CN107109421A - Car表达载体及car表达t细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于，提供在T细胞中既表达嵌合抗原受体(CAR)并且还表达T细胞的免疫功能促进因子的CAR表达T细胞、用于制备所述CAR表达T细胞的CAR表达载体，所述CAR表达T细胞的免疫诱导效果和抗肿瘤活性高。本发明中，制造了下述CAR表达载体和导入了所述CAR表达载体的CAR表达T细胞，所述CAR表达载体含有编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸及编码T细胞的免疫功能促进因子的核酸，其中，所述编码免疫功能促进因子的核酸为：编码白细胞介素7的核酸及编码CCL19的核酸、编码针对SHP‑1的显性负性突变体的核酸、或编码针对SHP‑2的显性负性突变体的核酸。

Description

CAR表达载体及CAR表达T细胞
技术领域
本发明涉及CAR表达载体、导入了CAR表达载体的CAR表达T细胞、含有CAR表达T细胞的抗癌剂。
背景技术
嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，以下也称为“CAR”)是将识别癌细胞的细胞表面抗原的单链抗体与诱导T细胞活化的信号转导区融合而得到的人工嵌合蛋白质。如图1所示，通过向不具有肿瘤反应性的通常的末梢血T细胞(末梢血T淋巴细胞)导入编码CAR的基因，从而得以能够大量地制备能够表达CAR的CAR表达T细胞(以下，也简称为“CAR-T细胞”)。该CAR-T细胞具有肿瘤反应性，能够不依赖与主要组织相容性基因复合体(MHC)的相互作用而导致癌细胞的损伤。
利用CAR-T细胞的施予的癌症免疫疗法(更具体而言、从患者采集T细胞、将编码CAR的基因导入所述T细胞进行扩增、然后再次植入患者的疗法(参见非专利文献1))，目前正在全世界开展临床试验，在白血病、淋巴瘤等造血系统恶性肿瘤等中得到了呈现有效性的结果。
近年来，进行了各种CAR-T细胞的研究。例如，提出了：含有经修饰的自体人T细胞的医药组合物，所述自体人T细胞含有编码由CD19抗原结合区、跨细胞膜区、4-1BB共同刺激信号区、和CD3ζ信号区组成的CAR的核酸(参见专利文献1)；表达1种或多种在治疗上有效的抗标签(tag)嵌合抗原受体(AT-CAR)的T细胞群，其和能与癌细胞结合并且带有1个或多个标签的蛋白质的配合物同时或分别地施予至受试体，并与所述带有标签的蛋白质结合，诱导癌细胞死亡(参见专利文献2)；含有编码包含人抗体139的抗原结合结构域、细胞外铰链结构域、跨细胞膜结构域、及细胞内T细胞信号转导结构域的嵌合抗原受体的核酸的细胞(参见专利文献3)；含有编码嵌合抗原受体的核酸序列的细胞，其中，所述该嵌合抗原受体包含抗原结合结构域、跨细胞膜结构域、共同刺激信号转导区及含有SEQ ID NO：24的氨基酸序列的CD3ζ信号转导结构域(参见专利文献4)；由基因工程制备的CD19特异性T细胞，其中，在细胞表面膜上表达及保有CD19特异性嵌合受体，所述嵌合受体由用于实现免疫细胞的效应器功能的细胞内信号结构域、至少1个跨细胞膜结构域及至少1个细胞外结构域组成，细胞外结构域包含CD19特异性受体(参见专利文献5)；导入了编码嵌合抗原受体的核酸的嵌合抗原受体表达细胞，所述嵌合抗原受体含有糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)的细胞内结构域作为细胞内结构域(参见专利文献6)。
然而，迄今为止的技术中，下述问题尚未解决：CAR-T细胞在生物体内的存活效率较低，或者由CAR-T细胞诱导的内源性T细胞的活化、向肿瘤局部的蓄积不充分的问题；CAR-T细胞的活性被经由PD-L1/PD-1途径(其为癌细胞具有的肿瘤免疫逃逸机制)的免疫抑制信号及癌症微环境中分泌的TGF-β、IL-10等免疫抑制因子抑制的问题。因此，存在无法呈现充分的治疗效果的癌症种类、病例，需要制备更有效的CAR-T细胞、及用于制备所述CAR-T细胞的表达载体。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利申请公开第2014/0106449号说明书
专利文献2：日本特表2014-504294号公报
专利文献3：日本特表2014-516510号公报
专利文献4：日本特表2014-507118号公报
专利文献5：日本特开2011-004749号公报
专利文献6：国际公开第2013/051718号小册子
非专利文献
非专利文献1：中泽洋三信州医志(日文：中沢洋三信州医誌)61(4)：197～203(2013)
发明内容
在以往的CAR-T细胞中，实施了通过使CAR的信号转导区中含有CD28、4-1BB、CD3ζ等来提高T细胞的激活性能的措施，但利用CAR-T细胞的内源性T细胞的免疫诱导效果、对于肿瘤微环境中的免疫抑制机制的抵抗性没有被充分地强化，利用CAR-T细胞的治疗尚未对实体癌获得效果。因此，本发明的课题在于，提供免疫诱导效果和抗肿瘤活性高的CAR-T细胞、及用于制备该CAR-T细胞的CAR表达载体，所述CAR-T细胞在T细胞中既表达CAR同时还表达T细胞的免疫功能促进因子。
用于解决课题的手段
本申请的发明人基于在利用了CAR-T细胞的癌症免疫疗法中达成更优异的免疫诱导效果、抗肿瘤活性的目的，尝试了CAR-T细胞的改良。在此过程中，着眼于作为促进T细胞的免疫功能的因子的细胞因子、趋化因子、信号调控蛋白，构建了既表达CAR同时还表达上述促进T细胞的免疫功能的因子的载体。将所述表达载体导入T细胞，结果发现，可制备具有较之以往的CAR-T细胞而言更优异的免疫诱导效果、抗肿瘤活性的CAR-T细胞，从而完成了本发明。
即，本发明涉及下文公开的内容。
(1)CAR表达载体，其含有编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸及编码T细胞的免疫功能促进因子的核酸，其特征在于，所述编码所述免疫功能促进因子的核酸为：编码白细胞介素7的核酸及编码CCL19的核酸、编码针对SHP-1的显性负性突变体的核酸、或编码针对SHP-2的显性负性突变体的核酸。
(2)如上述(1)所述的CAR表达载体，其特征在于，编码免疫功能促进因子的核酸为编码白细胞介素7的核酸及编码CCL19的核酸。
(3)如上述(2)所述的CAR表达载体，其特征在于，编码CAR的核酸与编码T细胞的免疫功能促进因子的核酸介由编码自切割肽(self-cleavage)的序列连接。
(4)如上述(2)或(3)所述的CAR表达载体，其特征在于，编码白细胞介素7的核酸与编码CCL19的核酸介由编码自切割肽的序列连接。
(5)如上述(1)～(4)中任一项所述的CAR表达载体，其特征在于，编码CAR的核酸含有编码下述单链抗体的多肽的核酸，所述单链抗体识别FITC或CD20。
(6)如上述(1)～(5)中任一项所述的CAR表达载体，其特征在于，编码CAR的核酸含有编码CD8的跨细胞膜区的多肽的核酸。
(7)如上述(1)～(6)中任一项所述的CAR表达载体，其特征在于，编码CAR的核酸含有编码CD28的细胞内区、4-1BB的细胞内区、及CD3ζ的细胞内区的多肽的核酸。
(8)CAR表达T细胞，其中导入了以下(a)或(b)所示的载体：
(a)上述(1)～(7)中任一项所述的CAR表达载体；
(b)含有编码CAR的核酸及编码白细胞介素7的核酸的CAR表达载体、和含有编码CAR的核酸及编码CCL19的核酸的CAR表达载体；
(9)抗癌剂，其含有上述(8)所述的CAR表达T细胞和药学上允许的添加剂。
发明的效果
通过使用本发明的CAR表达载体，能够制造兼具存活能力、淋巴细胞蓄积能力、肿瘤细胞损伤活性的CAR-T细胞、对于癌症微环境中的免疫抑制具有抵抗性的CAR-T细胞。通过利用上述CAR-T细胞实施针对癌症患者的免疫疗法，从而能够获得可期待强效的癌症治疗效果、对于难治性·进行性的癌症仍然有效的癌症免疫疗法。
附图说明
图1是表示CAR的结构及利用CAR-T细胞的癌症免疫疗法的基本体系的图。
图2是表示表达CAR、白细胞介素7(IL-7)及CCL19的载体的图。
图3是表示通过流式细胞术对抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞中的CAR表达水平进行确认的结果-1的图。左侧为CAR未染色、右侧为CAR染色。
图4是表示通过流式细胞术对抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞中的CAR表达水平进行确认的结果-2的图。
图5是表示通过流式细胞术对抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞中的CAR表达水平进行确认的结果的图。
图6是表示通过ELISA对抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的细胞上清液中的IL-7及CCL19的浓度进行测定的结果-1的图。
图7是表示通过ELISA对抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的细胞上清液中的IL-7及CCL19的浓度进行测定的结果-2的图。
图8是表示通过ELISA对抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的细胞上清液中的IL-7及CCL19的浓度进行测定的结果的图。
图9是表示刺激抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞、培养3天、5天、7天后的细胞数量的图。
图10是表示刺激抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞、培养3天、5天、7天后的存活率的图。
图11是表示刺激抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞、培养5天后的细胞数量的图。
图12是表示对抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞进行的T细胞迁移试验的结果-1的图。
图13是表示对抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞进行的T细胞迁移试验的结果-2的图。
图14是表示对抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞进行的树突细胞迁移试验的结果的图。
图15是表示抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞进行的T细胞迁移试验的结果的图。
图16是表示对抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的T细胞增殖能力进行研究的结果(刺激后第5天)的图。
图17是表示对抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的T细胞增殖能力进行研究的结果(刺激后第3天、第7天)的图。
图18是表示对抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞中的CD127表达进行研究的结果的图。
图19是表示对抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞中的CCR7表达进行研究的结果的图。
图20是表示对将抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞施予至荷癌小鼠的情况下的肿瘤体积变化进行研究的结果的图。
图21是表示对将抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞施予至荷癌小鼠的情况下的小鼠存活率进行研究的结果的图。
图22是表示对向在皮下接种P815-hCD20后施予环磷酰胺的小鼠施予了抗人CD20CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的情况下的小鼠存活率进行研究的结果的图。
图23是表示对向在皮下接种P815-hCD20后施予环磷酰胺的小鼠施予了抗人CD20CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的情况下的小鼠的肿瘤体积进行研究的结果的图。
图24是将图23中的CPA+7×19的图的纵轴的数值缩小至1/10而得到的图。
图25是表示将向皮下接种了P815-hCD20的小鼠施予了抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的情况下的肿瘤组织进行H&E染色并观察的结果的图。
