PT87086B

PT87086B - Processo para a preparacao de um agente terapeutico para a supressao do sistema imunologico

Info

Publication number: PT87086B
Application number: PT87086A
Authority: PT
Inventors: Richard L Edelson; Daniel J Tripodi
Original assignee: Therakos Inc
Priority date: 1987-03-27
Filing date: 1988-03-25
Publication date: 1992-07-31
Also published as: CA1306678C; PT87086A; GR1000039B; ZA882159B; AU1358488A; PH25590A; EP0284409A3; AU606666B2; DK166688D0; JPS63275525A; GR880100184A; DK166688A; EP0284409A2; US4838852A; JP2958372B2

Description

Memória descritiva referente à patente de invenção de TRtíRAKOS, , I

INC., norte-americana, (estado: ·

Florida), industrial e comercial, ;

I com domicílio em 10720 72nd Street, North Largo, Florida 33543, ί Estados Unidos da América, (inven-! toress Hichard L. Edelson e Daniel·

J. Tripodi, residentes nos Estadosi Unidos da América), para PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM ACINTE j TERAPÊUTICO PARA A SUPRESSÃO DO j SISTEMA IMUNOLÓGICO.

Memória Descritiva j j Antecedentes da invenção

Ao longo da presente memória descritiva, sao refe-i i rendadas várias publicações. As revelações destas publicações > na sua totalidade estão por este meio incorporadas por referência na presente memória, a fim de melhor descrever o estado da técnica como é conhecida dos peritos na matéria, à data da inven' ção aqui descrita e reivindicada.

Esta invenção diz respeito a um processo para a preparação de agentes terapêuticos destinados a alterar especí- ficamente a resposta do sistema Imunitário de um mamífero, de acordo com o qual são provocadas formas específicas de imuno-supressão no mamífero, quando este é activamente imunizado em resposta a um antigene específico. j

Uma resposta imunitária pode ser classificada como· uma resposta humoral ou como uma resposta mediada pelas células.!

Uma resposta humoral 4 a que é mediada por moléculas de anticor-; pos livremente difundíveis. Uma resposta mediada pelas células é mediada por linfócitos especificamente reactivos, tais como célu las T, e não por anticorpos.

Existem diferenças básicas entre as reacções iiumorais e as reacções mediadas pelas células. 0 período desde a exposição a um antigene, até à formulação de uma resposta imunitária é de minutos a horas para a imunidade humoral e de um ou mais dias para a imunidade mediada pelas células. A unidade i activa que reage com o antigene é um anticorpo em imunidade humo· ral e é um linfócito T em imunidade mediada pelas células. Os anticorpos humorais são geralmente específicos para determinan- , tes antigénicos pequenos. Os linfócitos T são específicos para moléculas maiores, normalmente proteínas (em especial, as existentes nas superfícies das células).

Enquant© que uma resposta mediada pelas células é, í em geral, um aspecto benéfico das defesas do corpo, certas respostas mediadas pelas células são nocivas. Exemplos de tais respostas nocivas imunitárias mediadas pelas células incluem reaoções de hipersensibilidade de tipo retardado, rejeições de | enxertos externos, reacções de enxerto-contra-hospedeiro e ' i algumas reacções alérgicas. Adicionalmente, algumas doenças ! auto-imunes estão também incluídas, tais como miastenia grave, artrite reumatóide, lupus eritematoso sistémico e a doença de í

Grave.

Muitas destas respostas nocivas mediadas por célu-; las envolvem destruição de tecidos num paciente e, compreensível! mente, seria desejável eliminar ou reduzir o efeito de tal res- j j posta. Uma das respostas de interesse é a rejeição de enxertos externos. Um enxerto externo é uma célula, um tecido ou um orgão^:que é transferido de um dador para um reoeptor geneticamente ! diferente da mesma espécie. Por causa do alto grau de polimorfismo de certas glicoproteínas de supei’fície, as células enxer- ί tadas têm quase sempre nas suas superfícies histooompatibilidadel j ]

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ou antigenes de transplantação que faltam nas células hospedeiras e vice-versa. A resposta do hospedeiro resultante leva à destruição do enxerto externo por intermédio de uma resposta mediada por células.

A reacção de enxerto-contra-hospedeiro ocorre quando são transferidos linfócitos de um dador imunologicamente competente (adulto normal) para um receptor slogénico incompetente (p. ex. um recém-nascido). Estas reacçoes têm importância clínica crescente, por causa de tentativas terapêuticas para transferir timos normais ou células de medula óssea para humanos imunodeficlentes (p. ex., crianças com defeitos genéticos, pacientes com leucemia tratados com drogas citotóxicas e tratamento por raios X integral).

Em doenças autoimunes, o sistema imunitário do corpo não consegue reconhecer certas células ou partes de células como suas e começa a atacá-las, resultando numa destruição de tecidos. Este ataque é efectuado pela produção de auto-anticorpos e por células T auto-reactivas.

Respostas alérgicas envolvem uma resposta imunitária elevada. Em algumas respostas alérgicas, o sistema imunitário organiza um ataque contra uma substância normalmente inofensiva, tal como pólen, resíduos de pele de animal ou poeira. Nestas respostas alérgicas, verifica-se uma reacção de linfécitos T sensibilizados com o antigene, produzindo-se uma inflamação através da acção de linfoquinas. Ã doença resulta do efeito nocivo da reacção inflamatória resultante a estes antigenes circundantes. Um exemplo de uma reacção como esta é uma dermatite de contacto alérgica.

A presente invenção proporciona um método para alterar especificamente a resposta imunitária de um paciente, resultando na melhoria de uma doença imunitária específica e, oonsequentemente, dos efeitos nocivos da doença.

As patentes n2s 4 521 919; 4 598 9O6; 4 428 744; e 4 464 166 dos Estados Unidos (todas em nome de Edelson), cujos

conteúdos estão por este meio incorporados por referência na sua, totalidade na presente memória, descrevem métodos para reduzir a. população de linfócitos em actividade de um sujeito humano« Os ! métodos de Edelson incluem o tratamento do sangue de um doente, no qual as células sanguíneas foram estimuladas naturalmente ! como uma consequência do estado da doença. Especificamente, os i métodos envolvem tratamento de células sanguíneas humanas estimuladas naturalmente, tais como linfócitos, oom uma droga foto- í activável dissolvida, tal como um psoraleno, que é capaz de formar foto-aductos com ADN na presença de radiação ultravioleta (U.V.). Os linfócitos são então tratados extra-corporalmente com radiação U.V., modificando deste modo os linfócitos» Seguindo a irradiação extra-corpórea, os linfócitos tratados são restituídos ao paciente. Os linfócitos modificados devem ser eliminados do sistema do sujeito por processos naturais, mas num ritmo acelerado, que se crê atribuível à ruptura da integridade da membrana, a alteração do ADN dentío das células ou a condições características associadas muitas vezes com uma perda substancial de eficácia ou de viabilidade celular.

Os métodos descritos nas patentes de Edelson foram usados recentemente em estudos clínicos humanos em pacientes ^!afectados pela forma eritrodérmica (Sezary) de linfoma cutâneo ) das células T (LCCT). Os resultados indicavam que o método redu-j zia todas as populações de célula T nos pacientes, mas as popu- j laçães normais de células T apareciam de novo dentro de quatro j semanas e a supressão de células malignas era mais lenta. !

