CN113384681A - 一种免疫抑制心肌炎小鼠模型及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种免疫抑制心肌炎小鼠模型及其构建方法与应用。所述方法包括以下步骤：选用4～6周龄雄性BALB/c小鼠作为构建心肌炎小鼠模型的实验小鼠，观察饲养三天；饲养三天后，通过腹腔注射的方式注射预设浓度的环孢菌素A溶液，每次注射量为40～50mg/kg小鼠体重，隔天注射一次，总共注射三次；末次注射1天后，即获得心肌炎小鼠模型。本发明以环孢菌素A为免疫抑制剂，按特定的给药方法成功诱发心肌炎并造成心肌损伤，构建了心肌炎小鼠模型，且无死亡，相对于现有技术通过病毒感染和LPS诱导炎症构建的小鼠模型，具有安全有效的优点，且实验小鼠耐受性更好。
Description
技术领域
本发明属于应用基础医学研究领域，具体涉及一种免疫抑制心肌炎小鼠模型及其构建方法与应用。
背景技术
心肌炎(Myocarditis)是一种常见的心肌炎性疾病，发病率近年来呈上升趋势，且临床表现无特异性，易被忽视导致扩张性心肌病、心力衰竭等严重后果，据统计约21％的心肌炎患者会发展成扩张性心肌病，其中在高达12％的心脏疾病病例中，心肌炎被认为是年轻人心脏性猝死的原因，但目前临床并无特异性治疗方法。
目前国内外的心肌炎动物模型主要有巨细胞病毒诱导和柯萨奇病毒诱导的小鼠模型，国内心肌炎模型多采用相对易感柯萨奇病毒的6-8周龄雄性BALB/c小鼠，但通过病毒构建模型有生物安全隐患且死亡率较高。
因此，有必要提供一种安全有效的心型心肌模型，为科学研究提供可靠的基础。
发明内容
本发明的目的在于提供以中高浓度的环孢菌素A为免疫抑制剂，构建一种安全有效的心肌炎小鼠模型。
为了实现上述目的，本发明提供了一种免疫抑制心肌炎小鼠模型的构建方法，所述方法包括以下步骤：
选用4～6周龄雄性BALB/c小鼠作为构建心肌炎小鼠模型的实验小鼠，观察饲养三天；
饲养三天后，通过腹腔注射的方式注射预设浓度的环孢菌素A溶液，每次注射量为40～50mg/kg小鼠体重，隔天注射一次，总共注射三次；
末次注射1天后，即获得心肌炎小鼠模型。
在一种具体的实施方式中，所述环孢菌素A溶液的预设浓度为80～150g/ml。
在一种具体的实施方式中，每次注射量相同。
在一种具体的实施方式中，所述实验小鼠为SPF级，体重质量为16～22g。
在一种具体的实施方式中，所述实验小鼠的饲养条件为：温度为20～25℃、湿度为40～60％、12h光照/黑暗周期循环。
在一种具体的实施方式中，所述环孢菌素A溶液采用无菌PBS缓冲溶液溶解CsA粉末制备得到。
在一种具体的实施方式中，所述心肌炎伴随炎症因子TNF-α、IL-6水平的升高。
在一种具体的实施方式中，炎症因子TNF-α、IL-6水平与环孢菌素A溶液的注射量正相关。
本发明还提供一种免疫抑制心肌炎小鼠模型，采用上文所述方法构建而成，所述小鼠模型具有心肌炎病理特征。
本发明还提供一种上文所述的免疫抑制心肌炎小鼠模型在筛选预防或治疗心肌炎的药物中的应用。
本发明的有益效果至少包括：
1、本发明构建的心肌炎模型与实验小鼠的选择、免疫抑制剂环孢菌素A的浓度、给药剂量、给药时间和给药方式等相关，通过选择特定的实验小鼠、以环孢菌素A为免疫抑制剂，通过注射中高剂量环孢菌素A溶液诱发心肌炎并造成心肌损伤，成功构建了心肌炎小鼠模型，且无死亡率，相对于现有技术通过病毒感染和LPS诱导炎症构建的小鼠模型，具有安全有效的优点，且小鼠耐受性更好，可以避免生物安全隐患。
2、本发明构建的心肌炎小鼠模型伴随炎症因子TNF-α、IL-6水平的升高，局部有大量炎性细胞浸润及心肌细胞变性、坏死，炎性细胞浸润在变性坏死的心肌周围，具有心肌炎病理的特征，可以用于心肌炎药物的研究。
3、本发明通过腹腔注射环孢菌素A构建的小鼠模型，会特异性造成实验小鼠心肌炎的产生，且实验小鼠血液炎症因子表达比LPS造模要低，小鼠耐受性更高，死亡率为0，更适合于后续心肌炎小鼠模型的应用研究。
4、本发明所采用的方法操作简单，模型动物饲养周期短，构建的动物模型稳定性好、重复性好，成功率可达到100％。