图26是表示向皮下接种了P815-hCD20的小鼠施予了抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的情况下的肿瘤组织进行免疫组织化学分析而得到的结果的图。
图27表示对图26中的利用荧光染色标记的阳性区域进行定量而得到的结果的图。
图28是表示对向皮下接种了P815-hCD20的小鼠施予了抗人CD20 CAR-IL-7表达T细胞、抗人CD20 CAR-CCL19表达T细胞、或抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的情况下的肿瘤体积进行研究的结果的图。
图29(a)是表示表达CAR和SHP1(含有2个Src同源区的磷酸酶-1，Src homologyregion 2domain-containing phosphatase-1，)的显性负性突变体的载体的图。(b)是表示表达CAR和SHP2(含有2个Src同源区的磷酸酶-2，Src homology region 2domain-containing phosphatase-2)的显性负性突变体的载体的图。
图30(a)是表示对抗人CD20 CAR-SHP1DN表达T细胞进行细胞损伤活性试验得到的结果的图。(b)是表示对抗人CD20 CAR-SHP2DN表达T细胞进行细胞损伤活性试验得到的结果的图。
图31是表示将P815-hCD20和抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞在FITC缀合利妥昔单抗(rituximab)的存在下混合、对肿瘤细胞损伤活性进行调查的结果的图。
图32是表示将P815-hCD20和抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞混合而对肿瘤细胞损伤活性进行调查的结果的图。
图33是表示向皮下接种了P815-hCD20的小鼠施予抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞，针对白细胞表面的表型，通过流式细胞术分析CD4、CD8、CD44、CD62L而得到的结果的图。
图34是表示将脾脏的白细胞与用丝裂霉素C处理的P815-hCD20共同培养4天进行刺激，用流式细胞术对T细胞的增殖进行调查的结果的图。
具体实施方式
本发明的CAR表达载体含有编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸及编码T细胞的免疫功能促进因子的核酸，对于该CAR表达载体而言，只要所述编码免疫功能促进因子的核酸是编码白细胞介素7的核酸及编码CCL19的核酸、编码针对SHP-1的显性负性突变体的核酸、或编码针对SHP-2的显性负性突变体的核酸则没有特别限制，所谓嵌合抗原受体，是指将识别癌细胞的细胞表面抗原的单链抗体和诱导T细胞的活化的信号转导区介由跨细胞膜区融合而得到的人工嵌合蛋白质。
本发明中，作为编码CAR的核酸，只要是编码构成CAR的多肽的核酸则没有特别限制，包括编码识别癌细胞的细胞表面抗原的单链抗体、跨细胞膜区、及诱导T细胞的活化的信号转导区的多肽的核酸。
作为CAR中的单链抗体，可举出来自单克隆抗体的抗原结合位点的轻链可变区及重链可变区(scFv)组成、且在轻链可变区与重链可变区之间具有接头(linker)肽的寡肽或多肽。
作为上述单链抗体识别的癌细胞的细胞表面抗原，可以是针对癌细胞及其前体细胞特异性表达的生物体分子、由于细胞的癌化而新确认到表达的生物体分子、或在癌细胞中与正常细胞相比表达水平升高的生物体分子，可举出CD20、EGFR、FITC、CD19、CD22、CD33、PSMA、GD2、EGFRvariant、ROR1、c-Met、HER2、CEA、间皮素(mesothelin)、GM2、CD7、CD10、CD30、CD34、CD38、CD41、CD44、CD74、CD123CD133、CD171、MUC16、MUC1、CS1(CD319)、IL-13Ra2、BCMA、LewisY、IgGkappa链、叶酸受体-α、PSCA、EpCAM。
T细胞活化信号转导区是在上述单链抗体识别癌细胞的细胞表面抗原时能够向细胞内转导信号的区域，优选含有选自CD28、4-1BB(CD137)、GITR、CD27、OX40、HVEM、CD3ζ、FcReceptor-associatedγchain的细胞内区的多肽中的至少1种或2种以上，更优选含有CD28、4-1BB、及CD3ζ这3种的细胞内区的多肽。
各细胞内区的多肽可以介由含有2～10个氨基酸的寡肽接头或多肽接头被连接，作为所述接头序列，可举出甘氨酸-丝氨酸连续序列。
作为本发明中的跨细胞膜区，可举出来自CD8、T细胞受体的α、β链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、GITR的跨细胞膜区的多肽，可优选举出人CD8跨细胞膜区的多肽。介由该跨细胞膜区，CAR被固定于T细胞的细胞膜。
在上述跨细胞膜区中，可含有由任意的寡肽或多肽组成、长度为1～100氨基酸、优选为10～70氨基酸的铰链区。作为铰链区，可举出人CD8的铰链区。
另外，在识别癌细胞的细胞表面抗原的单链抗体与跨细胞膜区、跨细胞膜区与T细胞活化信号转导区之间，可设置由任意的寡肽或多肽组成的间隔区。作为间隔区的长度，可举出1～100个氨基酸，优选为10～50个氨基酸，作为该间隔区，可举出甘氨酸-丝氨酸连续序列。
本发明中，作为编码T细胞的功能促进因子的核酸，只要是编码IL-7的核酸及编码CCL19的核酸(以下，也称为“本申请的核酸1”)、编码针对SHP-1的显性负性突变体的核酸(以下，也称为“本申请的核酸2”)、或编码针对SHP-2的显性负性突变体的核酸(以下，也称为“本申请的核酸3”)则没有特别限制，可含有复数的上述本申请的核酸1～3的各核酸，具体而言，可以是含有本申请的核酸1及本申请的核酸2、本申请的核酸1及本申请的核酸3、本申请的核酸2及本申请的核酸3、本申请的核酸1及本申请的核酸2及本申请的核酸3的核酸。
需要说明的是，作为本申请的核酸1中的编码IL-7的核酸及编码CCL19的核酸，含有编码IL-7的核酸和编码CCL19的核酸即可，相对于编码IL-7的核酸而言，编码CCL19的核酸可配置在上游，也可配置在下游。
作为编码针对SHP1的显性负性突变体的核酸，只要是编码显性作用于SHP1、且能够阻碍SHP1的作用的SHP1突变体的核酸则没有特别限制，可举出编码下述突变体的核酸，所述突变体含有SHP1的氨基酸序列中的至少1个氨基酸被其他的氨基酸取代而得到的氨基酸序列、且能够阻碍SHP1的作用。另外，作为编码针对SHP2的显性负性突变体的核酸，只要是编码显性作用于SHP2、且能够阻碍SHP2的作用的SHP2突变体的核酸则没有特别限制，可举出编码下述突变体的核酸，所述突变体含有SHP2的氨基酸序列中的至少1个氨基酸被其他的氨基酸取代而得到的氨基酸序列、且能够阻碍SHP2的作用。
本发明的CAR表达载体中，在编码嵌合抗原受体的核酸与编码T细胞的免疫功能促进因子的核酸之间、含有复数条本申请的核酸1、本申请的核酸2、本申请的核酸3的情况下的各核酸之间、本申请的核酸1中的编码IL-7的核酸与编码CCL19的核酸之间，只要能够使各核酸表达，则可含有任意的核酸，优选介由编码自切割肽(2A肽)、或IRES(内部核糖体进入位点，internal ribozyme entry site)的序列、优选为编码2A肽的序列而连接。通过利用上述序列进行连接，能够使各核酸效率良好地表达。
所谓2A肽，是指来自病毒的自切割肽，其特征在于，在内质网中，序列号1表示的氨基酸序列中的G-P之间(距C末端1残基的位置)被切割(Szymczak et al.,ExpertOpin.Biol.Ther.5(5):627-638(2005))。因此，隔着2A肽而组入其前后的核酸在细胞内彼此独立地表达。
作为上述2A肽，优选为来自小核糖核酸病毒、轮状病毒、昆虫病毒、口蹄疫病毒或锥虫病病毒的2A肽，更优选为序列号2所示的来自小核糖核酸病毒的2A肽(F2A)。
对于编码嵌合抗原受体的核酸而言，可基于编码针对癌细胞的细胞表面抗原的单链抗体、跨细胞膜区、及T细胞激活信号转导区的多肽的碱基序列，利用化学合成的方法、通过PCR进行扩增的方法等已知的技术进行制备。需要说明的是，可对选择用于编码氨基酸的密码子进行改造，从而优化核酸在目标宿主细胞中的表达。
编码针对癌细胞的细胞表面抗原的单链抗体、跨细胞膜区、及T细胞激活信号转导区的多肽的碱基序列的信息可通过检索已知的文献、NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)等数据库而适当获得。
例如，编码T细胞激活信号转导区中的CD28、4-1BB、及CD3ζ的跨细胞膜区的多肽的碱基序列的信息可通过检索NCBI等数据库而适当获得，对于人CD28而言，可列举注册为Genbank编号：NM＿006139.2(更新日：2014年5月10日)的序列，对于人4-1BB而言，可列举注册为Genbank编号：NM＿001561.5(更新日：2014年3月16日)的序列，对于人CD3ζ而言，可列举注册为Genbank编号：NM＿000734.3(更新日：2014年8月12日)的序列。
另外，编码人CD8的跨细胞膜区的多肽的碱基序列的信息可通过检索NCBI等数据库而适当获得，可列举注册为Genbank编号：NM＿001768.6(更新日：2014年5月10日)的序列。
此外，对于编码单链抗体的多肽的碱基序列的信息而言，可制备识别靶细胞表面抗原的单克隆抗体，用Edman法等已知的方法确定该单克隆抗体的氨基酸序列，基于该氨基酸序列获得信息。作为单克隆抗体的制备方法，可举出使用杂交瘤进行制备的方法、利用基因工程手段通过含有抗体基因的表达载体将宿主转化进行制备的方法、通过将转基因动物用所期望的抗原免疫进行制备的方法。
作为编码T细胞的免疫功能促进因子的核酸，编码IL-7的核酸及编码CCL19的核酸、编码针对SHP-1的显性负性突变体的核酸、或编码针对SHP-2的显性负性突变体的核酸可基于各核酸的碱基序列，利用化学合成的方法、通过PCR进行扩增的方法等已知的技术进行制备。需要说明的是，可对选择用于编码氨基酸的密码子进行改造，从而优化核酸在目标宿主细胞中的表达。
编码IL-7的核酸及编码CCL19的核酸、编码针对SHP-1的显性负性突变体的核酸、或编码针对SHP-2的显性负性突变体的核酸的信息可通过检索已知的文献、NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)等数据库而适当获得。
作为编码IL-7的核酸，可根据导入本发明的CAR表达载体的细胞的种类而适当选择，例如，可举出编码人IL-7的氨基酸序列(序列号3)的核酸，只要具有IL-7的细胞增殖率的亢进作用即可，可使用与序列号3所示的碱基序列具有80％以上、优选为85％以上、更优选为90％以上、进一步优选为95％以上、最优选为98％以上的同一性的碱基序列。
作为编码CCL19的核酸，可根据导入本发明的CAR表达载体的细胞的种类而适当选择，例如，可举出编码人CCL19的氨基酸序列(序列号4)的核酸，只要具有CCL19的T细胞迁移作用即可，可使用与序列号4所示的碱基序列具有80％以上、优选为85％以上、更优选为90％以上、进一步优选为95％以上、最优选为98％以上的同一性的碱基序列。
作为编码针对SHP-1的显性负性突变体的核酸，可根据导入本发明的CAR表达载体的细胞的种类而适当选择，例如，可举出编码针对人SHP-1的显性负性突变体的氨基酸序列(序列号5)的核酸，只要具有针对SHP-1的显性负性突变体的阻碍SHP-1的作用即可，可使用与序列号5所示的碱基序列具有80％以上、优选为85％以上、更优选为90％以上、进一步优选为95％以上、最优选为98％以上的同一性的碱基序列。需要说明的是，序列号5中，第453位的丝氨酸为突变位点。
作为编码针对SHP-2的显性负性突变体的核酸，可根据导入本发明的CAR表达载体的细胞的种类而适当选择，例如，可举出编码针对人SHP-2的显性负性突变体的氨基酸序列(序列号6)的核酸，只要具有针对SHP-2的显性负性突变体的阻碍SHP-2的作用即可，可使用与序列号6所示的碱基序列具有80％以上、优选为85％以上、更优选为90％以上、进一步优选为95％以上、最优选为98％以上的同一性的碱基序列。需要说明的是，序列号6中，第459位的丝氨酸为突变位点。
作为本发明的CAR表达载体，可以是直链状，也可以是环状，可以是质粒等非病毒载体，也可以是病毒载体，还可以是利用转座子的载体。另外，上述载体中可含有启动子、终止子等调控序列、耐药基因、报告基因等筛选标记序列。通过在启动子序列的下游以可发挥作用的方式配置编码CAR的核酸、编码T细胞的免疫功能促进因子的核酸，可将各核酸效率良好地转录。另外，通过含有标记基因，能够容易地确认编码嵌合抗原受体的核酸的表达。
