CN112300999A - 一种balb/c小鼠模型及其用途 - Google Patents
一种balb/c小鼠模型及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112300999A CN112300999A CN202011201383.0A CN202011201383A CN112300999A CN 112300999 A CN112300999 A CN 112300999A CN 202011201383 A CN202011201383 A CN 202011201383A CN 112300999 A CN112300999 A CN 112300999A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- balb
- humanized
- mice
- gene
- mouse
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
- A01K67/027—New breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70521—CD28, CD152
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases
Abstract
本申请提供一种balb/c小鼠或其功能活性部分，其包含和/或表达经人源化的免疫检查点基因和/或其表达产物。本申请还提供一种免疫检查点抑制剂毒性评估系统、方法、制备所述balb/c小鼠或其功能活性部分的方法，以及所述balb/c小鼠或其功能活性部分的用途。
Description
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种balb/c小鼠模型及其用途。
背景技术
早在2013年，Science杂志就将肿瘤免疫疗法评为10大科学突破之首，其中以PD1/PDL1为首的免疫检查点疗法(Immuno-checkpoint therapy)已在多种癌症临床治疗中显示出显著的抗肿瘤疗效。目前已有上市并用于临床的成功药物，默沙东公司的PD-1人源化抗体Keytruda(Pembrolizumab，MK-3475)及百时美施贵宝公司的PD-1抗体Opdivo(Nivolumab)于2014年被FDA批准上市的一线肿瘤治疗药物，有稳健的抗肿瘤作用。抗CTLA4单克隆抗体也在小鼠模型和临床病人中取得了卓越的抗肿瘤治疗效果，临床长期追踪证明，Ipilimumab一旦起效，并且突破3年存活期，患者就有极大机会能活到10年，成为“超级幸存者”。在晚期黑色素瘤和晚期非小细胞肺癌患者的治疗中，抗CTLA4抗体Iplimumab与Nivolumab联用，可显著增加有效应答率。另一组抗CTLA4抗体(Tremelimumab)与抗PD-1抗体(durvalumab)联用，取得了相似的临床效果。这使得免疫联合疗法具有巨大的临床开发价值。
然而伴随的免疫相关副反应(irAEs)表型使得部分患者的使用受到限制。PD-1抗体治疗后的3-5级irAEs比率为1-2％，而CTLA4抗体治疗后的3-5级irAEs比率为1-11％。《新英格兰杂志》曾指出，PD-1抗体单药使用导致的免疫性心脏炎症发生率约为万分之六，而PD-1抗体和CTLA4抗体联合使用，这一比例将上升到千分之三左右，一旦发生严重的心肌炎，病死率极高。此外，有研究者调研免疫检查点抑制剂(抗PD-1疗法等)治疗之后发生严重心肌炎的101例患者的详细资料后发现，使用该类疗法的患者要高度警惕这种肿瘤免疫治疗导致的免疫性心肌炎，目前没有针对这一症状的有效治疗手段，死亡率高达46％。同样的，在抗CTLA4抗体药物开发过程中，无论是单用还是联用，总是会遇到免疫相关不良反应的阻碍。在部分临床试验中，Iplimumab与Nivolumab联用使超过50％的患者出现了严重的不良反应(3～4级SAE)，这极大的限制了患者的长期免疫治疗。因此，如何在强大的抗癌效果及严重的副作用中取得平衡，获得最好的治疗效果及最小的毒副作用，正是目前免疫检查点抗体药物研发所面临的挑战！
体内人体生物学的研究受到道德和技术的严重限制，越来越需要动物模型来进行人体细胞、组织和器官的体内研究，而不会使个体处于危险之中。构建临床前的抗体安全评价体系对抗体药的临床安全性具有极大的参考意义。目前，在抗体药研发的临床前实验阶段，对药物的代谢及安全性评价主要依靠灵长类动物模型，使用啮齿类小鼠评价的大部分都是小分子药物的代谢及毒理等。在小鼠模型上进行抗体药安全性评价受限的原因主要有2点：目前尚没有对大分子抗体毒性敏感的小鼠模型，小鼠对于irAEs具有更高的耐受，在人体内具有毒性反应的抗体通常不能在小鼠上体现；受抗体种属差异的限制，人源抗体类药物识别特意靶点具有种属特异性，因此野生型小鼠模型无法直接进行人源抗体的评价。
鉴于此，期望获得一种可以有效克服抗体种属差异的模型，用于研究直接识别人体免疫检验点的药物；同时，期望建立一种对大分子抗体毒性更加敏感的毒理评价方法，以便更好的再现临床抗体的不良反应，用于更多的候选药物的临床前安全性评价。
发明内容
一方面，本申请提供一种balb/c小鼠或其功能活性部分，其包含和/或表达经人源化的免疫检查点基因和/或其表达产物。
在某些实施方式中，所述经人源化的免疫检查点基因包括选自下组的一种或多种：CTLA4和PD-1。
在某些实施方式中，本申请所述的balb/c小鼠或其功能活性部分，其包含和/或表达经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物，且所述经人源化的CTLA4基因包含编码人CTLA4的胞外区的核酸序列。
在某些实施方式中，所述人CTLA4的胞外区包含SEQ ID NO.1-2中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述经人源化的CTLA4基因是纯合的或杂合的。
在某些实施方式中，所述经人源化的CTLA4基因的表达水平与相应野生型balb/c小鼠中CTLA4基因的表达水平相比没有显著差异。
在某些实施方式中，所述人CTLA4的胞外区至少包含人CTLA4的外显子2。
在某些实施方式中，所述经人源化的CTLA4基因包含SEQ ID NO.13-14中任一项所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述经人源化的CTLA4基因的表达产物包含SEQ ID NO.3-4中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本申请所述的balb/c小鼠或其功能活性部分，其包含和/或表达经人源化的PD-1基因和/或其表达产物，且所述经人源化的PD-1基因包含编码人PD-1的胞外区的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述人PD-1的胞外区包含SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述经人源化的PD-1基因是纯合的或杂合的。
在某些实施方式中，所述经人源化的PD-1基因的表达水平与相应野生型balb/c小鼠中PD-1的表达水平相比没有显著差异。
在某些实施方式中，所述人PD-1的胞外区至少包含人PD-1的外显子2及3。
在某些实施方式中，所述经人源化的PD-1基因包含SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述经人源化的PD-1基因的表达产物包含SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
另一方面，本申请提供所述balb/c小鼠的后代或其功能活性部分，其中所述后代为balb/c小鼠且包含和/或表达所述经人源化的免疫检查点基因和/或其表达产物。
另一方面，本申请提供细胞系或原代细胞培养物，其源自所述的balb/c小鼠或其功能活性部分；或源自所述的balb/c小鼠的后代。
另一方面，本申请提供组织，其源自所述的balb/c小鼠或其功能活性部分；或源自所述的balb/c小鼠的后代。
在某些实施方式中，所述组织包括所述balb/c小鼠或所述balb/c小鼠的后代的体液。
在某些实施方式中，所述体液选自以下组：血液、血浆、血清、尿液、汗液、泪液、唾液、精液和脑脊髓液。
在某些实施方式中，所述组织选自以下组：上皮组织、结缔组织、神经组织和肌肉组织。
另一方面，本申请提供细胞，其源自所述的balb/c小鼠或其功能活性部分；或源自所述的balb/c小鼠的后代。
在某些实施方式中，所述细胞选自以下组：上皮细胞、神经细胞、红细胞、白细胞、血小板、吞噬细胞、B淋巴细胞、效应B细胞、记忆B细胞、T淋巴细胞、记忆T细胞、效应T细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、成骨细胞、神经胶质细胞、肝细胞、肾细胞、腺细胞和内分泌细胞。
在某些实施方式中，所述细胞不能发育为完整的小鼠。
另一方面，本申请提供一种免疫检查点抑制剂毒性评估的系统，其包含：所述的balb/c小鼠或其功能活性部分。
在某些实施方式中，所述毒性评估包括对选自下组的一种或多种毒性进行评估：
1)所述免疫检查点抑制剂的毒性反应；
2)所述免疫检查点抑制剂的变态反应；和
3)所述免疫检查点抑制剂的发育毒性。
另一方面，本申请提供一种评估免疫检查点抑制剂毒性的方法，所述方法包括：
I)将待评估的免疫检查点抑制剂与所述的balb/c小鼠或其功能活性部分、源自所述balb/c小鼠的生物体或功能活性部分，和/或所述的系统接触；
II)对所述免疫检查点抑制剂毒性进行评估，所述毒性评估包括对选自下组的一种或多种毒性进行评估：
1)所述免疫检查点抑制剂的毒性反应；
2)所述免疫检查点抑制剂的变态反应；和
3)所述免疫检查点抑制剂的发育毒性。
在某些实施方式中，所述发育毒性包括降低生存率。
在某些实施方式中，所述毒性反应包括关节损伤、肠道损伤、心脏损伤和/或脏器淋巴细胞浸润。
在某些实施方式中，所述关节损伤包括：关节炎症、关节肿胀和/或关节疼痛。
在某些实施方式中，所述肠道损伤包括：肠道炎症、肠道反应和/或肠道出血。
在某些实施方式中，所述心脏损伤包括心肌炎。
在某些实施方式中，所述脏器淋巴细胞浸润包括：肝脏淋巴细胞浸润、肾脏淋巴细胞浸润、肺淋巴细胞浸润、小肠淋巴细胞浸润和/或唾液腺淋巴细胞浸润。
在某些实施方式中，所述变态反应包括皮肤损伤和/或贫血。
在某些实施方式中，所述皮肤损伤包括：皮肤炎症、毛发脱落和/或面部皮肤脱落。
在某些实施方式中，所述毒性评估包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人免疫检查点抑制剂之后，生存率显著降低，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的免疫检查点基因和/或其表达产物的B6小鼠。
在某些实施方式中，所述毒性评估包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人PD-1抑制剂和/或人CTLA4抑制剂之后，生存率显著降低，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的PD-1基因和/或所述经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物的B6小鼠。
在某些实施方式中，所述毒性评估包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人免疫检查点抑制剂之后，显示出组织损伤，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的免疫检查点基因和/或其表达产物的B6小鼠。
在某些实施方式中，所述毒性评估包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人PD-1抑制剂和/或人CTLA4抑制剂之后，显示出组织损伤，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的PD-1基因和/或所述经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物的B6小鼠。
在某些实施方式中，所述组织损伤选自以下组：关节损伤、皮肤损伤、肠道损伤、心脏损伤和脏器淋巴细胞浸润。
在某些实施方式中，所述毒性评估包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人免疫检查点抑制剂之后，显示出关节损伤，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的免疫检查点基因和/或其表达产物的B6小鼠。
在某些实施方式中，所述毒性评估包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人PD-1抑制剂和/或人CTLA4抑制剂之后，显示出关节损伤，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的PD-1基因和所述经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物的B6小鼠。
在某些实施方式中，所述关节损伤选自以下组：关节炎症、关节肿胀和关节疼痛。
在某些实施方式中，所述毒性评估包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人免疫检查点抑制剂之后，显示出皮肤损伤，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的免疫检查点基因和/或其表达产物的B6小鼠。
在某些实施方式中，所述毒性评估包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人PD-1抑制剂和/或人CTLA4抑制剂之后，显示出皮肤损伤，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的PD-1基因和所述经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物的B6小鼠。
在某些实施方式中，所述皮肤损伤选自以下组：皮肤炎症、毛发脱落和面部皮肤脱落。
在某些实施方式中，所述毒性评估包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人免疫检查点抑制剂之后，显示出肠道损伤，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的免疫检查点基因和/或其表达产物的B6小鼠。
在某些实施方式中，所述毒性评估包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人PD-1抑制剂和/或人CTLA4抑制剂之后，显示出肠道损伤，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的PD-1基因和所述经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物的B6小鼠。
在某些实施方式中，所述肠道损伤选自以下组：肠道炎症、肠道反应和肠道出血。
在某些实施方式中，所述毒性评估包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人免疫检查点抑制剂之后，显示出心脏损伤，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的免疫检查点基因和/或其表达产物的B6小鼠。
在某些实施方式中，所述毒性评估包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人PD-1抑制剂和/或人CTLA4抑制剂之后，显示出心脏损伤，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的PD-1基因和所述经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物的B6小鼠。
在某些实施方式中，所述心脏损伤包括心肌炎。
在某些实施方式中，所述心脏损伤包括弥漫性淋巴细胞浸润性心肌炎。
在某些实施方式中，所述毒性评估包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人免疫检查点抑制剂之后，显示出贫血，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的免疫检查点基因和/或其表达产物的B6小鼠。