Uma desvantagem dos métodos descritos por Edelson ' reside no facto de não serem adequados para uso profilático <, Ror’ exemplo, os métodos de Edelson não podem ser utilizados para suprimir selectivamente a resposta do sistema imunitário de um | paciente a um antigene específico que seja característico de um i distúrbio imunitário e perante o qual o paciente ainda não tenhaj i sido exposto.

Estudos em sistemas de roedores mostraram que a

perfusão intravenosa de células singénicas a partir de clones de^;células T auto-reactivas expandidas in vitro podem induzir tiroi dite auto-imune experimental, encefalomielite ou artrite (Oohen, IR. Adv. Intern. Med. (1984) 29:147-165). No entanto, se células' em cultura dos mesmos membros de células T forem letalmente dani; ficadas ou atenuadas por tratamento com irradiação ou com mito- ;

micina C para preparar uma vacina e forem em seguida administra-, das a ratos ou a ratazanas singénicos, o receptor animal desen- ; volve resistência à indução da doença pela subsequente perfusão de células T auto-reactivas viáveis (Ben-nun, A. et al., Nature (1981), 292:60-61; Holoshitz, J. et al., Science (1983), 219*56-! -58; e Cohen, IR., J. Invest. Derm. (1985), 85 (Supp.l)*345-385)1 Deste modo, foi demonstrado que as linhas celulares de células I T efectoras auto-imunes tratadas podem ser usadas para vacinar contra as afecçães auto-imunitárias.

As experiências com roedores acima descritas têm a desvantagem de requerer o isolamento e a cultura de linhas de células T, as quais são capazes de produzir uma aoença auto-imunitária. Tais linhas de células não estão imediatamente disponí-j veis para doenças humanas e sé podem ser obtidas, se de todo i possível, através de um trabalho demorado. Por conseguinte, os métodos descritos nestas experiências com roedores não são adequados para o tratamento de seres humanos. Além disso, se linhas; de células T humanas equivalentes pudessem ser obtidas, ter-se-ia que preparar uma diferente linha de células específica para > cada doença auto-imune tratada. I

Em outras experiências com roedores, foi recente- ; mente provado que a perfusão intravenosa de 8-metoxipsoraleno i (8-MOP) e, subsequentemente, de linfécitos tratados com U.V. em. i ratos IvIRL singénicos, inibe substancialmente o desenvolvimento ! da sua síndrome caracteristica de lupus eritematoso sistémico e de hiperplasia linfóide que desenvolvem espontaneamente (Perez, M. et al., Clín. Res. (1986) 34:774A). j

Um estudo piloto descrito em Parrish, J.A. et al.,

N. Engl. J. Med (1974), 291:1207-1211, demonstrou que uma combinação da administração oral de 8-MOi com uma exposição da pele ;

I a ultravioleta-A (UVA) é eficaz no tratamento de psoríase vulgar i debilitante, uma doença hiperproliferativa da epiderme. Este ' facto foi confirmado, subsequentemente, numa experiência clínica multi-institucional (Melski, J.W. et al. J. Invest. Derm. (1977), 68:328-335)· Subsequentemente, foi também demonsrrado que a fase de placas do linfoma cutâneo de células T (liCCT), limitado à pele, responde igualmente a este tratamento (Gilchrest B.A., et ' al. Câncer (1976) 38:683-689» Hongismann H., et al. J. Am. Acad.: Derm. (1984) 10:238-245). ’

A técnica anterior descreve que os linfócitos podem ser ineficazes em doentes ou podem ser atenuados para criar vacinas. No entanto, tal conhecimento não é útil para a profilaxia de doenças nos humanos. A presente invenção tem a vantagem de ser adequada para prevenir selectivamente afecçães í imunitárias em pacientes humanos. Para além disso, a presente invenção baseia-se na estimulação conveniente do sistema imunitário do próprio paciente para produzir linfócitos estimulados i em vez da utilização de técnicas de cultura de células, que são ! muito demoradas. Deste modo, a presente invenção proporciona um processo conveniente para a preparação de um agente para evitar afecçães imunitárias, o qual é adequado para se tratar qualquer i afecção imunitária. í

Sumário da invenção >

A presente invenção proporciona um processo para ai preparação de agentes terapêuticos destinados a alterar especifi! camente a resposta do sistema imunitário de um mamífero a um j antigene específico, o qual compreende as seguintes fases:

(a) contactar o sistema imunitário do mamífero com o antigene específico por um período de tempo adequado a fim de j estimular artificialmente células sanguíneas; i (b) retirar do mamífero material contendo células

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sanguíneas, incluindo células sanguíneas estimuladas por um antigene ;

(c) tratar o material ou as células referidos, a fim de alterar as células estimuladas pelo antigene; e (d) devolver o material e as células alteradas ao ; mamífero·

A expressão «estimulado artificialmente ·' refere-se na presente memória descritiva à intervenção humana requerendo fase positiva de fazer contactar o sistema imunitário do mamí- í fero com o antigene específico de interesse. 0 antigene então ί estimula uma resposta imunitária específica para esse antigene. , A resposta imunitária pode ser a produção de linfdcitos de células B ou de linfócitos de células T. A estimulação artificial do sistema imunitário está em contraste com a estimulação natural, na qual o sistema imunitário é naturalmente estimulado como uma consequência da doença.

material contendo células sanguíneas pode ser sangue, fluido linfático, medula óssea, tecido de órgãos linfáticos ou qualquer outro fluido ou tecido do corpo que contenha j células sanguíneas. Num modo de concretização preferido o mate- i rial é sangue. ί i

Num modo de concretização preferido da presente invenção, é utilizada uma combinação de estimulação artificial de células sanguíneas e de subsequente fotoferese das células. 0 método de fotoferese envolve basicamente a combinação das célu- ? las a serem tratadas com um agente fotoactivável, a irradiação j | das células com radiação activante e a devolução das células i tratadas ao corpo do paciente. A fotoferese pode ser efectuada, '

I formando uma corrente extra-corpórea com o sangue ou células ou ! fluido derivado do sangue e em seguida fazendo fluir a corrente |

I através de uma estação de tratamento de um paciente que compre- [ ende uma câmara fina, substancialmente transparente à radiação j

I

UV. A corrente extra-corpórea é, de seguida, irradiada no sis- i

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tema de tratamento com radiação UV na presença de um agente fotoactivável dissolvido. 0 agente fotoactivável deve ter capacidade para ser transformado por radiação UV de um estado biologicamente inerte para um estado transitoriamente excitado com capacidade para fazer ligações cruzadas covalentes do ADN nas células do sangue tratado. As células contendo o ADN com ligações cruzadas são, deste modo, letalmente danificadas ou, no mínimo, inactivadas funcionalmente. '

Descrição pormenorizada da invenção ,

No método da presente invenção, o antigene, ao qual a resposta do sistema imunitário tem que ser suprimida ou i modificada, pode ser qualquer antigene, incluindo os associados !