另外，本发明的CAR表达载体中可含有编码自杀基因的核酸，该自杀基因的位置没有特别限制，可在用于使编码IL-7的核酸、编码CCL19的核酸、编码针对SHP-1的显性负性突变体的核酸、或编码针对SHP-2的显性负性突变体的核酸表达的启动子的下游、隔着编码2A肽或IRES的序列配置在上述各核酸的上游或下游，也可配置在其他的启动子的下游。通过使本发明的CAR表达载体含有编码自杀基因的核酸，可根据癌症的治疗过程，例如在肿瘤消失时施予激活自杀基因的功能的药物，从而控制生物体内的CAR表达T细胞数量。
作为自杀基因，可举出以下的文献中记载的单纯疱疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)、诱导性半胱天冬酶9(inducible caspase 9)等，作为激活这些基因的功能的药物，对于前者可举出更昔洛韦(ganciclovir)，对于后者可举出作为诱导二聚物(chemical inductionof dimerization:CID)的AP1903(Cooper LJ.,et.al.Cytotherapy.2006；8(2):105-17.,Jensen M.C.et.al.Biol Blood Marrow Transplant.2010Sep；16(9):1245-56.,JonesBS.Front Pharmacol.2014Nov 27；5:254.,Minagawa K.,Pharmaceuticals(Basel).2015May 8；8(2):230-49.,Bole-Richard E.,Front Pharmacol.2015Aug 25；6:174)。
作为上述病毒载体，可举出逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体，可优选举出逆转录病毒载体、pMSGV载体(Tamada k et al.,Clin Cancer Res 18:6436-6445(2002))，可更优选举出pMSCV载体(Takara Bio公司制)。若使用逆转录病毒载体，则导入基因被组入宿主细胞的基因组中，因此能够长期且稳定地表达。
作为本发明的CAR表达T细胞，只要是(a)导入上述本发明的CAR表达载体而得到的T细胞、(b)将含有编码CAR的核酸及编码白细胞介素7的核酸的CAR表达载体(CAR-IL-7表达载体)、和含有编码CAR的核酸及编码CCL19的核酸的CAR表达载体(CAR-CCL19表达载体)中的至少2个载体导入而得到的T细胞则没有特别限制，作为将本发明的CAR表达载体、CAR-IL-7表达载体和CAR-CCL19表达载体导入T细胞的方法没有特别限制，可举出利用病毒感染法、磷酸钙法、脂质体转染法、显微注射法、电穿孔法等已知的方法来导入的方法，可优选举出病毒感染法。需要说明的是，上述CAR-IL-7表达载体只要含有编码CAR的核酸及编码白细胞介素7的核酸即可，上述CAR-CCL19表达载体只要含有编码CAR的核酸及编码CCL19的核酸即可，与本发明的CAR表达载体同样地，只要能够使各核酸表达，则可含有编码2A肽、IRES、或自杀基因的核酸等其他的核酸。
作为病毒感染法，可举出将本发明的CAR表达载体和包装质粒转染至GP2-293细胞(Takara Bio公司制)、Plat-GP细胞(Cosmo·Bio公司制)、PG13细胞(ATCC CRL-10686)、PA317细胞(ATCC CRL-9078)等包装细胞中制备重组病毒、用该重组病毒使T细胞感染的方法，也可使用Retrovirus packaging Kit Eco(Takara Bio公司制)等市售的试剂盒实施。
对于本发明的CAR表达载体向T细胞的导入的确认，可通过利用流式细胞术、Northern印迹法、Southern印迹法、RT-PCR等PCR、ELISA、Western印迹法调查CAR的表达、调查插入载体的标记基因的表达来进行确认。
作为T细胞，可举出来自人的T细胞、来自狗、猫、猪、小鼠等非人哺乳动物的T细胞。另外，T细胞可从血液、骨髓液等体液、脾脏、胸腺、淋巴结等组织、或浸润原发肿瘤、转移性肿瘤、癌性腹水等癌症组织的免疫细胞中分离、纯化而得到。作为该T细胞，可举出αβT细胞、γδT细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、肿瘤浸润T细胞、记忆T细胞、幼稚T细胞、NKT细胞。
在本发明的CAR表达T细胞中，表达的单链抗体位于细胞外，通过具有该单链抗体，CAR表达T细胞能够识别在癌细胞的表面上表达的肿瘤相关抗原(TAA)。
另外，本发明的CAR表达T细胞中，可与上述本发明的CAR表达载体一同导入含有编码自杀基因的核酸的载体。
对于本发明的抗癌剂而言，只要含有本发明的CAR表达T细胞和药学上允许的添加剂则没有特别限制，作为上述添加剂，可举出生理盐水、缓冲生理盐水、细胞培养基、葡萄糖、注射用水、甘油、乙醇及它们的组合、稳定剂、可溶剂及表面活性剂、缓冲剂及防腐剂、等渗剂、填充剂、以及润滑剂。
本发明的抗癌剂可使用本领域技术人员已知的方法施予至需要癌症治疗的受试体，作为施予方法，可举出向静脉内、肿瘤内、皮内、皮下、肌肉内、腹腔内、动脉内、髓内、心脏内、关节内、滑液囊内、头盖内、髓腔内、及蛛网膜下(髓液)的注射。
关于施予的抗癌剂中含有的本发明的CAR表达T细胞的量，可根据癌症的种类、位置、重症度、接受治疗的受试体的年龄、体重及状态等适当调节，可优选举出一次施予中为1×104～1×1010个，优选为1×105～1×109个，更优选为5×106～5×108个。
对于施予的抗癌剂而言，可1天4次、3次、2次或1次、隔1天、隔2天、隔3天、隔4天、隔5天、每周1次、隔7天、隔8天、隔9天、每周2次、每月1次或每月2次地独立施予。
对于本发明的抗癌剂而言，作为后述的癌症治疗方法中的癌症，可举出腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、未分化癌、大细胞癌、小细胞癌、皮肤癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、阴道癌、颈部癌、子宫癌、肝癌、肾癌、胰腺癌、脾脏癌、肺癌、气管癌、支气管癌、结肠癌、小肠癌、胃癌、食道癌、胆囊癌、精巢癌、卵巢癌等癌症、骨组织、软骨组织、脂肪组织、肌肉组织、血管组织及造血组织的癌症，以及，软骨肉瘤、Ewing肉瘤、恶性血管内皮瘤、恶性神经鞘瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤等肉瘤、肝母细胞瘤、髓母细胞瘤、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、胰母细胞瘤、胸膜肺母细胞瘤、视网膜母细胞瘤等母细胞瘤、胚细胞肿瘤、淋巴瘤、白血病。
可将本发明的抗癌剂与其他抗癌剂合用。作为其他的抗癌剂，可举出环磷酰胺、苯达莫司汀、异环磷酰胺、达卡巴嗪(dacarbazine)等烷基化药物、喷司他丁(pentostatin)、氟达拉滨(fludarabine)、克拉屈滨(cladribine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、依诺他滨(enocitabine)等代谢拮抗药、利妥昔单抗、西妥昔单抗、曲妥单抗(Trastuzumab)等分子靶向药物、伊马替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、阿法替尼(afatinib)、达沙替尼(dasatinib)、舒尼替尼(sunitinib)、曲美替尼(trametinib)等激酶抑制剂、硼替佐米(bortezomib)等蛋白酶体抑制剂、环孢菌素、他克莫司等钙调神经磷酸酶抑制剂、伊达比星(idarubicin)、多柔比星、丝裂霉素C等抗癌性抗生素、依立替康、依托泊苷(etoposide)等植物生物碱、顺铂、奥沙利铂(oxaliplatin)、卡铂(carboplatin)等铂制剂、他莫昔芬、比卡鲁胺(bicalutamide)等激素疗法药物、干扰素、nivolumab、pembrolizumab等免疫调节药，可优选举出烷基化药物或代谢拮抗药，可进一步优选举出环磷酰胺。
作为上述“将本发明的抗癌剂与其他抗癌剂合用”的方法，可举出在使用其他的抗癌剂进行处理后使用本发明的抗癌剂的方法、同时使用本发明的抗癌剂和其他的抗癌剂的方法、使用本发明的抗癌剂进行处理后使用其他的抗癌剂的方法，可优选举出使用其他的抗癌剂进行处理后使用本发明的抗癌剂的方法。另外，将本发明的抗癌剂与其他抗癌剂合用时，在进一步提高癌症的治疗效果的同时，可减少各抗癌剂的施予次数或施予量，从而能够降低各抗癌剂导致的副作用。另外，本发明的抗癌剂可含有上述其他的抗癌剂。
作为本发明的其他形式1，可举出1)癌症的治疗方法，其特征在于，将本发明的CAR表达T细胞施予至需要癌症治疗的患者，2)用作抗癌剂的本发明的CAR表达T细胞，3)本发明的CAR表达T细胞在抗癌剂的制备中的用途。
此外，作为本发明的其他形式2，可举出包含本发明的CAR表达载体、用于制备CAR表达T细胞的试剂盒，作为该试剂盒，只要包含本发明的CAR表达载体则没有特别限制，可包含用于制备CAR表达T细胞的说明书、用于将本发明的CAR表达载体导入T细胞的试剂。
实施例1
[表达IL-7及CCL19T的细胞的制备]
(T细胞的免疫功能促进因子的选择)
在生物体内至少存在数百种能够调控T细胞的功能的分子。发明人基于迄今为止的见解、经验，从庞大的组合中选择IL-7和CCL19作为用于进一步提高CAR-T细胞的抗肿瘤效果的调控分子，并且，选择并非单独、而是2个的组合、即IL-7和CCL19的组合，制备了既表达该T细胞的免疫功能促进因子同时还表达CAR的载体。
需要说明的是，上述IL-7是对于T细胞的存活而言必需的细胞因子，由骨髓、胸腺、淋巴器官·组织的基质细胞等非造血细胞产生。另一方面，几乎确认不到T细胞自身的产生能力。
另外，上述CCL19主要由淋巴结的树突细胞、巨噬细胞产生，具有介由作为其受体的CCR7引发T细胞、B细胞、成熟的树突细胞的迁移的功能。
(表达IL-7及CCL19的抗FITC CAR表达载体的制备)
人工合成编码包含抗FITC scFv、小鼠CD8跨膜区、小鼠CD28-4-1BB-CD3ζ细胞内信号基序的抗FITC CAR的抗FITC CAR DNA片段(序列号7)、编码序列号1所示的2A肽(F2A)和与其接续的限制性内切酶位点(MCS)的F2A-MCS DNA片段(序列号8)、编码小鼠IL-7(不含终止密码子)及其后续的F2A和小鼠CCL19的IL-7-F2A-CCL19DNA片段(序列号9)。在序列号7中，第1～819位为编码抗FITC scFv的多肽的序列，第829～1074位为编码小鼠CD8跨膜区的多肽的序列，第1075～1197位为编码小鼠CD28的细胞内区的多肽的序列，第1198～1332位为编码4-1BB的细胞内区的多肽的序列，第1333～1674位为编码CD3ζ的细胞内区的多肽的序列。另外，在序列号9中，第1～462位为编码IL-7的序列，第463～537位为编码F2A的序列，第538～864位为编码CCL19的序列。
为了制备表达CAR、IL-7及CCL19CAR的载体，将上述抗FITC CAR DNA片段与上述F2A-MCS DNA片段连接，制备抗FITC CAR-F2A-MCS构建体(construct)。接着，将制备的构建体克隆至pMSGV逆转录病毒表达载体(Tamada k et al.,Clin Cancer Res 18:6436-6445(2002))，制备含有抗FITC CAR-F2A-MCS的pMSGV载体。经过限制性内切酶(NsiI及SalI)处理及连接，将上述IL-7-F2A-CCL19DNA片段插入该pMSGV载体的MCS，得到含有抗FITC CAR-F2A-IL-7-F2A-CCL19的pMSGV载体(IL-7/CCL19表达-抗FITC CAR载体)。将得到的载体的配置图示于图2。另外，作为对照，将抗FITC CAR DNA片段克隆至pMSGV逆转录病毒表达载体，制备含有抗FITC CAR的pMSGV载体(对照抗FITC CAR载体)。
(导入了IL-7/CCL19表达-抗FITC CAR载体的逆转录病毒的制备)
为了小鼠T细胞的转导，制备逆转录病毒。使用Lipofectamine 2000或3000(LifeTechnologies公司制)，将上述的IL-7/CCL19表达-抗FITC CAR载体或对照抗FITC CAR载体、和pCL-Eco质粒(Imgenex公司制)转染至GP2-293包装细胞株(Takara Bio公司制)，由此制备导入了IL-7/CCL19表达-抗FITC CAR载体或对照抗FITC CAR载体的逆转录病毒。在转染起48小时后回收含有上述逆转录病毒的上清液。