附图说明
图1为本发明提供的免疫抑制心肌炎小鼠模型的构建方法的步骤流程图；
图2为本发明提供的空白对照组、低中高模型组和阳性对照组的胸腺指数对比图；
图3为本发明提供的HE染色显示空白对照组、低中高模型组和阳性对照组的心肌组织图；
图4为本发明提供的空白对照组、低中高模型组和阳性对照组的炎症因子TNF-α的水平数据对比图；
图5为本发明提供的空白对照组、低中高模型组和阳性对照组的炎症因子IL-6的水平数据对比图；
图6为本发明提供的空白对照组、低中高模型组和阳性对照组的心肌组织中TNF-α、IL-1β、IL-6的表达对比图。
具体实施方式
本发明提供了一种免疫抑制心肌炎小鼠模型的构建方法，所述方法包括以下步骤：
步骤S1、选用4～6周龄雄性BALB/c小鼠作为构建心肌炎小鼠模型的实验小鼠，观察饲养三天；
所述实验小鼠为SPF级，体重质量为16～22g。
所述实验小鼠的饲养条件为：温度为20～25℃、湿度为40～60％、12h光照/黑暗周期循环。
步骤S2、饲养三天后，通过腹腔注射的方式注射预设浓度的环孢菌素A溶液，每次注射量为40～50mg/kg小鼠体重，隔天注射一次，总共注射三次；
所述预设浓度为80～150g/ml，采用无菌1×PBS缓冲溶液溶解CsA粉末制备得到。
优选地，每次注射量相同。举例说明，第一次注射量为40mg/kg小鼠体重，则第二次和第三次均为40mg/kg小鼠体重。
当然在其他实施例中，第一次注射量为40mg/kg小鼠体重，则第二次和第三次注射量均为45mg/kg小鼠体重，也可构建成功，只需要注射量在40～50mg/kg小鼠体重范围内即可。
隔天注射一次举例说明即为第一天注射第一次，则第三天注射第二次，第五天注射第三次。
步骤S3、末次注射1天后，即获得心肌炎小鼠模型。
实验小鼠感染心肌炎后，所述心肌炎伴随炎症因子TNF-α、IL-6水平的升高，且炎症因子TNF-α、IL-6水平与环孢菌素A溶液的注射量正相关。
实施例1：
正常对照组、阳性对照组和模型组的制备
1)实验动物
25只SPF级BALB/c小鼠，雄性，4-6周龄，质量16-20g，购自湖南中医药大学实验动物中心，饲养于湖南中医药大学实验动物中心【SCXK(湘)2019-0009】。饲养期间各组大鼠自由饮水，饲喂普通维持饲料，饲料由湖南中医药大学实验动物中心提供。饲养环境：昼夜各半循环照明，湿度40～60％，温度控制在20～25℃，光照/黑暗12h周期循环。所有操作均符合湖南中医药大学实验伦理学要求【LL2020120202】。
2)实验药物与试剂
环孢菌素A(Cyclos-porin A，CsA)购自MCE公司；肿瘤坏死因子-α(Tumornecrosis factor，TNF-α)、白介素(Interleukin，IL)-6ELISA试剂盒购自武汉博士德公司；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)购自北京索莱宝公司；TNF-α抗体、IL-6、IL-1β抗体抗体购自成都正能公司。
3)实验方法
模型制备：实验小鼠共25只，随机分成5组，每组5只，分为空白对照组(Control)、低剂量环孢菌素A模型组(Low CsA)、中剂量环孢菌素A模型组(Mid CsA)和高剂量环孢菌素A模型组(High CsA)、阳性对照组(LPS)。
用无菌1×PBS缓冲溶液将CsA粉末溶解得到浓度为100g/ml的环孢菌素A溶液。
空白对照组(Control)：通过腹腔注射的方式注射1×PBS缓冲溶液，注射剂量为0.1ml/10g小鼠体重，隔天注射一次，总共注射三次；
低剂量环孢菌素A模型组(Low CsA)：通过腹腔注射的方式注射质量浓度为100g/ml的环孢菌素A溶液，每次注射量为30mg/kg小鼠体重，隔天注射一次，总共注射三次；
中剂量环孢菌素A模型组(Mid CsA)：通过腹腔注射的方式注射质量浓度为100g/ml的环孢菌素A溶液，每次注射量为40mg/kg小鼠体重，隔天注射一次，总共注射三次；
