JP2958372B2 - Ｔ細胞の調整方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、哺乳動物の免疫系統応答を特異的に変化
させる方法に関するもので、この方法においては、特定
の抗原に応答して哺乳動物が活発に免疫化されたとき
に、特定の形態の免疫抑制が哺乳動物中で誘発される。

免疫応答は、体液応答か細胞媒介応答かのいずれかに
分類される。体液応答は、自由に拡散できる抗体分子に
よって媒介される応答である。細胞媒介応答は、抗体で
はなく、Ｔ細胞のような特異反応的リンパ球によって媒
介される応答である。

体液応答と細胞媒介応答との間には基本的な相違があ
る。体液免疫では、抗原との接触から免疫応答までの時
間が数分ないし数時間であるのに対し、細胞媒介免疫で
は１日もしくはそれ以上である。体液免疫では、抗原と
反応する活性単位は抗体であるが、細胞媒介免疫ではＴ
リンパ球である。体液性抗体は一般的に小さな抗原決定
基に対して特異的である。Ｔリンパ球は、より大きな分
子、通常タンパク質（特に、細胞表面上に担持されてい
るもの）に対して特異的である。

細胞媒介応答は、身体の防御の一部として一般的に有
益なものであるが、細胞免疫応答の中のあるものは有害
である。このような有害な細胞媒介免疫応答の例として
遅延型過敏反応、移植片拒絶反応、移植片対宿主反応
（graft vs.host reaction）及びいくつかのアレルギー
反応を挙げることができる。さらに、重症性筋無力症、
リューマチ性関節炎、全身性紅斑性狼瘡及びグレーブス
病のようないくつかの自己免疫疾患も包含される。

これらの多くの有害な細胞媒介応答は患者の組織破壊
を引き起こすので、このような応答の効果を排除し、も
しくは減じることが望ましいことが理解される。問題と
なるこのような応答の１つは移植片の拒絶反応である。
移植片とは、供与者から同種の遺伝的に異なる受容者へ
移された細胞、組織又は器官である。ある表面糖タンパ
ク質の大きな多形性の故に、移植細胞は、ほとんど常
に、宿主細胞上では欠落している組織適合性抗原又は移
植抗原を有しており、また、逆に宿主細胞は移植細胞に
ない抗原を有している。その結果、宿主は細胞媒介応答
により移植片を破壊する。

移植片対宿主反応は、リンパ球が免疫的能力のある供
与者（健常な大人）から遺伝的に異質な無能力の受容者
（例えば新生児）に移された時に起きる。この反応は、
定常な甲状腺又は骨髄細胞を免疫欠陥を有する人（例え
ば遺伝的欠陥を有する幼児、細胞障害性薬剤又は全身性
Ｘ線放射により治療された白血病患者）に移して治療す
ることが試みられていることから、最近、臨床的な重要
性が増している。

自己免疫疾患では、身体の免疫系が自己の細胞のある
もの又はその一部を認識することができず、これらの細
胞を攻撃して組織破壊をもたらす。この攻撃は自己抗体
及び自己反応性Ｔ細胞によって行なわれる。

アレルギー性応答は、高い免疫応答を包含する。いく
つかのアレルギー性応答においては、免疫系は、花粉、
動物のふけ及び塵のような、通常無害な物質に対して攻
撃を開始する。これらのアレルギー性応答では、感作Ｔ
リンパ球が抗原と反応し、リンホカインの作用を介して
炎症を引き起こす。環境抗原に対するこの炎症反応の有
害な効果により疾病が引き起こされる。このような反応
の１例としてアレルギー性接触皮膚炎を挙げることがで
きる。

この発明は、患者の免疫応答を特異的に変化させ、そ
れによって特定の免疫疾患及びその有害な効果を改善す
る方法を提供する。

米国特許第4,321,919号、4,398,906号及び4,464,166
号（それぞれエデルソン）は、ヒトにおいて機能的なリ
ンパ球の数を減らす方法を記載している。エデルソンの
方法は、疾患のためにその血球細胞が自然に刺激されて
いる血液を処置することを包含する。さらに詳細に言う
と、この方法は、リンパ球のような、天然に刺激された
ヒト血球細胞を、ソラレン（psoralen）のような、紫外
線を照射するとDNAと光付加物を形成することができ
る、光活性化可能な溶解された薬剤で処理することを包
含する。次にリンパ球に体外で紫外線照射し、修飾す
る。体外での照射の後、処理されたリンパ球は患者に戻
される。修飾されたリンパ球は、自然の過程により患者
の体内から除去されるが通常よりも早い速度で除去され
る。これはしばしば細胞の有効性すなわち生存を失わし
める、膜の完全性の破壊、細胞内のDNAの変化等の条件
に起因するものと信じられる。

エデルソン特許に記載された方法は、最近、紅皮症
（セザリー（Sezary））型の皮膚性Ｔ細胞白血病（CTC
L）を患った患者の臨床試験に使われた。その結果、こ
の方法によると、患者体内の全てのＴ細胞が減少する
が、正常なＴ細胞は４週間以内に回復し、悪性細胞の抑
制はさらに長く続くことが示された。

エデルソンによって記載された方法の欠点は、予防の
ために用いるのに適していないことである。例えば、エ
デルソンの方法は、免疫疾患に特徴的な抗原であって患
者が未ださらされていない特定の抗原に対する免疫応答
を選択的に抑制するためには用いることができない。