作为上述GP2-293细胞的培养液，使用了添加了10％FCS、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素的DMEM。另外，作为后述的实施例中使用的T细胞的培养液，使用了添加了10％FCS、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素、50mM的2-巯基乙醇、2mM的L-谷氨酰胺的RPMI-1640。
(小鼠T细胞的转导)
为了小鼠T细胞的转导，将来自脾脏及淋巴结的3×106个纯化的小鼠T细胞用经过固相化的抗CD3单克隆抗体(3μg/ml)、抗CD28单克隆抗体(1μg/ml)、IL-2(100I U/ml)活化48小时。接着，将上述中制备的含有导入了IL-7/CCL19表达-抗FITC CAR载体或对照抗FITCCAR载体的逆转录病毒的上清液与在用25μg/ml的RetroNectin(注册商标：Takara Bio公司制)包被的培养皿中活化后的上述的小鼠T细胞(1×106细胞/ml)混合，以1500rpm离心2小时后，在IL-2(100I U/ml)的存在下培养6小时。为了从培养液中除去逆转录病毒，回收小鼠T细胞，移至含有IL-2(100I U/ml)的新的增殖培养液(RPMI)，进而培养42小时，得到导入了IL-7/CCL19表达-抗FITC CAR载体的小鼠T细胞(抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞)或导入了对照抗FITC CAR载体的小鼠T细胞(抗FITC CAR表达T细胞)。
(表达IL-7及CCL19的抗CD20 CAR表达载体的制备)
在上述的IL-7/CCL19表达-抗FITC CAR载体的制备中，将序列号7所示的序列中含有的抗FITC scFv区域的序列替换为由Life Technologies公司基于利妥昔单抗的序列合成的抗人CD20scFv(序列号10)的序列，除此以外，使用同样的方法制备含有抗人CD20 CAR-F2A-IL-7-F2A-CCL19的pMSGV载体(IL-7/CCL19表达-抗人CD20 CAR载体)。同样地，在上述的对照抗FITC CAR载体的制备中，将序列号7所示的序列中含有的抗FITC scFv区域的序列置换为上述抗人CD20scFv(序列号10)的序列，除此以外，使用同样的方法制备含有抗人CD20 CAR的pMSGV载体(对照抗人CD20 CAR载体)。将该IL-7/CCL19表达-抗人CD20 CAR载体或对照抗人CD20 CAR载体用与上述同样的方法导入小鼠T细胞，制备抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞或抗人CD20 CAR表达T细胞。
实施例2
[利用流式细胞术的CAR表达测定]
(流式细胞术分析)
利用双色流式细胞术对识别作为模型抗原的FITC的CAR的表达水平进行了分析。在FITC缀合葡聚糖和别藻蓝蛋白(APC)缀合抗CD8单克隆抗体(53-6.7Affymetrix公司制)的存在下培养制备的抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞。流式细胞仪使用EC800(索尼公司制)，数据分析使用FlowJo software(Tree Star公司制)。
另外，利用双色流式细胞术对识别人CD20的CAR的表达水平进行了分析。使用经过生物素标记的蛋白L及APC缀合链亲和素对制备的抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞进行了分析。
(结果)
将结果示于图3～5。图3中，左侧为CAR未染色(不添加FITC缀合葡聚糖)的抗FITCCAR-IL-7/CCL19表达T细胞，右侧为CAR染色(添加FITC缀合葡聚糖)的抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的结果，图4中，“转导(-)”为未转导的T细胞，“Cont.”为抗FITC CAR表达T细胞，“7×19”为抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞，图5中，“转导(-)”为未转导的T细胞，“Cont.”为抗人CD20 CAR表达T细胞，“7×19”为抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的结果。另外，图中的数值表示各细胞群所占的百分比。如图3～5所示的那样，在抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞、抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞中，确认到CAR的表达。
实施例3
[IL-7、CCL19的分泌]
(抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的培养上清液中的IL-7、CCL19浓度的测定-1)
将制备的抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞或抗FITC CAR表达T细胞用1μg/ml固相化的FITC缀合曲妥单抗刺激，培养3天，回收上清液，使用市售的ELISA试剂盒(R&Dsystems公司制)测定IL-7及CCL19的浓度。将结果示于图6。
(结果)
如图6所示的那样，在培养上清液中，检测到IL-7为300pg/ml以上，CCL19为75pg/ml以上。因此，确认到抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞表达IL-7及CCL19、且表达的IL-7及CCL19被分泌至细胞外。需要说明的是，在对照的抗FITC CAR表达T细胞中，IL-7、CCL19均为检测限以下(未检测到)。
(抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的培养上清液中的IL-7、CCL19浓度的测定-2)
利用固相化的FITC缀合曲妥单抗或抗CD3单克隆抗体，在进行刺激和无刺激的情况下，培养3、5、7天后，使用ELISA试剂盒测定IL-7及CCL-19的浓度。将结果示于图7。图7中，白色柱表示没有刺激，灰色柱表示有利用FITC缀合曲妥单抗的刺激，黑色柱表示有利用抗CD3单克隆抗体的刺激。另外，“Cont.”表示抗FITC CAR表达T细胞，“7×19”表示抗FITCCAR-IL-7/CCL19表达T细胞。
(结果)
由图7可见，除了培养3天以外，在培养5天、7天的情况下，在抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞中，IL-7及CCL-19也被分泌至细胞外。
(抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的培养上清液中的IL-7、CCL19浓度的测定)
进而，对于制备的抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞或抗人CD20 CAR表达T细胞，同样地利用经过丝裂霉素C处理的P815肥大细胞瘤、实施了基因重组从而能够表达人CD20的P815肥大细胞瘤(P815-hCD20)、或固相化的抗CD3单克隆抗体，在进行刺激、无刺激的情况下，培养3天或5天，然后使用ELISA试剂盒测定IL-7及CCL-19的浓度。将结果示于图8。图8中，白色柱表示没有刺激，斜线柱表示存在利用经过丝裂霉素C处理的815的刺激，黑色柱表示存在利用P815-hCD20的刺激，灰色柱表示存在利用固相化的抗CD3单克隆抗体的刺激。另外，“Cont.”表示抗人CD20 CAR表达T细胞，“7×19”表示抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞。
(结果)
由图8可见，在抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞中，IL-7及CCL-19也被分泌至细胞外。
实施例4
[CAR表达T细胞的细胞数量、存活率]
(抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的细胞数量、存活率)
对于由抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞产生的IL-7、CCL19是否发挥生物性功能、呈现免疫诱导效果进行了研究。将制备的抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞或抗FITCCAR表达T细胞用1μg/ml的固相化的FITC缀合曲妥单抗进行刺激，培养3天、5天、7天，回收细胞和上清液。利用台盼蓝的染色对细胞数量和存活率进行分析。将结果示于图9、10。图9、10中，黑色柱表示抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞，白色柱表示抗FITC CAR表达T细胞，横轴表示培养天数。另外，通过学生t检验(Student’s t-test)研究了统计学上的显著差异(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.005,p<0.001)。
(结果)
如图9、10所示的那样，抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的细胞增殖、存活率均亢进，可见，由抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞产生的L-7、CCL19发挥了生物性功能。
(抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的细胞数量)
将含有抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞(4×105个)的试样在大鼠IgG2a同型对照、抗CD127单克隆中和抗体、或抗CCR7单克隆中和抗体的存在下用丝裂霉素C和P815-hCD20刺激。培养5天，利用台盼蓝调查活细胞的绝对数量。需要说明的是，CD127为IL-7的受体，CCR7为CCL19的受体。将结果示于图11。图11中，“Iso.Cntrl.”为在大鼠IgG2a同型对照的存在下用P815-hCD20刺激的情况，“抗CD127”为在抗CD127单克隆中和抗体的存在下用P815-hCD20刺激的情况，“抗CCR7”为在抗CCR7单克隆中和抗体的存在下用P815-hCD20刺激的情况。图11中，黑色柱表示抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞，白色柱表示抗人CD20CAR表达T细胞。另外，各数据以3个孔(well)的平均±标准偏差表示，*表示P<0.05，表示P<0.001。
(结果)
如图11所示的那样，在抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞中，细胞数量增加，细胞增殖率亢进，以及，细胞增殖被抗CD127抑制，由此可见，细胞增殖率的亢进介由作为IL-7的受体的CD127而发挥作用。
实施例5
[T细胞迁移试验]
(利用抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的T细胞迁移试验)
利用使用了Transwell的细胞迁移试验，研究了CCL19的迁移引发效果。关于应答侧T细胞的迁移性，使用96孔的Transwell(注册商标)小室(chamber)(Cornig Costar公司制)，使细胞通过孔径为5μm的聚碳酸酯过滤器迁移来进行测定。具体而言，在小室的下层，将抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞或抗FITC CAR表达T细胞用1μg/ml的固相化的FITC缀合曲妥单抗刺激3天。应答侧T细胞利用脾脏、淋巴结通过MACS(注册商标)(MiltenyiBiotec公司制)的阴性选择制备。应答侧T细胞用Cyto Tell blue(AATBioquest公司制)标记，在上层培养3小时。用流式细胞术调查细胞从小室的上层向下层的迁移。将结果示于图12。图12中，黑色柱表示抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞，白色柱表示抗FITC CAR表达T细胞，纵轴表示迁移至下层的小室的应答侧T细胞的绝对数量(以下的图13、14中相同)。另外，通过学生t检验研究了统计学上的显著差异(*p<0.05)。
(结果)