在某些实施方式中，所述毒性评估包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人PD-1抑制剂和/或人CTLA4抑制剂之后，显示出贫血，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的PD-1基因和所述经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物的B6小鼠。
在某些实施方式中，所述毒性评估包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人免疫检查点抑制剂之后，显示出脏器淋巴细胞浸润，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的免疫检查点基因和/或其表达产物的B6小鼠。
在某些实施方式中，所述毒性评估包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人PD-1抑制剂和/或人CTLA4抑制剂之后，显示出脏器淋巴细胞浸润，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的PD-1基因和所述经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物的B6小鼠。
另一方面，本申请提供所述的balb/c小鼠或其功能活性部分、和/或源自所述balb/c小鼠的生物体或功能活性部分在制备系统中的用途，其中所述系统用于评估免疫检查点抑制剂的毒性。
在某些实施方式中，所述系统包括本申请所述的系统。
另一方面，本申请提供所述的balb/c小鼠或其功能活性部分、所述的balb/c小鼠的后代、所述的细胞系或原代细胞培养物、所述的组织，和/或所述的细胞在制备用于筛选药物、装置和/或组合物的系统中的用途，其中所述药物、装置和/或组合物用于治疗、预防和/或预后肿瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤选自以下组：乳腺癌、结直肠癌、黑色素瘤、肝癌、肺癌、恶性间叶肿瘤、淋巴癌、肾癌、浆细胞瘤。
另一方面，本申请提供制备所述的balb/c小鼠或其功能活性部分的方法，其包括以下的步骤：使所述balb/c小鼠或其功能活性部分包含和/或表达经人源化的免疫检查点基因和/或其表达产物。
在某些实施方式中，所述经人源化的免疫检查点基因包括选自下组的一种或多种：CTLA4和PD-1。
在某些实施方式中，所述的方法包括以下的步骤：使所述balb/c小鼠或其功能活性部分包含和/或表达经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物，且所述经人源化的CTLA4基因包含编码人CTLA4的胞外区的核酸序列。
在某些实施方式中，所述人CTLA4的胞外区至少包含人CTLA4的外显子2。
在某些实施方式中，所述经人源化的CTLA4基因包含SEQ ID NO.13-14中任一项所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述经人源化的CTLA4基因的表达产物包含SEQ ID NO.3-4中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的方法包括以下的步骤：使所述balb/c小鼠或其功能活性部分包含和/或表达经人源化的PD-1基因和/或其表达产物，且所述经人源化的PD-1基因包含编码人PD-1的胞外区的核酸序列。
在某些实施方式中，所述人PD-1的胞外区至少包含人PD-1的外显子2及3。
在某些实施方式中，所述经人源化的PD-1基因包含SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述经人源化的PD-1基因的表达产物包含SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述包含和/或表达经人源化的免疫检查点基因和/或其表达产物包括向所述balb/c小鼠或其功能活性部分转入所述经人源化的免疫检查点基因。
在某些实施方式中，转入所述经人源化的免疫检查点基因包括以下的步骤：在存在所述经人源化的免疫检查点基因的核酸分子的情况下，使balb/c小鼠的干细胞或合子的基因组与以下物质接触：
a)Cas相关蛋白；
b)gRNA，其包含I)与所述经人源化的免疫检查点的外显子的至少一部分互补的部分；II)与所述Cas蛋白的结合位点；
在某些实施方式中，所述Cas相关蛋白包括Cas9蛋白。
在某些实施方式中，所述干细胞选自以下组：胚胎干细胞，体细胞干细胞，全能干细胞，单能干细胞和诱导性多能干细胞。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：
图1显示小鼠的给药方案设计。
图2A显示B6-hPD1/hCTLA4小鼠在给药期间及给药结束后的存活率。
图2B显示BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠在给药期间及给药结束后的存活率。
图3显示小鼠经Keytruda/Yervoy联合用药处理后的四肢和毛发情况。
图4为Keytruda/Yervoy联合给药的第12天小鼠脏器解剖图(a，b)及腹部打开图(c，d)。
图5a显示BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠及B6-hPD1/hCTLA4小鼠给药后的第14天，小鼠血清中的LDH值变化。
图5b显示BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠及B6-hPD1/hCTLA4小鼠给药后的第14天，小鼠血清中的CK值变化。
图5c显示BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠给药第29天及B6-hPD1/hCTLA4小鼠给药第30天后小鼠心脏HE检测结果。
图6A-6D分别显示小鼠血清中的红细胞计数(rbc)、白细胞计数(wbc)、平均红细胞体积(mcv)和铁(FE)的含量。
图7a和图7b分别显示BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠(7a)和B6-hPD1/hCTLA4小鼠(7b)的HE检测结果。
图7c显示各脏器各自的以及综合的严重程度评分情况。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
以下对本申请做进一步描述：在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
在本申请中，术语“balb/c小鼠”(或写作“BALB/c小鼠”)通常是指一种近交系免疫缺陷小鼠。George D.Snell基于所述balb/c小鼠白色的特征，由毛色隐性上位recessiveepistasis基因将其命名。所述balb/c小鼠可以包括选自下组的亚系：BALB/cJ和BALB/cByJ。所述balb/c小鼠可易于发生肿瘤。
在本申请中，术语“功能活性部分”通常是指保留活性功能的部分结构。例如，生物体的功能活性部分，其不同于完整的生物体，可以为部分组织或部分器官，但具有与该功能活性部分所来源于的完整的生物体基本上相同的功能和/或活性。例如，生物体的功能活性部分可以为血液、血浆、血清、尿液、汗液、泪液、唾液、精液和脑脊髓液、骨骼、胃、肾、心、肝、胰、肺脏、唾液腺或肠。
在本申请中，术语“B6小鼠”也称C57BL/6小鼠，通常是指一种黑色的小鼠。所述B6小鼠由艾比·拉特洛坡(Abby Lathrop)的小鼠株雌性57号与雄性52号杂交后代中的黑毛小鼠所培育的第6组亚系而获得。所述B6小鼠可以包括选自下组的亚系：C57BL/6J和C57BL/6N。
在本申请中，术语“PD-1”，也称作编程性细胞死亡蛋白1，通常是指一种288个氨基酸的I型膜蛋白(Ishida et al.,EMBO J.,11(1992)，3887-3895)。PD-1是扩大的CD28/CTLA4T细胞调节物家族的一个成员且具有两种配体，PD-L1(B7-H1，CD274)和PD-L2(B7-DC，CD273)。该蛋白质的结构包括一个胞外IgV域，接着是一个跨膜区和一个胞内尾。胞内尾含有位于免疫受体基于酪氨酸的抑制性基序和免疫受体基于酪氨酸的转换基序中的两个磷酸化位点，提示PD-1阴性负调节TCR信号。
在本申请中，术语“CTLA4”，也称作细胞毒性T-淋巴细胞抗原-4，通常是指属于CD28家族的免疫抑制性受体。CTLA4在体内专一在T细胞上表达，和结合两种配体CD80和CD86。
在本申请中，术语“sgRNA”，“指导RNA”，“单指导RNA”和“合成指导RNA”是可互换的，并且通常是指包含指导序列的多核苷酸序列。指导序列约20bp，并且在指定靶位点的指导RNA内。
在本申请中，术语“CRISPR”通常是指成簇的规则间隔的短回文重复序列。CRISPR基因座通常与其他SSR的不同之处在于重复序列的结构，这些重复序列被称为短规则间隔重复序列(SRSR)。通常，重复序列是短的元件，以规则间隔的簇出现，具有基本恒定长度的独特插入序列。菌株之间的重复序列高度保守，但是散布的重复序列的数目和间隔区的序列通常因菌株而异。
在本申请中，术语“同源重组”通常是指一种遗传重组类型，其中核苷酸序列在被称为同源序列或同源臂的两个相似或相同的DNA分子之间交换。
在本申请中，术语“Cas相关蛋白”通常是指CRISPR-associated蛋白，其可以包括Cas蛋白或其片段的突变体、融合物和/或共价修饰。所述Cas相关蛋白可以为Cas9相关蛋白；或者可以为Cas12相关蛋白。
在本申请中，术语“CRISPR相关蛋白9”或“Cas9蛋白”通常是指与某些细菌中发现的II型CRISPR(有规律地间隔的短回文重复序列)自适应免疫系统相关的RNA引导的DNA核酸内切酶，比如，化脓性链球菌等细菌。例如，Cas9蛋白不仅可以包含在化脓链球菌中发现的野生型Cas9，而且可以包括其各种变体，例如WO2013/176772A1中描述的那些。在一些实施方案中，如Esvelt等人，Nature Methods，10(11)：1116-1121，2013中所述，Cas9蛋白可包含来自化脓性链球菌，脑膜炎奈瑟氏球菌，嗜热链球菌和树突线虫的Cas9序列。
在本申请中，术语“Cas9编码序列”通常是指能够根据在宿主细胞/宿主动物中起作用的遗传密码被转录和/或翻译以产生Cas9蛋白的多核苷酸序列。Cas9编码序列可以是DNA(例如质粒)或RNA(例如mRNA)。
在本申请中，术语“Cas9核糖蛋白”通常是指由Cas9蛋白和相关的指导RNA组成的蛋白/RNA复合物。
在本申请中，术语“CRISPR/Cas9系统”也可称为“Cas9-gRNA系统”，通常是指用于生物体中位点特异性基因组靶向的工具。例如，它可以是II型CRISPR/Cas系统，它是一种原核适应性免疫反应系统，该系统使用非编码RNA指导Cas9核酸酶诱导位点特异性DNA切割。通过细胞DNA修复机制，可以通过非同源末端连接DNA修复途径(NHEJ)或同源性定向修复(HDR)途径修复这种DNA损伤。可以利用CRISPR/Cas9系统创建一种简单的RNA可编程方法来介导哺乳动物细胞中的基因组编辑，并可以用于生成基因敲除(通过插入/缺失)或敲入(通过HDR)。
在本申请中，术语“敲入”通常是指涉及基因序列中DNA序列信息的一对一替换或内源基因座中未发现的序列信息的插入的基因工程过程。敲入可能涉及插入特定基因座的基因，因此可以是“靶向”插入。
在本申请中，术语“靶向载体”通常是指携带要插入或掺入宿主基因组和/或用于替代内源DNA片段的靶向序列的载体。
在本申请中，术语“胚胎干细胞”或“ES细胞”通常是指源自胚泡(哺乳动物的早期植入前胚胎)的内部细胞团(ICM)的多能干细胞，可以在延长的体外培养后进行培养，然后将其插入/注入正常的胚泡腔中，并诱导其恢复正常的胚胎发育程序，以分化为成年哺乳动物的各种细胞类型，包括生殖细胞。
在本申请中，术语“合子”通常是指通过两个配子例如卵和来自哺乳动物的精子之间的受精事件形成的真核细胞。
在本申请中，术语“合子性”通常是指生物体中性状的等位基因的相似度。
在本申请中，术语“纯合子”是针对特定基因或DNA(例如已被敲入的异源核酸序列)使用的，并且是指二倍体细胞或生物。这两个同源染色体都具有相同的等位基因或基因/DNA拷贝。
在本申请中，术语“杂合子”是针对特定基因或DNA(例如已被敲入的异源核酸序列)使用的，并且是指二倍体细胞或生物。这两个同源染色体具有不同的基因或DNA等位基因/拷贝/版本。
在本申请中，术语“毒性反应”通常是指药物对用药者发生的危害性反应。例如，所述毒性反应可以表现为关节损伤、肠道损伤、心脏损伤或脏器淋巴细胞浸润。在某些情形中，所述毒性反应可以表现为关节炎症、关节肿胀、关节疼痛、肠道炎症、肠道反应、肠道出血、心肌炎、肝脏淋巴细胞浸润、肾脏淋巴细胞浸润、肺淋巴细胞浸润、小肠淋巴细胞浸润或唾液腺淋巴细胞浸润。
在本申请中，术语“变态反应”也叫超敏反应，通常是指免疫系统对一些物质过于敏感，发生免疫应答，从而对机体造成伤害。例如，所述变态反应可以表现为皮肤过敏、皮肤骚痒、皮肤红肿、皮肤脱落、毛发脱落或贫血。
在本申请中，术语“发育毒性”通常是指影响个体生长发育的过程，具体可以表现为：生长迟缓、致畸作用、功能不全或异常、胚胎或胎仔致死作用。例如，所述发育毒性可以表现为生存率/存活率降低。
在本申请中，术语“包含”通常是指包括明确指定的特征，但不排除其他要素。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
balb/c小鼠或其功能活性部分
一方面，本申请提供一种balb/c小鼠或其功能活性部分，其包含和/或表达经人源化的免疫检查点基因和/或其表达产物。例如，所述balb/c小鼠或其功能活性部分，其可以包含经人源化的免疫检查点基因和/或其表达产物(例如蛋白)。又例如，所述balb/c小鼠或其功能活性部分，其可以表达经人源化的免疫检查点基因的表达产物(例如蛋白)。
在本申请中，所述功能活性部分，通常是指保留活性功能的部分结构。例如，生物体的功能活性部分，其不同于完整的生物体，可以为部分组织或部分器官，但具有与该功能活性部分所来源于的完整的生物体基本上相同的功能和/或活性。例如，生物体的功能活性部分可以为血液、血浆、血清、尿液、汗液、泪液、唾液、精液和脑脊髓液、骨骼、胃、肾、心、肝、胰、肺脏、唾液腺或肠。
在本申请中，所述balb/c小鼠的功能活性部分，其不同于完整的balb/c小鼠，但包含和/或表达经人源化的免疫检查点基因和/或其表达产物。例如，所述balb/c小鼠的功能活性部分，可以为血液(例如外周血)、血浆、血清、尿液、汗液、泪液、唾液、精液和脑脊髓液、骨骼、胃、肾、心、肝、胰、肺脏、唾液腺或肠。
在本申请中，所述经人源化的免疫检查点基因可以包括选自下组的一种或多种：CTLA4和PD-1。
在本申请中，本申请所述的balb/c小鼠或其功能活性部分，其可以包含和/或表达经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物，且所述经人源化的CTLA4基因包含编码人CTLA4的胞外区的核酸序列。例如，所述balb/c小鼠或其功能活性部分，其可以包含经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物(例如蛋白)，且所述经人源化的CTLA4基因包含编码人CTLA4的胞外区的核酸序列。又例如，所述balb/c小鼠或其功能活性部分，其可以表达经人源化的CTLA4基因的表达产物(例如蛋白)，且所述经人源化的CTLA4基因包含编码人CTLA4的胞外区的核酸序列。
在本申请中，所述人CTLA4的胞外区可以包含SEQ ID NO.1-2中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述经人源化的CTLA4基因可以是纯合的或杂合的。
在本申请中，所述经人源化的CTLA4基因的表达水平可以与相应野生型balb/c小鼠中CTLA4基因的表达水平相比没有显著差异，从而可以避免基因人源化造成小鼠表达含有人CTLA4蛋白功能域的CTLA4蛋白以及涉及CTLA4蛋白生理功能的异常。例如，所述经人源化的CTLA4基因的表达量可以与相应野生型balb/c小鼠中CTLA4基因的表达量基本相同。
在本申请中，所述人CTLA4的胞外区至少可以包含人CTLA4的外显子2。
在本申请中，所述经人源化的CTLA4基因可以包含SEQ ID NO.13-14中任一项所示的核苷酸序列。