I com uma afecção, condição patológica ou estado de doença, tal ί como doença autoimune, cancro (p.ex., um antigene específico de um tumor), alergia, doença infecciosa, rejeição de enxertos externos, reacção de hipersensibilidade de tipo retardado e reacção de enxerto-contra-hospedeiro. 0 paciente ou hospedeiro a ser tratado é um mamífero, por exemplo um ser humano. i ΐ 0 antigene específico de interesse pode servir ' para estimular uma célula T que expresse receptores específicos de células T, que sejam capazes de servir como antigenes clono- j típicos. Num caso como este, a expansão clonal destas células T

I anómalas em circulação, media o distúrbio que se pretende con- > trolar. A presente invenção proporciona um método para produzir uma reacção imunitária específica em relação a um clone que i limita a actividade de uma população anómala de células T como ί esta. i contacto do sistema imunitário do mamífero com o antigene específico pode ser conseguido de qualquer maneira que introduza o antigene no sistema imunitário do mamífero, p.ex. injectando directamente na corrente sanguínea, no sistema ‘ linfático ou em órgãos linfóides. 35 então permitido ao antigene i estar em contacto com ou exposto ao sistema imunitário do mamí- j

- fero, por um período de tempo adequado, de modo a permitir a estimulação de certas células sanguíneas especificamente em resposta a esse antigene. Este período de tempo adequado poderá ir até um ano» na maioria dos ceisos, é mais curto e, geralmente, não vai além de 72 horas.

Num modo de concretização preferido, as células sanguíneas estimuladas pelo antigene, tais como linfécitos estimulados, são retiradas do mamífero através do seu sangue» E preferida esta maneira, porque a colheita de sangue e a recirculação para o paciente é simples e conveniente, lais métodos são ! bem conhecidos na técnica e são análogos aos usados na hemodiálise. '

Outra razão para a colheita de sangue a fim de i obter o antigene de células sanguíneas estimuladas, é que as ' células afectadas, tais como linfécitos, existem no sangue em ! grande número. No entanto, os linfécitos circulam igualmente j através do fluido linfático e dos espaços dos tecidos e agregam-í i -se nas estruturas linfáticas primária e secundária, tal como o i timo, o baço e os gânglios linfáticos. Beste modo, os linfécitos» activados por antigene podem igualmente ser obtidos a partir do í fluido linfático ou das estruturas linfáticas primária ou secun-| dária. Os linfécitos activados assim obtidos são tratados e ΐ devolvidos ao mamífero, conforme descrito na presente memória.

De acordo com a presente invenção, após se ter estimulado as células sanguíneas com o antigene seleccionado especificamente, as células sanguíneas são retiradas do sujeito j e tratadas de modo a alterá-las, p.ex. danificar letalmente ou, !

I no mínimo, inactivá-las funcionalmente. Tal tratamento pode ser í i efectuado por vários meios, que ocorrerão a um perito na técnica Dor exemplo, uma exposição a temperatura excessivamente alta ou ; baixa, a pH alto ou baixo, a pressão alta ou baixa, a agentes químicos, a toxinas ou uma passagem por materiais resinosos, i pode ser utilizada para afectar o tratamento inactivante. Em I alguns casos, a simples manipulação das células sanguíneas I

conseguirá o resultado desejado. Contudo, de preferência, o tratamento é efectuado pelo método de iotoferese, referido em seguida.

método de fotoferese de tratamento das células envolve a irradiação extra-corpórea do sangue retirado do sujeito. Neste método, o sangue, ou o fluido ou as células derivadas do sangue, é posto em contacto com um agente fotoactivável, que é dissolvido no sangue, quer por mistura do agente com o sangue após a colheita deste, quer por administração oral do agente ao paciente, antes de se colher o sangue. 0 agente fotoactivável pode ser qualquer um que seja capaz de fazer ligações cruzadas com ADN. A classe dos psoralenos é um exemplo de tais agentes. Os psoralenos preferidos são amino-metil-trimetil-psoraleno (AMI) e 8-metoxi-psoraleno (8-MOP). Outros agentes podem ser o pirene fotoactivo e anticorpos monoclonais, que foram ligados a moléculas de porfirina.

Quando é utilizado um psoraleno no método de fotoferese, é desejável ter-se o psoraleno presente no sangue muna concentração de cerca de 1 nanograma até cerca de 100 microgramas por mililitro de sangue. A colheita do sangue, a I passagem do sangue para a estação de tratamento e a sua devolu- ção ao paciente, podem ser levadas a cabo como uma operação con-| tínua. ® preferível que o caudal da corrente sanguínea extra-corpórea esteja na ordem de cerca de 10 a cerca de 75 ml por minute. E igualmente preferível que o sangue seja irradiado com fotoenergia no domínio do comprimento de onda (UVA, UVB, UVC) num nível de dose de radiação de cerca de 0,1 a cerca de 100 joules/cm de superfície sanguínea. De preferência., o nível da dose é de cerca de 5 a cerca de 60 joules/cm² de superfície sanguínea.

Tem sido usado o composto 8-metoxipsoraleno para o tratamento de linfdcitos, porque pode ser transformado de um

I estado biologicamente inerte por radiação ultravioleta A de I í baixa energia para um estado excitado transitório capaz de fazer'

ligações cruzadas covalentes de ADN e de outras maoromolóculas» I 0 8-MOP ocorre naturalmente numa variedade de plantas, incluindo’ limas, salsa e figos, e na sua forma inactiva não é tóxica para : os humanos em doses farmacológicas. No entanto, a radiação UVA, ^!que passa através de vidro transparente e de alguns plásticos translúcidos, activa ο 8-MOP para uma forma que faz ligações j ί cruzadas das cadeias complementares de ADN, formando aductos I bifuncionais com bases de pirimidina, transformando, deste modo,; a molécula num potente agente quimioterapêutico. Como a meia _:vida do 8-MOP foto-activado é apenas da ordem de microsegundos, j os tecidos não expostos simultaneamente a droga e a radiação i UVA, são poupados aos efeitos tóxicos da forma activa. i

A gama óptima do comprimento de onda para activa- j ção de 8-MOP em células 1 é de 534 a 346 nm. as células activadas podem ser expostas à radiação UV durante um período que oscila entre cerca de le cerca de 6 horas. Lentro da gama óptima do comprimento de onda, é necessário uma exposição a WA de aproximadamente 270 minutos para proporcionar ao linfócito médio 2 joules/cm de área de superfície sanguínea.

