAACAGGAGTGGGAAGGTAGAGACATCTTCGGGGAAAATATCCCAAAGTCTCAAAGGA CAGAATAGTAGCCTCCAGACCCTAGGTTCAGTTATGCTGAAGGAAGAGCCCTGCTTGTTGGAGGTTACTTATTCACA ACCTACAAGAAGCTACAAGCTCCTAGGTAGGGGGAACTGCTTACGATATTCTGCCCTGGAATGGGTCTGAGAGCACA TTCCTCTCCAGGGGGTTCAGAAAAGATGTCAGAAAGGGTGTACAGGCTCCTTCCTCACAGCTCTTTGTTCTTCTGCA TTTCAGAGTCCCCAGACAGGCCCTGGAACCCCCCCACCTTCTCCCCAGCCCTGCTCGTGGTGACCGAAGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCCTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCGGCACCTACCTCTGTGGGGCCATCTCCCTGGCCCCCAAGGCGCAGATCAAAGAGAGCCTGCGGGCAGAGCTCAGGGTGACAGGTGCGGCCTCGGAGGCCCCGGGGCAGGGGTGAGCTGAGCCGGTCCTGGGGTGGGTGTCCCCTCCTGCACAGGATCAGGAGCTCCAGGGTCGTAGGGCAGGGACCCCCCAGCTCCAGTCCAGGGCTCTGTCCTGCACCTGGGGAATGGTGACCGGCATCTCTGTCCTCTAGCTCTGGAAGCACCCCAGCCCCTCTAGTCTGCCCTCACCCCTGACCCTGACCCTCCACCCTGACCCCGTCCTAACCCCTGACCTTTGTGCCCTTCCAGAGAGAAGGGCAGAAGTGCCCACAGCCCACCCCAGCCCCTCACCCAGGCCAGCCGGCCAGT TTCAAGGCATGGTCATTGGTATCATGAGTGCCCTAGTGGGTATCCCTGTATTGCTGCTGCTGGCCTGGGCCCTAGCT GTCTTCTGCTCAACAAGTATGTCAGGTAAGGCTCATCATACCCTGCTTCTGTCCTGCCAAACCTTGTAGTCACTGTA CTTCACACATACGTAGATCACCAGAAGGGTGGTCATGCACCACACACACTCTGACCACTACAAAAGCCTGTGGCCGC CCCACCCACACCTAGCCTCAGGCTGCTGGCTTTCCTAAACAACTAGTGAGAGCTGCCACCTCCAGGAGGTCTGGTCA TCAGCCAGCTAAGAGGCCACAGCTAATATCTGCTACATGCCTACCCTGTGTTGTGGTACACCAGGAAAGGGGACACT GATGCACCTGTGCCTGTGGCAGGCCCTACTCCTCAATTCATTGTCCTACCAGGAACTCCCCGTTAGTAAATGGGAAG GGTGCCCGTGGGGATGGAAAGGCTGGTGCTTGCCCATGGTGTAGATCTCTTCAGTGCCTGACACGCCCCTCCTGAGC ACACAAAACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACGAGAGAGAAAGATGGAGAGACAGAGG GAGGACATTCCTCCACTAGGGAAGATGGCTCTGTAGCTGCCCTCTAACCCAAACTGTGTGTCTCAACAGAGGCCAGA GGAGCTGGAAGCAAGGACGACACTCTGGTGAGTATGAGTTTTCTTTCTTGAGTGATCTATCCCAGGCCACCCCCAGG TCTTGGTACAGGTAGAGAGACCATGGGGCCTACAGGGCTAGAGCCTGGAGAGCCCAGCTCCCATTTTCTACCAGGCC CCCAGAGCCATATCCTGTTGTTCCTCCCAGCAGCTGACCCCACTGTGTGTACCCCTGTCGTGTCCAACGTGGTCACGACTTGTTTTCTTCTGTGCAGAGACAAGGGGCAAAAGTCAAATTTTGGAATCCTAAACCCGCCAGGAAACATTTAACGATAGAAACTGGGCCAGAAACACGAGGCTGCACCCTAAATATCAAGAAGTCAATGGGGAGCCTATGGCCTCTGTGGGTTCTGTGCCTGGGCAGCTGTTAGGTCAGGTCCCAGCTTCCATGACTGAGG