在本申请中，所述经人源化的CTLA4基因的表达产物可以包含SEQ ID NO.3-4中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，本申请所述的balb/c小鼠或其功能活性部分，其可以包含和/或表达经人源化的PD-1基因和/或其表达产物，且所述经人源化的PD-1基因包含编码人PD-1的胞外区的氨基酸序列。例如，所述balb/c小鼠或其功能活性部分，其可以包含经人源化的PD-1基因和/或其表达产物(例如蛋白)，且所述经人源化的PD-1基因包含编码人PD-1的胞外区的核酸序列。又例如，所述balb/c小鼠或其功能活性部分，其可以表达经人源化的PD-1基因的表达产物(例如蛋白)，且所述经人源化的PD-1基因包含编码人PD-1的胞外区的核酸序列。
在本申请中，所述人PD-1的胞外区可以包含SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述经人源化的PD-1基因可以是纯合的或杂合的。
在本申请中，所述经人源化的PD-1基因的表达水平可以与相应野生型balb/c小鼠中PD-1的表达水平相比没有显著差异，从而可以避免基因人源化造成小鼠表达含有人PD-1蛋白功能域的PD-1蛋白以及涉及PD-1蛋白生理功能的异常。例如，所述经人源化的PD-1基因的表达量可以与相应野生型balb/c小鼠中PD-1的表达量基本相同。
在本申请中，所述人PD-1的胞外区至少可以包含人PD-1的外显子2及3。
在本申请中，所述经人源化的PD-1基因可以包含SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列。
在本申请中，所述经人源化的PD-1基因的表达产物可以包含SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述野生型balb/c小鼠中的PD-1的胞外区可以包含SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列。所述野生型balb/c小鼠中的PD-1基因的表达产物可以包含SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述野生型balb/c小鼠中的CTLA4的胞外区可以包含SEQ ID NO.7-8中任一项所示的氨基酸序列。所述野生型balb/c小鼠中的CTLA4基因的表达产物可以包含SEQ ID NO.9-10中任一项所示的氨基酸序列。
balb/c小鼠的后代或其功能活性部分、细胞系、组织、细胞
另一方面，本申请提供所述balb/c小鼠的后代或其功能活性部分，其中所述后代为balb/c小鼠且包含和/或表达所述经人源化的免疫检查点基因和/或其表达产物。例如，所述balb/c小鼠的后代或其功能活性部分，其可以包含经人源化的免疫检查点基因和/或其表达产物(例如蛋白)。又例如，所述balb/c小鼠的后代或其功能活性部分，其可以表达经人源化的免疫检查点基因的表达产物(例如蛋白)。
在本申请中，所述balb/c小鼠包括近交系balb/c小鼠及通过其他品系小鼠回交获得的balb/c近交系或封闭群小鼠，该小鼠至少包含30％以上balb/c背景基因组。所述balb/c小鼠可以通过生化标记检测、免疫标记检测、限制性片段长度多态性(RFLP)、微卫星Marker、单核苷酸多态性(SNP)等分子遗传标记方法鉴定种系。
在本申请中，所述balb/c小鼠的后代可以通过将所述balb/c小鼠与近交系小鼠进行杂交获得，所述近交系小鼠可以包括：C57BL/6N、C57BL/6J、CBA/CaJ、DBA/2J、A/J、BALB/cJ、C57BL/10J、FVB/NJ、C57BLKS/J、DBA/1J、NOD/ShiLtJ、B6(Cg)-Tyrc-2J或129S1/SvImJ小鼠。
另一方面，本申请提供细胞系或原代细胞培养物，其源自所述的balb/c小鼠或其功能活性部分；或源自所述的balb/c小鼠的后代。
另一方面，本申请提供组织，其源自所述的balb/c小鼠或其功能活性部分；或源自所述的balb/c小鼠的后代。
在本申请中，所述组织可以包括所述balb/c小鼠或所述balb/c小鼠的后代的体液。
在本申请中，所述体液可以选自以下组：血液、血浆、血清、尿液、汗液、泪液、唾液、精液和脑脊髓液。
在本申请中，所述组织可以选自以下组：上皮组织、结缔组织、神经组织和肌肉组织。
另一方面，本申请提供细胞，其源自所述的balb/c小鼠或其功能活性部分；或源自所述的balb/c小鼠的后代。
在本申请中，所述细胞可以选自以下组：上皮细胞、神经细胞、红细胞、白细胞、血小板、吞噬细胞、B淋巴细胞、效应B细胞、记忆B细胞、T淋巴细胞、记忆T细胞、效应T细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、成骨细胞、神经胶质细胞、肝细胞、肾细胞、腺细胞和内分泌细胞。
在本申请中，所述细胞不能发育为完整的小鼠。例如，所述细胞可以不是全能干细胞或胚胎干细胞。
免疫检查点抑制剂毒性评估系统和方法
另一方面，本申请提供一种免疫检查点抑制剂毒性评估的系统，其包含：所述的balb/c小鼠或其功能活性部分。
在本申请中，所述毒性评估可以包括对选自下组的一种或多种毒性进行评估：
1)所述免疫检查点抑制剂的毒性反应；
2)所述免疫检查点抑制剂的变态反应；和
3)所述免疫检查点抑制剂的发育毒性。
另一方面，本申请还提供一种评估免疫检查点抑制剂毒性的方法，所述方法包括：
I)将待评估的免疫检查点抑制剂与所述的balb/c小鼠或其功能活性部分、源自所述balb/c小鼠的生物体或功能活性部分，和/或所述的系统接触；
II)对所述免疫检查点抑制剂毒性进行评估，所述毒性评估包括对选自下组的一种或多种毒性进行评估：
1)所述免疫检查点抑制剂的毒性反应；
2)所述免疫检查点抑制剂的变态反应；和
3)所述免疫检查点抑制剂的发育毒性。
在本申请中，所述接触可以是口服、输注或注射。在另一些实施方案中，所述接触可以通过不同的方式进行，例如静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部或真皮内的输注或注射，例如腹腔注射。
在本申请中，所述毒性反应可以包括关节损伤、肠道损伤、心脏损伤和/或脏器淋巴细胞浸润。所述关节损伤可以包括：关节炎症、关节肿胀和/或关节疼痛。所述肠道损伤可以包括：肠道炎症、肠道反应和/或肠道出血。所述心脏损伤可以包括心肌炎。所述脏器淋巴细胞浸润可以包括：肝脏淋巴细胞浸润、肾脏淋巴细胞浸润、肺淋巴细胞浸润、小肠淋巴细胞浸润和/或唾液腺淋巴细胞浸润。
在某些情形中，所述关节损伤可以表现为四肢肿胀。所述肠道损伤可以表现为小肠出血、结肠出血和/或12指肠出血。此外，所述心脏损伤可以表现为弥漫性淋巴细胞浸润性心肌炎。可以通过心脏炎性细胞浸润分析来判断心脏损伤情况。所述脏器淋巴细胞浸润可以表现为肝脏淋巴细胞浸润、肾脏淋巴细胞浸润、肺淋巴细胞浸润、小肠淋巴细胞浸润和/或唾液腺淋巴细胞浸润。可以通过对肝脏、肺脏、肾脏、小肠及唾液腺进行组织病理分析来判断脏器淋巴细胞浸润情况。
在本申请中，所述变态反应可以包括皮肤损伤和/或贫血。所述皮肤损伤可以包括：皮肤炎症、毛发脱落和/或面部皮肤脱落。例如，所述皮肤损伤可以表现为皮肤红肿、皮肤瘙痒、毛发脱落和/或面部皮肤脱落。此外，在某些情形中，所述贫血可以表现为红细胞体积、白细胞计数和/或血清Fe含量降低。
在本申请中，所述发育毒性可以包括降低生存率。
在本申请中，所述毒性评估可以包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人免疫检查点抑制剂之后，生存率显著降低，所述对照小鼠可以包括包含所述经人源化的免疫检查点基因和/或其表达产物的B6小鼠。
在本申请中，所述毒性评估可以包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人PD-1抑制剂和/或人CTLA4抑制剂之后，生存率显著降低，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的PD-1基因和/或所述经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物的B6小鼠。
例如，所述毒性评估可以包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人PD-1抑制剂和/或人CTLA4抑制剂之后，生存率降低1％～100％、1％～50％、50％～100％、10％～20％、10％～30％、10％～40％、10％～50％、10％～60％、10％～70％、10％～80％、10％～90％、10％～100％、20％～30％、20％～40％、20％～50％、20％～60％、20％～70％、20％～80％、20％～90％、20％～100％、30％～40％、30％～50％、30％～60％、30％～70％、30％～80％、30％～90％、30％～100％、40％～50％、40％～60％、40％～70％、40％～80％、40％～90％、40％～100％、50％～60％、50％～70％、50％～80％、50％～90％或50％～100％，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的PD-1基因和/或所述经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物的B6小鼠。
在本申请中，所述毒性评估可以包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人免疫检查点抑制剂之后，显示出组织损伤，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的免疫检查点基因和/或其表达产物的B6小鼠。
在本申请中，所述毒性评估可以包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人PD-1抑制剂和/或人CTLA4抑制剂之后，显示出组织损伤，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的PD-1基因和/或所述经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物的B6小鼠。
在本申请中，所述组织损伤可以选自以下组：关节损伤、皮肤损伤、肠道损伤、心脏损伤和脏器淋巴细胞浸润。
在本申请中，所述毒性评估可以包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人免疫检查点抑制剂之后，显示出关节损伤，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的免疫检查点基因和/或其表达产物的B6小鼠。
在本申请中，所述毒性评估可以包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人PD-1抑制剂和/或人CTLA4抑制剂之后，显示出关节损伤，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的PD-1基因和所述经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物的B6小鼠。
在本申请中，所述关节损伤可以选自以下组：关节炎症、关节肿胀和关节疼痛。
例如，所述毒性评估可以包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人PD-1抑制剂和/或人CTLA4抑制剂之后，显示出关节炎症，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的PD-1基因和所述经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物的B6小鼠。
例如，所述毒性评估可以包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人PD-1抑制剂和/或人CTLA4抑制剂之后，显示出关节肿胀，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的PD-1基因和所述经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物的B6小鼠。
例如，所述毒性评估可以包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人PD-1抑制剂和/或人CTLA4抑制剂之后，显示出关节疼痛，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的PD-1基因和所述经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物的B6小鼠。
在本申请中，所述毒性评估可以包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人免疫检查点抑制剂之后，显示出皮肤损伤，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的免疫检查点基因和/或其表达产物的B6小鼠。
在本申请中，所述毒性评估可以包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人PD-1抑制剂和/或人CTLA4抑制剂之后，显示出皮肤损伤，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的PD-1基因和所述经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物的B6小鼠。
在本申请中，所述皮肤损伤可以选自以下组：皮肤炎症、毛发脱落和面部皮肤脱落。
例如，所述毒性评估可以包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人PD-1抑制剂和/或人CTLA4抑制剂之后，显示出皮肤炎症，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的PD-1基因和所述经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物的B6小鼠。
例如，所述毒性评估可以包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人PD-1抑制剂和/或人CTLA4抑制剂之后，显示出毛发脱落，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的PD-1基因和所述经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物的B6小鼠。
例如，所述毒性评估可以包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人PD-1抑制剂和/或人CTLA4抑制剂之后，显示出皮肤脱落，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的PD-1基因和所述经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物的B6小鼠。
例如，所述毒性评估可以包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人PD-1抑制剂和/或人CTLA4抑制剂之后，显示出面部皮肤脱落，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的PD-1基因和所述经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物的B6小鼠。
在本申请中，所述毒性评估可以包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人免疫检查点抑制剂之后，显示出肠道损伤，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的免疫检查点基因和/或其表达产物的B6小鼠。
在本申请中，所述毒性评估可以包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人PD-1抑制剂和/或人CTLA4抑制剂之后，显示出肠道损伤，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的PD-1基因和所述经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物的B6小鼠。