Como só estão à disposição para uso clínico preparações orais de 8-MOP, é necessário obter a concentração apropriada do produto no plasma colhido na altura do tratamento» Para este fim, pode-se colher plasma do paciente durante o processo de fotoferese, duas horas após a administração oral de cerca de 0,6 mg/hg do peso do corpo âe 8-10P.

método de fotoferese pode ser levado a cabo num í só aparelho que compreenda uma centrifugação contínua para sepa-j rar os leucócitos, isto é, os glóbulos brancos do sangue, a partir do sangue retirado do paciente. A centrifugação pode ser usada num passo inicial de leucaferese descontínua, na qual os leucócitos são separados do sangue num ou em mais ciclos. Isto pode ser efectuado tendo o paciente reclinado numa cama e, em seguida, procedendo à leucaferese do sangue heparinizado durante 6 ciclos através do recipiente de uma centrífuga em rotação

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contínua, permitindo a remoção dum total de cerca de 240 ml de ; sangue enriquecido por leucócitos. Este sangue pode, então, ser i combinado com cerca de 300 ml de plasma obtido durante o mesmo , processo a partir do paciente (colhido 2 horas depois da inges- ί tão de 0,6 mg/Kg de 8-MOP) e com 200 ml de solução salina normal; estéril, obtendo-se um hematócrito final de, aproximadamente, 6,4 + 1.7% e contendo 30-50% do número de linfócitos no sangue do paciente no início da leucaferese. 0 volume total pode, então,! ser passado por uma câmara de irradiação estéril de utilização J única, a fim de o expor à energia (UVA). A câmara pode ser na ΐ forma de uma cassete de úso único com seis câmaras. ·

Cada câmara da cassete pode ser composta de um revestimento de policarbonato exterior, opaco a UVA, e de um tubo acrílico interior transparente a UVA fluorescente. Estas !

duas paredes, entre as quais o sangue é bombeado, estão afastadas, aproximadamente, de 1,0 mm. 0 fluxo em cada câmara vai do fundo ao topo, com ligações fazendo comunicar o topo de cada câmara ao fundo da câmara seguinte. 0 volume total da cassete é de cerca de 190 ml. Incorporado neste sistema de exposição a UVAí pode estar uma bomba automaticamente reversível para o sangue j que permita uma reciclagem contínua do sangue através da cassete' e sensores de temperatura para assegurar que o sangue não seja ' aquecido acima de 41°0. A seguir à exposição do sangue a UVA, o .

volume total é devolvido ao paciente. i

Nas Patentes U.S. NSs. 4 573 960; 4 568 328 e ' 4 578 056, descrevem-se métodos e aparelhos, úteis para irradiarj sangue. Podem ser encontradas descrições adicionais de métodos e; aparelhos para irradiar sangue nos seguintes pedidos de patente U.S.S.N. 834 292, intitulado Concurrent 0n-line Irradiation , Treatment Process” (Processo de Tratamento de Irradiação Concor-! rente em linha)5 e U.S.S.N. 834 258, Irradiation Chamber for i

Photoactivation Pacient Treatment System (Câmara de Irradiação para Fotoactivação do Sistema de Tratamento de Pacientes).

De acordo com um modo específico de concretização

a presente invenção proporciona um método para suprimir a resposta imunitária de um mamífero a um enxerto externo de tecido, no qual o tecido expressa, pelo menos, um antigene singular que serve para promover uma resposta imunológica adversa no mamífero. 0 antigene singular de interesse pode ser qualquer tipo de antigene de hlstocompatibilidade ou aloantigene, presente no tecido estranho. 0 método compreende as seguintes fases:

(a) fazer contactar o sistema imunitário do mamífero com, pelo menos, um dos citados antigenes, por um período de tempo adequado, de modo a activar certos linfócitos;

(b) colher sangue do mamífero, incluindo os linfócitos activados pelo antigene;

(c) tratar o sangue colhido, ou células derivadas ; de sangue, de modo a inactivar funcionalmente os linfócitos actii “í vados pelo antigene; e ι (d) devolver o sangue e linfócitos tratados ao ;

I mamífero.

Se bem que a invenção tenha sido descrita como ; sendo primeiro estimulado artificialmente o sistema imunitário ' e, de seguida tratadas as células sanguíneas, pode ser igualmente possível que os resultados desejados possam ser, também, I alcançados tratando primeiro as células sanguíneas, tais como linfócitos, antes de estimular realmente o sistema imunitário ^!

I com um antigene específico. Está previsto que esta circunstância poderia ser realizada extraindo sangue do paciente e tratando-o , num aparelho de fotoferese, devolvendo o sangue tratado ao paciente e, em seguida, fazendo contactar o sistema imunitário do paciente com um antigene específico. Verifica-se, oeste modo, que as células seriam alteradas de tal maneira, que perderiam a < capacidade de reconhecer e de reagir ao antigene.

A presente invençSo é profiláctica, na medida em * que pode ser usada para evitar uma resposta indesejada do sistema imunitário num paciente. Por exemplo, num paciente que

ainda não tenha sido exposto a um antigene associado com uma afecção imunitária, o sistema imunitário do paciente pode ser estimulado artificialmente com o antigene e com as células estimuladas do sistema imunitário, de modo ε evitar uma resposta imunitária indesejada. Uiâ exemplo específico é a estimulação do sistema imunitário do paciente com um ou mais antigenes, associa dos com um enxerto externo, que o paciente irá, subsequentemente, receber. Usando os métodos da presente invenção, um enxerto externo como este não será rejeitaao, como seria de outro modo.

Apesar da presente invenção ter sido descrita como tendo usos profilácticos, pode ser também possível que a invenção tenha, igualmente, usos terapêuticos, for exemplo, pacientes: que tenham sido expostos previamente a um antigene associado com' uma afecção, isto é, pacientes apresentando o estado de doença associado com o antigene, foram estimulados naturalmente pelo antigene. Está previsto que estes pacientes estimulados naturalmente, podem também ser estimulados artificialmente pelos métodos da presente invenção, a fim de se conseguir um resultado terapêutico. Em tal método, pode ser possível estimular artificial mente o paciente pelo mesmo ou por antigenes diferentes de acordo com os métodos da presente invenção, de modo a alterar a _:resposta do sistema imunitário do paciente e conseguir um eíeito terapêutico quanto à afecção.

Está previsto que o presente método poderá ter um uso terapêutico para pacientes que já tivessem uma doença, tal como uma afecção autoimune ou cancro. Para um paciente que tenha cancro, pensa-se que o método poderá ser usado para estimular artificialmente o sistema imunitário do doente canceroso com um antigene específico tumoral ao qual o paciente tenha já sido exposto, como uma consequência natural do tumor existente no paciente. Pensa-se que, enquanto o sistema imunitário do paciente não tiver atacado o tumor antes do tratamento por estimula-, ção artificial, o método da presente invenção pode alterar a resposta imunitária do paciente, de modo a provocar um ataque

imunológico ao tumor que, previamente, não tinha sido atacado.

Se bem que a presente invenção tenha sido descrita em pormenor na presente memória, o mecanismo pelo qual o sistema imunitário é alterado não é inteiramente compreendido. A alteração do sistema imunitário pelo método da presente invenção pode resultar, quer em supressão, quer na activação do sistema imunitário. Este, pode ser suprimido a fim de melhorar a resposta imunitária a um antigene específico, tal como no exemplo do enxerto externo acima descrito. No entanto, também se prevê que o sistema imunitário pode ser activado em vez de suprimido, tal como no exemplo do tumor hipotético acima descrito.

Os seguintes exemplos íoram scleccionados para mostrar que a fotodestruição de um grande número de células T pertencentes a um clone ampliado e a sua introdução num sistema : imunitário que não foi inibido directamente por 8-MOP fotoactivado, pode levar a uma reacção imunológica específica contra aquelas. Estes exemplos são baseados na ideia de que a reintro- : dução de linfócitos intactos funcionalmente inactivados, que expressam antigenes da superfície celular, pode servir para provocar uma resposta imunológica no receptor.