高剂量环孢菌素A模型组(High CsA)：通过腹腔注射的方式注射质量浓度为100g/ml的环孢菌素A溶液，每次注射量为50mg/kg小鼠体重，隔天注射一次，总共注射三次；
阳性对照组(LPS)：通过腹腔注射的方式注射10mg/kg小鼠体重的LPS，注射一次，总共注射一次。
实验过程中小鼠状态如下：
空白对照组小鼠皮毛光泽，肌肉充实，正常饮食、活动，体重明显增加，无死亡。
模型组小鼠第一次注射后第二天即出现饮食减少、饮水量减少的现象，随后出现体重增长缓慢、行动迟缓、活动减少、毛失光泽、对刺激反应淡漠或易激惹等现象，有明显的免疫抑制表现；且随着注射量的增加，上述表述更为明显，但无死亡。
阳性对照组小鼠同模型小组一样精神萎靡，且处于濒死状态，可操控性差，死亡率高达40％。
实施例2HE染色观察小鼠心肌病理变化及各指标检测
1)动物处理
末次注射1天后，采用颈椎脱臼方法处死全部存活小鼠进行标本采集。给小鼠做常规固定、消毒、开胸，分离胸腺、脾脏、肺脏、肝脏、肾脏及心脏，取出心脏后立即放入4℃预冷生理盐水中，将残余血液冲洗干净，再用滤纸吸干，将心尖部组织置常规4％多聚甲醛固定，其余组织存放于-80°长期保存。
2)胸腺指数计算
电子天平称重心脏、胸腺、脾脏、肺脏，然后计算器官质量指数，其中，器官质量指数＝器官质量/体质量。
空白对照组、模型组、阳性对照组的胸腺指数详见图2。从图2可以看出，与空白对照组比较，阳性对照组、低剂量CsA环孢菌素A组、中剂量CsA环孢菌素A组、高剂量CsA环孢菌素A组小鼠的胸腺指数显著降低。
3)HE染色观察小鼠心肌病理变化
心尖部组织固定24h后行石蜡包埋、切片、常规苏木精、伊红(HE)染色，进行病理学检查，光学显微镜下观察心肌的病理改变，详见图3。
从图3可以看出，空白对照组心肌细胞结构正常、排列整齐，无心肌纤维的破坏，细胞间隙正常。中、高剂量环孢菌素A组心肌呈典型心肌病样改变：心肌细胞变性、坏死，局部可见大量淋巴细胞、中性粒细胞的浸润。LPS组的心肌炎细胞浸润与环孢菌素A组相比较少。
4)炎症因子TNF-α、IL-6水平的检测
酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠炎症因子TNF-α、IL-6水平：处死小鼠前，眼眶取血，于4℃过夜后，在4℃、转速为2500r/min下离心10min，取每只小鼠血清，使用ELISA试剂盒，严格按照ELISA试剂盒说明书进行检测，依次对TNF-α、IL-6进行检测，分别在450nm处测OD值。模型组、空白对照组、阳性对照组的炎症因子TNF-α、IL-6水平数据详见图4和图5，其中图4为模型组、空白对照组、阳性对照组的炎症因子TNF-α的水平数据对比图，图5为模型组、空白对照组、阳性对照组的炎症因子IL-6的水平数据对比图。
从图4和图5可以看出，与空白对照组相比，阳性对照组与中、高剂量环孢菌素A模型组血清中炎症因子TNF-α、IL-6水平均显著升高，但低、中、高剂量环孢菌素A模型组与阳性对照组相比TNF-α、IL-6水平均较低，且随环孢菌素A溶液注射量的增加而增加，说明通过环孢菌素A溶液构建的小鼠模型的炎症反应要比LPS诱导的小鼠模型弱，小鼠的耐受性更好。
5)免疫组化检测心肌组织中TNF-α、IL-1β、IL-6的表达
4％多聚甲醛固定心脏组织，经过脱水和石蜡包埋、切片，心脏病理切片上机脱蜡后3％过氧化氢浸泡8min，蒸馏水洗，PBS洗2洗，每次2min；随后进行抗原修复，把切片浸泡在PBS中，微波炉加热沸腾即可；然后隔水冷却至常温，PBS洗2次，每次2min；PBS清洗后于湿盒中进行一抗孵育，4℃过夜；孵育后PBS洗3次，每次2min；再滴加反应增强液，室温反应20min；然后PBS洗3次，每次2min；PBS清洗后，滴加二抗，室温反应30min；然后PBS洗3次，每次2min；最后，加DAB显色，显微镜下观察显色结果并拍照，详见图6。