如图12所示的那样，较之抗FITC CAR表达T细胞而言，抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞中的更多的T细胞迁移至下层。在移入CAR表达T细胞等淋巴细胞的疗法中，施予的T细胞导致的癌细胞损伤自然是重要的，除此以外，将原本存在于癌症患者体内的内源性T细胞(＝宿主侧免疫细胞)活化、发动其攻击癌细胞也是重要的。为此，从提高免疫治疗效果的观点考虑，优选的是，不仅仅单纯地从外部移入具有抗肿瘤活性的淋巴细胞，而是利用某些手段，引发移入的T细胞与内源性T细胞的积极的相互作用，从而使内源性T细胞在癌变部位蓄积。由图12的结果可见，抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞具有使内源性T细胞蓄积的能力，因此能够诱导移入的T细胞与内源性T细胞的积极的相互作用。
(利用抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的T细胞或树突细胞的迁移试验)
在Transwell的下层小室中，利用固相化的FITC缀合曲妥单抗或抗CD3单克隆抗体刺激含有抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞或抗FITC CAR表达T细胞的试样(5×105个)。在第3天将用Cyto Tell Blue染色的4×105个T细胞置于上层，孵育3小时或5小时。同样地，用固相化的FITC缀合曲妥单抗刺激各试样，在第3天将用Cyto Tell Blue染色的4×105个树突细胞置于上层，孵育3小时。用流式细胞术分析从上层迁移至下层的各应答侧细胞。将结果示于图13、14。图13、14中，黑色柱表示抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞，白色柱表示抗FITC CAR表达T细胞。需要说明的是，在图13、14及后述的图15中，各数据以3个孔(well)的平均±标准偏差表示，*表示P<0.05,**表示P<0.01，表示P<0.001，表示P<0.00001，表示P<5×10-5。
(结果)
由图13、14的结果可见，抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的使内源性T细胞及树突细胞蓄积的能力高。
(利用抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的T细胞迁移试验)
在Transwell的下层小室中，将含有抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞(1×105个)的试样与用丝裂霉素C处理的P815-hCD20共培养。在第3天将用Cyto Tell Blue染色的4×105个T细胞置于上层，在大鼠IgG2a同型对照、抗CD127单克隆抗体、或抗CCR7单克隆抗体的存在下孵育3小时。用流式细胞术分析从上层迁移至下层的各应答侧T细胞。将结果示于图15。图15中，“Iso.Cntrl.”表示在大鼠IgG2a同型对照的存在下用P815-hCD20刺激的情况，“抗CD127”在抗CD127单克隆中和抗体的存在下用P815-hCD20刺激的情况，“抗CCR7”表示在抗CCR7单克隆中和抗体的存在下用P815-hCD20刺激的情况。图15中，黑色柱表示抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞，白色柱表示抗人CD20 CAR表达T细胞。
(结果)
由图15的结果可见，在抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞中，使内源性T细胞蓄积的能力也高，以及，内源性T细胞的蓄积被抗CCR7抑制，由此可见，内源性T细胞的蓄积介由作为CCL19的受体的CCR7而发挥作用。
另外，由图9～15的结果可见，IL-7导致抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞、抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞高效地增殖，存活率也高，并且，CCL19导致T细胞、树突细胞在癌变部位蓄积，二者具有上述对于免疫诱导不可或缺的重要效果，并具有优异的免疫诱导效果。即，由此可知，通过使“IL-7”和“CCL19”这2个调控分子在CAR表达T细胞中表达，能够提高该T细胞的增殖能力、存活率、免疫诱导效果。
实施例6
[T细胞的增殖能力]
将含有抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞及作为对照的抗FITC CAR表达T细胞的试样(5×105个)用Cyto Tell Blue(AAT Bioquest公司制)染色，并利用固定化的FITC缀合曲妥单抗刺激后，用流式细胞术进行分析。将刺激开始后第5天的结果示于图16，将第3天、第7天的结果示于图17。图16中，直方图的数值表示细胞分裂数量，图16、17中，圆形图的数值表示各细胞分裂数在白细胞总体中占据的部分(0、1、2、3、大于4的细胞分裂数量)的比例。
(结果)
由图16、17的结果可见，较之抗FITC CAR表达T细胞而言，抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的增殖能力升高。
实施例7
[T细胞、树突细胞、及CAR表达T细胞中的CD127或CCR7的表达]
用流式细胞术，对未被刺激的脾脏T细胞(幼稚T细胞：naive T细胞)、将脾脏T细胞与抗CD3单克隆抗体、抗CD28单克隆抗体及IL-2共同培养2天进行刺激而得到的细胞(活化T细胞)、未被刺激的脾脏中的树突细胞(树突细胞)、及使用与实施例1的“小鼠T细胞的转导”同样的方法激活而制备的抗FITC CAR表达T细胞(Cont.)和抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞(7×19)进行分析，调查CD127或CDR7的表达。需要说明的是，T细胞为CD3+CD19-的细胞群，抗FITC CAR表达T细胞、抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞为对于FITC缀合葡聚糖珠为阳性的细胞群、树突细胞为CD11c+的细胞群。将调查CD127表达的结果示于图18，将调查CCR7表达结果的结果示于图19。图中，数值表示阳性的百分率(％)，“Cont.”表示抗FITCCAR表达T细胞，“7×19”表示抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞。
(结果)
如图18所示的那样，可见，CD127在活化T细胞中的表达比幼稚T细胞明显降低，但在抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞中比活化T细胞更多，进一步地，恢复到幼稚T细胞以上的水平。另外，如图19所示的那样，可见，对于CCR7的表达而言，在抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞中表达由于活化而降低，但维持了相对于幼稚T细胞而言为约67％的表达。以往已知，T细胞活化后，CD127或CCR7的表达降低至1/2～1/3。因此，可认为即使制备了表达IL-7、CCL19的CAR表达T细胞，仍然会由于CAR表达T细胞活化而导致IL-7及CCL19的作用降低。因此，通常很难期待通过使CAR表达T细胞表达IL-7及CCL19来提高CAR表达T细胞的免疫诱导效果、抗肿瘤活性。在本试验中，在将脾脏T细胞活化后第2天，也发现CD127或CCR7的表达暂时降低。然而，确认到在抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞中，CD127或CCR7的表达在第4天恢复。这表示，使CAR表达T细胞表达IL-7及CCL19对于免疫诱导效果、抗肿瘤活性的强化是有用的。
实施例8
[小鼠肿瘤模型中的治疗效果]
(抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞向小鼠的施予)
向荷癌小鼠(DBA/2小鼠)皮下接种5×105个经过基因重组从而能够表达人CD20的P815肥大细胞瘤(P815-hCD20)。3天后，向上述小鼠静脉内施予3×106个抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞或抗人CD20 CAR表达T细胞。作为对照，设定接种上述P815肥大细胞瘤后未处理(未施予CAR表达T细胞)的非治疗组。每周测定2次小鼠的肿瘤体积、存活率。在肿瘤体积分析中，根据各实验组算出标准偏差。对于3个组的统计性显著差异，在肿瘤体积分析中利用学生t检验进行研究，在存活率的调查中利用时序检验(log-rank test)进行研究(*P<0.05,**P<0.01)。
将小鼠的肿瘤体积变化的结果示于图20，将小鼠的存活率的结果示于图21。图20、21中，○表示施予了抗人CD20 CAR表达T细胞的情况，●表示施予了抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的情况，◇表示作为非治疗组而没有施予CAR表达T细胞的情况。另外，图20的横轴表示将细胞施予至小鼠静脉内后经过的天数，纵轴表示肿瘤体积(mm3)，图21的横轴表示将细胞施予至小鼠静脉内后经过的周数，纵轴表示存活率(％)。
(结果)
如图20、21所示的那样，在施予了抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的情况下，较之施予了抗人CD20 CAR表达T细胞的情况、没有施予CAR表达T细胞的情况而言，确认到肿瘤体积的减少效果、存活率的提高(存活时间的延长效果)。因此，可知抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞具有优异的抗肿瘤活性。
(抗癌剂及抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞向小鼠的接种)
向小鼠皮下接种5×105个P815-hCD20。在接种后第10天将作为抗癌剂的环磷酰胺(CPA，100mg/kg)施予至腹腔内，在第14天将1×106个抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞或抗人CD20 CAR表达T细胞施予至静脉内。将小鼠的存活率的结果示于图22，将肿瘤的体积的结果示于图23、24。图22～24中，横轴为皮下接种P815-hCD20后的天数(将向小鼠皮下接种P815-hCD20当天设为0天)，纵轴为存活率(图22)，肿瘤体积(肿瘤的长轴×(肿瘤的短轴)2/2(mm3))(图23、24)，“未处理”为未处理组，“CPA”为仅施予CPA的组，“CPA+Cont.”为在施予CPA后施予抗人CD20 CAR表达T细胞的组，“CPA+7×19”为在施予CPA后施予抗人CD20CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的组，表示小鼠死亡。需要说明的是，图24为将图23中的CPA+7×19的图的纵轴的数值缩小至1/10而得到的图。
(结果)
如图22所示的那样，可见通过将本发明的抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞与抗癌剂联合使用，存活率变得极高。另外，通过如图23、24所示的那样将本发明的抗人CD20CAR-IL-7/CCL19表达T细胞与抗癌剂合用，可见肿瘤完全地消失。需要说明的是，如图24所示的那样，肿瘤体积在皮下接种P815-hCD20后第10天成为最大，此时的短径为4.86mm～7.25mm，长径为5.92mm～8.39mm，换算成肿瘤体积为69.91mm3～220.50mm3，平均为140.02mm3。上述结果也表明，暂时增殖的肿瘤经过利用抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的治疗而消失。需要说明的是，与其他的抗癌剂合用时，从能够进一步提高利用本发明的CAR表达T细胞的抗肿瘤活性的观点考虑，优选的是，如上述方法那样，首先利用其他的抗癌剂降低淋巴细胞的细胞数量，然后施予抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞。利用该方法能够强化CAR表达T细胞的生物体内平衡(homeostasis)。
实施例9
[向肿瘤组织的浸透效果]