De acordo com um modelo, a resposta de hipersensibilidade retardada a um antigene dependente das células T, células vermelhas sanguíneas de carneiro (CVfíC), é inibida pela indução de tolerância anterior usando células capazes inacbivadt.s >

I com 8-MOP-UVA. Num outro modelo, a resposta aloreactiva a antigenes de histocompatibilidade estranha é inibida num sisTema de : enxerto externo de pele de um murino. Ainda em outro modelo, o análogo murino de lupus eritematoso sistémico (DES) desenvolvido num rato MRL/lpr é melhorado.

Os exemplos que se seguem são apresentados a fim de ilustrar o objecto da invenção. A invenção não deve ser considerada limitada pelos exemplos, mas apenas pelas reivindice;çoes anexas.

Resposta de Hipersensibilidade Retardada às Células Vermelhas Oanguíneas do Carneiro

Este exemplo utilizou ratos singénicos, isto é, membros geneticamente idênticos, da mesma espécie. Porque cada rato é geneticamente idêntico, as manipulações e transferência de tecido de um rato para o outro ueviam ser vistas como tendo sido feitas num único rato e não em vários ratos diferentes. 0 método da presente invenção foi utilizado para alterar específioamente a resposta do sistema imunitário do rato a um antigene específico, nomeadamente células vermelhas sanguíneas de carneiro (CVfíC). As células sanguíneas vermelhas dos carneiros foram infectadas intravenosamente em ratos BALB/o em pequenas quantidades (10 ). Este contacto do sistema imunitário do rato com CVSC estimulou artificialmente o seu sistema imunitário para induzir imunidade das células T demonstrável como uma reacção de hipersensibilidade de tipo retardado (HTR), mas não provocou respostas humorais. Após um período de tempo adequado, os ratos foram sacrificados, os seus baços removidos e as células esplénicas foram alteradas por tratamento com 8-M0B-UVA. Estas células esplénicas alteradas foram usadas de seguida para tratar ratos singénicos simples. Os detalhes deste procedimento estão descritos seguidamente.

Dividiram-se ratos BALB/c, de 6 a 8 semanas ae idade em dois grupos e trataram-se uma vez por semana por perfusões intravenosas de:

1) Esplenócitos de ratos singénicos que tinham sido imunizados, inactivados por 8-MOP-UVA, isto é estimulados artificialmente, 7 dias antes com 10 CVSC/0,2 ml de solução salina, (Grupo A)

- lo

ou

2) hsplenócitos simples como comparação, (Grupo B)_e;

Para a indução de HTR em CVSC os ratos foram prepa 6 rados (Br) com 10 CVCC dois dias depois do sexto tratamento«. I Cada rato recebeu 15 x 10 de células inactivadas. Sete dias i depois, foram provocados (Ch) com 10 de CVSC em 50 microlitros f de solução salina no tecido subcutâneo da pata posterior esquerda. A pata posterior direita, como comparação, recebeu 50 microlitros de solução salina.

Paralelamente, ratos simples adicionais não tratados ou foram preparados e provocados (Grupo C) ou só provocados (Grupo D). Boi medida a HTR. 24 horas após a extracção com um medidor de mostrador (tipo Manostat 6921) calibrado para +0,05 mm. 0 nível de HTR foi expresso pela medida do aumento da “ -2 espessura da pata em 10 mm entre as patas esquerda e direita, a informação é apresentada no Quadro 1 sob a forma das módias geométricas + DOM de 4 a 10 ratos em cada grupo.

Como se apresenta no Quadro 1, os ratos no Grupo λ não foram capazes de preparar uma resposta a CVSC. Λ resposta de HTR do Grupo A foi semelhante à observada em ensaios de comparação negativos (Grupo D), que não foram tratados, mas foram provocados com CVSC. Em contraste, ratos do Grupo B tratados com esplenócitos simples inactivados demonstraram uma reacção de HTB. normal, semelhante à resposta observada no grupo de comparação positivo (Grupo C).'

- 17 *

QiJÁDfiO 1

Kesposta de hipersensibilidade de tipo retardado às células vermelhas sanguíneas do carneiro

Grupo Tx £VS£ aumento da pata em 24 horas (esplenócitos inacti Pr/Ch (xlO Smn) vados com 8M0P-WA)

A	Inoculados por CVSC	+/+	7+1.1
B	Simples	+/+	24.8+1.3
C	0	+y/+	19+1.6
D	0	-/+	6+1.2 «m·

Para ensaiar a especificidade desta supressão, expuseram-se ratos a um antigene não relacionado, nomeadamente a células vermelhas sanguíneas de galinha (CVSG), após mais dois tratamentos in vitro. Todos os grupos de ratos (incluindo os que tinham sido tornados tolerantes a CVSC) apresentavam um nível normal de HTR a CVSG. Isto demonstra que a supressão era específica para os linfócitos activados pelo antigene de CVSC.

Para melhor elucidar o mecanismo celular de indiferença a CVSC, foi efectuada a transferência de células passivas para receptore.s normais, imediatamente após a reacção HEx a CVSC. 24 horas depois da reacção HTR, foram retirados os baços de cada grupo de ratos. Os Grupos A e B foram tratados com esplenócitos activados por CVSC inactivados ou com células simples inactivadas. Os grupos não tratados foram inoculados e provocados (Grupo C) ou apenas provocados (Grupo D). Injectaram-se 45x10 células de cada grupo por via intravenosa em

- 18 —

foram provocados na pata e o HTR foi medido 24 horas depois. Os resultados estão apresentados seguidamente no Quadro 2. Os receptores que receberam células de animais tornados tolerantes a CVSC (Grupo A) não desenvolveram uma reacção HTR em contraste com os outros grupos.

QUADRO 2

Transferência de tolerância a células vermelhas sanguíneas de carneiro

Grupo	Fonte Celular Tx w/8M0P-UVA células IV	CVSC Pr/Gh	Provocação Pós-transferên cia CVSC	Aumento da pata em 24 horas (xlO ^mm)
A	Inoculados por CVSC	+/+		3.9 + 1.8
B	Simples	+/+		15.7+1.9
C	0	+/+	+	15+3.2
D	0	-/+	+	4.5+1.4

Estes resultados demonstram que a perfusão repetida de 8M0P-UVA de células activadas de antigene inactivado, em receptores normais, induz a supressão de imunidade das células T, como foi avaliado pela reacção de HTR, tornando estes ratos tolerantes a esse antigene. Esta tolerância pode ser uevida quer à falta de suficientes células capazes, quer à presença ou estimulação de células supressoras endógenas.

Estes modelos murinos validam o conceito de que respostas imunitárias mediadas por células T podem ser imunorreguladas, estimulando primeiro artificialmente o sistema imunitá- 19 -

rio e, em seguida, expondo o sistema imunitário a células capazes inactivadas com 8WB-UVA.. 0 poder desta abordagem para terapia de doenças autoimunee é demonstrado no Exemplo 5, onde as manifestações de doença autoimune fulminante foram controladas no modelo de ratos MRL/lpr.