在本申请中，所述肠道损伤可以选自以下组：肠道炎症、肠道反应和肠道出血。
例如，所述毒性评估可以包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人PD-1抑制剂和/或人CTLA4抑制剂之后，显示出肠道炎症，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的PD-1基因和所述经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物的B6小鼠。
例如，所述毒性评估可以包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人PD-1抑制剂和/或人CTLA4抑制剂之后，显示出肠道反应，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的PD-1基因和所述经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物的B6小鼠。
例如，所述毒性评估可以包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人PD-1抑制剂和/或人CTLA4抑制剂之后，显示出肠道出血，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的PD-1基因和所述经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物的B6小鼠。
在本申请中，所述毒性评估可以包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人免疫检查点抑制剂之后，显示出心脏损伤，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的免疫检查点基因和/或其表达产物的B6小鼠。
在本申请中，所述毒性评估可以包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人PD-1抑制剂和/或人CTLA4抑制剂之后，显示出心脏损伤，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的PD-1基因和所述经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物的B6小鼠。所述心脏损伤可以包括心肌炎。在某些情形中，所述心脏损伤还可以包括弥漫性淋巴细胞浸润性心肌炎。
例如，所述毒性评估可以包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人PD-1抑制剂和/或人CTLA4抑制剂之后，显示出心肌炎，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的PD-1基因和所述经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物的B6小鼠。
例如，所述毒性评估可以包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人PD-1抑制剂和/或人CTLA4抑制剂之后，显示出弥漫性淋巴细胞浸润性心肌炎，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的PD-1基因和所述经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物的B6小鼠。
在本申请中，所述毒性评估可以包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人免疫检查点抑制剂之后，显示出贫血，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的免疫检查点基因和/或其表达产物的B6小鼠。
在本申请中，所述毒性评估可以包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人PD-1抑制剂和/或人CTLA4抑制剂之后，显示出贫血，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的PD-1基因和所述经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物的B6小鼠。
例如，所述毒性评估可以包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人PD-1抑制剂和/或人CTLA4抑制剂之后，显示出红细胞体积降低、白细胞计数减少和/或血清Fe含量降低，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的PD-1基因和所述经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物的B6小鼠。
在本申请中，所述毒性评估可以包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人免疫检查点抑制剂之后，显示出脏器淋巴细胞浸润，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的免疫检查点基因和/或其表达产物的B6小鼠。
在本申请中，所述毒性评估可以包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人PD-1抑制剂和/或人CTLA4抑制剂之后，显示出脏器淋巴细胞浸润，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的PD-1基因和所述经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物的B6小鼠。
例如，所述毒性评估可以包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人PD-1抑制剂和/或人CTLA4抑制剂之后，显示出肝脏淋巴细胞浸润、肾脏淋巴细胞浸润、肺淋巴细胞浸润、小肠淋巴细胞浸润和/或唾液腺淋巴细胞浸润，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的PD-1基因和所述经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物的B6小鼠。
在本申请中，所述施用可以通过不同的方式进行，例如静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部或真皮内输注或注射。在某些实施方式中，所述施用可以是口服。在其他的一些实施方式中，所述施用可以不间断进行。
用途和制备方法
另一方面，本申请提供所述的balb/c小鼠或其功能活性部分、和/或源自所述balb/c小鼠的生物体或功能活性部分在制备系统中的用途，其中所述系统用于评估免疫检查点抑制剂的毒性。所述系统可以包括本申请所述的系统。
另一方面，本申请所述的balb/c小鼠或其功能活性部分、和/或源自所述balb/c小鼠的生物体或功能活性部分，其可以用于评估免疫检查点抑制剂的毒性。
另一方面，本申请提供所述的balb/c小鼠或其功能活性部分、所述的balb/c小鼠的后代、所述的细胞系或原代细胞培养物、所述的组织，和/或所述的细胞在制备用于筛选药物、装置和/或组合物的系统中的用途，其中所述药物、装置和/或组合物可以用于治疗、预防和/或预后肿瘤。
另一方面，本申请所述的balb/c小鼠或其功能活性部分、所述的balb/c小鼠的后代、所述的细胞系或原代细胞培养物、所述的组织，和/或所述的细胞，其可以用于筛选药物、装置和/或组合物，所述药物、装置和/或组合物可以用于治疗、预防和/或预后肿瘤。
在本申请中，所述肿瘤可以选自以下组：乳腺癌、结直肠癌、黑色素瘤、肝癌、肺癌、恶性间叶肿瘤、淋巴癌、肾癌、浆细胞瘤。
另一方面，本申请提供制备所述的balb/c小鼠或其功能活性部分的方法，其包括以下的步骤：使所述balb/c小鼠或其功能活性部分包含和/或表达经人源化的免疫检查点基因和/或其表达产物。
在本申请中，所述经人源化的免疫检查点基因可以包括选自下组的一种或多种：CTLA4和PD-1。
在本申请中，所述的方法可以包括以下的步骤：使所述balb/c小鼠或其功能活性部分包含和/或表达经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物，且所述经人源化的CTLA4基因包含编码人CTLA4的胞外区的核酸序列。
在本申请中，所述人CTLA4的胞外区至少可以包含人CTLA4的外显子2。
在本申请中，所述经人源化的CTLA4基因可以包含SEQ ID NO.13-14中任一项所示的核苷酸序列。
在本申请中，所述经人源化的CTLA4基因的表达产物可以包含SEQ ID NO.3-4中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述的方法可以包括以下的步骤：使所述balb/c小鼠或其功能活性部分包含和/或表达经人源化的PD-1基因和/或其表达产物，且所述经人源化的PD-1基因包含编码人PD-1的胞外区的核酸序列。
在本申请中，所述人PD-1的胞外区至少可以包含人PD-1的外显子2及3。
在本申请中，所述经人源化的PD-1基因可以包含SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列。
在本申请中，所述经人源化的PD-1基因的表达产物可以包含SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述包含和/或表达经人源化的免疫检查点基因和/或其表达产物可以包括向所述balb/c小鼠或其功能活性部分转入所述经人源化的免疫检查点基因。其中，转入所述经人源化的免疫检查点基因可以包括以下的步骤：在存在所述经人源化的免疫检查点基因的核酸分子的情况下，使balb/c小鼠的干细胞或合子的基因组与以下物质接触：
a)Cas相关蛋白；
b)gRNA，其包含I)与所述经人源化的免疫检查点的外显子的至少一部分互补的部分；II)与所述Cas蛋白的结合位点；
在本申请中，所述Cas相关蛋白可以包括Cas9蛋白。
在本申请中，所述干细胞可以选自以下组：胚胎干细胞，体细胞干细胞，全能干细胞，单能干细胞和诱导性多能干细胞。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的balb/c小鼠、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniais，T.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd edition，Cold spring HarborLaboratory Press。
实施例
实施例所用的实验设备和材料如下：
血生化分析仪(HITACHI 7020,Japan Care Co.,Ltd.Japan)；日本和光(WAKO)原装进口配套试剂；血液自动分析仪(型号：HEMAVET 950FS厂家：DREW)；超声成像系统(VISUAL SONICS，Vevo 770)；异氟烷(维特宁，深圳市瑞沃德生命科技，100ml)；医用超声耦合剂(凯普乐，杭州凯普乐医疗器械有限公司，250g)；刀片。
数据统计方法如下：
所有数据通过GraphPad Prism进行分析。2组间数据通过unpaired two-tailedStudent's t-test，多重比较检验通过One-way ANOVA方差分析，Bonferroni multiplecomparison test或Dunnett's test进行检验。另，偏离值通过Thompson test或Grubbs'test检验去除。
实施例1.小鼠模型的构建
小鼠模型的构建方法如下：
将BALB/c小鼠(4-5周龄，雌性，购于集萃药康生物科技有限公司)的PD-1胞外区替换为相应的人源基因片段(如SEQ ID NO.15所示)，并将小鼠CTLA4基因编码胞外区的部分替换为对应的人源基因序列(如SEQ ID NO.13所示)，而胞内区则保留完整的鼠源序列，将得到的小鼠模型命名为BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠(即本申请所述的balb/c小鼠)。
用同样的方法，将B6小鼠(4-5周龄，雌性，购于江苏集萃药康生物科技有限公司)的PD-1胞外区替换为相应的人源基因片段(如SEQ ID NO.15所示)，并将小鼠CTLA4基因编码胞外区的部分替换为对应的人源基因序列(如SEQ ID NO.13所示)，而胞内区则保留完整的鼠源序列，将得到的小鼠模型命名为B6-hPD1/hCTLA4小鼠(即对照小鼠)。
实验分别获得BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠和B6-hPD1/hCTLA4小鼠各40只，用于人类PD-1抑制剂、CTLA4抑制剂以及两者联用的药效评价及安全性评价。
实施例2.小鼠模型用于药效评价及安全性评价
2.1.实验方案设计
4-5周龄的BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠及B6-hPD1/hCTLA4小鼠分别单独给予Keytruda抗体(购于华特药房，货号：S001188)或Yervoy抗体(购于华特药房，货号：ABA4171)，或者用这两种抗体联合处理。通过腹腔注射(i.p.)的方式，每3天一次，共给予8次；开始给药后进行小鼠体重的测量，所有小鼠每周测2次；给药后第29天或者第30天，小鼠安乐死进行血清、组织器官收集，并进行毒理学相关指标检测。具体给药方案如表1和图1所示，其中PBS是指磷酸缓冲盐溶液，用于空白对照；“Q3d x 8”表示每3天一次，共给予8次。
表1.小鼠的给药方案
2.2.生存率
BALB/c-hPD1/hCTLA4及B6-hPD1/hCTLA4小鼠在给药期间及给药结束后体重均无明显变化。图2A显示B6-hPD1/hCTLA4小鼠在给药期间及给药结束后的存活率，图2B显示BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠在给药期间及给药结束后的存活率，图中anti-hPD1表示给予Keytruda，anti-hCTLA4表示给予Yervoy。可以看出，成年的BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠经Keytruda/Yervoy联合处理后，小鼠存活率明显降低(D18：50％)。
2.3.皮肤及关节药物毒性
图3显示小鼠经Keytruda/Yervoy联合用药处理后的四肢和毛发情况，可以看出，在BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠中，相比PBS组(即空白对照)，BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠经Keytruda/Yervoy联合用药处理第6天，爪子出现四肢肿胀，持续一周后症状会有减轻。此外，BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠经Keytruda/Yervoy联合用药处理出现面颊毛发脱落。这些表型的出现，说明Keytruda/Yervoy联合用药能够引起部分小鼠皮肤炎症及关节炎症，这与临床上免疫检查点抑制剂治疗后引起患者皮炎及关节疼痛是一致的。
2.4.肠道炎症
Keytruda/Yervoy抗体联合处理的BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠在第4次给药后(Day9)开始死亡，死亡时间主要出现在给药第9-15天。其中，在第4次给药后(Day9)开始出现死亡(1只)，第5次给药后(Day12)死亡3只，第7次给药后(Day18)死亡1只，实验过程中共计死亡5只；BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠未给药刺激对照组(即PBS组)在第6次给药后第二天(Day16)死亡1只。小鼠死亡前表现为身体发凉、弓背、活动异常缓慢、毛发凌乱无光泽等。对死亡后的小鼠进行剖检发现，BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠肠道在不同的部位有严重出血现象(结肠、12指肠)，这与临床上患者出现严重的肠道炎症相吻合，而B6-hPD1/hCTLA4小鼠未出现类似表型。