齧歯動物を用いた実験により、生体外で培養されたＴ
細胞の自己反応性クローンからの同質遺伝子的細胞を静
脈注射すると、実験的自己免疫甲状腺炎、脳脊髄炎又は
関節炎を引き起こすことが示された（コーエン、IR.Ad
v.Intcrn.Med.（1984）29:147−165）。しかしながら、
もし同じＴ細胞クローンからの培養細胞を照射処理又は
マイトマイシンＣ処理によって殺し、もしくは弱毒化し
てワクチンを形成し、これを同質遺伝子的なマウス又は
ラットに注射すると、その後、その動物に生きた自己反
応性Ｔ細胞を注射してもその動物は、その疾病に対して
抵抗力を獲得していることが示された（ベンナン・エイ
ら、Nature（1981）292:60−61;ホロシツ・ジェイら、S
cicnce（1983），219:56−58;及びコーエン、I.R.J.Inv
est.Derm（1985），85（Supp.1）:345−385）。このよ
うに、処理された自己免疫エフェクターＴ細胞のセルラ
インを自己免疫疾患に対するワクチンとして用いること
が可能であることが示されている。

上記した齧歯動物系の実験は、自己免疫疾患を生みだ
すことができるＴ細胞ラインを単離して増殖させる必要
があるという欠点を有する。このようなセルラインはヒ
トの疾病については容易に入手することができず、不可
能ではないとしても時間のかかる努力を通じてのみ得る
ことができる。従って、これらの齧歯動物系の実験に示
された方法はヒトの治療には相応しくない。さらに、こ
のようなヒトＴ細胞ラインを得ることができたとして
も、それぞれの自己免疫疾患について特異的な異なるセ
ルラインをそれぞれ調製しなければならない。

齧歯動物を用いたさらに他の実験により、８−メトキ
シソラレン（８−MOP）及びこれに続く紫外線処理した
リンパ球の同質遺伝子的MRLマウスに対する静脈内注射
により、それらの全身性紅斑性狼瘡様症候群及び自発的
に進行するリンパ過形成が実質的に阻害されることが最
近示された（ペレズ・エムら、Clin.Res.（1986）34:77
4A）。

パリッシュ・ジェイ・エイ等、N.Engl.J.Med（197
4），291:1207−1211に記載された実験により、８−MOP
の経口投与と皮膚の紫外線Ａ（UVA）照射とを組合せる
と、表皮の過増殖疾患である衰弱性尋常乾癬に有効であ
ることが示された。これはその後、複数の研究所による
臨床試験により確認された（メルスキー・ジェイ・ダブ
リュら、J.Invest.Derm.（1977），68:328−335）。引
き続き、皮膚に限定されたブラークステージ皮膚Ｔ細胞
リンパ腫（CTCL）もこの処置に応答することも示された
（ギルヒレスト・ビーエイら、Cancer（1976）38:683−
689;ホンギスマン・エイチら、J.Am.Acad.Derm.（198
4）10:238−245）。

先行技術は、リンパ球が患者の体内で無力化され又は
弱毒化されてワクチンを創製し得ることを示している。
しかしながら、このような知識はヒトにおける疾病を防
止するのに有用ではない。従って、この発明は、あらゆ
る免疫疾患の治療に用いるのに相応しい、便利な方法を
提供するものである。

この発明は、機能的に不活性化したＴ細胞の調製方法
であって、 （ａ）哺乳動物の体内で所定期間特定の抗原に接触させ
て人工的に刺激した後に前記哺乳動物から抜き取って得
られるＴ細胞を原料として装置に供給する工程と、 （ｂ）前記供給されたＴ細胞を紫外線とソラレン類薬剤
を用いて処理して機能的に不活性にする工程と、 を備えた方法を提供する。

また、この発明は、哺乳動物の体内で所定期間特定の
抗原に接触させて人工的に刺激した後に前記哺乳動物か
ら抜き取って得られるＴ細胞を、紫外線とソラレン類薬
剤を用いて装置により処理することによって調製した機
能的に不活性化したＴ細胞を提供する。

この発明は、ヒト患者における免疫疾患を選択的に防
止するために適しているという利点を有する。この発明
の原理は、時間のかかる細胞培養技術を用いるのではな
く、患者自身の免疫系を刺激して刺激リンパ球を産生す
るという便利な方法に依存している。

この発明は、（ａ）Ｔ細胞を所定期間特定の抗原に接
触させて、人工的に前記Ｔ細胞を刺激し、（ｂ）前記Ｔ
細胞を処理して前記Ｔ細胞を機能的に不活性にするＴ細
胞の調整方法を提供する。

ここで、人工的に刺激するとは、問題としている特定
の抗原を哺乳動物の免疫系と接触する積極的段階を必要
とする人間の介在を意味する。抗原は次いで、この抗原
について特異的な免疫応答を刺激する。この免疫応答は
Ｂ細胞リンパ球又はＴ細胞リンパ球の産生であることも
ある。免疫系の人工的刺激は、疾病の結果免疫系が自然
に刺激される天然刺激と対称的なものである。

血球細胞含有物は血液、リンパ球、骨髄、リンパ系器
官組織又は血球細胞を含む他のどのような体液又は組織
であってもよい。好ましい具体例では、これは血液であ
る。

この発明の好ましい具体例では、血球細胞の人工的刺
激とそれに続く細胞のフォトフェレシス（photopheresi
s）との組合せが用いられる。フォトフェレシスの方法
は、基本的には、処理すべき細胞を光活性可能な薬剤と
結合させ、細胞を照射して薬剤を活性化させ、このよう
に処理した細胞を患者の体内に戻すことを包含する。フ
ォトフェレシスは、血液又は血液から誘導された細胞著
しくは液体を体外流とし、紫外線に対して実質的に透明
な薄い室を有する患者治療ステーションにこの流れを流
通させることによって達成することができる。体外流は
次いで、溶解された光活性化可能な薬剤の存在下におい
て上記治療装置内で紫外線を照射される。光活性化可能
な薬剤は、紫外線照射によって生物学的に不活性な状態
から、処置された血液の細胞中のDNAと共有結合的に架
橋できる一時的な励起状態に転化され得るものである。
架橋結合されたDNAを含む細胞はそれによって致命的に
損傷され、又は少なくとも機能的に不活性化される。