向小鼠皮下接种5×105个P815-hCD20。在接种后第3天，施予1×106个抗人CD20CAR-IL-7/CCL19表达T细胞，在接种后第21天切割肿瘤组织。将各组织分成两半。其中一半进行苏木精·曙红(H&E)染色，另一半用于免疫组织化学分析。在免疫组织化学分析中，作为一抗，使用抗CD4及抗CD8的单克隆抗体的组合、或抗CD3及抗DEC205的单克隆抗体的组合实施。另外，作为二抗，使用了Alexa Fluor(商标注册)488缀合抗大鼠IgG2a(绿)及AlexaFluor(商标注册)647缀合抗大鼠IgG2b(红)。细胞核用DAPI(青)进行染色。H&E染色试样及经过免疫标记的片段的显微镜观察以×100或×200的倍率进行。需要说明的是，CD4及CD8为T细胞的标记，DEC205为树突细胞的标记。将H&E染色的结果示于图25，将免疫组织化学分析的结果示于图26(a)、(b)。另外，将使用杂交细胞计数程序(Hybrid Cell Countprogram)(KEYENCE公司制)将图26(a)、(b)的数据中的各利用荧光染色(CD4染色(红)、CD8染色(绿)、CD3染色(红)、DEC205染色(绿)、CD3及DEC205的共存(黄))标记的阳性区域定量而得到的结果分别示于图27(a)、(b)。图25～27中，“未处理”为未处理组，“Cont.”为用抗人CD20 CAR表达T细胞进行处理的组，7×19为用抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞进行处理的组。
(结果)
根据图25的结果，在用抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞进行处理时，观察到坏死进展(用箭头示出的区域)、核消失的区域。此外，由图26(a)、27(a)的结果可见，通过用抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞进行处理，T细胞浸润至癌组织内，以及，由图26(b)、27(b)的结果可见，通过用抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞进行处理，树突细胞与T细胞一同浸润至癌组织内。
实施例10
[利用IL-7和CCL19的组合的肿瘤治疗效果]
向DBA/2小鼠皮下接种5×105个P815-hCD20。在接种后第3天，将1×106个抗人CD20CAR表达T细胞、作为免疫功能促进因子仅表达IL-7(不表达CCL19)的抗人CD20 CAR-IL-7表达T细胞、作为免疫功能促进因子仅表达CCL19(不表达IL-7)的抗人CD20 CAR-CCL19表达T细胞、或表达IL-7及CCL19的抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞施予至静脉内。作为对照，设置没有施予不表达IL-7及CCL19的CAR表达T细胞的小鼠组。在施予后第10天测定肿瘤的长轴、短轴，用与上述同样的方法算出肿瘤的体积(mm3)。将结果示于图28。图28中，“未处理”表示没有施予CAR表达T细胞的情况，“对照CAR”表示施予了抗人CD20 CAR表达T细胞的情况，“IL-7 CAR”表示施予了抗人CD20 CAR-IL-7表达T细胞的情况，“CCL19 CAR”表示施予了抗人CD20 CAR-CCL19表达T细胞的情况，“IL-7/CCL19CAR”表示施予了抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的情况。
需要说明的是，抗人CD20 CAR-IL-7表达T细胞通过下述方法得到：制备含有抗人CD20 CAR-F2A-IL-7的pMSGV载体(IL-7表达-抗人CD20 CAR载体)，用与实施例1的“小鼠T细胞的转导”同样的方法导入小鼠T细胞。同样地，抗人CD20 CAR-CCL19表达T细胞通过下述方法得到：制备含有抗人CD20 CAR-F2A-CCL19的pMSGV载体(CCL19表达-抗人CD20 CAR载体)，用与实施例1的“小鼠T细胞的转导”同样的方法导入小鼠T细胞。各载体的制备按照实施例1的“表达IL-7及CCL19的抗FITC CAR表达载体的制备”、“表达IL-7及CCL19的抗CD20 CAR表达载体的制备”的方法实施。IL-7编码的序列使用了序列号9中的第1～462位和与其连续的终止密码子序列，CCL19编码的序列使用了序列号9中的第538～864位的序列。将结果示于图28。
(结果)
如图28所示的那样，施予了抗人CD20 CAR-IL-7表达T细胞、抗人CD20 CAR-CCL19表达T细胞的情况下，仅具有与施予了对照(Control)的抗人CD20 CAR表达T细胞的情况相比几乎同等或较低的肿瘤增殖抑制效果，但施予抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞后，肿瘤几乎消失。由此可见，尽管IL-7、CCL19各自单独几乎不具有肿瘤增殖抑制效果，但通过将IL-7和CCL19组合，能够得到极高的肿瘤增殖抑制效果。
实施例11
[利用51Cr释放测定得到的肿瘤细胞损伤活性-1]
(T细胞的免疫功能促进因子的选择)
在癌组织的微环境中，将抑制性信号向免疫细胞转导，抗肿瘤免疫反应受到阻碍，从而使免疫疗法的效果减弱。抑制信号经由SHP-1、SHP-2转导向免疫细胞。因此，在针对癌症的T细胞疗法中，通过使T细胞自身产生阻碍SHP-1、SHP-2的作用的显性负性突变体，能够强化抗肿瘤效果。因此，制备既表达阻碍SHP-1、SHP-2的作用的显性负性突变体和同时还表达CAR的载体，对肿瘤细胞损伤活性进行了调查。
(表达SHP1或SHP2的显性负性突变体的CAR表达载体的制备)
编码含有第453位的催化性半胱氨酸残基向丝氨酸的突变(C453S)的小鼠SHP1显性负性突变体(SHP1DN)的DNA片段通过利用PCR的位点特异性突变导入法制备，编码含有第459位的催化性半胱氨酸残基向丝氨酸的突变(C459S)的小鼠SHP2显性负性突变体(SHP2DN)的DNA片段使用了由Life Technologies公司合成的DNA片段。将编码小鼠SHP1DN的碱基序列示于序列号11，将编码小鼠SHP2DN的碱基序列示于序列号12。序列号11中第1357～1359位、及序列号12中第1375～1377位的3个碱基为突变位点。将编码SHP1DN或SHP2DN的DNA片段插入实施例2的IL-7/CCL19表达-抗人CD20 CAR载体制备过程中的含有抗人CD20 scFv CAR-F2A-MCS的pMSGV载体的MCS，分别得到SHP1DN表达-抗人CD20 CAR载体、SHP2DN表达-抗人CD20 CAR载体。将得到的载体的配置图示于图29。
(小鼠T细胞的转导)
将上述SHP1DN表达-抗人CD20 CAR载体、SHP2DN表达-抗人CD20 CAR载体使用与实施例1同样的方法导入小鼠T细胞，分别得到抗人CD20 CAR-SHP1DN表达T细胞、抗人CD20CAR-SHP2DN表达T细胞。作为对照，使用了实施例1中制备的抗人CD20 CAR表达T细胞。
(利用51Cr释放测定得到的肿瘤细胞损伤活性)
利用标准的4小时51Cr释放测定，对CAR表达T细胞对于肿瘤的细胞损伤活性进行测定。作为靶肿瘤细胞，使用了表达人CD20 的P815(P815-hCD20)。采集上述肿瘤细胞，在100μCi Na2 51CrO4的存在下，于37℃培养1小时，然后洗涤3次。然后，作为效应器T细胞，与抗人CD20 CAR表达T细胞、抗人CD20 CAR-SHP1DN表达T细胞、或抗人CD20 CAR-SHP2DN表达T细胞共培养。使效应器/靶之比为0.6、1.25、2.5、5、10。将上述细胞在含有10％的Triton-X(Sigma-Aldrich公司制)的培养液或仅在培养液中进行培养，测定靶细胞的最大释放量和自然释放量。上清液的51Cr释放使用Top Count闪烁计数器(PerkinElmer公司制)进行测定。特异性损伤的比例使用式：特异性损伤(％)＝[(试验释放量-自然释放量)/(最大释放量-自然释放量)]×100算出。将结果示于图30。图30(a)中，○为抗人CD20 CAR表达T细胞，●为抗人CD20 CAR-SHP1DN表达T细胞，图30(b)中，○为抗人CD20 CAR表达T细胞，●为抗人CD20CAR-SHP2DN表达T细胞。另外，横轴以E/T比表示效应器(T细胞)与靶(肿瘤细胞)之比，纵轴表示特异性损伤(％)。通过学生t检验研究了统计学上的显著差异(*p<0.05)。
如图30所示的那样，可见，抗人CD20 CAR-SHP1DN表达T细胞、抗人CD20 CAR-SHP2DN表达T细胞较之抗人CD20 CAR表达T细胞而言，具有明显更高的肿瘤细胞损伤活性。
实施例12
[利用51Cr释放测定得到的肿瘤细胞损伤活性-2]
在未标记(Ab，空心)或FITC缀合(FITC-Ab，涂黑)利妥昔单抗的存在下，将P815-hCD20(1×104个/孔)以使效应器/靶(E/T)比例成为0.15625、0.3125、0.625、2.5、5、10的方式与抗FITC CAR表达T细胞(Cont，圆形)或抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞(7×19，方形)一同混合，用与上述同样的方法测定上清液的51Cr释放，算出损伤活性的比例。将结果示于图31。图31中，在FITC缀合利妥昔单抗的存在下，将与抗FITC CAR表达T细胞一同混合的情况以“●”表示，将在未标记的利妥昔单抗的存在下与抗FITC CAR表达T细胞一同混合的情况以“○”表示，将在FITC缀合利妥昔单抗的存在下与抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞一同混合的情况以“■”表示，将在未标记的利妥昔单抗的存在下与抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞一同混合的情况以“□”表示。
另外，将815-hCD20(1×104个/孔)以使效应器/靶(E/T)比例成为0.3125、0.625、2.5、5、10、20的方式与抗人CD20 CAR表达T细胞或抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞一同混合，用与上述同样的方法测定上清液的51Cr释放，算出损伤活性的比例。将结果示于图33。图32中，将与抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞一同混合的情况以“●”表示，将与抗人CD20 CAR表达T细胞一同混合的情况以“○”表示。
(结果)
如图31、32所示的那样，可见，抗FITC CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的每1个细胞的肿瘤细胞损伤活性维持在与抗FITC CAR表达T细胞同等的水平，同样地，抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的每1个细胞的肿瘤细胞损伤活性维持在与抗人CD20 CAR表达T细胞同等的水平。
实施例13
[生物体内的CAR表达T细胞的存活和向记忆T细胞的分化]
(流式细胞术分析)
向DBA/2小鼠皮下接种5×105个P815-hCD20。在接种后第10天将作为抗癌剂的环磷酰胺(CPA、100mg/kg)施予至腹腔内，在第14天将1×106个抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞或抗人CD20 CAR表达T细胞施予至静脉内。在CAR表达T细胞施予后第21天从脾脏或肿瘤区域淋巴结(腋下、上臂、鼠蹊)分离白细胞。对于白细胞表面的表型，将使用流式细胞术分析CD4、CD8、CD44、CD62L得到的结果示于图33。另外，将脾脏的白细胞与用丝裂霉素C处理的P815-hCD20共同培养4天进行刺激，用流式细胞术调查T细胞的增殖的结果示于图34。使用生物素标记的蛋白L及APC缀合链亲和素对CAR的表达进行了确认。图33中的数字表示CD4+T细胞、CD8+T细胞的各门区(gate region)(CD62L+CD44-为幼稚T细胞、CD62L+CD44+为中央记忆T细胞、CD62L-CD44+为效应器记忆T细胞)的比例，图34中的数字表示蛋白L阳性T细胞的比例。另外，在图33、34中，“Cont.”表示抗人CD20 CAR表达T细胞，“7×19”表示抗人CD20CAR-IL-7/CCL19表达T细胞。
(结果)
如图33、34所示的那样，可见，在施予了抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的小鼠中，记忆T细胞在脾脏及淋巴结中增加，或存活于小鼠内的抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞在与人CD20表达肿瘤细胞共培养后大幅度增殖。综合图21、22的存活率的结果考虑，可认为本发明的CAR表达T细胞在施予其的生物体内高效存活，并具有通过形成记忆T细胞而杀灭癌细胞、提高存活率的能力，从而表示其对于预防癌症的复发也是有效的。