图4为Keytruda/Yervoy联合给药的第12天小鼠脏器解剖图(a，b)及腹部打开图(c，d)。可以看出，对照小鼠(即B6-hPD1/hCTLA4小鼠)的脏器无明显的变化(图4a)；Keytruda/Yervoy联合处理后的BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠的小肠出现明显的出血(图4b)；与正常鼠(即BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠未给药刺激组)(图4c)相比，Keytruda/Yervoy联合给药第12天，BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠出现严重的肠道出血反应(图4d)。
2.5.心脏损伤
BALB/c-hPD1/hCTLA4及B6-hPD1/hCTLA4小鼠在完成5次给药之后，于第14天对小鼠眼眶采血，收集血清进行血生化、血常规检测，分析血清中心脏毒性指标肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)的变化。
结果如图5a和图5b所示，BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠及B6-hPD1/hCTLA4小鼠给药后的第14天，小鼠血清中的LDH值(图5a)、CK值(图5b)的变化，其中，vehicle表示PBS组，anti-hPD1表示单独给予Keytruda，anti-hCTLA4表示单独给予Yervoy，combo表示Keytruda/Yervoy联合给药，B6表示B6-hPD1/hCTLA4小鼠，BALB/c表示BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠。可以看出，B6-hPD1/hCTLA4小鼠中对照组(即PBS组)及各给药组的CK值及LDH值无显著变化。BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠中，联合给药组LDH显著增加(p<0.05)；与对照组(即PBS组)相比，经Keytruda单独处理后的BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠的心脏CK值显著增加，再现了Keytruda在临床上会引起严重的心肌炎表型，说明BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠模型能够用于抗PD-1抗体的安全性评价。
BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠给药第29天后，随机选取BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠中的对照组(选5只)及实验组(全部)小鼠进行终点取材，收集外周血进行血常规、血生化检测；对小鼠心脏进行生理盐水穿心灌注并使用KCl浸泡处理，之后进行心脏炎性细胞浸润分析。此外，B6-hPD1/hCTLA4小鼠给药第30天后，随机选取B6-hPD1/hCTLA4小鼠中的对照组及实验组各5只进行终点取材，收集外周血进行血常规、血生化检测；对小鼠心脏进行生理盐水穿心灌注并使用KCl浸泡处理，之后进行心脏炎性细胞浸润分析。结果如图5c所示，BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠给药第29天及B6-hPD1/hCTLA4小鼠给药第30天后小鼠心脏HE检测结果(图5c，虚线表示炎症浸润)，B6表示B6-hPD1/hCTLA4小鼠，BALB/c表示BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠，可以看出，Keytruda/Yervoy联合处理后，BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠心脏出现更严重的弥漫性淋巴细胞浸润性心肌炎。
2.6.贫血情况
BALB/c-hPD1/hCTLA4及B6-hPD1/hCTLA4小鼠完成全部给药后，收集各小鼠血清进行血生化、血常规检测。图6A-6D分别显示小鼠血清中的红细胞计数(rbc)、白细胞计数(wbc)、平均红细胞体积(mcv)和铁(FE)的含量，图中数据用“均数±标准误”表示，样本数n为5～10，圆圈中为异常点，异常点是通过格鲁布斯测试，也被称为ESD(extremestudentized deviate)方法挑出的显著异常值(Significant outlier.P<0.05)，此外，“+”表示给予该药，“-”表示不给予该药，B6表示B6-hPD1/hCTLA4小鼠，BALB/c表示BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠。
可以看出，两种小鼠中，红细胞计数(rbc)无明显差异，白细胞计数(wbc)有降低倾向；平均红细胞体积(mcv)在Keytruda、Yervoy单独给药后均有降低倾向，联合给药条件下显著降低。两种小鼠给药组血清中Fe含量在Keytruda、Yervoy单独给药后均有降低倾向，联合给药条件下显著降低，B6-hPD1/hCTLA4联合给药组出现显著性降低。综合血清中的指标数据，经过Keytruda/Yervoy联合治疗后的2种小鼠出现贫血倾向。
2.7.脏器情况
两种小鼠给药完成后，给药第D29天后随机选取BALB/c-hPD1/hCTLA4对照组(即PBS组，5只)小鼠及实验组(全部)小鼠进行终点取材，收集小鼠肝脏、肺脏、肾脏、小肠及唾液腺进行组织病理分析。不同器官的收集方式：小肠取材从十二指肠开始，统一量取20cm后用PBS清洗干净并擦干称重，卷肠后用4％PFA固定；肝脏、肺脏、肾脏统一取左侧，分别为肺左叶、左肾、肝左叶，用4％PFA固定。所有组织进行石蜡切片及HE染色处理。给药第30天后随机选取B6-hPD1/hCTLA4对照组及实验组各5只小鼠进行终点取材，与BALB/c背景小鼠采取同样的方法收集脏器并进行HE检测，分析器官的炎症。根据各器官及腺体炎症进行毒性评分；根据所有腺体和器官的综合炎症进行毒性评分。
图7a和图7b分别显示BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠(7a)和B6-hPD1/hCTLA4小鼠(7b)的HE检测结果，其中箭头表示炎症病灶。图7c显示各脏器各自的以及综合的严重程度评分情况，其中，0表示无炎症；1表示轻度炎症；2表示中度炎症；3表示重度炎症。可以看出，B6-hPD1/hCTLA4小鼠对照组与实验组之间的炎症评分无明显差异；BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠中，与对照组相比，单独给予Keytruda、Yervoy治疗或者联合给药组炎症评分均有显著增加。结果表明，Keytruda/Yervoy联用后，BALB/c-hPD1/hCTLA4小鼠脏器内出现更严重的淋巴细胞浸润，小鼠脏器炎症明显高于B6-hPD1/hCTLA4小鼠。
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。
序列表
<110> 江苏集萃药康生物科技有限公司
<120> 一种balb/c小鼠模型及其用途
<130> 20201101
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 161
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala
1 5 10 15
Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro
20 25 30
Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala
35 40 45
Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly
50 55 60
Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln
65 70 75 80
Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr
85 90 95
Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val
100 105 110
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile
115 120 125
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly
130 135 140
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser
145 150 155 160
Asp
<210> 2
<211> 174
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala
1 5 10 15
Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro
20 25 30
Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala
35 40 45
Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly
50 55 60
Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln
65 70 75 80
Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr
85 90 95
Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val
100 105 110
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile
115 120 125
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly
130 135 140
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Ala Lys Glu Lys Lys Pro Ser Tyr
145 150 155 160
Asn Arg Gly Leu Cys Glu Asn Ala Pro Asn Arg Ala Arg Met
165 170
<210> 3
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Ala Cys Leu Gly Leu Arg Arg Tyr Lys Ala Gln Leu Gln Leu Pro
1 5 10 15
Ser Arg Thr Trp Pro Phe Val Ala Leu Leu Thr Leu Leu Phe Ile Pro
20 25 30
Val Phe Ser Glu Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala
35 40 45
Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly
50 55 60
Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln
65 70 75 80
Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr
85 90 95
Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val
100 105 110
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile
115 120 125
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly
130 135 140
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser
145 150 155 160
Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Val Ala Val Ser Leu Gly Leu Phe Phe
165 170 175
Tyr Ser Phe Leu Val Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys
180 185 190
Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu
195 200 205
Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn
210 215 220
<210> 4
<211> 174
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Ala Cys Leu Gly Leu Arg Arg Tyr Lys Ala Gln Leu Gln Leu Pro
1 5 10 15
Ser Arg Thr Trp Pro Phe Val Ala Leu Leu Thr Leu Leu Phe Ile Pro
20 25 30
Val Phe Ser Glu Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala
35 40 45
Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly
50 55 60
Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln
65 70 75 80
Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr
85 90 95
Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val
100 105 110
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile
115 120 125
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly
130 135 140
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Ala Lys Glu Lys Lys Ser Ser Tyr
145 150 155 160
Asn Arg Gly Leu Cys Glu Asn Ala Pro Asn Arg Ala Arg Met
165 170
<210> 5
<211> 170
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val
165 170
<210> 6
<211> 288
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Gly Met Val Ile Gly Ile Met Ser Ala
165 170 175
Leu Val Gly Ile Pro Val Leu Leu Leu Leu Ala Trp Ala Leu Ala Val
180 185 190
Phe Cys Ser Thr Ser Met Ser Glu Ala Arg Gly Ala Gly Ser Lys Asp
195 200 205
Asp Thr Leu Lys Glu Glu Pro Ser Ala Ala Pro Val Pro Ser Val Ala
210 215 220
Tyr Glu Glu Leu Asp Phe Gln Gly Arg Glu Lys Thr Pro Glu Leu Pro
225 230 235 240
Thr Ala Cys Val His Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Thr Glu Gly