この発明の方法においては、それに対する免疫応答を
抑制し又は修飾すべき抗原は、自己免疫疾患、ガン（例
えば腫瘍特異的抗原）、アレルギー、感染症、移植片拒
絶、遅延型過敏症反応、及び移植片対宿主反応のよう
な、疾患、病的状態及び疾患状態に伴なわれる抗原を包
含する、あらゆる抗原であってよい。処置される患者又
は宿主はヒトのような哺乳動物である。

問題とする特定の抗原は、クローン型（clonotypic）
抗原として働くことができる、固有のＴ細胞レセプター
を発現するＴ細胞を刺激する働きをする場合がある。こ
の場合には、これらの循環する異常Ｔ細胞のクローン的
増殖により、制御しようとする疾患が媒介される。この
発明は、このような異常Ｔ細胞のクローン特異的免疫反
応を誘導する方法を提供する。

哺乳動物の免疫系を特定の抗原で接触することは、例
えば抗原を血流、リンパ系又はリンパ器官に直接注射す
る等の、哺乳動物の免疫系に抗原を導入するいずれの方
法によっても行なうことができる。抗原は次いで、該抗
原に特異的なある血球細胞の刺激を許容するのに適当な
時間、哺乳動物の免疫系と接触させられる。この適当な
時間は１年の長きにわたることもあり得るが、ほとんど
の場合はそれよりも短く、一般に72時間以内である。

好ましい具体例では、刺激リンパ球のような、抗原に
よって刺激された血球細胞は、その血液を介して哺乳動
物から抜き取られる。この態様は、患者から血液を抜き
取ってそれを再循環させることが簡単で便利であるので
好ましい。このような方法はこの分野において周知であ
り、血液透析に用いられる方法と類似している。

抗原で刺激された血球細胞を得るために血液を抜き取
るもう１つの理由は、リンパ球のような、影響を受けた
細胞が血液中に大量に存在するからである。しかしなが
ら、リンパ球はまた、リンパ液及び組織空間を循環し、
甲状腺、脾臓及びリンパ節のような一次及び二次リンパ
構造体中に凝集する。従って、抗原により活性化された
リンパ球はまた、リンパ液又は一次もしくは二次リンパ
構造体からも得ることができる。このようにして得られ
た活性化リンパ球は、この明細書で記載するように処理
され、哺乳動物に戻される。

この発明では、血球細胞を特定の抗原で刺激した後、
哺乳動物から血球細胞を抜き取り、それを例えば致命的
損傷を与えるか又は少なくとも機能的な不活性化するよ
うに処理する。このような処理は、当業者が想到するい
くつかの方法により達成することができる。例えば、過
度の高温若しくは低温、高pH若しくは低pH、高圧若しく
は低圧にさらす；化学物質、毒物で処理する；又は樹脂
材料を通過させる；等の方法を不活性化処理に用いるこ
とができる。血球細胞を単に取扱うだけで所望の結果を
得ることができる場合もある。しかし好ましくは、この
処理は、後述するフォトフェレシス法により行なわれ
る。

細胞を処理するフォトフェレシス法は、哺乳動物から
抜き取った血液を体外で照射することを包含する。この
方法では、血液又は血液から誘導された液若しくは細胞
を血液中に溶解された光活性化可能な薬剤と接触させ
る。光活性化可能な薬剤は、血液を抜き取った後に血液
と混合することによって、又は血液を抜き取る前に患者
に経口投与することによって血液中に溶解される。光活
性化可能な薬剤は、DNAと架橋結合することができるい
ずれの薬剤であってもよい。このような薬剤の例として
ソラレン類を挙げることができる。好ましいソラレン類
としてアミノメチルトリメチルソラレン（AMT）、８−
メトキシソラレン（８−MOP）を挙げることができる。
さらに薬剤の例として、光活性ピレン、及びボルフィリ
ン分子に結合されているモノクローナル抗体を挙げるこ
とができる。

ソラレンをフォトフォレシス法に用いる場合には、血
液1ml当たり約１ナノグラムないし約100ナノグラムの濃
度でソラレンが血液中に存在することが好ましい。血液
の抜き取り、処理ステーションへの血液の流通及び患者
へ血液を戻すことは１つの連続的な操作として行なうこ
とができる。体外血液流の流速は１分当たり約10ないし
75mlである。また、血液の表面1cm²当たり約0.1ないし
約100ジュールの照射量で、紫外波長領域（UVA,UVB,UV
C）の光エネルギーを照射することが好ましい。好まし
くは、照射量は血液表面1cm²当たり約５ないし60ジュー
ルである。

８−メトキシソラレンがリンパ球を処理するために用
いられている。なぜなら、これは生物学的に不活性な状
態から、低エネルギーの紫外線Ａを照射することによっ
て、DNA又は他の分子と共有結合的に架橋結合できる一
時的な励起状態に転換され得るからである。８−MOP
は、ライム、パセル及びイチジクを包含する種々の植物
中で天然に存在し、その不活性型は、薬理的な投与量で
はヒトに対して無毒である。ところが、透明なガラス及
びいくつかの反透明なプラスチックを透過するUVAは、
８−MOPを活性化してDNAのビリミジン塩基と二価の付加
物を形成させることによってDNAの姉妹ストランドを架
橋結合させる形態に変化させ、それによって８−MOPを
潜在的な化学治療薬剤に変化させる。光活性化された８
−MOPの半減期はマイクロ秒の範囲であるので、この薬
剤及びUVAに同時にさらされなかった組織は、活性型の
毒的な効果から免れる。

Ｔ細胞中の８−MOPの活性化の最適波長領域は334nmな
いし346nmである。活性化された細胞は、約１時間ない
し約６時間紫外線照射にさらされる。最適な波長領域の
UVAを用いた場合、血液表面1cm²当り２ジュールのエネ
ルギーを与えるためには270分間の照射が必要である。

８−MOPについては経口投与のための製剤のみが臨床
使用において人手可能であるので、処理の時に採取され
た血漿から適当な濃度の薬剤を得ることが必要である。
この目的のために、８−MOPは体重1kg当たり約0.6mg経
口投与し、その２時間後に患者から血漿を採取すること
ができる。