EXEMPLO 2

Indução de tolerância a enxerto externo

A tolerância a enxertos externos da pele, isto é, a um enxerto de tecido entre dois membros diferentes geneticamente da mesma espécie, foi estudado num sistema alogénico. Neste sistema, ratos BaLB/c receberam enxertos histoincompatíveis, isto é, tendo antigenes de transplantação incompatíveis, a partir de dadores CBa/J. Os ratos que receberam enxertos histoincompatíveis rejeitarão, normalmente, o enxerto. Quando se seguiu a rejeição do enxerto, os ratos foram sacrificados e as suas células esplénicas foram inactivadas com 8M)P e UVA₀ Estes esplenócitos inactivados foram injectados em receptores BALB/c simples. Após 8 tratamentos de esplenócitos singénicos inactivados, de ratos que estão em processo de rejeição de transplante os receptores BALB/c foram provocados com um aloantigene, presente no enxerto externo CBA/J, resultando numa reacção de hiper sensibilidade de tipo retardado.

A metodologia utilizada é como se segue: ratos BALB/c foram tornados tolerantes a aloantigenes de OBâ/J por 8 injecçÕes de esplenócitos de ratos BALB/c singénicos que estavam rejeitando enxertos externos CBA/J. Os ratos BALB/c tornados tolerantes foram inoculados com 30 x 10 esplenócitos inactivados por 8M0P-UVA de um rato BALB/c. Os ratos tornados tolerantes foram provocados no peito do pó com 10x10 esplendeitos H . Ratos tornados tolerantes foram provocados com um segun20

ido aloantigene (Η ), Prepararam-se ratos BajjB/o simples e provoI carum-se por ambos os aloantigenes. Os ensaios de comparação negativos, foram executados com ratos BALB/c simples que não receberam qualquer dose de inoculação, mas que foram provocados com antigenes externos. Os resultados são apresentados seguidamente no Quadro 5. 0 Hg refere-se a uma região do genoma do Complexo de Histocompatibilidade Maior (OHM) do rato, que gera produtos importantes no processo de rejeição. 0 complexo Hg é adicionalmente subdividido em regiães, uma das quais é a região D, A região B contém genes que codificam para proteínas, que agem como moléculas de reconhecimento de superfície da célula.

Resposta de hipersensibilidade retardada de ratos BAlB/ç d (H^ ) tornados tolerantes a aloantigenes CBA/d (H k)

HTR ~2

BALB/c Inoculados Provocados (mmxlO ) %Supres₀

N=5 (X+SD)

Comparação Pos.	D	H* 2	H^k 2	84.4+13
Simples
Comparação Neg. Simples	D		^H2	8.9+3.7
Tol. a H k 2	D	__Tk ^tí2	H^k 2	19.9+6.0	85«5
Comparação Pos. Simples	D	^H2	H^b 2	73.4+15.4 ·*·
Comparação Neg. Simples	D		H^b 2	18.0+4.0
Tol. k aH₂	D	^H2	b H 2	74.3+2.5	OoO

Os ratos tornados tolerantes apresentavam 86 $ de ; supressão da resposta de hipersensibilidade retardada a aloantigenes de CBA/J. Esta supressão era específica para produtos do · local Hg, j^ Q.^{ue 08} BAIiB/c tornados tolerantes, provocados com esplenócitos foram tão capazes de responder a este aloantigene como os ratos BaEB/c simples. Assim, a tolerância específica a aloantigenes pode ser induzida por repetidas injecçães de células dos baços dos ratos que estão a ser sujeitos a uma í resposta de rejeição de enxerto. i

Os baços dos ratos que rejeitam um enxerto externoí ί contêm células efectoras que são especificamente reactivas para | antigenes de histocompatibilidade estranha. Repetidas transferências destas células efectoras singénicas inactivadas com 8M0P-UVA em ratos BaEB/c podem provocar uma resposta no rato receptor, que suprime a população de células efectoras. Quando I estes ratos são provocados com o aloantigene relevante, não i podem preparar uma resposta de célula efectora, pois suprimiram j a população de células capazes de resposta. Esta observação é apoiada pelos resultados de uma análise de citotoxicidade₀ '

A imunidade mediada por células ϊ pode ser demons-j trada numa análise de citotoxicidade in vitro, tal como a liber-* ·

tação de CR de uma célula visada pré-classificada. Numa andlise destas, a função efectora de células T citotóxicas, é verificada incubando células efectoras de linfócitos com as ^!células visadas marcadas por radioisótopos. A acção lírica dos efectores é avaliada analisando os isótopos libertados. Numa análise de citotoxicidade como a descrita foram obtidos esplenócitos BALB/c a partir de ratos que foram tornados tolerantes a aloantigenes de CBA/J por injecção de esplenócitos inactivados por 8M0P-UVA de ratos BhLB/o que estavam em curso de rejei- . ção de um enxerto externo de OBA/J. As células efectoras foram ;

6/3 6 , 3 cultivadas a 8x10 /cm com 3x10 /cm υθ esplenócitos OBA/J inactivados com 8WP-UVA como células estimuladoras, durante 7 i

I ί

dias. As células visadas eram blastos CBà/J de eonoanavalina A (linfócitos de células T estimulados pela lectina Con a mitogé- .

i nica) que foram marcados com Cr e adicionados ao efeotor apropriado à proporção de células visadas. As células visadas foram * incubadas durante 4 horas e as células eíectoras e os sobrenadan: tes foram colhidos para contagem de cintilação líquida. Os resul' tados desta análise são apresentados seguidamente no Quadro 4.

QUADRO 4

Análise Citotóxica:

BALB/ç tornados tolerantes a aloantigenes de CBA/J

Efector

Estimulador

Células visadas % de lise

Proporção entre o efector e as células visadas

BAlB/c	CBA/J	CBA/J	20:1 40:1 51+7.ô 62.1+19.2	80:1 55.5+17o 2
simples
BAlB/c Nenhum	cba/J	75.5+7.1 ÍW	81.2+0
transplantados com enxerto de CBA/J
BALB/ç transplantados com enxerto de CBA/J	CBA/J	CBA/J	75.9^4.4 42.5+2	52 +16.8
BALB/c tornados tolerantes para CBA/J	CBA/J	CBA/J	20.4±5.9 19.2±5.7	26.9±6_O6

j i

- 24 - i

Como se pode verificar pelo Quadro 4, os ratos BALB/c simples e os ratos BALB/c sensibilizados a enxertos de pele CBA/J lisaram eficazmente alvos UBa/J para todas as propor ções entre efectores e células visadas estudadas. Esplenécitos de ratos BALB/c, que foram tornados tolerantes por injecção de populações de células efectoras de baços de ratos em processo de rejeição de enxertos CBA/J, apresentaram 48 $ a 67 % de supressão da capacidade de gerar células 1’ citotóxicas capazes de lisar alvos CBA/J.

Os esplenécitos inactivados suprimiram igualmente a resposta citotóxica de esplenécitos BALB/c simples e sensibilizados quando foram adicionados adicionalmente a uma análise padrão de citotoxicidade. Deste modo, os baços dos ratos torna- ^;dos tolerantes continham células que não responderam ao aloantigene relevante e que eram capazes de suprimir uma resposta das células efectoras in vitro. Estes resultados apoiam a hipótese de que a nova perfusão de populações de células efectoras inactivadas por 8M0P-UVA provoca uma resposta no hospedeiro que provoca uma redução do tipo de células imunorreactivas. Esta resposta imunossupressiva é específica em relação ao antigene.