245 250 255
Leu Gly Ala Ser Ala Met Gly Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Leu Gln
260 265 270
Gly Pro Arg Pro Pro Arg His Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
275 280 285
<210> 7
<211> 161
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Ala Cys Leu Gly Leu Arg Arg Tyr Lys Ala Gln Leu Gln Leu Pro
1 5 10 15
Ser Arg Thr Trp Pro Phe Val Ala Leu Leu Thr Leu Leu Phe Ile Pro
20 25 30
Val Phe Ser Glu Ala Ile Gln Val Thr Gln Pro Ser Val Val Leu Ala
35 40 45
Ser Ser His Gly Val Ala Ser Phe Pro Cys Glu Tyr Ser Pro Ser His
50 55 60
Asn Thr Asp Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Thr Asn Asp Gln
65 70 75 80
Met Thr Glu Val Cys Ala Thr Thr Phe Thr Glu Lys Asn Thr Val Gly
85 90 95
Phe Leu Asp Tyr Pro Phe Cys Ser Gly Thr Phe Asn Glu Ser Arg Val
100 105 110
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Val Asp Thr Gly Leu Tyr Leu
115 120 125
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Phe Val Gly Met Gly
130 135 140
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser
145 150 155 160
Asp
<210> 8
<211> 174
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met Ala Cys Leu Gly Leu Arg Arg Tyr Lys Ala Gln Leu Gln Leu Pro
1 5 10 15
Ser Arg Thr Trp Pro Phe Val Ala Leu Leu Thr Leu Leu Phe Ile Pro
20 25 30
Val Phe Ser Glu Ala Ile Gln Val Thr Gln Pro Ser Val Val Leu Ala
35 40 45
Ser Ser His Gly Val Ala Ser Phe Pro Cys Glu Tyr Ser Pro Ser His
50 55 60
Asn Thr Asp Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Thr Asn Asp Gln
65 70 75 80
Met Thr Glu Val Cys Ala Thr Thr Phe Thr Glu Lys Asn Thr Val Gly
85 90 95
Phe Leu Asp Tyr Pro Phe Cys Ser Gly Thr Phe Asn Glu Ser Arg Val
100 105 110
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Val Asp Thr Gly Leu Tyr Leu
115 120 125
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Phe Val Gly Met Gly
130 135 140
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Ala Lys Glu Lys Lys Ser Ser Tyr
145 150 155 160
Asn Arg Gly Leu Cys Glu Asn Ala Pro Asn Arg Ala Arg Met
165 170
<210> 9
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Met Ala Cys Leu Gly Leu Arg Arg Tyr Lys Ala Gln Leu Gln Leu Pro
1 5 10 15
Ser Arg Thr Trp Pro Phe Val Ala Leu Leu Thr Leu Leu Phe Ile Pro
20 25 30
Val Phe Ser Glu Ala Ile Gln Val Thr Gln Pro Ser Val Val Leu Ala
35 40 45
Ser Ser His Gly Val Ala Ser Phe Pro Cys Glu Tyr Ser Pro Ser His
50 55 60
Asn Thr Asp Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Thr Asn Asp Gln
65 70 75 80
Met Thr Glu Val Cys Ala Thr Thr Phe Thr Glu Lys Asn Thr Val Gly
85 90 95
Phe Leu Asp Tyr Pro Phe Cys Ser Gly Thr Phe Asn Glu Ser Arg Val
100 105 110
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Val Asp Thr Gly Leu Tyr Leu
115 120 125
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Phe Val Gly Met Gly
130 135 140
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser
145 150 155 160
Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Val Ala Val Ser Leu Gly Leu Phe Phe
165 170 175
Tyr Ser Phe Leu Val Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys
180 185 190
Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu
195 200 205
Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn
210 215 220
<210> 10
<211> 169
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp
20 25 30
Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met
50 55 60
Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala
65 70 75 80
Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln
85 90 95
Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp
100 105 110
Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val
130 135 140
Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln Gly Met
165
<210> 11
<211> 288
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp
20 25 30
Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met
50 55 60
Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala
65 70 75 80
Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln
85 90 95
Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp
100 105 110
Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val
130 135 140
Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln Gly Met Val Ile Gly Ile Met Ser Ala
165 170 175
Leu Val Gly Ile Pro Val Leu Leu Leu Leu Ala Trp Ala Leu Ala Val
180 185 190
Phe Cys Ser Thr Ser Met Ser Glu Ala Arg Gly Ala Gly Ser Lys Asp
195 200 205
Asp Thr Leu Lys Glu Glu Pro Ser Ala Ala Pro Val Pro Ser Val Ala
210 215 220
Tyr Glu Glu Leu Asp Phe Gln Gly Arg Glu Lys Thr Pro Glu Leu Pro
225 230 235 240
Thr Ala Cys Val His Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Thr Glu Gly
245 250 255
Leu Gly Ala Ser Ala Met Gly Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Leu Gln
260 265 270
Gly Pro Arg Pro Pro Arg His Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
275 280 285
<210> 12
<211> 672
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atggcttgtc ttggactccg gaggtacaaa gctcaactgc agctgccttc taggacttgg 60
ccttttgtag ccctgctcac tcttcttttc atcccagtct tctctgaagc catgcacgtg 120
gcccagcctg ctgtggtact ggccagcagc cgaggcatcg ccagctttgt gtgtgagtat 180
gcatctccag gcaaagccac tgaggtccgg gtgacagtgc ttcggcaggc tgacagccag 240
gtgactgaag tctgtgcggc aacctacatg atggggaatg agttgacctt cctagatgat 300
tccatctgca cgggcacctc cagtggaaat caagtgaacc tcactatcca aggactgagg 360
gccatggaca cgggactcta catctgcaag gtggagctca tgtacccacc gccatactac 420
ctgggcatag gcaacgggac gcagatttat gtcattgatc cagaaccatg cccggattct 480
gacttcctcc tttggatcct tgtcgcagtt agcttggggt tgttttttta cagtttcctg 540
gtcactgctg tttctttgag caagatgcta aagaaaagaa gtcctcttac aacaggggtc 600
tatgtgaaaa tgcccccaac agagccagaa tgtgaaaagc aatttcagcc ttattttatt 660
cccatcaact ga 672
<210> 13
<211> 562
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atggcttgtc ttggactccg gaggtacaaa gctcaactgc agctgccttc taggacttgg 60
ccttttgtag ccctgctcac tcttcttttc atcccagtct tctctgaagc catgcacgtg 120
gcccagcctg ctgtggtact ggccagcagc cgaggcatcg ccagctttgt gtgtgagtat 180
gcatctccag gcaaagccac tgaggtccgg gtgacagtgc ttcggcaggc tgacagccag 240
gtgactgaag tctgtgcggc aacctacatg atggggaatg agttgacctt cctagatgat 300
tccatctgca cgggcacctc cagtggaaat caagtgaacc tcactatcca aggactgagg 360
gccatggaca cgggactcta catctgcaag gtggagctca tgtacccacc gccatactac 420
ctgggcatag gcaacgggac gcagatttat gtcattgcta aagaaaagaa gtcctcttac 480
aacaggggtc tatgtgaaaa tgcccccaac agagccagaa tgtgaaaagc aatttcagcc 540
ttattttatt cccatcaact ga 562
<210> 14
<211> 867
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atgtgggtcc ggcaggtacc ctggtcattc acttgggctg tgctgcagtt gagctggcaa 60
tcagggtggc ttctagagtc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 120
ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 180
gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 240
gccttccccg aggaccgcag ccagcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 300
cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 360
tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aaggcgcaga tcaaagagag cctgcgggca 420
gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccaccccag cccctcaccc 480
aggccagccg gccagtttca aggcatggtc attggtatca tgagtgccct agtgggtatc 540
cctgtattgc tgctgctggc ctgggcccta gctgtcttct gctcaacaag tatgtcagag 600
gccagaggag ctggaagcaa ggacgacact ctgaaggagg agccttcagc agcacctgtc 660