フォトフェレシス法は、患者から抜き取られた血液か
ら白血球を分離するための連続的な遠心分離機を有する
単一の装置内で行なうことができる。遠心分離機は、白
血球が１又は２以上のサイクルで血液から分離される、
最初の非連続的なリューカフェレシス（leukapheresi
s）工程において用いることができる。これは、患者を
ベッドの上に横たえ、連続的に回転する遠心分離機ボー
ルを介してヘパリン添加血液から６サイクルで白血球分
離し、合計約240mlの白血球濃縮血液を得ることによっ
て行なうことができる。この血液を、患者から同時に採
取した約300mlの血漿（0.6mg/kgの８−MOPを投与２時間
後に採取）及び200mlの減菌食塩水と共にプールして約
6.4±1.7％の最終的ヘマトクリット（リューカフェレシ
ス開始時の患者の血液中のリンパ球の30％ないし50％を
含むもの）を得ることができる。次いで、この全量を、
UVAエネルギーにさらすために、使い捨ての減菌照射室
を通過させる。この室は、６室から成る使い捨てのカセ
ットの形態であることができる。

カセットのそれぞれの室は、UVAに対して不透明な外
部ポリカーボネートの鞘と、螢光UVA源を囲包する、UVA
に対して透明なアクリルチューブから成ることができ
る。これらの２つの壁は約1.0mm離れており、この間を
血液が流通する。個々の室内における流れは底部から頂
部に向うものであり、個々の室の頂部と隣の室の底部と
を結ぶ経路が設けられている。カセットの総体積は約19
0mlである。このUVA露光装置には、カセットに血液を連
続的に循環させる自動可逆血液ポンプと、血液が41℃を
超える温度に加熱されないことを保証する温度センサー
を組込むことができる。血液をUVAに露光した後、全量
を患者に戻す。

血液を照射するのに有用な方法及び装置は米国特許第
4,573,960号、第4,568,328号及び第4,578,056号に記載
されている。血液照射のための方法及び装置のさらに他
の記載は本願出願人による「同時オンライン照射処理方
法」と題する米国特許出願834,292号及び「光活性化患
者処置システムのための照射室」と題する米国特許出願
第834,258号に記載されている。

特定の具体例では、この発明は、哺乳動物中で望まし
くない免疫応答を促進する働きをする少なくとも１つの
抗原を発現する組織移植片に対する哺乳動物の免疫応答
を抑制する方法を提供する。問題とする固有の抗原は、
あらゆる型の組織適合性抗原又は外来組織上に存在する
移植片抗原であってよい。この方法は、（ａ）Ｔ細胞を
所定期間特定の抗原に接触させて、人工的に前記Ｔ細胞
を刺激し、（ｂ）前記Ｔ細胞を処理して前記Ｔ細胞を機
能的に不活性にすることを備える。

以上では、先ず免疫系を人工的に刺激し、次いで血球
細胞を処理する態様について記載したが、所望の結果は
また、特定の抗原で免疫系を実際に刺激する前に、先ず
リンパ球のような血球細胞を処理することによっても達
成することができる。これは、患者から血液を抜き取
り、この血液をフォトフェレシス装置内で処理し、処理
した血液を患者に戻し、次いで患者の免疫系を特定の抗
原で接触することによって達成することができる。この
ようにすることによって、細胞が特定の抗原を認識して
これと反応することができないように変化され得る。

この発明は、患者内で望ましくない免疫応答を防止す
るために用いることができるという意味において予防的
なものである。例えば、免疫疾患に伴なう抗原にさらさ
れていない患者内において、患者の免疫系を抗原で人工
的に刺激し、不所望の免疫応答を防止するように免疫系
細胞を変化させることができる。例として、患者の免疫
系を、患者がやがて受容する移植片に伴なわれる１又は
２以上の抗原で刺激することを挙げることができる。こ
の発明の方法を用いることによって、この方法を用いな
ければ拒絶反応を引き起こしたであろうこのような移植
片は拒絶されなくなる。

この方法を予防的な用法に関して説明したが、この発
明の方法はまた、治療的に用いることもできる。例え
ば、疾患に伴なう抗原に予めさらされた患者、すなわ
ち、この抗原に伴なう病的状態を示している患者は抗原
によって自然に刺激されている。このような自然に刺激
された患者もまた、この発明の方法によって人工的に刺
激して治療効果を得ることができる。このような方法で
は、患者の免疫応答を変化させ、疾患に対する治療効果
を得るために患者を同一の抗原又は異なる抗原で人工的
に刺激することができる。

この方法は、自己免疫疾患又はガンのような疾病を既
に有する患者に治療的に用いることができる。ガン患者
については、ガン患者の体内に存在する腫瘍によって患
者が既に自然にさらされている腫瘍特異的抗原で患者の
免疫系を人工的に刺激することができる。患者の免疫系
は、人工的な刺激の前には腫瘍を攻撃していないが、こ
の発明の方法により、腫瘍を免疫的に攻撃するように患
者の免疫応答を変えることができるものと考えられる。

この発明を詳細に記載したが、免疫系が変化を受ける
機構は完全にはわかっていない。この発明の方法による
免疫系の変化は、免疫系の抑制又は活性化のどちらかを
引き起すものであろう。免疫系は、上記した移植片の例
の場合のように、特定の抗原に対する免疫応答を改善す
るように抑制することができる。しかしながら、免疫系
は、上記した腫瘍についての仮説のように抑制するので
はなく、活性化することも可能であると考えられる。

以下の実施例は、増殖した１つのクローンに属する多
数のＴ細胞を光破壊し、これを光活性化された８−MOP
によって直接阻害されていない免疫系に導入することに
よって、特異的な免疫反応を引き起こすことができるこ
とを示すためのものである。これらの実施例は、機能的
に不活性化された、細胞表面抗原を発現する損なわれて
いないリンパ球を再び受容者に戻すことによって、受容
者の免疫応答を高める働きをするという考えに基いて予
測される。