产业上的可利用性
通过使用本发明的CAR表达载体，能够制备兼具存活能力及淋巴细胞蓄积能力的CAR-T细胞、具有对于癌症微环境中的免疫抑制的抵抗性的CAR-T细胞，因此，可在癌症免疫疗法的领域中利用。

Claims (9)

1.CAR表达载体，其含有编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸及编码T细胞的免疫功能促进因子的核酸，其特征在于，所述编码所述免疫功能促进因子的核酸为：编码白细胞介素7的核酸及编码CCL19的核酸、编码针对SHP-1的显性负性突变体的核酸、或编码针对SHP-2的显性负性突变体的核酸。
2.如权利要求1所述的CAR表达载体，其特征在于，所述编码免疫功能促进因子的核酸为编码白细胞介素7的核酸及编码CCL19的核酸。
3.如权利要求2所述的CAR表达载体，其特征在于，所述编码CAR的核酸与所述编码T细胞的免疫功能促进因子的核酸介由编码自切割肽的序列连接。
4.如权利要求2或3所述的CAR表达载体，其特征在于，所述编码白细胞介素7的核酸与所述编码CCL19的核酸介由编码自切割肽的序列连接。
5.如权利要求1～4中任一项所述的CAR表达载体，其特征在于，编码CAR的核酸含有编码下述单链抗体的多肽的核酸，所述单链抗体识别FITC或CD20。
6.如权利要求1～5中任一项所述的CAR表达载体，其特征在于，编码CAR的核酸含有编码CD8的跨细胞膜区的多肽的核酸。
7.如权利要求1～6中任一项所述的CAR表达载体，其特征在于，编码CAR的核酸含有编码CD28的细胞内区、4-1BB的细胞内区、及CD3ζ的细胞内区的多肽的核酸。
8.CAR表达T细胞，其中导入了以下(a)或(b)所示的载体：
(a)权利要求1～7中任一项所述的CAR表达载体；
(b)含有编码CAR的核酸及编码白细胞介素7的核酸的CAR表达载体、和含有编码CAR的核酸及编码CCL19的核酸的CAR表达载体。
9.抗癌剂，其含有权利要求8所述的CAR表达T细胞和药学上允许的添加剂。
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Cited By (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108641001A (zh) * 2018-04-26 2018-10-12 上海怡豪生物科技有限公司 结肠癌的双靶点car-t治疗载体及其构建方法和应用
CN108641000A (zh) * 2018-04-26 2018-10-12 上海怡豪生物科技有限公司 肝癌的双靶点car-t治疗载体及其构建方法和应用
CN108659133A (zh) * 2018-04-26 2018-10-16 上海怡豪生物科技有限公司 肺癌的双靶点car-t治疗载体及其构建方法和应用
CN108866004A (zh) * 2018-06-26 2018-11-23 奥妙生物技术（广州）有限公司 Shp-1敲除的t细胞及其构建方法
CN109055430A (zh) * 2018-08-14 2018-12-21 杭州荣泽生物科技有限公司 一种共表达il18和ccl19蛋白及靶向muc1基因car-t细胞的制备方法
CN109153989A (zh) * 2016-03-17 2019-01-04 国立大学法人山口大学 表达免疫功能调控因子的免疫活性细胞及表达载体
CN109504660A (zh) * 2018-11-02 2019-03-22 温州启星生物技术有限公司 一种第四代car-t细胞及其构建方法和应用
WO2020057641A1 (zh) * 2018-09-20 2020-03-26 科济生物医药（上海）有限公司 表达有趋化因子的细胞及用途
CN110922490A (zh) * 2019-12-05 2020-03-27 浙江启新生物技术有限公司 分泌白介素7和趋化因子21的car表达载体及应用
CN111511911A (zh) * 2017-12-24 2020-08-07 诺伊尔免疫生物科技株式会社 表达特异性地识别人间皮素的细胞表面分子、il-7和ccl19的免疫活性细胞
CN111542338A (zh) * 2017-12-27 2020-08-14 武田药品工业株式会社 含核酸脂质纳米粒子及其用途
CN112080525A (zh) * 2019-06-14 2020-12-15 南京艾德免疫治疗研究院有限公司 一种改良型嵌合抗原受体t细胞的制备
CN112080526A (zh) * 2019-06-14 2020-12-15 南京艾德免疫治疗研究院有限公司 表达il-7和car的表达载体及免疫细胞
CN112771166A (zh) * 2018-08-31 2021-05-07 诺伊尔免疫生物科技株式会社 表达car的t细胞和car表达载体
CN112961248A (zh) * 2021-02-22 2021-06-15 广州百暨基因科技有限公司 共表达IL-7和CCR2b的嵌合抗原受体融合蛋白及其应用
CN113543792A (zh) * 2019-03-08 2021-10-22 奥托路斯有限公司 包含工程化嵌合抗原受体和car调节剂的组合物和方法
CN113528483A (zh) * 2020-04-22 2021-10-22 复星凯特生物科技有限公司 Shp2特异性失活突变蛋白及其在car-t治疗中应用
CN113913385A (zh) * 2021-09-01 2022-01-11 苏州璞惠卓越生物科技有限公司 一种抑制蛋白阻断型嵌合抗原受体修饰的免疫细胞及其用途
CN113921082A (zh) * 2021-10-27 2022-01-11 云舟生物科技（广州）有限公司 基因搜索权重调整方法、计算机存储介质及电子设备
CN115505601A (zh) * 2022-10-17 2022-12-23 深圳市先康达生命科学有限公司 一种两级SynNotch逻辑调控结构及其应用

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101890638B1 (ko) 2014-10-09 2018-08-22 고쿠리츠다이가쿠호우진 야마구치 다이가쿠 Car 발현 벡터 및 car 발현 t 세포
GB201509413D0 (en) * 2015-06-01 2015-07-15 Ucl Business Plc Fusion protein
AU2017219859A1 (en) 2016-02-16 2018-08-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Immunotherapy compositions and methods
US11447562B2 (en) * 2017-01-01 2022-09-20 Chi-Yu Gregory Lee RP215 chimeric antigen receptor construct and methods of making and using same
TWI780102B (zh) 2017-01-10 2022-10-11 國立大學法人山口大學 抗gpc3抗體
US20210122831A1 (en) * 2017-03-27 2021-04-29 Noile-Immune Biotech, Inc. Chimeric antigen receptor
CN108484777B (zh) * 2017-03-31 2022-07-12 李吉祐 人源化rp215单克隆抗体的嵌合抗原受体构建体及核酸分子与应用
BR112020006746A2 (pt) * 2017-10-10 2020-10-06 Yamaguchi University intensificador para células t ou células b, composição farmacêutica, inibidor da recorrência de tumor maligno, e, indutor para induzir uma função de memória em células t ou células b
CN112154204A (zh) * 2018-05-15 2020-12-29 科济生物医药（上海）有限公司 基因工程化的细胞及应用
KR20190141511A (ko) * 2018-06-14 2019-12-24 주식회사 녹십자랩셀 신규 펩티드, 이를 포함하는 키메라 항원 수용체 및 이를 발현하는 면역 세포
US20230071098A1 (en) * 2018-07-17 2023-03-09 Noile-Immune Biotech, Inc. Anti-gpc3 single-chain antibody-containing car
EP3864142A4 (en) * 2018-10-12 2023-07-19 iCell Gene Therapeutics LLC CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR (CARS) COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
WO2020106621A1 (en) * 2018-11-19 2020-05-28 Board Of Regents, The University Of Texas System A modular, polycistronic vector for car and tcr transduction
JP2021016371A (ja) * 2019-07-23 2021-02-15 株式会社東芝 Ｃａｒ−ｔ細胞の製造方法、核酸導入キャリア及びキット
CA3156231A1 (en) 2019-10-28 2021-05-06 Koji Tamada Drug for treating cancer, combination drug, drug composition, immune responsive cell, nucleic acid delivery vehicle, and product
JP2023513752A (ja) * 2020-02-14 2023-04-03 ベイジン ヨンタイ ルイケ バイオテクノロジー カンパニー リミテッド 外部から導入された細胞シグナル伝達調節因子を過剰発現する免疫細胞及びその使用
GB202006820D0 (en) * 2020-05-07 2020-06-24 Autolus Ltd Cell
US20230257705A1 (en) 2020-06-17 2023-08-17 Kyoto University Chimeric antigen receptor-expressing immunocompetent cells
KR102297396B1 (ko) 2020-07-29 2021-09-06 (주)티카로스 면역시냅스를 안정화시키는 키메라 항원 수용체(car) t 세포
JP2023553157A (ja) 2020-12-10 2023-12-20 ユーティレックス カンパニー リミテッド 抗－ｐｄ－１抗体およびその用途
CN114717203B (zh) * 2020-12-22 2023-06-27 广东东阳光药业有限公司 一种hIL7/hCCL19双基因重组溶瘤病毒及其制备方法和用途
CN114716548A (zh) 2021-01-05 2022-07-08 (株)爱恩德生物 抗-fgfr3抗体及其用途
WO2022245098A1 (ko) 2021-05-18 2022-11-24 주식회사 바이오솔루션 세포외소포체 분비능이 증진된 면역세포 및 이를 활용한 면역 항암요법
TW202321287A (zh) 2021-07-29 2023-06-01 日商武田藥品工業股份有限公司 特異性靶向間皮素之經工程改造之免疫細胞及其用途
WO2023081455A2 (en) * 2021-11-08 2023-05-11 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Immune cells expressing glucose transporter 5 (gluts) and compositions and methods including the same
WO2023223292A1 (en) * 2022-05-20 2023-11-23 Takeda Pharmaceutical Company Limited Methods of producing engineered immune cells