cctagtgtgg cctatgagga gctggacttc cagggacgag agaagacacc agagctccct 720
accgcctgtg tgcacacaga atatgccacc attgtcttca ctgaagggct gggtgcctcg 780
gccatgggac gtaggggctc agctgatggc ctgcagggtc ctcggcctcc aagacatgag 840
gatggacatt gttcttggcc tctttga 867
Claims (76)
1.balb/c小鼠或其功能活性部分，其包含和/或表达经人源化的免疫检查点基因和/或其表达产物。
2.根据权利要求1所述的balb/c小鼠或其功能活性部分，其中所述经人源化的免疫检查点基因包括选自下组的一种或多种：CTLA4和PD-1。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的balb/c小鼠或其功能活性部分，其包含和/或表达经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物，且所述经人源化的CTLA4基因包含编码人CTLA4的胞外区的核酸序列。
4.根据权利要求3所述的balb/c小鼠或其功能活性部分，其中所述人CTLA4的胞外区包含SEQ ID NO.1-2中任一项所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求3-4中任一项所述的balb/c小鼠或其功能活性部分，其中所述经人源化的CTLA4基因是纯合的或杂合的。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的balb/c小鼠或其功能活性部分，其中所述经人源化的CTLA4基因的表达水平与相应野生型balb/c小鼠中CTLA4基因的表达水平相比没有显著差异。
7.根据权利要求3-6中任一项所述的balb/c小鼠或其功能活性部分，其中所述人CTLA4的胞外区至少包含人CTLA4的外显子2。
8.根据权利要求3-7中任一项所述的balb/c小鼠或其功能活性部分，其中所述经人源化的CTLA4基因包含SEQ ID NO.13-14中任一项所示的核苷酸序列。
9.根据权利要求3-8中任一项所述的balb/c小鼠或其功能活性部分，其中所述经人源化的CTLA4基因的表达产物包含SEQ ID NO.3-4中任一项所示的氨基酸序列。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的balb/c小鼠或其功能活性部分，其包含和/或表达经人源化的PD-1基因和/或其表达产物，且所述经人源化的PD-1基因包含编码人PD-1的胞外区的氨基酸序列。
11.根据权利要求10所述的balb/c小鼠或其功能活性部分，其中所述人PD-1的胞外区包含SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。
12.根据权利要求10-11中任一项所述的balb/c小鼠或其功能活性部分，其中所述经人源化的PD-1基因是纯合的或杂合的。
13.根据权利要求10-12中任一项所述的balb/c小鼠或其功能活性部分，其中所述经人源化的PD-1基因的表达水平与相应野生型balb/c小鼠中PD-1的表达水平相比没有显著差异。
14.根据权利要求10-13中任一项所述的balb/c小鼠或其功能活性部分，其中所述人PD-1的胞外区至少包含人PD-1的外显子2及3。
15.根据权利要求10-14中任一项所述的balb/c小鼠或其功能活性部分，其中所述经人源化的PD-1基因包含SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列。
16.根据权利要求10-15中任一项所述的balb/c小鼠或其功能活性部分，其中所述经人源化的PD-1基因的表达产物包含SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的balb/c小鼠的后代或其功能活性部分，其中所述后代为balb/c小鼠且包含和/或表达所述经人源化的免疫检查点基因和/或其表达产物。
18.细胞系或原代细胞培养物，其源自权利要求1-16中任一项所述的balb/c小鼠或其功能活性部分；或源自权利要求17所述的balb/c小鼠的后代。
19.组织，其源自权利要求1-16中任一项所述的balb/c小鼠或其功能活性部分；或源自权利要求17所述的balb/c小鼠的后代。
20.根据权利要求19所述组织，其包括所述balb/c小鼠或所述balb/c小鼠的后代的体液。
21.根据权利要求20所述组织，其中所述体液选自以下组：血液、血浆、血清、尿液、汗液、泪液、唾液、精液和脑脊髓液。
22.根据权利要求19-21中任一项所述的组织，其选自以下组：上皮组织、结缔组织、神经组织和肌肉组织。
23.细胞，其源自权利要求1-16中任一项所述的balb/c小鼠或其功能活性部分；或源自权利要求17所述的balb/c小鼠的后代。
24.根据权利要求23所述的细胞，其中所述细胞选自以下组：上皮细胞、神经细胞、红细胞、白细胞、血小板、吞噬细胞、B淋巴细胞、效应B细胞、记忆B细胞、T淋巴细胞、记忆T细胞、效应T细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、成骨细胞、神经胶质细胞、肝细胞、肾细胞、腺细胞和内分泌细胞。
25.根据权利要求23-24中任一项所述的细胞，其中所述细胞不能发育为完整的小鼠。
26.一种免疫检查点抑制剂毒性评估的系统，其包含：权利要求1-16中任一项所述的balb/c小鼠或其功能活性部分。
27.根据权利要求26所述的系统，其中所述毒性评估包括对选自下组的一种或多种毒性进行评估：
1)所述免疫检查点抑制剂的毒性反应；
2)所述免疫检查点抑制剂的变态反应；和
3)所述免疫检查点抑制剂的发育毒性。
28.一种评估免疫检查点抑制剂毒性的方法，所述方法包括：
I)将待评估的免疫检查点抑制剂与权利要求1-16中任一项所述的balb/c小鼠或其功能活性部分、源自所述balb/c小鼠的生物体或功能活性部分，和/或权利要求26-27中任一项所述的系统接触；
II)对所述免疫检查点抑制剂毒性进行评估，所述毒性评估包括对选自下组的一种或多种毒性进行评估：
1)所述免疫检查点抑制剂的毒性反应；
2)所述免疫检查点抑制剂的变态反应；和
3)所述免疫检查点抑制剂的发育毒性。
29.根据权利要求26-28中任一项所述的系统或方法，其中所述发育毒性包括降低生存率。
30.根据权利要求26-29中任一项所述的系统或方法，其中所述毒性反应包括关节损伤、肠道损伤、心脏损伤和/或脏器淋巴细胞浸润。
31.根据权利要求30所述的系统或方法，其中所述关节损伤包括：关节炎症、关节肿胀和/或关节疼痛。
32.根据权利要求30-31中任一项所述的系统或方法，其中所述肠道损伤包括：肠道炎症、肠道反应和/或肠道出血。
33.根据权利要求30-32中任一项所述的系统或方法，其中所述心脏损伤包括心肌炎。
34.根据权利要求30-33中任一项所述的系统或方法，其中所述脏器淋巴细胞浸润包括：肝脏淋巴细胞浸润、肾脏淋巴细胞浸润、肺淋巴细胞浸润、小肠淋巴细胞浸润和/或唾液腺淋巴细胞浸润。
35.根据权利要求28-34中任一项所述的系统或方法，其中所述变态反应包括皮肤损伤和/或贫血。
36.根据权利要求35所述的系统或方法，其中所述皮肤损伤包括：皮肤炎症、毛发脱落和/或面部皮肤脱落。
37.根据权利要求26-36中任一项所述的系统或方法，其中所述毒性评估包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人免疫检查点抑制剂之后，生存率显著降低，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的免疫检查点基因和/或其表达产物的B6小鼠。
38.根据权利要求26-37中任一项所述的系统或方法，其中所述毒性评估包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人PD-1抑制剂和/或人CTLA4抑制剂之后，生存率显著降低，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的PD-1基因和/或所述经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物的B6小鼠。
39.根据权利要求26-38中任一项所述的系统或方法，其中所述毒性评估包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人免疫检查点抑制剂之后，显示出组织损伤，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的免疫检查点基因和/或其表达产物的B6小鼠。
40.根据权利要求26-39中任一项所述的系统或方法，其中所述毒性评估包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人PD-1抑制剂和/或人CTLA4抑制剂之后，显示出组织损伤，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的PD-1基因和/或所述经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物的B6小鼠。
41.根据权利要求39-40中任一项所述的系统或方法，其中所述组织损伤选自以下组：关节损伤、皮肤损伤、肠道损伤、心脏损伤和脏器淋巴细胞浸润。
42.根据权利要求26-41中任一项所述的系统或方法，其中所述毒性评估包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人免疫检查点抑制剂之后，显示出关节损伤，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的免疫检查点基因和/或其表达产物的B6小鼠。
43.根据权利要求26-42中任一项所述的系统或方法，其中所述毒性评估包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人PD-1抑制剂和/或人CTLA4抑制剂之后，显示出关节损伤，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的PD-1基因和所述经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物的B6小鼠。
44.根据权利要求42-43中任一项所述的系统或方法，其中所述关节损伤选自以下组：关节炎症、关节肿胀和关节疼痛。
45.根据权利要求26-44中任一项所述的系统或方法，其中所述毒性评估包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人免疫检查点抑制剂之后，显示出皮肤损伤，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的免疫检查点基因和/或其表达产物的B6小鼠。
46.根据权利要求26-45中任一项所述的系统或方法，其中所述毒性评估包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人PD-1抑制剂和/或人CTLA4抑制剂之后，显示出皮肤损伤，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的PD-1基因和所述经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物的B6小鼠。
47.根据权利要求45-46中任一项所述的系统或方法，其中所述皮肤损伤选自以下组：皮肤炎症、毛发脱落和面部皮肤脱落。
48.根据权利要求26-47中任一项所述的系统或方法，其中所述毒性评估包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人免疫检查点抑制剂之后，显示出肠道损伤，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的免疫检查点基因和/或其表达产物的B6小鼠。
49.根据权利要求26-48中任一项所述的系统或方法，其中所述毒性评估包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人PD-1抑制剂和/或人CTLA4抑制剂之后，显示出肠道损伤，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的PD-1基因和所述经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物的B6小鼠。
50.根据权利要求48-49中任一项所述的系统或方法，其中所述肠道损伤选自以下组：肠道炎症、肠道反应和肠道出血。
51.根据权利要求26-50中任一项所述的系统或方法，其中所述毒性评估包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人免疫检查点抑制剂之后，显示出心脏损伤，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的免疫检查点基因和/或其表达产物的B6小鼠。
52.根据权利要求26-51中任一项所述的系统或方法，其中所述毒性评估包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人PD-1抑制剂和/或人CTLA4抑制剂之后，显示出心脏损伤，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的PD-1基因和所述经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物的B6小鼠。
53.根据权利要求51-52中任一项所述的系统或方法，其中所述心脏损伤包括心肌炎。
54.根据权利要求51-53中任一项所述的系统或方法，其中所述心脏损伤包括弥漫性淋巴细胞浸润性心肌炎。
55.根据权利要求26-54中任一项所述的系统或方法，其中所述毒性评估包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人免疫检查点抑制剂之后，显示出贫血，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的免疫检查点基因和/或其表达产物的B6小鼠。
56.根据权利要求26-55中任一项所述的系统或方法，其中所述毒性评估包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人PD-1抑制剂和/或人CTLA4抑制剂之后，显示出贫血，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的PD-1基因和所述经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物的B6小鼠。
57.根据权利要求26-56中任一项所述的系统或方法，其中所述毒性评估包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人免疫检查点抑制剂之后，显示出脏器淋巴细胞浸润，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的免疫检查点基因和/或其表达产物的B6小鼠。
58.根据权利要求26-57中任一项所述的系统或方法，其中所述毒性评估包括与对照小鼠相比，所述的balb/c小鼠或其功能活性部分在施用人PD-1抑制剂和/或人CTLA4抑制剂之后，显示出脏器淋巴细胞浸润，所述对照小鼠包括包含所述经人源化的PD-1基因和所述经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物的B6小鼠。
59.权利要求1-16中任一项所述的balb/c小鼠或其功能活性部分、和/或源自所述balb/c小鼠的生物体或功能活性部分在制备系统中的用途，其中所述系统用于评估免疫检查点抑制剂的毒性。
60.根据权利要求59所述的用途，其中所述系统包括权利要求26-27、28-58中任一项所述的系统。
61.权利要求1-16中任一项所述的balb/c小鼠或其功能活性部分、权利要求17所述的balb/c小鼠的后代、权利要求18所述的细胞系或原代细胞培养物、权利要求19-22中任一项所述的组织，和/或权利要求23-25中任一项所述的细胞在制备用于筛选药物、装置和/或组合物的系统中的用途，其中所述药物、装置和/或组合物用于治疗、预防和/或预后肿瘤。