１つのモデルでは、Ｔ細胞依存性抗原であるヒツジ赤
血球（SRBC）に対する遅延型過敏反応が、８−MOP−UVA
によって不活性化されたエフェクター細胞を用いて予め
トレランスを導入することによって阻害される。もう１
つのモデルでは、ネズミの皮膚移植系において、外来組
織適合性抗原に対する移植反応性応答が阻害される。さ
らに他のモデルでは、MRL/1prネズミ内で誘導された全
身性紅斑性狼瘡の疑似モデルが改善される。

以下の実施ははこの発明を例示するために記載するも
のである。この発明の範囲は、実施例によって限定的に
解釈されるものではなく、特許請求の範囲に基いてのみ
解釈される。

実施例１ ヒツジ赤血球に対する遅延型敏感反応 この実施例は、同質遺伝子的マウス、すなわち、同一
種の遺伝的に同一のメンバーを用いた。それぞれのマウ
スは遺伝的に同一であるので、１匹のマウスから他のマ
ウスへの組織の移植は、異なるマウスの間で行われたの
ではなく、同一のマウスにおいて行われたものと考える
ことができる。この発明の方法は、特定の抗原、すなわ
ちヒツジ赤血球細胞（SRBC）に対するマウスの免疫応答
を特異的に変化させるために用いた。ヒツジ赤血球細胞
を少量（10⁶個）BALB/cマウスに静脈内注射した。マウ
スの免疫系をSRBCで接触することは、遅延型過敏症反応
（DTH）として現われるＴ細胞免疫を人工的に刺激する
が、体液性応答は誘導しなかった。適当な時間経過後、
マウスを殺し、脾臓を取り出し、脾細胞を８−MOP−UVA
で処理することにより変化させた。これらの変化された
脾細胞を次いで未処置の同質遺伝子的マウスを処置する
ために用いた。この操作の詳細は以下に記載されてい
る。

６〜８週令のBALB/cマウスを２つの群に分け、以下の
ものを毎週静脈内注射した。

１） 10⁶SRBC/0.2ml食塩水で７日前に免疫化、すなわ
ち人工的に刺激された同質遺伝子的マウスからの、８−
MOP−UVAで刺激された脾細胞（Ａ群）、又は ２） 対照としての、未処置の脾細胞（Ｂ群）。

SRBCに対するDTHを誘導するために、６回目の処置の
２日後にマウスに10⁶SRBCを投与した（Pr）。それぞれ
のマウスは15×10⁷の不活性化細胞を受容した。７日
後、50μｌの食塩水中に懸濁された10⁸個のSRBCを左後
足の踵の皮下組織を攻撃した（Ch）。対照としての右後
足の踵には50μｌの食塩水を注射した。

これと並行して、別の未処置のマウスにSRBCを投与お
よび攻撃し（Ｃ群）、又は攻撃のみを行なった（Ｄ
群）。DTHは、±0.05mmの精度を有するダイヤルゲージ
カリパス（マノスタットタイプ6921）で、誘導の24時間
後に測定した。DTHの程度は、左右の踵の厚さの増加の
差として10^-2mmで表わした。データはそれぞれの群の４
ないし10匹のマウスの算術平均±SEMで表１に表わされ
ている。

第１表に示すように、Ａ群のマウスはSRBCに対して応
答することができなかった。Ａ群のDTH応答は、SRBCで
処置せずに攻撃だけしたネガティブ対照（Ｄ群）のそれ
と類似している。対照的に、不活性化した未処理の脾細
胞を投与したＢ群マウスにおけるDTH反応は、ポジティ
ブ対照（Ｃ群）のそれと類似した正常なものであった。

この抑制の特異性を試験するために、マウスを無関係
の抗原、すなわちニワトリ赤血球（CRBC）に、２回の生
体外処理の後にさらした。全群のマウス（SRBCに対する
トレランスを獲得したものも包含する）はCRBCに対する
正常な程度のDTHを示した。これにより、抑制は、SRBC
抗原で活性化されたリンパ球にとって特異的であること
が示された。

SRBCに対する非応答性の細胞的機構をさらに示すため
に、SRBCに対するDTH反応の直後に正常な受容動物に細
胞を投与した。すなわち、DTH反応の24時間後にそれぞ
れの群をマウスから脾臓を取り出した。上記の通り、Ａ
群及びＢ群は、それぞれSRBCを投与した動物からの脾細
胞又は未処理の動物からの不活性化した脾細胞で処置し
たものである。また、未処置群は投与及び攻撃（Ｃ群）
したもの並びに攻撃だけしたもの（Ｄ群）である。それ
ぞれの群からの45×10⁶の細胞を未処置の受容動物に静
脈内注射した。注射直後、マウスの踵を攻撃し、DTHを2
4時間後に測定した。結果を第２表に示す。SRBCに対す
るトレランスを獲得した動物（Ａ群）からの細胞を受容
した動物は、他の群とは対照的に、DTH反応を起さなか
った。

これらの結果は、抗原を投与した動物からの８−MOP
−UVAで不活性化した抗原を繰り返し正常な動物に投与
することにより、DTH反応により測定されたＴ細胞免疫
の抑制し、これらのマウスをその抗原に対してトレラン
ス状態にすることを示している。このトレランスは十分
なエフェクター細胞の欠如、若しくは存在又は内発的サ
ブレッサー細胞の刺激によるものであろう。

これらのネズミを用いたモデルは、先ず免疫系を人工
的に刺激し、次いで８−MOP−UVAで不活性化されたエフ
ェクター細胞に免疫系をさらすことによってＴ細胞媒介
免疫応答を調節できるという概念を正当化する。自己免
疫疾患の治療に対するこのアプローチの威力は、MRL/1p
rマウスモデルにおいて電撃性自己免疫疾患の治療を行
なった実施例３において示されている。