3.2移植产物构建：
使用PCR方法对Pdcd1-E2E3-KI donor载体进行移植产物构建。最终对获得的移植产物测序验证。
Pdcd1-E2E3-KI移植产物PCR制备采用下表引物。
引物名称 引物序列(5’→3’)
Pdcd1-E2E3-final-ampF ACCCAACCGCACCTATATACCCG
Pdcd1-E2E3-final-ampR TGCTGGGAGGAACAACAGGATAT
Productsize 2410bp
Template Pdcd1-E2E3-KIdonor
Pdcd1-E2E3-KI移植产物测序验证采用下表引物
引物名称 引物序列(5’→3’)
Pdcd1-E2E3-seqF1 GACAGAATAGTAGCCTCCAGACC
Pdcd1-E2E3-seqR1 TGGCTGATGACCAGACCTCC
Pdcd1-E2E3-seqF2 CCTGCCAAACCTTGTAGTCAC
Pdcd1-E2E3-seqR2 GGAATGTGCTCTCAGACCCAT
4、移植注射获得阳性鼠
将移植产物、目的sgRNA、cas9蛋白注射到受精卵，移植至假孕小鼠。
获得阳性F0：对假孕生的仔鼠进行基因型鉴定，鉴定引物见下表，筛选成功插入正确人源片段的阳性鼠F0小鼠，鉴定结果见图4。
F0鉴定引物：
PCR反应条件
图4显示了Pdcd1-E2E3-KI-target鉴定结果，其中A图显示了Pdcd1-E2E3-KI-target 5’端鉴定结果，B图显示了Pdcd1-E2E3-KI-target 3’端鉴定结果。其中阴性对照为B6基因组DNA；水为空白对照，无模板的对照；DL：DL20002000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp。
阳性鼠F0与背景鼠配繁获得F1，对F1代鼠尾进行基因鉴定，F1代小鼠PCR实验结果见图5，获得小鼠编号如下：28#、29#、30#、32#、33#、35#、36#。F1大量扩繁后进行互配，获得纯合子。
图5显示了F1代Pdcd1-E2E3-KI-target鉴定电泳图，其中A图为Pdcd1-E2E3-KI-target 5’端鉴定结果，B图显示了Pdcd1-E2E3-KI-target 3’端鉴定结果。阴性对照为B6基因组DNA；水为空白对照，P为阳性鼠尾对照，BALB&B6为阴性鼠尾对照；DL：DL2000 2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp。
实施例2PD1人源化小鼠的PD1表达及功能验证
本实施例通过mRNA检测杂合子中人源PD1转录情况，而后通过流式细胞术分析杂合子及纯合子人源化基因的表达情况并对免疫细胞类群进行检查，经分析能够成功表达人源化基因，且未造成免疫系统明显异常的小鼠可供肿瘤药效实验。
1.mRNA测定
实验使用样品为人源化Pdcd153#♂(KI/wt)及BALB/c野生型54#♂(wt/wt)。提取53#、54#小鼠脾脏、胸腺RNA进行RT-PCR，对PCR产物测序以验证Pdcd1mRNA剪接是否正确。测序结果显示：53#的PCR产物检测到正确人源化mRNA。上述结果说明：人源化Pdcd1小鼠的嵌合mRNA剪接正常。
人源mRNA鉴定引物:
鼠源mRNA鉴定引物:
小鼠信息：
图6显示了hPD1mRNA及引物的示意图，可见引物(mouse Pdcd1-5RTF1、humanPdcd1-5RTR1)位于鼠源Pdcd1musExon1外侧、人源Pdcd1huExon3内，引物(Human Pdcd1-3RTF1、mouse Pdcd1-3RTR1)位于人源Pdcd1huExon2、鼠源Pdcd1musExon5内，以脾脏、胸腺RNA的反转录cDNA为模板扩增，如果Pdcd1mRNA正确剪接，则出现的目的条带，野生型B6无目的条带。将目的条带切胶送测序。
在扩增时使用的PCR反应体系和反应程序如下：
PCR体系
试剂 体积(ul)
2×Primer Star Max 25
ddH2O 22
primerF 1