EXEMPLO 3

Tratamento de Doença Autoimune de Murino modelo MRL/lpr de lupus eritematoso sistémico (LES) é um modelo onde a estirpe MRL/lpr de ratos desenvolve uma doença autoimune semelhante ao LES humano. Neste exemplo, foram tratados ratos novos (4 a 6 semanas de idade), antes do começo da doença autoimune, com esplenécitos singénicos inactivados por 8M0P-UVA de ratos autoimunes velhos (18 a 22 semanas). As manifestações de doença autoimune nos ratos MNL/lpr inclui hiperproliferação maciça de células T, levando a hiperplasia dos gânglios linfáticos e do baço.

ί A proliferação de células i¹ é constituída por t* células linfóides que são células T THY1 e LY1 · Provou-se que a terapia que suprime esta proliferação de células T inibe o desenvolvimento da doença autoimune em ratos ííRL/lpr. Portanto, foi considerado que, quando se tratam ratos novos antes do começo da âoença autoimune, se provoca uma resposta imunitária autorreguladora que melhora o curso fulminante da sua doença autoimune. Os presentes resultados confirmam este postulado.

Os ratos MKL/lpr rêm várias características c.e doença consistentes que proporcionam indicadores de confiança da eficácia do protocolo do tratamento. Os seguintes parâmetros de doença autoimune foram respeitados em ratos ífeL/lpr de idade adequada:

1. Peso, tamanho e celularidade do baço e dos gânglios linfáticos;

2. Sobrevivência;

3. Títulos de autoanticorpos anti-ADN;

4. Fenótipos dos linfócitos; e

5. Resposta a mitogenes de células 1 e 3.

Ratos MRL/lpr tratados por 8MVP-UVA receberam bi-semanalmente injecçoes intravenosas na veia da cauda de 20 a 50x10^ esplenécitos tratados com 100 ng/ml de 8M0P e 1 joule/cm^ de UVA. Os ratos de comparação não receberam qualquer tratamento.; Os ratos foram sacrificados a intervalos semanais e levaram-se a cabo comparações do tamanho, do peso e da celularidade do baço e dos gânglios linfáticos. Os resultados de autópsias consecutivas em ratos ifil/lpr de comparação não tratados e tratados por 8M0P-UVA de idade adequada são apresentados no Quadro 5.

—

Comparação dos baços e dos g*nglios linfáticos de ratos iGRL/lpr tratados com 83íOP-UVa e de ratos de comparação da mesma idade

			Peso do	Píendimento Tamanho
Grupo	Idade (semanas)	N	Baço (g)	de células esplénicas (cm²) (xio⁶)
8M0P-
UVA	13-19	5	0.31+0.07	229+115 1.11+0.32
	20-26	7	0.29+0.16	71+0.52 1.26+0.45
	29-32		0.98+0.56	500+80 3.0+0.53
No Tx	13-19	19	0.53+0.23	323+90 1.77+0.77
	20-26	20	0.63+0.22	364+167 1.92+0.80
	29-32	Com	paração da mesma	idade - 100 % Ge mortali-
				dade
			QUADRO 5 (2^ Parte)
Grupo	Idade (semanas)		Peso Gánglio (g)	s linfáticos Tamanho (cm²)
8M0P-
UVA	13-19		0.48±0.33	1.28+0.79
	20-26		0.62+0.39	1.44+0.60
	29-32		1.00+0.77	1.70+1.20
No Tx	13-19		0.8710.43	2.14+1.5
	20-26		1.38±0.64	2.35+1.26
	20-32		100 % de mortalidade

Os ratos M&L/lpr tratados com esplenócitos 8M0P-UVA singénicos de dadores autoimunitários mostram uma diminuição no peso, tamanho e celularidade do baço e dos gânglios linfáticos, em comparação com os ratos de idade adequada, não tratados, de comparação a 13 a 19 semanas. Os baços de ratos tratados pesavam menos 49 % e tinham menos 2g % de esplenócitos do que os ratos de comparação. Os gânglios linfáticos dos ratos tratados por 8M0P-UVA às 13 a 19 semanas tinham menos 45 P do peso e estavam 40 % mais pequenos do que os de comparação. Esta diminuição foi ainda mais evidente no grupo de ratos tratados por 8M0P-UVA, sacrificados às 20 a 26 semanas. Verificou-se uma diminuição de 54 % (p/0,001) no rendimento de esplenócitos no grupo tratado por 8M0P-UVA. De modo semelhante, os gânglios linfáticos obtidos a partir de ratos tratados por 8M0P-UVA às 20 a 26 semanas pesavam menos 55 % (P/0,01) e eram 39 p mais pequenos do que os de comparação.

Deixou-se sobreviver um grupo de ratos tratados por 8M0P-UVA para além da idade em que todos os ratos de comparação não tratados tinham morrido (22 a 26 semanas). Estes ratos foram sacrificados com 29 a 32 semanas de idade, um aumento no período de vida de mais de dois meses. Constatou-se a ocorrência de organomegália nestes ratos muito velhos, sugerindo que a nova perfusão de esplenócitos autoimunitários tratados por 8M0P-WÁ atrasa o começo de doença autoimune i.iríl/lpr, mas que eventualmente ocorrerá hiperplasia linfóide.

Noutro estudo, foram ensaiados ratos MRD/lpr tratados com esplenócitos de δΙώΟΡ-ΙΓνΑ para a produção de anticorpos anti-ADN. Poi obtido soro de ratos, por colheita ne sangue no plexo retro-orbital, fratou-se por ultra-sons ADN de timo de vitela e secou-se em alvéolos duma placa de microtitulação com 10 mg/alvéolo. 0s soros foram adicionados aos alvéolos e es placas foram agitadas durante uma hora a 23°C. Depois da lavagem, foram detectados anticorpos reactivos, pela ligação de

125 um reagente de Ig de coelho anti-rato marcado com I, Os resul tados

deste estudo são apresentados seguidamente no Quadro 6.

QuaDR.0 6

Títulos de anticorpos anti-AòN em ratos M<b/lpr tratados com 8M0P-UVA

Grupo Idade/Semanas

MRl/lpr 13

TX 8M0P-UVA

MRl/lpr sem Tx

Ratos normais baib/c cba/j

Título de anticorpos anti-luA Is 100 ύ±χ

901 + 858

1.971 ± 772

6.355 + 733

15.063 + 4.482

2.353 + 670

2.353 + 120

Os esplenócitos autoimunes inactivados de ratos MRl/lpr tratados com 8M0P-UVA não desenvolveram títulos altos de anticorpos anti-ADN. As 19 semanas de idade, o soro uos ratos tratados por SMOP-UVa continha níveis de anticorpos anti-ADN semelhantes aos obtidos em ratos não autoimunes normais. Os ratos MRl/lpr não tratados tinham altos níveis de anticorpos

anti-ADN detectados ao fim de três semanas de idade e estes níveis subiram para 6 vezes o normal ao fim de 17 semanas de idade. No entanto, a nova perfusão de esplenócitos autoimunes singénicos tratados por 8M0P-WA inibe a indução ae auto-anticorpos anti-ADN, o que é compatível com uma diminuição da doença.