実施例２ 移植片トレランスの誘導 皮膚移植片、すなわち、同種の遺伝的に非類似のメン
バー間での移植組織片に対するトレランスを異質遺伝子
系を用いて試験した。この系では、BALB/cマウスが組織
非適合性移植片、すなわち、非適合性の移植抗原を有す
る移植片をCBA/J供与動物から受容した。移植片拒絶が
起きた時にマウスを殺し、その脾細胞を８−MOP及びUVA
で不活性化した。これらの不活性化された脾細胞を未処
置のBALB/cマウスに注射した。移植拒絶反応を起こして
いるマウスからの不活性化された同質遺伝子的脾細胞で
８回処置した後、BALB/cマウスをCBA/J移植片上に存在
する異種抗原で攻撃して遅延型過敏症反応を引き起こし
た。

用いた方法は以下の通りであった。CBA/J移植片を拒
絶している同質遺伝子的BALB/cマウスからの脾細胞を８
回注射することによって、BALB/cマウスをCBA/J移植抗
原に対してトレランス状態にした。トレランス状態にさ
れたBALB/cマウスにBALB/cマウスからの、８−MOP−UVA
で不活性化した30×10⁶個の脾細胞を投与した。トレラ
ンス状態にしたマウスを10×10⁶の▲Ｈ^k ₂▼脾細胞で足
の背部を攻撃した。トレランス状態にしたマウスを第２
の移植抗原（H₂ ^b）で攻撃した。未処置のBALB/cマウス
を移植片抗原にさらし両方の移植片抗原で攻撃した。ネ
ガティブ対照は、移植抗原を投与せず移植片抗原で攻撃
のみを行なった未処置のBALB/cマウスである。結果を第
３表に示す。H₂は、この拒絶反応において重要な産物を
生み出すマウスの主組織適合性複合物（MHC）ゲノムの
領域を示す。H₂複合物はさらに細分化され、そのうちの
１つがＤ領域である。Ｄ領域は細胞表面認識分子として
機能するタンパク質をコードする遺伝子を含む。

トレランス状態にしたマウスは、CBA/J移植片抗原に
対する遅延型過敏症反応を86％抑制した。この抑制はH₂
^k部位の産物に特異的である。なぜなら、トレランス状
態にされた、H₂ ^b脾細胞で攻撃されたBALB/cマウスは、
未処置のBALB/cマウスと同程度にこの移植片抗原に対し
て応答することができたからである。従って、移植拒絶
反応を行なっているマウスの脾細胞を繰り返し注射する
ことによって、移植片抗原に対する特異的なトレランス
を誘導することができる。

移植片を拒絶しているマウスの脾臓は、外来性の組織
適合抗原に対して特異的な反応性を有するエフェクター
細胞を含む。８−MOP−UVAで不活性化したこれらの同質
遺伝子的エフェクター細胞をBALB/cマウスに繰り返し投
与することにより、受容マウス中でエフェクター細胞の
数を抑制する応答を引き起こすことができる。これらの
マウスに関連する移植片抗原で攻撃すると、それらはエ
フェクター細胞応答をすることができない。なぜなら、
それらは応答する細胞の数を抑制したからである。この
観察は細胞障害性試験の結果により指示される。

Ｔ細胞媒介免疫は、予めラベルされた標的細胞からの
⁵¹Crの放出のような、生体外での細胞障害性試験によっ
て示される。このような試験において、細胞障害性Ｔ細
胞エフェクター機能は、リンパ球エフェクター細胞を放
射標識標的細胞と共に培養することにより監視される。
エフェクターの溶解作用は、放出されたアイソトープを
分析することによって測定される。このような細胞障害
性分析において、BALB/cマウスの脾細胞は、CBA/J移植
片を拒絶しているBALB/cマウスからの８−MOP−UVAで不
活性化された脾細胞を注射することによってCBA/J移植
片抗原に対してトレランス状態になったマウスから得ら
れた。エフェクター細胞は、刺激細胞としての８−MOP
−UVAで不活性化された３×10⁶/ccのCBA/J脾細胞と共に
８×10⁶/ccの濃度で７日間培養した。標的細胞は、⁵¹Cr
でラベルされ、適当はエフェクター対標的細胞比率で加
えられた、CBA/JコンカナバリンＡブラスト（blasts）
（有糸分裂誘導レクチンコンカナバリンＡによって刺激
されたＴ細胞リンパ球）であった。標的細胞は４時間培
養し、エフェクター細胞及び上清を回収して液体シンチ
レーションカウンティングを行なった。この分析の結果
を第４表に示す。

第４表からわかるように、未処置のBALB/cマウス及び
CBA/J皮膚移植片に対して感作されたBALB/cマウスは、
試験した全てのエフェクター対標的細胞比率においてCB
A/J標的に効果的に溶解した。CBA/J移植片を拒絶してい
るマウスの脾臓からのエフェクター細胞の注射によって
トレランス状態になったBALB/cマウスからの脾細胞は、
CBA/J標的を溶解することができる細胞障害性Ｔ細胞を
生じる能力の48％ないし67％を抑制することが示され
た。

不活性化された脾細胞はまた、標準的な細胞障害性試
験に第３者細胞として加えられた時に未処置及び感作BA
LB/c脾細胞の細胞障害性応答を抑制した。従って、トレ
ランス状態にされたマウスは、関連する移植片抗原に対
して応答しないが生体外でのエフェクター細胞応答を抑
制することができる細胞を含んでいた。これらの結果
は、８−MOP−UVAで不活性化されたエフェクター細胞を
再投与することによって免疫反応性細胞型を抑制する宿
主応答を促進するという説を支持する。