primerR 1
Template 1
PCR程序：
PCR产物的电泳图如图7所示，测序图如图8所示。
图7中，A图为huPdcd1和mus pdcd1mRNA的5`end PCR，引物为mouse Pdcd1-5RTF1、human Pdcd1-5RTR1。泳道1/2为huPdcd1mRNA的5`end PCR，泳道4/5为mus pdcd1mRNA的5`end PCR；B图为huPdcd1和mus pdcd1mRNA的3`end PCR，引物为Human Pdcd1-3RTF1、mousePdcd1-3RTR1。泳道1/2为huPdcd1mRNA的3`end PCR，泳道4/5为mus pdcd1mRNA的3`endPCR；C图为huPdcd1和mus pdcd1mRNA全长PCR，引物为mouse Pdcd1-5RTF1、mouse Pdcd1-3RTR1。泳道1/2为huPdcd1mRNA的全长PCR，泳道4/5为mus pdcd1mRNA的全长PCR。注：图中箭头标出的为测序的目的片段；DL为Marker DL2000，条带：2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp。
图8测得序列为人源化PD1mRNA序列，如下序列所示。其中第53-128位mouse Exon1区域；第129-488位为human Exon2区域；第489-547位为human Exon3区域；第548-650位为mouse Exon3区域。测序结果表明人源化PD1构建成功。
gaggaggaagaggagactgctactgaaggcgacactgccaggggctctgggcatgtgggtccggcaggtaccctggtcattcacttgggctgtgctgcagttgagctggcaatcagggtggcttctagagtccccagacaggccctggaacccccccaccttctccccagccctgctcgtggtgaccgaaggggacaacgccaccttcacctgcagcttctccaacacatcggagagcttcgtgctaaactggtaccgcatgagccccagcaaccagacggacaagctggccgccttccccgaggaccgcagccagcccggccaggactgccgcttccgtgtcacacaactgcccaacgggcgtgacttccacatgagcgtggtcagggcccggcgcaatgacagcggcacctacctctgtggggccatctccctggcccccaaggcgcagatcaaagagagcctgcgggcagagctcagggtgacagagagaagggcagaagtgcccacagcccaccccagcccctcacccaggccagccggccagtttcaaggcatggtcattggtatcatgagtgccctagtgggtatccctgtattgctgctgctggcctgggccctagctgtcttctgctcaacaagtatgtcagaggccagaggagctggaagcaaggacgacactctgaaggaggagccttcagcagcacctgtccctagtgtggcctatgaggagctggacttccagggacgagagaagacaccagagctccct
2.蛋白表达检测
选取PD1主要表达组织胸腺或脾脏，剪取PD1纯合小鼠和BALB/c背景鼠胸腺或脾脏，将组织研磨消化成单个细胞。
(1)免疫细胞流式检测方法：
取材：对PD1纯合小鼠和BALB/c背景鼠(见小鼠信息列表)眼眶采血100ul至1.5mLEP管；剪取脾脏和胸腺组织，称重，置于C型管。
消化：外周血室温避光裂红，用FACS buffer洗涤1次；脾脏与胸腺使用酶消化液(PBS含Ca,Mg+2％CS+10mM HEPES+30ugDNase+1.75mg胶原酶D)，37℃，消化30min。室温裂解红细胞，加FACS buffer混匀。
抗体孵育：加入hPD-1,mPD-1抗体，冰上避光孵育1h；FACS buffer洗涤，加入FACSbuffer，上机检测。上样前5min添加Sytoxblue(终浓度1:10000稀释)，区分死活细胞。