Em estudos fenotípicos de linfócitos de baços de ratos tratados com 8K0P-UVA, detectou-se um abaixamento de 65 / em células T THil , em comparação com ratos de comparação não tratados, a população de LY1 baixou de 50 /. Eoi evidente um aumento para o dobro das células B positivas em relação a imunoglobina de superfície em baços de ratos tratados. Quando se lisaram estas células B detectou-se um aumento de 6 vezes num tipo de células Ia⁺. Estudos funcionais preliminares mostraram já que esplenócitos de ratos tratados por 8M0P-UVA retinham a capacidade de responder à concanavalina A mitogénica de células T e a lipopolissacárido mitogénico de células B, enquanto os esplenócitos de ratos não tratados perderam a capacidade de responder aos mitogenes tanto das células T como 3.

Tomados em conjunto, estes resultados demonstram que o curso de doença autoimune em ratos MRl/lpr pode ser melhorado pela exposição de esplenócitos inactivados por 8M0P-UVA numa idade jovem. A hiperplasia linfóide fulminante é atrasada no ataque e ratos tratados sobrevivem, pelo menos, 2 meses mais que os da mesma ninhada, não tratados. Além disso, a produção de autoanticorpos anti-ADN é inibida em ratos não tratados. Os baços de ratos tratados contêm menos células T e percentagens superiores de células B e de células Ia . Também os ratos tratados retêm a capacidade de elaborar uma resposta proliferativa a mitogenes de células T e B. Por estimulação artificial do sistema imunitário dos animais, antecedente ao começo da doença, o método aqui descrito alterou o curso da doença.

Se bem que a presente invenção tenha sido particulannente descrita em modos específicos de concretização, deverá — 50

compreender-se, em vista da presente descrição, que numerosas variações sobre a invenção são agora permitidas aos peritos na técnica, sendo estas variações abrangidas pelo âmbito da presente invenção. Em concordância, a presente invenção deverá ser interpretada num sentido amplo e limitada apenas pelo âmbito e pelo espírito das reivindicações anexas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

- Is -

Processo para a preparação de um agente terapêutico para alteração especifica da resposta do sistema imunitário de um mamífero caracterizado por compreender as fases de:

(a) fazer contactar o sistema imunitário do mamífero com o antigene específico durante um período de tempo adequado de modo a que o referido sistema imunitário seja artificialmente estimulado;

(b) colher material contendo células sanguíneas, incluindo células sanguíneas estimuladas pelo antigene, do referi do mamífero;

(c) tratar o referido material ou células de modo a alterar as células estimuladas.

- 2â -

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a fase (c) de tratamento do referido material ou células compreender a combinação das células sanguíneas com um agente de fotoactivação e a irradiação das referidas células tratadas com radiação ultravioleta (DV).

- ?s -

Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o tratamento compreender as fases de:

formar com o referido material ou células uma corrente extracorporal, fazendo fluir a referida corrente através duma estação de tratamento que compreende uma câmara fina substancialmente transparente à radiação ^TeV θ irradiar a corrente na estação de tratamento com radiação UV na presença dum agente capaz ue fotoactivação dissolvido com capacidade de ser transformado pela radiação UV de um estado biologicamente inerte para um estado excitado de modo transiente capaz de estabelecer ligações cruzadas com ADN nas células, alterando deste modo as células.

— 4- —

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o material contendo células sanguíneas ser sangue, líquido linfático, .medula óssea ou tecido de um órgão linfático o — 3* —

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o antigene estar associado com uma afecção seleccionada de entre o grupo constituído por reacção de hipersensibilidade de tipo retardado, doença auto-imune, cancro, alergia, doenças infecciosas e rejeição de enxertos e de aumoenxertos contra a reacção do hospedeiro.

— -

Processo de acordo com a. reivindicação 1, caracterizado por o mamífero ser humano.

- 7^è -

Processo ue acordo com a. reivindicação 1, caracterizado por as células serem linfócitos.

~ 8- —

Processo ue acordo com a reivindicação 7, caracterizado por os linfócitos serem células T.

- 9^â -

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o antigene ser uma célula T que expressa receptores de células 1' singulares com capacidade de servir como ant.i•7 genes clonotípicos

- lOè Processo de acordo com a reivindicação 5» caracterizado por a aíecção ser mediada por uma expansão clonel de células 1 aberrantes em circulação.

-llâ -

Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o agente capaz de fotoactivação ser psoraleno.

—12- —

Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o psoraleno ser 3-metoxi-psoraleno ou amino-metil-trimetil-psoraleno·

-13& -

Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o psoraleno estar presente no sangue a uma concentração de cerca de 1 nanograma até cerca de 100 mocrogramas por mililitro de sangue.

- 14& —

Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a colheita do material e a passagem do mesmo para a estação de tratamento serem efectuados sob a forma duma operação contínua que é levada a efeito em conjunto com a própria administração do agente terapêutico ao paciente.

- 15& -

Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o caudal da corrente extracorporal estar situado na gama de cerca de 10 a cerca de 75 mVmin.

- 16 s -

Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por incluir adicionulmente uma fase de separação de pelo menos porções das células antes da administração fazendo passar a corrente através duma centrífuga de fluxo contínuo.

- 17a „

Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por 0 material ser irradiado com fotoenergia num comprimento de onda de UVA e com uma dose de radiação de cerca de

0,1 até cerca de 100 joule/cm .

- 18* -

Processo de acordo com a reivindicação 2, c<.racterizado por 0 agente capaz de fotoactivação ser dissolvido no material por mistura do mesmo com 0 material depois da colheita do material do paciente.

- 19* -

Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por 0 agente capaz de fotoactivação ser dissolvido no material por administração oral do agente ao paciente.

- 20* -

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a fase de contacto incluir a introdução artificial do antigene na corrente sanguínea ou no sistema imunitário do mamífero.

- 21* Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por 0 período de tempo adequado ser não superior a um ano.

— 22* —

Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por 0 período de tempo adequado ser cerca de 72 horas.

- 23* -

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a fase de estimulação compreender a formação de certos linfócitos especificamente em resposta ao antigene,

- 24* -

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a alteração das células compreender uma substan- 34 - ciai perda cie efectividade ou de viabilidade celular.

- 25^& -

Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por se romper a integridade da membrana celular.

- 26& -

Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por o ADN dentro das células ser alterado,

- 27^ Processo para a preparação de um agente terapêutico para supressão da resposta do sistema imunitário de um mamífero a um enxerto de um tecido que expressa pelo menos um antigene singular que serve para promover uma resposta imunológica adversa no mamífero caracterizado por compreender as fases de 1 (a) contactar 0 sistema imunitário do mamífero com pelo menos um dos antigenes referidos durante um período de tempo adequado de modo a que sejam estimulados certos linfócitos;

(b) colher sangue, incluindo linfócitos activados pelo antigene ou pelos antigenes, do referido mamífero;

(c) tratar 0 sangue colhido ou os linfócitos de modo a inactivar os linfócitos activados pelo antigene ou pelos antigenes.

A requerente declara que 0 primeiro pedido desta

- 35 Estados unidos da .américa em 27 de de série 31,49θ·