この免疫抑制応答は抗原に特異的である。

実施例３ ネズミ自己免疫疾患の治療 全身性紅斑性狼瘡（SLE）のMRL/1prモデルは、マウス
のMRL/1pr系統がヒトSLEに類似した自己免疫疾患を生じ
ているモデルである。この実施例では、令（18−22週
令）の自己免疫疾患を患ったマウスからの、８−MOP−U
VAで不活性化された同質遺伝的脾細胞で自己免疫疾患の
開始前に若いマウス（４〜６週令）で処置した。MRL/1p
rマウスにおける自己免疫疾患の微候は、脾臓及びリン
パ節の肥大に導かれるＴ細胞の過形成を包含する。

Ｔ細胞増殖は、THY1⁺、LY1⁺T細胞であるリンパ細胞の
増殖から成る。このＴ細胞の増殖を停止させる治療は、
MRL/1prマウスにおける自己免疫疾患の発達を阻害する
ことが示されている。従って、自己免疫疾患の発生前に
若いマウスを処置すると、自己免疫疾患の劇症過程を改
善する、自己制御免疫応答が誘導されるであろうと仮定
することができる。実験結果によりこの仮説が確認され
た。

MRL/1prマウスは、処置プロトコールの有効性を示す
信頼できる指標を与える一貫した多数の疾病徴候を有す
る。以下の自己免疫疾患のパラメーターを同令のMRL/1p
rマウスについての指標として用いた。

1. 脾臓及びリンパ節の重量、大きさ及び細胞性 2. 生存 3. 抗DNA自己抗体タイター 4. リンパ球発現型、及び 5. Ｔ及びＢ細胞マイトジェンに対する応答 ８−MOP−UVAで処置したMRL/1prマウスは100ng/mlの
８−MOPと１ジュール/cm²のUVAで処理した20−50×10⁶
個の脾細胞を尾の静脈に隔週に投与した。マウスは１週
間毎に殺し、脾臓及びリンパ節の大きさ、重量及び細胞
性の比較を行なった。これらの同週令の８−MOP−UVAで
処置した又は処置しない対照MRL/1prマウスの連続的解
剖の結果が表５に示されている。

自己免疫疾患を有する供与動物からの同質遺伝子的８
−MOP−UVA処理脾細胞で処理したMRL/1prマウスは、同
週令（13〜19週令）の対照の未処理マウスと比較して脾
臓及びリンパ節の重量、大きさ及び細胞性の減少を示し
た。処置したマウスの脾臓は対照マウスに比べて49％重
量が軽く、脾細胞の数は29％少なかった。13〜19週令
の、８−MOP−UVA処置マウスからのリンパ節は対照に比
べ重量で45％、大きさで40％小さかった。この減少は、
20〜26週令で殺した８−MOP−UVA処置マウスの群におい
てより一層顕著であった。脾細胞収量の54％減少（Ｐ＜
0.001）は８−MOP−UVA処置群において顕著であった。
同様に、20〜26週令の８−MOP−UVA処置マウスからのリ
ンパ節は対照に比べ、重量で55％（Ｐ＜0.01）、大きさ
で39％小さかった。

８−MOP−UVAで処置したマウスの一群は、全ての未処
理対照マウスが死んだ後（22〜26週令）にも生きること
を許した。これらのマウスは29〜32週で殺したが、寿命
の延びは２カ月以上であった。これらの非常に高齢のマ
ウスに器官巨大症が混在した。このことから、８−MOP
−UVAで処置した自己免疫疾患脾細胞を再投与すること
によってMRL/1prの自己免疫疾患を遅らせることはでき
るが、最終的にはリンパ肥大は起きるであろうことが示
唆された。

別の実験において、８−MOP−UVA脾細胞で処置したMR
L/1prについて抗DNA自己抗体の産生を試験した。血清は
後部眼網状組織から採血して得た。ウシ甲状腺DNAを超
音波破砕してマイクロタイターウェル上で10mg/ウェル
の濃度で乾燥させた。血清をウェルに加え、ブレートを
23℃で１時間回転させた。洗浄後、反応性抗体を、¹²⁵I
でラベルした抗マウス免疫グロブリン試薬の結合によっ
て検出した。この試験の結果を表６に示す。

８−MOP−UVAで不活性化した自己免疫疾患脾細胞で処
置したMRL/1prマウスは抗DNA抗体の高タイターを発達さ
せなかった。19週令において、８−MOP−UVAで処置した
マウスからの血清は、正常な非自己免疫疾患マウスにお
いて得られたのと同様なレベルのバックグランドを有し
ていた。未処理のMRL/1prマウスは13週において高レベ
ルの抗DNA抗体が検出され、これらは17週までに６倍に
増加する。従って、８−MOP−UVAで処理した同質遺伝子
的自己免疫疾患脾細胞を再投与することは、抗DNA自己
抗体の誘導を阻害し、これは疾病を弱めることと一貫す
る。

８−MOP−UVAで処理したマウスの脾臓からのリンパ球
の発現型試験において、未処理の対照に比較してTHY1＋
Ｔ細胞が65％減少した。LY1＋細胞は50％減少した。処
置したマウスの脾臓中の表面免疫グロブリン陽性Ｂ細胞
の２倍の増加は顕著であった。これらのＢ細胞が溶解さ
れると、1a⁺細胞型の６倍の増加が検出された。予備的
な機能的試験により、８−MOP−UVAで処理されたマウス
はＴ細胞マイトジェンであるコンカナバリンＡ及びＢ細
胞マイトジェンである糖脂質に応答する能力を維持して
いるが、未処理マウスからの脾細胞は、Ｔ細胞及びＢ細
胞のいずれのマイトジェンに対する反応能力も喪失する
ことが示されている。