图6中，从左至右，依次为空白对照组、阳性对照组、低剂量环孢菌素A模型组、高剂量环孢菌素A模型组和剂量环孢菌素A模型组的心肌组织显色结果图，从图6可以看出，阳性对照组与中、高剂量环孢菌素A模型组小鼠心肌组织中TNF-α、IL-6、IL-1β大量表达，心肌组织炎症损伤明显，且阳性对照组相比模型组心肌组织中TNF-α、IL-6、IL-1β表达较少。
综合以上实验结果可知，中、高剂量环孢菌素A模型组有大量炎性细胞浸润及心肌细胞变性、坏死，炎性细胞浸润在变性坏死的心肌周围，具有心肌炎病理特征；检测各实验组小鼠血清IL-6、TNF-α发现，中、高剂量环孢菌素A模型组小鼠IL-6、TNF-α水平较空白对照组均明显升高，但相比于阳性对照组的实验小鼠水平要低很多，说明通过环孢菌素A构建模型的实验小鼠全射性炎症反应较弱，实验小鼠的耐受性更好，且模型组的实验小鼠无死亡(阳性对照组的实验小鼠死亡率为40％)；检测心肌组织TNF-α、IL-6、IL-β发现，中、高剂量环孢菌素A模型组小鼠心肌组织中分布有大量TNF-α、IL-6、IL-β，说明通过腹腔注射中、高剂量环孢菌素成功诱发心肌炎并造成心肌损伤，心肌炎小鼠模型构建成功。
本发明还提供一种免疫抑制心肌炎小鼠模型，所述小鼠模型利用环孢菌素A溶液按照上文所述方法构建得到，所述小鼠模型具有心肌炎病理特征，且该模型无死亡。环孢菌素A构建心肌炎模型靶向性高，便于开展后续实验。
本发明还提供一种上文所述的免疫抑制心肌炎小鼠模型在筛选预防或治疗心肌炎的药物中的应用。
本发明利用环孢菌素A构建的免疫抑制心肌炎小鼠模型，还可以深入研究免疫机制、免疫细胞在心肌炎发生发展中的具体机制提供基础。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演和替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种免疫抑制心肌炎小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
选用4～6周龄雄性BALB/c小鼠作为构建心肌炎小鼠模型的实验小鼠，观察饲养三天；
饲养三天后，通过腹腔注射的方式注射预设浓度的环孢菌素A溶液，每次注射量为40～50mg/kg小鼠体重，隔天注射一次，总共注射三次；
末次注射1天后，即获得心肌炎小鼠模型。
2.根据权利要求1所述的免疫抑制心肌炎小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述环孢菌素A溶液的预设浓度为80～150g/ml。
3.根据权利要求2所述的免疫抑制心肌炎小鼠模型的构建方法，其特征在于，每次注射量相同。
4.根据权利要求1所述的免疫抑制心肌炎小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述实验小鼠为SPF级，体重质量为16～22g。
5.根据权利要求1所述的免疫抑制心肌炎小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述实验小鼠的饲养条件为：温度为20～25℃、湿度为40～60％、12h光照/黑暗周期循环。
6.根据权利要求1所述的免疫抑制心肌炎小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述环孢菌素A溶液采用无菌PBS缓冲溶液溶解CsA粉末制备得到。
7.根据权利要求1所述的免疫抑制心肌炎小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述心肌炎伴随炎症因子TNF-α、IL-6水平的升高。
8.根据权利要求7所述的免疫抑制心肌炎小鼠模型的构建方法，其特征在于，炎症因子TNF-α、IL-6水平与环孢菌素A溶液的注射量正相关。
9.一种免疫抑制心肌炎小鼠模型，其特征在于，采用权利要求1～8任一项权利要求所述方法构建而成，所述小鼠模型具有心肌炎病理特征。
10.如权利要求9所述的免疫抑制心肌炎小鼠模型在筛选预防或治疗心肌炎的药物中的应用。
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