检测结果：使用人源抗PD1抗体及鼠源抗PD1抗体，通过流式细胞仪检测PD1纯合小鼠和背景鼠中表达人源和鼠源PD1T-cell情况，背景鼠中未检测到人源PD1表达，而PD1纯合小鼠中仅能检测到人源PD1表达，与对照组小鼠PD1相比，人源PD1表达水平与其基本一致(见图9-图10)，表明本方法制备得到的PD1基因修饰人源化小鼠可成功表达PD1蛋白，且表达水平达到普通小鼠水平。我们在杂合PD1小鼠中既检测到人源PD1表达，也同步检测到共表达鼠源PD1。
小鼠信息及脾脏重量
3.免疫系统验证
选取PD1主要表达组织胸腺或脾脏，剪取PD1纯合小鼠和BALB/c背景鼠胸腺或脾脏(小鼠信息同上)，将组织研磨消化成单个细胞，用鼠源T\B\NK表面抗体对组织细胞胞外蛋白进行染色，用PBS清洗细胞后，进行流式细胞检测T(CD4+、CD8+)、B、NK细胞数量。
免疫细胞流式检测方法：
取材：剪取PD1纯合小鼠、PD1杂合鼠、BALB/c背景鼠脾脏称重，置于C型管。
消化：使用酶消化液(PBS含Ca,Mg+2％CS+10mM HEPES+30ugDNase+1.75mg胶原酶D)，37℃，消化30min。室温裂解红细胞，加FACS buffer混匀。
抗体孵育：加入CD3,CD4,CD8,CD19,CD335,IgM,B220抗体，冰上避光孵育1h；FACSbuffer洗涤，加入FACS buffer，上机检测。上样前5min添加Sytoxblue(终浓度1:10000稀释)，区分死活细胞。
检测结果：参见图11，BALB/c-hPD1纯合小鼠各T、B、NK各免疫细胞数量与BALB/c背景鼠基本无差别。以上数据表明hPD1参与到了小鼠的免疫应答过程，PD1人源化修饰小鼠免疫系统正常，与普通背景鼠相较无差异。
4.hPD1人源化小鼠评价PD1抑制剂抗肿瘤药效验证
体外数据已验证PD1人源化小鼠可正常表达PD1蛋白，且该蛋白在小鼠体内的免疫应答显示正常。但该小鼠是否能用于评价PD1抗癌药实际疗效仍有待验证，因此我们选取已被广泛应用于作用在PD1/PDL1信号通路的实体瘤治疗药物Keytruda(Merck&Co)进行BALB/c-hPD1体内药效验证。
4.1PD1抑制剂评价MC38-hPD1小鼠模型
选取4-6w BALB/c-hPD1纯合小鼠(同性别)，皮下接种小鼠结肠癌细胞CT26，待肿瘤体积约150±50mm3后随即分为对照组和治疗组。治疗组腹腔注射10mg/kg的抗人PD-1抗体keytruda，对照组注射相同体积的空白溶剂PBS；给药频次为2d/次，给药4次，之后3d/次，给药3次。(给药方案见下表)给药终点，将小鼠处死，取小鼠外周血、脾脏及肿瘤组织，进行免疫细胞流式检测。
给药方案
具体步骤：
1)CT26.WT细胞培养
复苏细胞：液氮罐中取出，于37℃水浴锅中迅速解冻，接种在15cm dish中培养。
传代：CT26.WT属于贴壁细胞，通常情况下，每2-3天需要进行一次传代。
2)皮下注射CT26.WT细胞
收集细胞，1000rpm离心5min，弃去上清，用10ml无钙镁离子的PBS洗2次。用无钙镁PBS重悬细胞，调整细胞终浓度为5×106/ml。皮下注射，将100uL CT26.WT细胞注射到小鼠右侧背部，大腿上方。
3)接CT26.WT细胞10天后，肿瘤平均体积为150mm3，将小鼠分为5组，开始药效实验。
4)将Anti-PD1抗体药用PBS配置成浓度为1mg/mL，按10ul/g体重腹腔注射；对照组注射PBS，2d/次给4次后，调整为3d/次再给药3次。
5)每周三次监测肿瘤大小、体重。实验终点各取3只取肿瘤称重，流式检测肿瘤中免疫细胞。
免疫细胞流式检测方法：
取材：剪取肿瘤组织，称重，置于C型管。
消化：外周血室温避光裂红，用FACS buffer洗涤1次；脾脏与肿瘤使用酶消化液(PBS含Ca,Mg+2％CS+10mM HEPES+30ugDNase+1.75mg胶原酶D)，37℃，消化30min。室温裂解红细胞，加FACS buffer混匀。
抗体孵育：加入CD3,CD4,CD8,CD19,CD335,IgM,B220抗体，冰上避光孵育1h；FACSbuffer洗涤，加入FACS buffer，上机检测。上样前5min添加Sytoxblue(终浓度1:10000稀释)，区分死活细胞。
实验结果
1)小鼠体重变化
图12显示了荷瘤小鼠的治疗组和对照组的体重变化情况。可见小鼠体重整体缓慢增长，治疗组小鼠与对照组体重变化趋势相似。。
2)肿瘤生长曲线
图13显示了荷瘤小鼠的治疗组和对照组的肿瘤生长曲线。可见，在细胞接种后7d第一次给药，给药4次后表现出抑制作用。连续给药7次后，给药组肿瘤生长显著抑制。
3)肿瘤重量对比
与对照组相比，Keytruda药物治疗组肿瘤重量显著减小(1.4724下降到0.5808)。
从实验结果看：
使用human-PD1抑制剂keytruda能够在人源化PD-1的小鼠体内发挥作用，抑制肿瘤生长，瘤重减小。结果表明BALB/c-hPD1小鼠可用于PD1人源抗体评价。
4)肿瘤组织免疫细胞检测(TILs)
I.肿瘤中免疫细胞分类流式图
图14显示了荷瘤小鼠的治疗组和对照组的肿瘤免疫细胞分类流式图。
II.肿瘤细胞分类结果统计
从实验结果看：
人源化PD-1小鼠接CT26.WT荷瘤之后，与对照组相比，Keytruda给药组外周血、脾脏中T/B/NK无明显差异。
4.2MC38-hPD1小鼠模型用于PD1抑制剂与ENT联用评价
PD1抗体药对于CT26肿瘤细胞系按标准疗法(10mg/kg，3d给1次，共给6次)响应并不显著。Entinostat(Ent)是一类组蛋白去乙酰化酶抑制剂，该药物可通过增加细胞内组蛋白的乙酰化程度，调控细胞凋亡及分化相关蛋白的表达和稳定性，诱导细胞凋亡及分化，从而抑制肿瘤生长。临床上已有PD1与该药物联用治疗的案例，例如与默沙东的Keytruda联合治疗非小细胞肺癌、黑色素瘤；与辉瑞的aromasin联合治疗乳腺癌；与Opdivo和Vidaza联合治疗非小细胞肺癌等。因此，我们选取化疗药物Ent与Keytruda联合给药，检测其在CT26-BALB/c-hPD1小鼠上的肿瘤抑制效果。
选取4-6w BALB/c-hPD1纯合小鼠(同性别)，皮下接种小鼠结肠癌细胞CT26，待肿瘤体积约150±50mm3后随即分为4个对照组或治疗组。治疗组分别腹腔注射10mg/kg抗人PD-1抗体keytruda，20mg/kg化药Ent，keytruda与ENT联用，对照组注射相同体积的空白溶剂；给药频次为3d/次，给药6次。(给药方案见下表)
给药方案
实验结果
1)小鼠体重变化
图15显示了荷瘤小鼠的各种治疗组和对照组的小鼠体重变化。可见，小鼠体重整体缓慢增长，与对照组相比，各治疗组小鼠体重略轻。
2)肿瘤生长曲线
图16显示了荷瘤小鼠的各种治疗组和对照组的肿瘤生长曲线。可见，在细胞接种后10d第一次给药，给药4次后表现出抑制作用。keytruda、ENT单独使用对肿瘤生长有一定的抑制作用，keytruda+ENT联合用药组抑制作用最显著，5/9肿瘤完全消退。
3)TGI(Tumor growth inhibition value)统计
3days after last treatment TGI(based on RTV) TGI(based on TV)
Keytruda 50.04％ 47.26％
ENT 47.40％ 49.97％
Keytruda+ENT 97.18％ 97.08％
keytruda、Ent单独给药对肿瘤生长有一定的抑制作用，TGI达到40％keytruda+ENT联合用药组抑制作用极其显著，TGI高达90％。
结果显示：
抗人PD1抑制剂keytruda和化疗药物Entinostat联合用药组与单独用药组相比表现出更为显著的肿瘤抑制效果，证明BALB/c-hPD1小鼠也是评估PD1抑制剂与化药联合用药体内药效的有力工具。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
序列表
<110> 江苏集萃药康生物科技有限公司
<120> 一种PD1人源化BALB/c小鼠模型的构建方法及其应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 1
gccttctggt ttgggcga 18
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 2
gacctccagg gcccatt 17
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 3
atctctagag gatccccggg tac 23
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 4
ctctgaaatg cagaagaaca aagagct 27
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 5
ccatgccttg aaactggccg gctggcctgg gtga 34
<210> 6
<211> 46
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 6
ctctttgttc ttctgcattt cagagtcccc agacaggccc tggaac 46
<210> 7
<211> 38
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 7
ccagccggcc agtttcaagg catggtcatt ggtatcat 38
<210> 8
<211> 46
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 8
gtacccgggg atcctctaga gattgctggg aggaacaaca ggatat 46
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 9
gagcggataa caatttcaca cagg 24
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 10
gacagaatag tagcctccag acc 23

Claims (11)

1.一种人源化小鼠PD1基因的核酸序列，其特征在于，该核酸序列编码的蛋白含有人PD1蛋白的功能域，其是将小鼠PD1基因的外显子2-3的编码区替换为人PD1基因的外显子2-3，保留了小鼠PD1跨膜区及胞内区。
2.包含权利要求1所述核酸序列的载体。
3.权利要求1所述的核酸序列或权利要求2所述的载体在制备PD1基因修饰人源化的动物模型中的用途。
4.一种制备PD1人源化BALB/c小鼠模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建表达针对BALB/c小鼠PD1基因的sgRNA的质粒；
(2)构建人源化PD1基因的载体；
(3)将步骤(1)所述质粒体外转录获得的sgRNA与步骤(2)的载体以及Cas9mRNA或Cas9蛋白注射至鼠受精卵细胞质或细胞核中，移植入受体母鼠生产PD1基因修饰人源化鼠模型；
所述载体能够将鼠源PD1基因的外显子2-3的编码区替换为人源PD1基因的外显子2-3，保留了小鼠PD1跨膜区及胞内区。
5.如权利要求4所述的方法，其中针对鼠源PD1基因的sgRNA的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO:2所示。
6.如权利要求4或5所述的方法，其中步骤(2)中构建载体的过程如下：分别扩增三条片段，片段1为外显子2端的同源臂、人的部分Exon2序列及载体骨架，片段2为人的外显子2的其余部分和外显子3，片段三为外显子3端的同源臂，然后将三条片段按顺序连接，构建人源化PD1基因的载体。
7.如权利要求6所述的方法，扩增片段1使用的引物为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，扩增片段2使用的引物为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，扩增片段3使用的引物为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
8.如权利要求6所述的方法，在构建载体后还进一步包括对载体进行PCR鉴定、酶切鉴定、测序鉴定的步骤，其中PCR鉴定时使用的引物为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。
9.如权利要求4或5所述的方法，进一步包括利用引物鉴定所述动物模型的基因型或者mRNA的步骤。
10.权利要求1所述的核酸序列、权利要求2所述的载体或者权利要求4－9任一种所述的方法在评估靶向PD1的药物有效性、PD1靶向药物筛选开发、PD1靶向药物联合其他药物抗肿瘤药效评价、或PD1靶向药物的毒理研究中的应用。
11.特异性靶向小鼠PD1基因的sgRNA，其序列如SEQ ID NO:1和SEQID NO:2所示。
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