US12006353B2 (en) 2022-07-25 2024-06-11 Long Chen Application of SCFV protein, car gene expression vector, CAR-T cell and application thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013123061A1 (en) * 2012-02-13 2013-08-22 Seattle Children's Hospital D/B/A Seattle Children's Research Institute Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5857318A (ja) * 1981-10-01 1983-04-05 Nippon Koutai Kenkyusho:Kk 癌細胞障害性リンパ球の製造法
US7446179B2 (en) 2000-11-07 2008-11-04 City Of Hope CD19-specific chimeric T cell receptor
KR20050118057A (ko) * 2004-04-24 2005-12-15 김상희 아세틸디아실글리세롤류의 화합물을 유효성분으로함유하는 항암제 및 건강식품
TWI436775B (zh) * 2007-08-24 2014-05-11 Oncotherapy Science Inc 以抗原胜肽合併化療藥劑治療胰臟癌
EP2356219A4 (en) * 2008-10-08 2017-07-05 Intrexon Corporation Engineered cells expressing multiple immunomodulators and uses thereof
SG190997A1 (en) 2010-12-09 2013-07-31 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
WO2012082841A2 (en) * 2010-12-14 2012-06-21 University Of Maryland, Baltimore Universal anti-tag chimeric antigen receptor-expressing t cells and methods of treating cancer
EP2694549B1 (en) 2011-04-08 2018-08-15 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Anti-epidermal growth factor receptor variant iii chimeric antigen receptors and use of same for the treatment of cancer
US20130071414A1 (en) * 2011-04-27 2013-03-21 Gianpietro Dotti Engineered cd19-specific t lymphocytes that coexpress il-15 and an inducible caspase-9 based suicide gene for the treatment of b-cell malignancies
EP2755487B1 (en) * 2011-09-16 2018-12-19 Baylor College Of Medicine Targeting the tumor microenvironment using manipulated nkt cells
CN104126009B (zh) 2011-10-07 2019-05-10 国立大学法人三重大学 嵌合抗原受体
JP2015509716A (ja) * 2012-02-22 2015-04-02 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア 第二世代キメラ抗原受容体におけるｃｄ２シグナル伝達ドメインの使用
CN102625373A (zh) * 2012-02-22 2012-08-01 中兴通讯股份有限公司 一种智能载波管理方法及装置
KR101890638B1 (ko) * 2014-10-09 2018-08-22 고쿠리츠다이가쿠호우진 야마구치 다이가쿠 Car 발현 벡터 및 car 발현 t 세포

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013123061A1 (en) * 2012-02-13 2013-08-22 Seattle Children's Hospital D/B/A Seattle Children's Research Institute Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARNI S等: "Combined CCL19/IL-7 treatment eradicates tumors in murine models of lung cancer", 《JOURNAL OF THORACIC ONCOLOGY》 *
CARLOS AR等: "Chimeric antigen receptor (CAR)-engineered lymphocytes for cancer therapy.", 《EXPERT OPIN BIOL THER.》 *
JOHN CM等: "IL-7 and IL-21 are superior to IL-2 and IL-15 in promoting human T cell-mediated rejection of systemic lymphoma in immunodeficient mice", 《BLOOD》 *

Cited By (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109153989A (zh) * 2016-03-17 2019-01-04 国立大学法人山口大学 表达免疫功能调控因子的免疫活性细胞及表达载体
CN109153989B (zh) * 2016-03-17 2022-10-28 国立大学法人山口大学 表达免疫功能调控因子的免疫活性细胞及表达载体
CN111511911B (zh) * 2017-12-24 2023-11-03 诺伊尔免疫生物科技株式会社 表达特异性地识别人间皮素的细胞表面分子、il-7和ccl19的免疫活性细胞
CN111511911A (zh) * 2017-12-24 2020-08-07 诺伊尔免疫生物科技株式会社 表达特异性地识别人间皮素的细胞表面分子、il-7和ccl19的免疫活性细胞
CN111542338A (zh) * 2017-12-27 2020-08-14 武田药品工业株式会社 含核酸脂质纳米粒子及其用途
CN108641001A (zh) * 2018-04-26 2018-10-12 上海怡豪生物科技有限公司 结肠癌的双靶点car-t治疗载体及其构建方法和应用
CN108641000A (zh) * 2018-04-26 2018-10-12 上海怡豪生物科技有限公司 肝癌的双靶点car-t治疗载体及其构建方法和应用
CN108659133A (zh) * 2018-04-26 2018-10-16 上海怡豪生物科技有限公司 肺癌的双靶点car-t治疗载体及其构建方法和应用
CN108866004A (zh) * 2018-06-26 2018-11-23 奥妙生物技术（广州）有限公司 Shp-1敲除的t细胞及其构建方法
WO2020000526A1 (zh) * 2018-06-26 2020-01-02 奥妙生物技术（广州）有限公司 Shp-1敲除的t细胞及其构建方法
CN109055430A (zh) * 2018-08-14 2018-12-21 杭州荣泽生物科技有限公司 一种共表达il18和ccl19蛋白及靶向muc1基因car-t细胞的制备方法
CN112771166A (zh) * 2018-08-31 2021-05-07 诺伊尔免疫生物科技株式会社 表达car的t细胞和car表达载体
CN112771167A (zh) * 2018-09-20 2021-05-07 科济生物医药（上海）有限公司 表达有趋化因子的细胞及用途
WO2020057641A1 (zh) * 2018-09-20 2020-03-26 科济生物医药（上海）有限公司 表达有趋化因子的细胞及用途
CN109504660A (zh) * 2018-11-02 2019-03-22 温州启星生物技术有限公司 一种第四代car-t细胞及其构建方法和应用
CN109504660B (zh) * 2018-11-02 2021-08-06 温州启星生物技术有限公司 一种第四代car-t细胞及其构建方法和应用
CN113543792A (zh) * 2019-03-08 2021-10-22 奥托路斯有限公司 包含工程化嵌合抗原受体和car调节剂的组合物和方法
CN112080526A (zh) * 2019-06-14 2020-12-15 南京艾德免疫治疗研究院有限公司 表达il-7和car的表达载体及免疫细胞
CN112080525A (zh) * 2019-06-14 2020-12-15 南京艾德免疫治疗研究院有限公司 一种改良型嵌合抗原受体t细胞的制备
CN110922490A (zh) * 2019-12-05 2020-03-27 浙江启新生物技术有限公司 分泌白介素7和趋化因子21的car表达载体及应用
CN110922490B (zh) * 2019-12-05 2023-03-03 浙江启新生物技术有限公司 分泌白介素7和趋化因子21的car表达载体及应用
CN113528483B (zh) * 2020-04-22 2024-08-16 复星凯特生物科技有限公司 Shp2特异性失活突变蛋白及其在car-t治疗中应用
WO2021213479A1 (zh) * 2020-04-22 2021-10-28 复星凯特生物科技有限公司 Shp2特异性失活突变蛋白及其在car-t治疗中应用
CN113528483A (zh) * 2020-04-22 2021-10-22 复星凯特生物科技有限公司 Shp2特异性失活突变蛋白及其在car-t治疗中应用
WO2022174498A1 (zh) * 2021-02-22 2022-08-25 广州百暨基因科技有限公司 共表达IL-7和CCR2b的嵌合抗原受体融合蛋白及其应用
CN112961248A (zh) * 2021-02-22 2021-06-15 广州百暨基因科技有限公司 共表达IL-7和CCR2b的嵌合抗原受体融合蛋白及其应用
CN113913385A (zh) * 2021-09-01 2022-01-11 苏州璞惠卓越生物科技有限公司 一种抑制蛋白阻断型嵌合抗原受体修饰的免疫细胞及其用途
CN113921082A (zh) * 2021-10-27 2022-01-11 云舟生物科技（广州）有限公司 基因搜索权重调整方法、计算机存储介质及电子设备
CN115505601A (zh) * 2022-10-17 2022-12-23 深圳市先康达生命科学有限公司 一种两级SynNotch逻辑调控结构及其应用
CN115505601B (zh) * 2022-10-17 2024-05-28 深圳市先康达生命科学有限公司 一种两级SynNotch逻辑调控结构及其应用

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Publication number Publication date
DK3597742T3 (da) 2022-10-03
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US10316102B2 (en) 2019-06-11
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TWI688651B (zh) 2020-03-21
WO2016056228A1 (ja) 2016-04-14
BR112017006710A2 (pt) 2017-12-12
IL251504A0 (en) 2017-05-29
EP3597742A1 (en) 2020-01-22
PH12017500596A1 (en) 2017-08-30
LT3597742T (lt) 2022-09-12

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