全体として見ると、これらの結果は、MRL/1prマウス
における自己免疫疾患の過程が、若い時に８−MOP−UVA
で不活性化した脾細胞にさらすことによって改善するこ
とができることを示している。劇症リンパ過形成はその
開始時点が遅れ、また、処置マウスは未処置の回復の動
物よりも少なくとも２カ月は長生きすることが示され
た。さらに、抗DNA自己抗体の産生は処置マウス内では
阻害される。処置マウスの脾臓はより少数のＴ細胞を有
し、Ｂ細胞及び1a⁺細胞は増大する。また、処置マウス
はＴ細胞及びＢ細胞マイトジェンに対する増殖応答を開
始する能力を維持する。疾病が始まる前に動物の免疫系
を人工的に刺激することによって、ここで記載した方法
は疾病の経路を変えた。

この発明を特定の具体例に基いて詳細に記載したが、
上記開示に照らし、この発明の範囲に属する多くの変形
が当業者にとって可能である。従って、この発明は広く
解釈されるべきであり、特許請求の範囲の記載によって
のみ限定される。

本発明の具体的な実施態様はつぎのように要約でき
る。

（１）前記工程（ｂ）におけるＴ細胞の処理は、前記Ｔ
細胞の生体外での流れを形成し、紫外線に対して実質的
に透明な細い室を有する処理ステーションに前記流れを
流通させ、溶解したソラレン類薬剤の存在下で前記流れ
を前記処理ステーション中で紫外線照射し、それによっ
て細胞を変化させることを含む請求項１記載の方法。

（２）前記抗原は、遅延型過敏症反応、自己免疫疾患、
癌、アレルギー、移植片拒絶反応及び移植片対宿主反応
から成る群より選ばれる疾患に付随するものである請求
項１記載の方法。

（３）前記抗原は、クローン型抗原として働くことがで
きる固有のＴ細胞レセプターを発現するＴ細胞である請
求項１記載の方法。

（４）前記疾患は、循環異常Ｔ細胞のクローン的増殖に
よって媒介されるものである前記実施態様（２）記載の
方法。

（５）前記ソラレン類は８−メトキシソラレン又はアミ
ノメチルトリメチルソラレンである請求項１記載の方
法。

（６）前記生体外での流れの流速は約10ないし約75ml/
分である前記実施態様（１）記載の方法。

（７）前記Ｔ細胞は、照射量約0.1ないし約100ジュール
/cm²のUVA波長領域の光エネルギーによって照射される
請求項１に記載の方法。

（８）前記所定期間は１年以内である請求項１記載の方
法。

（９）前記所定時間は約72時間である前記実施態様
（８）記載の方法。

（10）細胞の前記変化は、細胞の有効性又は生存力を実
質的に喪失させることである前記実施態様（１）記載の
方法。

（11）細胞の膜の完全さが破壊される前記実施態様（1
0）記載の方法。

（12）細胞内のDNAが変化する前記実施態様（10）記載
の方法。

（13）前記Ｔ細胞の処理は、前記Ｔ細胞の生体外での流
れを形成し、紫外線に対して実質的に透明な細い室を有
する処理ステーションに前記流れを流通させ、溶解した
ソラレン類薬剤の存在下で前記流れを前記処理ステーシ
ョン中で紫外線照射し、それによって細胞を変化させる
ことを含む請求項２記載のＴ細胞。

（14）前記抗原は、遅延型過敏症反応、自己免疫疾患、
癌、アレルギー、感染症、移植片拒絶反応及び移植片対
宿主反応から成る群より選ばれる疾患に付随するもので
ある請求項２記載のＴ細胞。

（15）前記抗原は、クローン型抗原として働くことがで
きる固有のＴ細胞レセプターを発現するＴ細胞である請
求項２記載のＴ細胞。

（16）前記疾患は、循環異常Ｔ細胞のクローン的増殖に
よって媒介されるものである前記実施態様（14）記載の
Ｔ細胞。

（17）前記ソラレン類は８−メトキシソラレン又はアミ
ノメチルトリメチルソラレンである請求項２記載のＴ細
胞。

（18）前記生体外での流れの流速は約10ないし75ml/分
である前記実施態様（13）記載のＴ細胞。

（19）前記Ｔ細胞は、照射量約0.1ないし約100ジュール
/cm²のUVA波長領域の光エネルギーによって照射される
請求項２に記載のＴ細胞。

（20）前記所定期間は１年以内である請求項２記載のＴ
細胞。

（21）前記所定時間は約72時間である前記実施態様（2
0）記載のＴ細胞。

（22）細胞の前記変化は、細胞の有効性又は生存力を実
質的に喪失させることである前記実施態様（13）記載の
Ｔ細胞。

（23）細胞の膜の完全さが破壊された前記実施態様（2
2）記載のＴ細胞。

（24）細胞内のDNAが変化した前記実施態様（22）記載
のＴ細胞。

以上述べたように、本発明により調製したＴ細胞は、
ある特定の抗原に対する免疫応答が選択的に、かつ、特
異的に変化されているので、当該抗原が引き起こす不所
望の免疫応答を防止したり、あるいは疾病に対する治療
効果を得ることができる効果がある。

フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭59−155257（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−109576（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−131520（ＪＰ，Ａ) Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｎ ｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔ ｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．85，Ｎｏ．１ Ｓ ｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（1985）ｐ．34ｓ− 38ｓ (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) A61K 39/00,35/12 C12N 5/00 ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＢＩＯＴＥＣＨＡＢＳ（ＳＴＮ)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】機能的に不活性化したＴ細胞の調製方法で
   あって、 （ａ）哺乳動物の体内で所定期間特定の抗原に接触させ
   て人工的に刺激した後に前記哺乳動物から抜き取って得
   られるＴ細胞を原料として装置に供給する工程と、 （ｂ）前記供給されたＴ細胞を紫外線とソラレン類薬剤
   を用いて装置により処理して機能的に不活性にする工程
   とを備えた方法。
2. 【請求項２】哺乳動物の体内で所定期間特定の抗原に接
   触させて人工的に刺激した後に前記哺乳動物から抜き取
   って得られるＴ細胞を、紫外線とソラレン類薬剤を用い
   て装置により処理することによって調製した、機能的に
   不活性化したＴ細胞。