62.根据权利要求61所述的用途，其中所述肿瘤选自以下组：乳腺癌、结直肠癌、淋巴瘤。
63.制备权利要求1-16中任一项所述的balb/c小鼠或其功能活性部分的方法，其包括以下的步骤：使所述balb/c小鼠或其功能活性部分包含和/或表达经人源化的免疫检查点基因和/或其表达产物。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述经人源化的免疫检查点基因包括选自下组的一种或多种：CTLA4和PD-1。
65.根据权利要求63-64中任一项所述的方法，其包括以下的步骤：使所述balb/c小鼠或其功能活性部分包含和/或表达经人源化的CTLA4基因和/或其表达产物，且所述经人源化的CTLA4基因包含编码人CTLA4的胞外区的核酸序列。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述人CTLA4的胞外区至少包含人CTLA4的外显子2。
67.根据权利要求65-66中任一项所述的方法，其中所述经人源化的CTLA4基因包含SEQID NO.13-14中任一项所示的核苷酸序列。
68.根据权利要求65-67中任一项所述的方法，其中所述经人源化的CTLA4基因的表达产物包含SEQ ID NO.3-4中任一项所示的氨基酸序列。
69.根据权利要求63-68中任一项所述的方法，其包括以下的步骤：使所述balb/c小鼠或其功能活性部分包含和/或表达经人源化的PD-1基因和/或其表达产物，且所述经人源化的PD-1基因包含编码人PD-1的胞外区的核酸序列。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述人PD-1的胞外区至少包含人PD-1的外显子2及3。
71.根据权利要求69-70中任一项所述的方法，其中所述经人源化的PD-1基因包含SEQID NO.15所示的核苷酸序列。
72.根据权利要求69-71中任一项所述的方法，其中所述经人源化的PD-1基因的表达产物包含SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
73.根据权利要求63-72中任一项所述的方法，其中所述包含和/或表达经人源化的免疫检查点基因和/或其表达产物包括向所述balb/c小鼠或其功能活性部分转入所述经人源化的免疫检查点基因。
74.根据权利要求73所述的方法，其中转入所述经人源化的免疫检查点基因包括以下的步骤：在存在所述经人源化的免疫检查点基因的核酸分子的情况下，使balb/c小鼠的干细胞或合子的基因组与以下物质接触：
a)Cas相关蛋白；
b)gRNA，其包含I)与所述经人源化的免疫检查点的外显子的至少一部分互补的部分；II)与所述Cas蛋白的结合位点。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述Cas相关蛋白包括Cas9蛋白。
76.根据权利要求74-75中任一项所述的方法，其中所述干细胞选自以下组：胚胎干细胞，体细胞干细胞，全能干细胞，单能干细胞和诱导性多能干细胞。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011201383.0A CN112300999A (zh) | 2020-11-02 | 2020-11-02 | 一种balb/c小鼠模型及其用途 |
| PCT/CN2020/138974 WO2022088455A1 (zh) | 2020-11-02 | 2020-12-24 | 一种balb/c小鼠模型及其用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011201383.0A CN112300999A (zh) | 2020-11-02 | 2020-11-02 | 一种balb/c小鼠模型及其用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112300999A true CN112300999A (zh) | 2021-02-02 |
Family
ID=74334202
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011201383.0A Pending CN112300999A (zh) | 2020-11-02 | 2020-11-02 | 一种balb/c小鼠模型及其用途 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112300999A (zh) |
| WO (1) | WO2022088455A1 (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113384681A (zh) * | 2021-06-28 | 2021-09-14 | 湖南中医药大学 | 一种免疫抑制心肌炎小鼠模型及其构建方法与应用 |
| CN113424800A (zh) * | 2021-07-22 | 2021-09-24 | 复旦大学附属中山医院 | 一种免疫检查点抑制剂相关心肌炎小鼠模型及构建方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018177440A1 (en) * | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Beijing Biocytogen Co., Ltd | Genetically modified non-human animal with human or chimeric cd47 |
| CN109022443A (zh) * | 2018-09-11 | 2018-12-18 | 江苏集萃药康生物科技有限公司 | 一种ctla4基因人源化动物模型的构建方法及其应用 |
| CN109266656A (zh) * | 2018-10-10 | 2019-01-25 | 江苏集萃药康生物科技有限公司 | 一种PD1人源化BALB/c小鼠模型的构建方法及其应用 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9790490B2 (en) * | 2015-06-18 | 2017-10-17 | The Broad Institute Inc. | CRISPR enzymes and systems |
| US10912287B2 (en) * | 2016-06-28 | 2021-02-09 | Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd | Genetically modified mice expressing humanized PD-1 |
| CN107815468B (zh) * | 2016-08-31 | 2021-03-16 | 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 | 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用 |
| CN107815466B (zh) * | 2016-08-31 | 2020-03-13 | 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司 | 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用 |
| CN109666701B (zh) * | 2017-10-13 | 2021-08-24 | 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 | 一种pd-1基因修饰人源化动物模型的构建方法及其应用 |
| CN111944825A (zh) * | 2020-08-24 | 2020-11-17 | 江苏集萃药康生物科技有限公司 | 一种ctla4基因和pd1基因人源化小鼠模型的应用 |
-
2020
- 2020-11-02 CN CN202011201383.0A patent/CN112300999A/zh active Pending
- 2020-12-24 WO PCT/CN2020/138974 patent/WO2022088455A1/zh active Application Filing
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018177440A1 (en) * | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Beijing Biocytogen Co., Ltd | Genetically modified non-human animal with human or chimeric cd47 |
| CN109022443A (zh) * | 2018-09-11 | 2018-12-18 | 江苏集萃药康生物科技有限公司 | 一种ctla4基因人源化动物模型的构建方法及其应用 |
| CN109266656A (zh) * | 2018-10-10 | 2019-01-25 | 江苏集萃药康生物科技有限公司 | 一种PD1人源化BALB/c小鼠模型的构建方法及其应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| CUNXIANG JU等: "Abstract 2228：PD1/CTLA4 humanized mice - A great model for pre-clinical toxicology and efficacy evaluation of macromolecular drugs", 《CANCER RESEARCH》 * |
| GEMPHARMATECH: "Promote Drug Development! !! How to use a preclinical mouse model to evaluate clinical efficacy of PD1 and CTLA4 combination and reduce iRAE", 《HTTP://WWW.GEMPHARMATECH.COM/EN/LECTURE/LECINFO/57.HTML》 * |
| 集萃药康: "B6和BALB/c, 另外两只小鼠的江湖（下）", 《HTTP://WWW.GEMPHARMATECH.COM/CN/INDEX.PHP/LECTURE/LECINFO/115.HTML》 * |
| 集萃药康: "B6和BALB/c, 另外两只小鼠的江湖（下）", 《知乎》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113384681A (zh) * | 2021-06-28 | 2021-09-14 | 湖南中医药大学 | 一种免疫抑制心肌炎小鼠模型及其构建方法与应用 |
| CN113424800A (zh) * | 2021-07-22 | 2021-09-24 | 复旦大学附属中山医院 | 一种免疫检查点抑制剂相关心肌炎小鼠模型及构建方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2022088455A1 (zh) | 2022-05-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11492643B2 (en) | Methods and compositions for treatment of a genetic condition | |
| JP7203014B2 (ja) | 工学操作されたヌクレアーゼを使用した遺伝子発現の調節 | |
| CN106795488A (zh) | 用于造血干细胞中核酸酶介导的基因组工程化和校正的方法和组合物 | |
| US20160046683A1 (en) | Methods and compositions for gene correction | |
| CN107529739B (zh) | 表达人特定分子和人Fcγ受体家族的转基因非人动物 | |
| WO2016019144A2 (en) | Gene correction of scid-related genes in hematopoietic stem and progenitor cells | |
| WO2015117081A2 (en) | Methods and compositions for treatment of a beta thalessemia | |
| JP6965466B2 (ja) | 操作されたカスケード構成要素およびカスケード複合体 | |
| WO2018166534A1 (en) | Immunodeficient non-human animal | |
| CN112300999A (zh) | 一种balb/c小鼠模型及其用途 | |
| CN113423831A (zh) | 核酸酶介导的重复扩增 | |
| EP3790980A1 (en) | Differential knockout of an allele of a heterozygous elane gene | |
| Welch et al. | Generating mitochondrial-nuclear exchange (MNX) mice to identify mitochondrial determinants of cancer metastasis | |
| CN115125273B (zh) | 一种乳头型颅咽管瘤动物模型的构建方法及应用 | |
| WO2013053765A1 (en) | A non-human animal model of mucosa-associated lymphoid tissue (malt) lymphoma | |
| WO2018081775A1 (en) | Gene correction of scid-related genes in hematopoietic stem and progenitor cells | |
| JP6914564B2 (ja) | 老化及び／又は神経変性モデル動物 | |
| KR102493904B1 (ko) | EeCpf1에 의해 IL2Rg 유전자가 돌연변이된 면역부전 동물모델 및 그 제조방법 | |
| TW202237821A (zh) | 使用經工程改造之核酸酶調控基因表現 | |
| JP2002142610A (ja) | Ａｌｓモデルラット | |
| WO2019161805A1 (en) | Hr knockout non-human animal | |
| JP2023076344A (ja) | 子宮がんモデル非ヒト動物の製造方法、子宮がんモデル非ヒト動物、および被検物質の評価方法 | |
| JP2022553855A (ja) | 長さが２１～３０ヌクレオチドのガイド配列を使用したヘテロ接合ｅｌａｎｅ遺伝子の対立遺伝子のさまざまなノックアウト | |
| NZ791706A (en) | Regulation of gene expression using engineered nucleases | |
| CN117070524A (zh) | 一种白介素人源化的非人动物的制备方法及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20220130 Address after: 200000 floor 3, building 2, No. 200, zhangheng Road, China (Shanghai) pilot Free Trade Zone, Pudong New Area, Shanghai Applicant after: Shanghai Yaokang Biotechnology Co.,Ltd. Address before: No.12 Xuefu Road, Jiangbei new district, Nanjing, Jiangsu 210061 Applicant before: Jiangsu Jicui Yaokang Biotechnology Co.,Ltd. |
|
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210202 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |