CN108430498A - 用于治疗自身免疫疾病和癌症的组合物及方法 - Google Patents

用于治疗自身免疫疾病和癌症的组合物及方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供通过调节Siglec 15和/或其结合配体的表达和/或活性用于治疗需要的受试者中的癌症的方法和组合物、用于增强对抗肿瘤的免疫反应的方法、用于治疗自身免疫疾病的方法以及用于降低炎症反应的方法。

Description

用于治疗自身免疫疾病和癌症的组合物及方法
相关申请
本申请要求于2015年11月10日提交的美国临时申请第62/253,437号的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
背景技术
在工业化国家中，癌症已被认为是死亡的主要原因之一。癌症由单一转化细胞的后代的进行性生长所引起。治疗癌症需要去除或破坏所有恶性细胞而不导致患者死亡。达到此目的的有吸引力的方式为诱发区分肿瘤细胞及其正常细胞对应物的对抗肿瘤的免疫反应。的确，就特异性破坏肿瘤而对正常组织没有毒性而言，免疫系统具有巨大潜力。免疫系统检测及破坏异常细胞的天然能力可防止许多癌症的发展。此外，免疫系统的长期记忆可防止癌症复发。
然而，癌症细胞有时能够通过减低其表面上的肿瘤抗原表达而避免被免疫系统检测及破坏，使得免疫系统对其的检测更为困难。可选地，癌症细胞可于其表面上表达诱导免疫细胞失活的蛋白质，或诱导周围环境中的细胞释放抑制免疫反应并促进肿瘤细胞增殖和存活的物质。因此，对于鉴定调节对抗肿瘤的免疫反应的新分子以供开发新颖免疫治疗剂存在着持续需求(Sznol M和Chen L,Clin Cancer Res 19(5):1021-1034,2013)。
免疫细胞的细胞膜被各种聚糖例如唾液酸的致密外层覆盖，该各种聚糖可被各种聚糖结合蛋白质识别。唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素(Siglecs)为I型膜蛋白的家族，其通过聚糖识别而调控先天及适应性免疫系统中细胞的功能(Kameda Y.et al.,J.BoneMiner.Res.2013,28(12):24463-75)。Siglecs蛋白含有唾液酸结合成分和Ig-样分子。其参与细胞粘附相互作用、神经元、脑功能和神经元发育。Siglec家族有两个较小成员：Siglec14和Siglec 15；此二分子均具有可被磷酸化的小的胞内结构域和膜内结构域；它们足够小而得以由于其大小跨越细胞膜传递信号。此类Siglec成员于小鼠及人类中均有发现，且在物种之间是高度进化保守的。
先前的微阵列数据表明，Siglec 15存在于外周的骨髓细胞中、巨噬细胞中和单核细胞中。Siglec 15通常于单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、B细胞和破骨细胞上表达。单核细胞、骨髓细胞和B细胞中的Siglec 15表达可被RANK配体与M-CSF诱导并上调(Stuible M,etal..J Biol Chem.2014,289(10):6498-512；Takamiya R,et al.,Glycobiology.2013；23(2):178-87)。Siglec-15缺陷小鼠展现由破骨细胞发育受损产生的轻度骨硬化症(KamedaY.et al.,J.Bone Miner.Res.28(12):24463-75,2013)。Siglec 15在破骨细胞分化及骨骼重建中的作用虽然已被广泛研究，但关于Siglec 15的免疫功能所知甚少(Stuible M,etal..J Biol Chem.2014,289(10):498-512)。新近的研究显示于肺的肿瘤、直肠腺癌和肝细胞癌中Siglec 15与CD68之间的表达与共定位，它们发现在巨噬细胞中表达，进一步支持Siglec 15于骨髓细胞中的表达(Takamiya R,et al.,Glycobiology.2013；23(2):178-87)。
因此，本领域中对于鉴定调节对抗肿瘤的免疫反应的另外分子以扩大抗肿瘤和自身免疫的免疫疗法的成功率和充分利用抗肿瘤和自身免疫的免疫疗法有所需求。
发明内容
本发明至少部分地基于发现Siglec 15于抑制对癌症的免疫反应中发挥关键作用，因此，提供操控Siglec 15途径用于进一步开发癌症治疗药物的理论基础。特别是，已发现降低Siglec 15的表达会缩减肿瘤大小及延长具有脑肿瘤的小鼠的存活期。此外，在脑炎症小鼠模型中通过阻断Siglec 15与其配体之间的相互作用而抑制Siglec 15活性，以及于Siglec 15基因敲除小鼠中消除Siglec 15的表达促进脑炎症。
因此，本发明提供通过抑制或压制Siglec 15和/或其结合配体例如MAG、LRRC4C和/或Sialyl-Tn的表达和/或活性而治疗癌症或增强对癌症的免疫反应的方法。在另一方面中，本发明包括通过增强Siglec 15和/或其结合配体例如MAG、LRRC4C和/或Sialyl-Tn的表达和/或活性而治疗受试者的自身免疫疾病或降低炎症反应的方法。
在一方面中，本发明提供治疗需要的受试者的癌症的方法，该方法包括给予该受试者有效量的Siglec 15的调节剂，其中该调节剂降低该受试者中的Siglec 15的表达和/或活性，从而治疗该受试者的癌症。
在一些实施方案中，该调节剂是选自包括Siglec 15的小分子抑制剂、Siglec 15的拮抗剂抗体或其抗原结合片段、重组Siglec 15融合蛋白或者靶向Siglec 15的抑制性肽或核酸的组。在其他实施方案中，该Siglec 15融合蛋白是Siglec 15-Fc融合蛋白。
在一些实施方案中，该调节剂阻断Siglec 15与结合配体之间的相互作用。在一些实施方案中，该结合配体选自MAG和LRRC4C。在一些实施方案中，该调节剂是具有残基143处的单一置换突变的突变体Siglec 15蛋白。在其他实施方案中，该调节剂是具有IgV结构域缺失的突变体Siglec 15蛋白。在其他实施方案中，该结合配体是Sialyl-Tn。在一些实施方案中，该调节剂是可溶性Sialyl-Tn分子。在其他实施方案中，该调节剂是特异性地结合Sialyl-Tn的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，该调节剂降低MAG和/或LRRC4C的表达和/或活性水平。在其他实施方案中，该调节剂降低含Sialyl-Tn的蛋白质的表达和/或活性水平。在一些实施方案中，该调节剂选自MAG的小分子抑制剂、MAG的拮抗剂抗体或其抗原结合片段、重组MAG融合蛋白、靶向MAG的抑制性肽或核酸、LRRC4C的小分子抑制剂、LRRC4C的拮抗剂抗体或其抗原结合片段、重组LRRC4C融合蛋白或者靶向LRRC4C的抑制性肽或核酸。
在一些实施方案中，该癌症选自脑癌、肺癌、胰腺癌、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、肾细胞癌、直肠腺癌、肝细胞癌和Ewing氏肉瘤。在其他实施方案中，该脑癌是胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，该癌症是结肠癌、子宫内膜样癌、肾癌(例如，肾乳头状细胞癌、肾透明细胞癌)、肝癌、甲状腺癌、肺癌(例如，肺腺癌、肺鳞状细胞癌)、头颈癌、乳腺癌、子宫颈癌、前列腺癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤、直肠癌或胆管癌。在一个实施方案中，该癌症是脑癌。在一个实施方案中，该癌症是胶质母细胞瘤。在一个实施方案中，该癌症不是血液衍生的癌症。在一个实施方案中，该癌症不是白血病。在一个实施方案中，该癌症不是急性髓性白血病(AML)。
在一些实施方案中，该受试者未罹患进行中的自身免疫疾病。
在其他实施方案中，该受试者是人类。
在一方面中，本发明提供缩减需要的受试者的肿瘤大小的方法，该方法包括给予该受试者有效量的Siglec 15的调节剂，其中该调节剂降低Siglec 15的表达和/或活性，从而缩减该受试者的肿瘤大小。
在一些实施方案中，该调节剂选自Siglec 15的小分子抑制剂、Siglec 15的拮抗剂抗体或其抗原结合片段、重组Siglec 15融合蛋白或者靶向Siglec 15的抑制性肽或核酸。在一些实施方案中，该Siglec 15融合蛋白是Siglec 15-Fc融合蛋白。
在一些实施方案中，该调节剂阻断Siglec 15与结合配体之间的相互作用。在一些实施方案中，该结合配体选自MAG和LRRC4C。在其他实施方案中，该结合配体是Sialyl-Tn。在一些实施方案中，该调节剂是在残基143处具有单一置换突变的突变体Siglec 15蛋白。在其他实施方案中，该调节剂是具有IgV结构域缺失的突变体Siglec 15蛋白。
在一些实施方案中，该调节剂降低MAG和LRRC4C的表达和/或活性。在一些实施方案中，该调节剂选自MAG的小分子抑制剂、MAG的拮抗剂抗体或其抗原结合片段、重组MAG融合蛋白、靶向MAG的抑制性肽或核酸、LRRC4C的小分子抑制剂、LRRC4C的拮抗剂抗体或其抗原结合片段、重组LRRC4C融合蛋白或者靶向LRRC4C的抑制性肽或核酸。
在一些实施方案中，该肿瘤与选自脑癌、肺癌、胰腺癌、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、肾细胞癌、直肠腺癌、肝细胞癌和Ewing氏肉瘤的癌症相关。在一些实施方案中，该脑癌是胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，该癌症是结肠癌、子宫内膜样癌、肾癌(例如，肾乳头状细胞癌、肾透明细胞癌)、肝癌、甲状腺癌、肺癌(例如，肺腺癌、肺鳞状细胞癌)、头颈癌、乳腺癌、子宫颈癌、前列腺癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤、直肠癌或胆管癌。在一个实施方案中，该癌症是脑癌。在一个实施方案中，该癌症是胶质母细胞瘤。在一个实施方案中，该癌症不是血液衍生的癌症。在一个实施方案中，该癌症不是白血病。在一个实施方案中，该癌症不是急性髓性白血病(AML)。
在一些实施方案中，该受试者未罹患进行中的自身免疫疾病。
在其他实施方案中，该受试者是人类。
在一方面中，本发明提供延长罹患癌症的受试者的存活期的方法，该方法包括给予该受试者有效量的Siglec 15的调节剂，其中该调节剂降低Siglec 15的表达和/或活性，从而延长该受试者的存活期。
在一些实施方案中，该调节剂选自Siglec 15的小分子抑制剂、Siglec 15的拮抗剂抗体或其抗原结合片段、重组Siglec 15融合蛋白或者靶向Siglec 15的抑制性肽或核酸。在一些实施方案中，该Siglec 15融合蛋白是Siglec 15-Fc融合蛋白。
在一些实施方案中，该调节剂阻断Siglec 15与结合配体之间的相互作用。在其他实施方案中，该结合配体选自MAG和LRRC4C。在其他实施方案中，该结合配体是Sialyl-Tn。在一些实施方案中，该调节剂是在残基143处具有单一置换突变的突变体Siglec 15蛋白。在其他实施方案中，该调节剂是具有IgV结构域缺失的突变体Siglec 15蛋白。
在一些实施方案中，该调节剂降低MAG和LRRC4C的表达和/或活性。在一些实施方案中，该调节剂选自MAG的小分子抑制剂、MAG的拮抗剂抗体或其抗原结合片段、重组MAG融合蛋白、靶向MAG的抑制性肽或核酸、LRRC4C的小分子抑制剂、LRRC4C的拮抗剂抗体或其抗原结合片段、重组LRRC4C融合蛋白或者靶向LRRC4C的抑制性肽或核酸。
在一些实施方案中，该癌症选自脑癌、肺癌、胰腺癌、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、肾细胞癌、直肠腺癌、肝细胞癌和Ewing氏肉瘤。在一些实施方案中，该脑癌是胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，该癌症是结肠癌、子宫内膜样癌、肾癌(例如，肾乳头状细胞癌、肾透明细胞癌)、肝癌、甲状腺癌、肺癌(例如，肺腺癌、肺鳞状细胞癌)、头颈癌、乳腺癌、子宫颈癌、前列腺癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤、直肠癌或胆管癌。在一个实施方案中，该癌症是脑癌。在一个实施方案中，该癌症是胶质母细胞瘤。在一个实施方案中，该癌症不是血液衍生的癌症。在一个实施方案中，该癌症不是白血病。在一个实施方案中，该癌症不是急性髓性白血病(AML)。
在一些实施方案中，该受试者未罹患进行中的自身免疫疾病。
在其他实施方案中，该受试者是人类。
在一方面中，本发明提供增强需要的受试者中对抗肿瘤的免疫反应的方法，该方法包括给予该受试者有效量的Siglec 15的调节剂，其中该调节剂降低Siglec 15的表达和/或活性，从而增强该受试者中对抗肿瘤的免疫反应。
在一些实施方案中，该调节剂选自Siglec 15的小分子抑制剂、Siglec 15的拮抗剂抗体或其抗原结合片段、重组Siglec 15融合蛋白或者靶向Siglec 15的抑制性肽或核酸。在一些实施方案中，该Siglec 15融合蛋白是Siglec 15-Fc融合蛋白。
在一些实施方案中，该调节剂阻断Siglec 15与结合配体之间的相互作用。在一些实施方案中，该结合配体选自MAG和LRRC4C的组。在其他实施方案中，该结合配体是Sialyl-Tn。在一些实施方案中，该调节剂是在残基143处具有单一置换突变的突变体Siglec 15蛋白。在其他实施方案中，该调节剂是具有IgV结构域缺失的突变体Siglec 15蛋白。
在一些实施方案中，该调节剂降低MAG和LRRC4C的表达和/或活性。在一些实施方案中，该调节剂选自MAG的小分子抑制剂、MAG的拮抗剂抗体或其抗原结合片段、重组MAG融合蛋白、靶向MAG的抑制性肽或核酸、LRRC4C的小分子抑制剂、LRRC4C的拮抗剂抗体或其抗原结合片段、重组LRRC4C融合蛋白或者靶向LRRC4C的抑制性肽或核酸。
在一些实施方案中，该肿瘤与选自脑癌、肺癌、胰腺癌、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、肾细胞癌、直肠腺癌、肝细胞癌和Ewing氏肉瘤的癌症相关。在一些实施方案中，该脑癌是胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，该癌症是结肠癌、子宫内膜样癌、肾癌(例如，肾乳头状细胞癌、肾透明细胞癌)、肝癌、甲状腺癌、肺癌(例如，肺腺癌、肺鳞状细胞癌)、头颈癌、乳腺癌、子宫颈癌、前列腺癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤、直肠癌或胆管癌。在一个实施方案中，该癌症是脑癌。在一个实施方案中，该癌症是胶质母细胞瘤。在一个实施方案中，该癌症不是血液衍生的癌症。在一个实施方案中，该癌症不是白血病。在一个实施方案中，该癌症不是急性髓性白血病(AML)。
在一些实施方案中，该受试者未罹患进行中的自身免疫疾病。
在其他实施方案中，该受试者是人类。
在另一方面中，本发明提供治疗需要的受试者中的自身免疫疾病的方法，该方法包括给予该受试者有效量的Siglec 15的调节剂，其中该调节剂增强受试者中Siglec 15的表达和/或活性，从而治疗该受试者的自身免疫疾病。
在一些实施方案中，该调节剂选自Siglec 15的小分子活化剂、Siglec 15的激动剂抗体或其抗原结合片段或激活Siglec 15的转录和/或翻译的蛋白质和核酸。
在一些实施方案中，该调节剂促进Siglec 15与结合配体之间的相互作用。在一些实施方案中，该结合配体选自MAG和LRRC4C。在其他实施方案中，该结合配体是Sialyl-Tn。在一些实施方案中，该调节剂增强MAG和LRRC4C的表达和/或活性。
在一些实施方案中，该调节剂选自MAG的小分子活化剂、MAG的激动剂抗体或其抗原结合片段、激活MAG的转录和/或翻译的蛋白质和核酸、LRRC4C的小分子活化剂、LRRC4C的激动剂抗体或其抗原结合片段或者激活LRRC4C的转录和/或翻译的蛋白质和核酸。
在其他实施方案中，该调节剂选自MAG蛋白质、编码MAG蛋白质的核酸、LRRC4C蛋白质或编码LRRC4C蛋白质的核酸。在一个实施方案中，该调节剂是合成的Sialyl-Tn或带有Sialyl-Tn的合成肽。
在一些实施方案中，该自身免疫疾病是炎性脑疾病。在其他实施方案中，该炎性脑疾病是多发性硬化症。在其他实施方案中，该炎性脑疾病是实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)。在一些实施方案中，该受试者是人类。
在一方面中，本发明提供治疗需要的受试者的自身免疫疾病的方法，该方法包括给予该受试者有效量的Siglec 15蛋白、编码Siglec 15蛋白的核酸，从而治疗该受试者的自身免疫疾病。
在一些实施方案中，该Siglec 15蛋白选自全长Siglec 15蛋白、Siglec 15的功能性片段或Siglec 15的IgV结构域。
在一些实施方案中，该自身免疫疾病是炎性脑疾病。在其他实施方案中，该炎性脑疾病是多发性硬化症。在其他实施方案中，该炎性脑疾病是实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)。在一些实施方案中，该受试者是人类。
在另一方面中，本发明提供降低需要的受试者中的脑炎症反应的方法，该方法包括给予该受试者有效量的Siglec 15的调节剂，其中该调节剂增强Siglec 15的表达和/或活性，从而降低该受试者中的脑炎症反应。
在一些实施方案中，该调节剂选自Siglec 15的小分子活化剂、Siglec 15的激动剂抗体或其抗原结合片段或激活Siglec 15的转录和/或翻译的蛋白质和核酸。
在一些实施方案中，该调节剂促进Siglec 15与结合配体之间的相互作用。在一些实施方案中，该结合配体选自MAG和LRRC4C。在其他实施方案中，该结合配体是Sialyl-Tn。在其他实施方案中，该调节剂增强MAG和LRRC4C的表达和/或活性。
在一些实施方案中，该调节剂选自MAG的小分子活化剂、MAG的激动剂抗体或其抗原结合片段、激活MAG的转录和/或翻译的蛋白质和核酸、LRRC4C的小分子活化剂、LRRC4C的激动剂抗体或其抗原结合片段或者激活LRRC4C的转录和/或翻译的蛋白质和核酸。
在其他实施方案中，该调节剂选自MAG蛋白质、编码MAG蛋白质的核酸、LRRC4C蛋白质或编码LRRC4C蛋白质的核酸。
在一些实施方案中，该脑炎症反应与多发性硬化症相关。在一些实施方案中，该脑炎症反应与实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)相关。在一些实施方案中，该受试者是人类。
在一方面中，本发明提供降低需要的受试者中的脑炎症反应的方法，该方法包括给予该受试者有效量的Siglec 15蛋白或编码Siglec 15蛋白的核酸，从而降低该受试者中的脑炎症反应。
在一些实施方案中，该Siglec 15蛋白选自全长Siglec 15蛋白、Siglec 15的功能性片段或Siglec 15的IgV结构域。
在一些实施方案中，该脑炎症反应与多发性硬化症相关。在一些实施方案中，该脑炎症反应与实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)相关。在一些实施方案中，该受试者是人类。
在另一方面中，本发明提供鉴定可用于治疗受试者的自身免疫疾病或癌症的化合物的方法，该方法包括提供测试化合物；测定该测试化合物对Siglec 15的表达和/或活性的影响；和选择调节Siglec 15的表达和/或活性的化合物，从而鉴定可用于治疗受试者的自身免疫疾病或癌症的化合物。
在一些实施方案中，Siglec 15的表达和/或活性的增强指示该化合物可用于治疗自身免疫疾病。在其他实施方案中，Siglec 15的表达和/或活性的降低指示该化合物可用于治疗癌症。
在一方面中，本发明提供鉴定可用于增强需要的受试者中对抗肿瘤的免疫反应的化合物的方法，该方法包括提供测试化合物；测定该测试化合物对Siglec 15的表达和/或活性的影响；和选择降低Siglec 15的表达和/或活性的化合物，从而鉴定可用于增强受试者中对抗肿瘤的免疫反应的化合物。
在另一方面中，本发明提供针对鉴定可用于降低需要的受试者中的脑炎症反应的化合物的方法，该方法包括提供测试化合物；测定该测试化合物对Siglec 15的表达和/或活性的影响；和选择增强Siglec 15的表达和/或活性的化合物，从而鉴定可用于降低受试者中的脑炎症反应的化合物。
在一方面中，本发明提供Siglec 15的调节剂，其中该调节剂调节Siglec 15与MAG、LRRC4C和/或Sialyl-Tn之间的相互作用。在一些实施方案中，该调节剂结合Siglec 15的IgV结构域。在其他实施方案中，该调节剂结合包含Siglec 15的残基143的表位。
在一些实施方案中，该调节剂是Siglec 15的抑制剂。在其他实施方案中，抑制剂选自Siglec 15的小分子抑制剂、Siglec 15的拮抗剂抗体或其抗原结合片段、重组Siglec15融合蛋白或者靶向Siglec 15的抑制性肽或核酸。
在一些实施方案中，该调节剂是Siglec 15的活化剂。在其他实施方案中，该活化剂选自Siglec 15的小分子活化剂、Siglec 15的激动剂抗体或其抗原结合片段或者激活Siglec 15的转录和/或翻译的蛋白质和核酸。
通过下述附图及详细描述说明本发明；其对权利要求中所述的本发明范围并不构成限制。
附图说明
图1A描述在不同小鼠组织中使用RT-PCR的Siglec 15的RNA表达谱。图1B描述在人类组织中使用微阵列分析的Siglec 15的RNA表达谱。图1C以图表描述根据微阵列分析的Siglec 15的表达谱。Siglec 15通常在单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、B细胞和破骨细胞上表达。
图2描述在人类癌症中相对于正常组织的Siglec 15表达水平。
图3A描述使用NCI60微阵列数据所测定的人Siglec 15在人类癌症细胞系中的表达(BioGPS；任意单位)。图3B描述使用FACS所测定的人Siglec 15在人类癌症细胞系中的表达。
图4A描述Siglec 15与结合配体，髓鞘相关糖蛋白(MAG)和包含4C的富亮氨酸重复序列(LRRC4C)，之间的相互作用。Siglec 15与MAG或LRRC4C之间的相互作用在小鼠和人之间是高度保守的。图4B描述使用Octet链霉抗生物素蛋白生物传感器所测定的Sialyl-Tn抗原与Siglec 15-mIg融合蛋白或对照mIg之间的结合。
图5描述MAG在正常组织与癌症中的mRNA表达。MAG的表达富集在脑或脑相关肿瘤中。
图6描述LRRC4C在正常组织与癌症中的mRNA表达。LRRC4C的表达在癌症如脑癌、乳腺癌、卵巢癌、肾细胞癌和Ewing氏肉瘤中上调。
图7以图表描述Siglec 15-MAG或LRRC4C相互作用的结合结构域。具体而言，Siglec 15的IgV结构域为与MAG和LRRC4C的相互作用所必需的。IgV结构域中的R143A突变防止与MAG或LRRC4C的结合，表明两种配体都结合Siglec 15中IgV结构域的残基143。
图8A描述以抗CD3抗体OKT3刺激并暴露于固定化人Siglec 15或对照IgG的PBMC中3H胸腺嘧啶核苷掺入的水平。图8B描述在与过表达模拟质粒(Mock)、全长FASLG(FASLG)、全长Siglec 15(Siglec15FL)、编码Siglec15胞外结构域和B7-H6跨膜结构域的构建体(Siglec15ATM)或LRRC4C的293T.m.OKT3细胞一起孵育后，在Jurkat NF-AT报道(reporter)细胞中所观测的荧光素酶活性水平。
图9A描述以固定化抗CD3和以固定化小鼠Siglec-15-mIgG融合蛋白(S15-mIg)或对照IgG(mIg)刺激的小鼠脾细胞中3H胸腺嘧啶核苷掺入的水平。图9B描述以固定化抗CD3和可溶性小鼠Siglec-15-mIgG融合蛋白(S15-mIg)或对照IgG(mIg)刺激的小鼠脾细胞中3H胸腺嘧啶核苷掺入的水平。图9C描述与过表达全长小鼠Siglec 15(KbOVA-S15)或模拟对照(KbOVA-对照)的293T-KbOVA细胞共培养的来自OT-1转基因小鼠的活化脾细胞中3H胸腺嘧啶核苷掺入的水平。图9D描述过表达小鼠Siglec 15的三个293T-KbOVA细胞系中的Siglec15表达水平。图9E描述与具有提高的Siglec 15表达水平(在图9D中测定)的293T-KbOVA细胞共培养的来自OT-1转基因小鼠的活化脾细胞的上清液中存在的IFN-γ水平。图9F描述与具有提高的Siglec 15表达水平的293T-KbOVA细胞共培养的来自OT-1转基因小鼠的活化脾细胞的上清液中存在的TNF-α水平。
图10A描述通过基于粘附的细胞毒性分析(ACEA Biosciences)所示的293T-KbOVA靶细胞的OT-1T细胞杀伤的剂量反应。图10B在增加量的OT-1T细胞存在下，将过表达Siglec15的293T-KbOVA细胞(293T-KbOVA-S15)的粘附信号与模拟转染的293T-KbOVA细胞(293T-KbOVA-对照)的粘附信号进行比较。比率表示OT-1T细胞对293T-KbOVA细胞的比例。
图11A为实施例8中所述OT-1体内活化模型的示意图。图11B描述来自OT-1/RagKO小鼠的脾细胞的静脉内转移后，在野生型(WT)或Siglec 15全体敲除(KO)小鼠的血液(左图)与脾脏(右图)中OT-1细胞占总CD8T细胞群体的百分比。该OT-1细胞的百分比使用OT-1四聚体通过FACS染色监测。图11C描述在第5天通过抗EdU染色所测定的血液OT-1细胞的增殖，并计算为EdU阳性OT-1细胞/总OT-1阳性细胞的百分比。图11D描述在无刺激的情况下分离和培养过夜及针对膜联蛋白V染色的脾细胞中的细胞凋亡。细胞凋亡计算为膜联蛋白V-阳性OT-1细胞/总OT-1阳性细胞的百分比。
图12A描述依照图11A中所描述的时间表，在来自OT-1/RagKO小鼠的脾细胞的静脉内转移后的各个不同时间小鼠血液中OT-1细胞占总CD8T细胞群体的百分比。WT，野生型小鼠；KO，Siglec 15全体敲除小鼠；LysM-Cre KO，巨噬细胞特异性Siglec 15基因敲除小鼠。图12B描述与野生型相比，在OT-1T细胞反应期间所评估的全体KO与LysM-Cre KO小鼠血浆中的IL-10水平。
图13描述11月龄的野生型(WT)或Siglec 15基因敲除(S15KO)小鼠血液中骨髓细胞、CD8+细胞和CD4+细胞的百分比。
图14描述与过表达模拟质粒(对照)、全长LRRC4C或Siglec 15的293T细胞共培养的巨噬细胞的上清液中的细胞因子水平。
图15描述Siglec 15抗体S15m02具有作为破坏Siglec 15与MAG或LRRC4C结合的阻断抗体的作用，而Siglec 15抗体S15m03不影响Siglec 15与MAG或LRRC4C之间的相互作用。
图16描述添加Siglec 15的阻断抗体，S15m02，导致EAE小鼠比注射对照mAb或接受S15m03抗体的对应小鼠发生更严重的疾病症状。
图17描述添加Siglec 15-Fc融合蛋白至EAE(实验性自身免疫性脑脊髓炎)小鼠导致这些小鼠中的炎症加速。
图18描述Siglec 15基因敲除(KO)小鼠(上面线条)比野生型(WT)小鼠(下面线条)展现更严重的EAE疾病症状，指示Siglec 15在脑炎症反应的调控中的抑制性作用。
图19A描述用MOG肽进行免疫并在第0天和第1天以百日咳毒素强化，随后从第6天开始每周两次用100μg Siglec 15-mIg融合蛋白(Siglec15-mIg)或对照mIg(左图)或者Siglec 15-hIg融合蛋白(Siglec15-hIg)或对照hIg(右图)，总共4个剂量处理的WT小鼠的EAE临床评分。图19B描述在5ug/ml Siglec15-mIg(S15-mIg)或对照mIg(mIg)存在下，从对照mIg处理的小鼠(其用MOG肽(60μg/ml)再刺激3天)第12天得到的脾细胞中的3H-胸腺嘧啶核苷掺入。
图20描述通过Siglec 15-Fc处理阻断Siglec显著地缩减具有胶质母细胞瘤的小鼠中的肿瘤大小。
图21描述通过Siglec 15-Fc处理阻断Siglec显著地延长具有胶质母细胞瘤的小鼠的存活期。
图22描述Siglec15-Fc和抗PDL1处理在具有胶质母细胞瘤的小鼠中缩减肿瘤大小和促进存活的效益上的协同作用。
图23A描述在第0天用含荧光素酶报道基因的GL261胶质母细胞瘤细胞颅内接种的野生型(WT)或Siglec 15基因敲除(Siglec15KO)小鼠的脑中的荧光素酶活性。图23B呈现用GL261细胞接种后，第13天和第18天WT和KO小鼠的脑中荧光素酶活性的图像。图23C呈现用GL261接种的WT和KO小鼠的存活曲线。
图24A描述在第14天，两个组(WT和KO)的脑或脾脏中CD8T细胞的百分比和总数。图24B描述在第14天，两个组(WT和KO)的脑或脾脏中CD4T细胞的百分比和总数。图24C描述在第14天，两个组(WT和KO)的脑或脾脏中树突细胞(DC)、巨噬细胞和小神经胶质细胞的百分比和总数。图24D描述在第14天获得并用GL-261肿瘤细胞再刺激过夜的来自荷瘤WT或KO小鼠的脑淋巴细胞中IFN-γ阳性CD8或CD4T细胞的百分比和总数。
图25A描述通过用抗Siglec 15单克隆抗体的FACS染色测定的MC38-S15-和MC38-S15+细胞上的Siglec 15表达(图25A)。图25B描述通过皮下注射接种后MC38-S15-和MC38-S15+细胞在B6小鼠中的肿瘤成长(图25B)。
图26描述接种MC38-S15+稳定细胞系，并用对照抗体、抗Siglec 15抗体m01或Siglec 15-mIg融合蛋白处理的B6小鼠中的平均肿瘤大小。显示了各组的平均肿瘤大小。
图27A概述所提出的Siglec 15用作配体的作用机制。图27B概述所提出的Siglec15用作受体的作用机制。
具体实施方式
本发明至少部分地基于发现Siglec 15在抑制对癌症的免疫反应中发挥关键作用，因此，提供操控Siglec 15途径用于未来开发癌症治疗药物的理论基础。特别是，已发现降低Siglec 15的表达缩减肿瘤大小和延长具有脑肿瘤的小鼠的存活期。此外，在脑发炎小鼠模型中通过阻断Siglec 15与其配体之间的相互作用而抑制Siglec 15活性，以及在Siglec 15基因敲除小鼠中消除Siglec 15表达，均使脑炎症恶化。因此，本发明提供通过调节Siglec 15以及其相同途径中的其结合伴体的表达和/或活性而治疗癌症的方法、治疗自身免疫疾病的方法、调控对癌症的免疫反应的方法和调控受试者的炎症反应的方法。
I.定义
为了更容易理解本发明，首先定义特定术语。除非本文另外定义，否则所使用的与本发明有关的科学和技术术语应具有本领域技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应清晰明了，然而，如果任何潜在的模糊性发生，本文所提供的定义优先于任何字典或外部的定义。除非本文另外指明，否则本文列举的数值范围仅意欲用于作为个别提及的个别列举或落在该范围内的个别数值的速记(shorthand)方法，且各个别数值如同被单独引用般地被并入说明书中。
下述说明中，为解释的目的，提出具体数值、材料和配置以提供对本发明的彻底理解。然而，本领域普通技术人员将明显可见，本发明可在无这些具体细节的情况下实施。在一些情况中，可省略或简化熟知的特征，以免模糊本发明。再者，说明书中提及的短语，例如"一个实施方案"或"一实施方案"，意指与该实施方案相关所述的特定特点、结构或特征包含在本发明的至少一个实施方案中。在说明书中不同地方出现的短语，例如"在一个实施方案中"，未必全部指相同实施方案。
除非在本文中另外指明或显然与上下文相抵触，否则在描述本发明的上下文中(尤其是在下述权利要求范围的上下文中)的"一(a)"和"一个(an)"和"该(the)"等词和类似提示语的使用将被解释为包含单数和复数两者(即，一个或多个)。例如，"一个元件(anelement)"意指一个元件或多于一个元件。除另外指明，否则"包含(comprising)"、"具有(having)"、"包括(including)"和"含有(containing)"等词将被解释为开放式术语(即，意指"包括但不限于")。
本文所用的"Siglec15"一词也被称为唾液酸结合Ig样凝集素15、CD33抗原样3、CD33分子样3、CD33L3和HsT1361，是包含唾液酸结合组分与Ig样分子的凝集素家族蛋白的成员。人Siglec15mRNA的序列可在例如GenBank Accession GI:225637536(NM_213602.2；SEQ ID NO:1)中找到。人Siglec15多肽序列的序列可在例如GenBank Accession No.GI:47106069(NP_998767.1；SEQ ID NO:2)中找到。
本文所用的"MAG"一词，也被称为髓鞘相关糖蛋白、唾液酸结合Ig样凝集素4A、SIGLEC4A或GMA，是I型膜蛋白和免疫球蛋白超家族的成员。MAG为NOGO-66的功能性受体，且被认为参与神经元髓鞘形成。MAG也存在于骨髓细胞中，尤其是小神经胶质细胞中。MAG基因敲除(KO)小鼠存在胞吞作用的问题。MAG结合唾液酸化的糖复合物并介导某些髓鞘-神经元的细胞-细胞相互作用。针对此基因已描述了编码不同同种型的三种选择性剪接转录物。人MAG mRNA的序列可在例如GenBank Accession GI:312836849(NM_002361.3；SEQ ID NO:3)找到。人MAG多肽序列的序列可在例如GenBank Accession No.GI:11225258(NP_002352.1；SEQ ID NO:4)找到。
本文所用的"LRRC4C"一词，也被称为含4C的富亮氨酸重复序列(LRR)、轴突生长诱向因子(netrin)-G1配体、NGL1或KIAA1580,LRRC4C，为与神经元相关生长、树突形成和轴突延伸相关的LRR家族分子。LRRC4C主要定位于兴奋性突触的突触后侧，并与突触前配体，轴突生长诱向因子G1，相互作用以调控兴奋性突触形成。人LRRC4C mRNA的序列可在例如GenBank Accession GI:385724810(NM_020929.2；SEQ ID NO:5)找到。人LRRC4C多肽序列的序列可在例如GenBank Accession No.GI:51317373(NP_065980.1；SEQ ID NO:6)找到。
本文所用的"Sialyl-Tn"一词，也被称为"STn"、"Sialyl-Tn抗原"和"Neu5Acα2-6GalNAcα-O-Ser/Thr"，是指Tn抗原的唾液酸取代的形式。Tn抗原为通过糖苷键连接于丝氨酸或苏氨酸的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)寡糖，作为O-聚糖。Sialyl-Tn是含有唾液酸α-2,6连接于GalNAcα-O-Ser/Thr的截短O-聚糖。Sialyl-Tn表达由异常糖基化途径的活化所引起，且一般发生在肿瘤细胞中。Sialyl-Tn的生物合成与唾液酸转移酶ST6GalNAc1的表达和与COSMC(核心1β3-Gal-T-特异性分子伴侣蛋白)的突变相关联。Sialyl-Tn表达已在超过80％的人类癌症(包括胃癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、前列腺癌和子宫内膜样癌)中被报道，且与不良预后相关联(Munkley,Int.J.Mol.Sci.(2016),17(3):275)。
应注意的是，除非另外指明，否则全文中的分子名称，例如Siglec15、MAG或LRRC4C，包括基因和蛋白质两者。因此，"Siglec15"一词在用于指分子时包括Siglec15蛋白质和Siglec15基因两者。
"Siglec 15的水平"一词包括Siglec 15mRNA或cDNA的水平，和/或Siglec 15蛋白、DNA、mRNA或cDNA的蛋白质浓度、表达、活性、功能或稳定性。在一个实施方案中，本文所用的"水平"一词是指可测量的Siglec 15量。该量可为(a)以分子、摩尔或者每单位体积的重量或细胞测量的绝对量，或(b)例如通过密度测定分析测量的相对量。
本文所用的"Siglec 15的调节剂"是指调节Siglec 15的mRNA表达和/或蛋白质表达；和/或Siglec 15的mRNA和/或蛋白质稳定性；和/或Siglec 15的生物活性的任何化合物或分子。调节剂可直接或间接地调节Siglec 15的表达和/或活性。Siglec 15的调节剂直接作用于Siglec 15，例如结合Siglec 15并抑制或激活其功能的抗体。在另一个实施方案中，该Siglec 15的调节剂间接作用于Siglec 15(例如通过另一分子，如Siglec 15的结合伴体)，导致Siglec 15活性的增强或降低。适用于本发明方法的示例性药剂包括干扰核酸分子(例如，反义RNA、sdRNA和siRNA)、细胞内抗体、重组融合蛋白、抑制性肽或小分子。适用于本发明方法的药剂在下文中详细讨论。
本文所用"调节"一词的各种形式包括刺激(例如，增强或上调特定反应或活性)和抑制(例如，降低或下调特定反应或活性)。在一些实施方案中，该调节剂是Siglec 15的抑制剂。在一些实施方案中，该调节剂是Siglec 15的活化剂。
本文所用的"抑制"一词是指降低Siglec 15的表达、稳定性和/或生物活性。例如，"抑制"一词是指降低或下调如本文所描述的Siglec 15的表达、稳定性和/或活性的能力。
本文所用的"刺激"一词是指增强Siglec 15的表达、稳定性和/或生物活性。例如，"刺激"一词是指增强或上调如本文所述的Siglec 15的表达、稳定性和/或活性的能力。
本文所用的"Siglec 15活性的抑制剂"或"Siglec 15拮抗剂"包括部分或完全地阻断、抑制或中和由Siglec 15介导的生物活性的任何分子。在一些实施方案中，Siglec 15拮抗剂抑制Siglec 15多肽。在其他实施方案中，Siglec 15拮抗剂抑制Siglec 15的配体，例如，MAG、LRRC4C或Sialyl-Tn。
本文所用的"Siglec 15活性的激动剂"或"Siglec 15激动剂"包括部分或完全地刺激或加强其所结合的抗原的生物活性的任何分子。示例性的Siglec 15激动剂结合Siglec 15并在结合后刺激通过Siglec 15的信号传导，从而模拟Siglec 15与例如MAG、LRRC4C或Sialyl-Tn的天然配体的相互作用。Siglec 15活性的其他示例性激动剂是与例如MAG、LRRC4C或Sialyl-Tn的Siglec 15配体结合并通过其传导信号，从而模拟该配体与Siglec 15的相互作用。
本文所用的"抗体"一词意指由四条多肽链，通过二硫键互相连接的两条重(H)链和两条轻(L)链，组成的免疫球蛋白分子。各重链由重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域，CH1、CH2和CH3组成。各轻链由轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由1个结构域CL组成。VH和VL区可进一步细分成称为互补决定区(CDR)的高度可变区，其散布在更保守的、称为框架区(FR)的区域中。各个VH和VL由3个CDR和4个FR组成，其从氨基端至羧基端依下述顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
本文所用术语抗体的"抗原结合部分"或"抗原结合片段"(或简称"抗体部分")是指全长抗体的一部分，通常是靶结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段。抗体的"功能性片段"的短语是具有与全长抗体共有的定性生物活性的化合物。例如，拮抗性抗Siglec 15抗体的功能性片段可以阻断、抑制或中和由Siglec 15介导的生物活性的方式结合Siglec 15。本文所用关于抗体的"功能性片段"是指Fv、scFv、双抗体(diabody)、F(ab)和F(ab')2片段。"Fv"片段是含有完整靶识别与结合位点的最小抗体片段。此区域由紧密、非共价结合的一重链和一轻链可变结构域的二聚体(VH-VL二聚体)组成。在此构型中，各可变结构域的3个CDR相互作用以限定VH-VL二聚体表面上的靶结合位点。scFv含有用肽接头连接的一重链和一轻链可变结构域，该肽接头的大小容许VH与VL结构域相互作用以形成靶结合位点。总而言之，6个CDR赋予抗体或抗体片段的靶结合特异性。然而，甚至单一可变结构域(或仅含3个对靶特异性的CDR的Fv的一半)可以具有识别和结合靶的能力，虽然亲和力较整体结合位点更低。
本文所用的"拮抗剂抗体"或"阻断抗体"等词是指抑制或降低其所结合抗原的生物活性的抗体。示例的拮抗剂抗体实质上或完全抑制抗原的生物活性。
本文所用的"激动剂抗体"一词是指刺激或加强其所结合抗原的生物活性的抗体。示例的激动剂抗体在结合后刺激通过抗原的信号传导，从而模拟抗原与天然配体的相互作用。
本文所用的"受试者"一词是指动物，例如哺乳动物，包括灵长类动物(例如人、非人灵长类动物例如猴子和黑猩猩)、非灵长类动物(例如母牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠、小鼠和鲸)、禽类(例如鸭或鹅)和鲨鱼。在一个实施方案中，该受试者是人类，例如正在治疗或评估疾病、病症(disorder)或症状(condition)的人、处在疾病、病症或症状风险中的人、具有疾病、病症或症状的人和/或正在治疗或评估如本文所述的疾病、病症或症状的人。在一些实施方案中，该受试者未罹患进行中的自身免疫疾病。在一个实施方案中，该受试者为约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10岁。在另一个实施方案中，该受试者为约5至10、10至15、15至20、20至25、25至30、30至35、35至40、40至45、45至50、50至55、55至60、60至65、65至70、70至75、75至80、80至85、85至90、90至95、95至100岁。上文详述范围中间的数值和范围也为本发明的一部分。此外，意图包括使用任何上文详述数值组合作为上限和/或下限的数值范围。
本文所用的"处理"或"治疗"等词是指有益或期望的结果，包括但不限于，无论是可检测或不可检测的，一种或多种症状的减轻或改善、病症程度的缩减、病症状况的稳定(即，不恶化)状态、病症的改善或缓和。"治疗"也可意指与缺乏治疗的预期存活期相比较，存活期延长。
本文所用的"有效量"一词是指治疗的用量，其足以降低或改善病症或其一种或多种症状的严重性和/或持续时间、抑制或预防病症进展、致使病症消退、抑制或预防一种或多种与病症相关症状的复发、形成、发病或进展、检测病症或者增强或增进另外疗法(例如，预防性或治疗性药剂)的预防或治疗效果。有效量可能需要超过一个剂量。
II.本发明的方法
本发明至少部分地基于发现Siglec 15在免疫调控中具有关键性作用。Siglec 15已在破骨细胞分化中被广泛研究，其中Siglec 15发挥非免疫性作用。除了在破骨细胞分化中的作用外，如本文所述，Siglec 15通过抑制免疫细胞包括T细胞和巨噬细胞的活性而调控免疫反应。因此，Siglec 15在癌症细胞或肿瘤微环境中的上调可抑制受试者对抗癌症的免疫反应。再者，缺乏Siglec 15可促成与自身免疫相关的病症。
不拘泥于理论，提出Siglec 15可通过作为配体和/或作为受体作用而发挥免疫调节性功能(图27)。Siglec 15在骨髓细胞中表达，并在脑微环境、癌症细胞和肿瘤微环境中过表达。在脑、癌症细胞或在肿瘤微环境中过表达时，Siglec 15可具有配体的功能，其中它可直接地或通过骨髓细胞间接地影响T细胞反应。T细胞和骨髓细胞两者皆可表达负责Siglec 15的免疫抑制性功能的受体(图27A)。另外或替代地，Siglec 15配体在脑微环境、癌症细胞或在肿瘤微环境中的表达可通过作为受体发挥作用的Siglec 15而诱导信号传导(图27B)。因此，Siglec 15可通过骨髓：T细胞相互作用或免疫抑制细胞因子如IL-10和TGF-β而间接地影响T细胞反应。
在各个不同方面中，本发明涉及通过促进或抑制Siglec 15活性而调节免疫功能的方法。
A.通过降低Siglec 15的表达和/或活性而增强免疫反应的方法
在一方面中，本发明提供通过给予受试者有效量的Siglec 15调节剂用于增强受试者中的免疫或炎症反应的方法，其中该调节剂在受试者中降低Siglec 15的表达和/或活性。在一个实施方案中，此方法可用以在受试者中增加T细胞例如CD4T细胞和/或CD8T细胞的数量。在另一个实施方案中，此方法可用以在受试者中增强T细胞例如CD4T细胞和/或CD8T细胞的活性。
前述方法可用以在受试者中治疗将受益于增加或加强免疫反应的病症。例如，可使用降低Siglec 15表达和/或活性的Siglec 15的调节剂以治疗需要的受试者的癌症。此类方法可包括给予需要的受试者有效量的Siglec 15的调节剂，其中该调节剂降低受试者中Siglec 15的表达和/或活性水平，从而治疗受试者的癌症。
在另一方面中，本发明提供用于缩减需要的受试者的肿瘤大小的方法。该方法包括给予需要的受试者有效量的Siglec 15的调节剂，其中该调节剂降低受试者中Siglec 15的表达和/或活性水平，从而缩减受试者的肿瘤大小。
在一方面中，本发明的特征在于用于延长需要的受试者的存活期的方法。该方法包括给予需要的受试者有效量的Siglec 15的调节剂，其中该调节剂降低受试者中Siglec15的表达和/或活性水平，从而延长受试者的存活期。
在另一方面中，本发明的特征在于用于增强需要的受试者对抗肿瘤的免疫反应的方法。该方法包括给予需要的受试者有效量的Siglec 15的调节剂，其中该调节剂降低受试者中Siglec 15的表达和/或活性水平，从而增强受试者对抗肿瘤的免疫反应。
适用于本发明方法的Siglec 15的调节剂包括可调控Siglec 15的表达和/或活性，例如，Siglec 15的mRNA表达和/或蛋白质表达、Siglec 15的mRNA和/或蛋白质稳定性；和/或Siglec 15的生物活性的任何化合物或分子。调节剂可直接或间接地调节Siglec 15的表达和/或活性。在一些实施方案中，该调节剂抑制Siglec 15的表达和/或活性。Siglec15的抑制性调节剂可直接作用于Siglec 15，例如结合Siglec 15并抑制其功能的拮抗剂抗体。替代地，Siglec 15的抑制性调节剂间接地作用于Siglec 15(例如，通过另一分子，如Siglec 15的结合伴体)，导致降低的活性。适用于本发明方法的示例调节剂包括小分子抑制剂、拮抗剂抗体或其抗原结合片段、重组融合蛋白(例如可溶性Siglec 15融合蛋白，例如可溶性Siglec 15-Fc)、抑制性肽或干扰核酸分子(例如，反义RNA、sdRNA和siRNA)。适用于本发明方法的调节剂在下文中详细讨论。
本发明的Siglec 15的调节剂也可阻断Siglec 15与结合配体之间的相互作用。Siglec 15的结合配体可利用本领域中已知的任何方法鉴定。例如，Siglec 15与结合配体之间的蛋白质-蛋白质相互作用可利用共免疫沉淀法鉴定，其中可通过在体外形成与抗体的共沉淀物确定感兴趣的蛋白质对的结合。替代地，可使用酵母双杂交蛋白或噬菌体展示方法以筛选Siglec 15的结合配体。在一些实施方案中，化学交联分析和随后的质谱测定法分析可用于鉴定相互作用的蛋白质。
在一些实施方案中，适用于本发明的Siglec 15的结合配体可利用受体阵列技术鉴定。受体阵列技术是被用于筛选靶蛋白的对应受体的良好确立的技术(Zhu Y et al,NatCommun,4:2043,2013；Yao S et al,Immunity,34(5):729-740,2011)。简言之，该受体阵列包含含多个孔的固体支持结构，其中多个孔各含有经编码受体蛋白的基因转染的细胞。如先前所述，使靶基因(编码分泌蛋白)或该靶基因的胞外结构域(编码跨膜蛋白，例如免疫调节剂)与标签基因(小鼠IgG2a Fc、人IgG1 Fc、FLAG或6xHIS)遗传融合以制备融合基因(Chapoval,AI.et al.,Mol Biotechnol 21(3):259-264,2002)。在个别融合基因转染至293T细胞中后，使用纯化的重组融合蛋白针对受体阵列进行筛选。施用针对该标签的荧光标记的二抗以检测靶蛋白(例如，根据本发明方法鉴定的免疫调节剂)与转染的293T细胞的结合，并使用Applied Biosystems 8200细胞检测系统进行筛选和通过CDS 8200软件进行分析。前述参考文献的全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，Siglec 15的结合配体为MAG。在其他实施方案中，Siglec 15的结合配体为LRRC4C。在其他实施方案中，Siglec 15的结合配体为Sialyl-Tn。
Siglec 15与其配体例如MAG、LRRC4C和/或Sialyl-Tn的结合位点可利用本领域中已知的任何方法确定。例如，可使用本领域中已知的标准方法产生结构域缺失的Siglec 15突变体蛋白并加以纯化。在一些实施方案中，适用于本发明方法的调节剂为具有降低的配体结合活性的突变体Siglec 15蛋白。例如，调节剂可为在残基143处具有单一置换突变的突变体Siglec蛋白。在其他实施方案中，适用于本发明方法的调节剂是具有IgV结构域缺失的突变体Siglec 15蛋白。
适用于本发明方法的Siglec 15的调节剂可通过抑制参与Siglec 15途径的活性，例如，通过降低Siglec 15的任何结合配体如MAG、LRRC4C或Sialyl-Tn的表达和/或活性，增强对抗肿瘤的免疫反应。在一些实施方案中，适用于本发明方法的调节剂是MAG或LRRC4C的小分子抑制剂、MAG或LRRC4C的拮抗剂抗体或其抗原结合片段、性质上为抑制性的重组MAG融合蛋白、性质上为抑制性的重组LRRC4C融合蛋白或者靶向MAG或LRRC4C的抑制性蛋白或核酸。在其他实施方案中，该调节剂是特异性地结合Sialyl-Tn的抗体或其抗原结合片段。此类抗体或其抗原结合片段可结合Sialyl-Tn并屏蔽其与Siglec 15的结合。在其他实施方案中，该调节剂是可溶性Sialyl-Tn分子，任选地与支架偶联，例如支架肽。适用于本发明方法的调节剂在下文中详细讨论。
前述方法可用于治疗将受益于增加或加强受试者中的免疫反应的病症。此类病症包括，但不限于，癌症。例如，可采用降低Siglec 15表达和/或活性的Siglec 15调节剂的施用以刺激对抗癌症的免疫反应(例如，刺激对抗癌症的T细胞反应)、缩减肿瘤大小和/或延长患有癌症的受试者的存活期。
本文所述的"癌症"一词是指由可扩散到邻接组织或身体其他部分的细胞的未受控制的、异常增殖所引起的一组疾病。癌细胞可形成其中癌细胞团聚在一起的实体肿瘤，或作为分散细胞存在，如在白血病中。适合通过降低Siglec 15表达或活性治疗的癌症的类型包括，但不限于，实体肿瘤和/或血液肿瘤。在一个实施方案中，癌症是上皮来源的。可利用通过前述方法治疗的示例癌症类型包括，但不限于，肾上腺癌、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑/CNS肿瘤、乳腺癌、卡斯特雷曼氏症(castleman disease)、子宫颈癌、结肠/直肠癌、子宫内膜样癌、食道癌、眼癌、胆囊癌、胃肠癌、肾癌、喉和下咽癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、皮肤的淋巴瘤、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓发育不良综合征、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、神经胚细胞瘤、非霍奇金氏(non-hodgkin)淋巴瘤、口腔和口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、脑下垂体瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、皮肤癌、小肠癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫肉瘤、阴道癌、阴门癌、瓦登斯特隆(waldenstrom)巨球蛋白血症和威尔姆氏(wilms)瘤。在一些实施方案中，癌症选自脑癌、肺癌、胰腺癌、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、肾细胞癌、直肠腺癌、肝细胞癌和尤文氏(Ewing)肉瘤。
在一些实施方案中，该癌症是结肠癌、子宫内膜样癌、肾脏癌(例如肾乳突状细胞癌、肾透明细胞癌)、肝癌、甲状腺癌、肺癌(例如肺腺癌、肺鳞状细胞癌)、头颈癌、乳腺癌、子宫颈癌、前列腺癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤、直肠癌或胆管癌。在一个实施方案中，该癌症是脑癌。在一个实施方案中，该癌症是胶质母细胞瘤。在一个实施方案中，该癌症不是血液衍生的癌症。在一个实施方案中，该癌症不是白血病。在一个实施方案中，该癌症不是急性髓性白血病(AML)。
使用"有效量"的本发明的调节剂(与包含此类调节剂的治疗组合物)是达到期望结果所需的剂量与时间周期的有效的量。例如，调节剂的有效量可根据例如疾病状况、年龄、性别、生殖状态与体重和该制剂在生物体中引起期望反应的能力等因素而不同。剂量方案可经调整以提供最适反应。例如，可每日提供数个分剂量或可视紧急情况依比例减少剂量。
本文所用的"治疗"是指赋予患者例如罹患疾病或处在形成疾病风险的患者的益处的介入。治疗包括为了改善患者状况的目的，例如缓和一种或多种症状或延缓疾病的发作或进展而采取的行动和避免采取的行动。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗癌症的组合疗法，其中将降低Siglec 15表达和/或活性的Siglec 15调节剂和检查点抑制剂例如PD-L1拮抗剂或PD-1拮抗剂组合给予受试者。PD-1为T细胞上的检查点蛋白，其阻止T细胞攻击身体内表达PD-L1的细胞。一些癌细胞过表达PD-L1，以使它们能够逃避T细胞的检测。PD-L1和PD-1的抑制剂可增强对抗癌细胞的免疫反应，且与Siglec 15活性的拮抗剂结合使用时可协同促进肿瘤细胞杀伤。可与Siglec 15活性的拮抗剂结合使用的示例抗PD-L1抑制性抗体包括但不限于阿替珠单抗(atezolizumab)(Genentech)、阿维单抗(avelumab)(Pfizer)和度伐单抗(durvalumab)(AstraZeneca)。可与Siglec 15活性的拮抗剂结合使用的示例抗PD-1抑制性抗体包括但不限于派姆单抗(pembrolizumab)(Merck)和纳武单抗(nivolumab)(Bristol-MyersSquibb)。
在一些实施方案中，前述方法进一步包括筛选步骤，其中筛选用于在癌症或肿瘤微环境中上调Siglec 15的癌症患者。例如，在一个实施方案中，从受试者得到含癌细胞的生物样品，测定Siglec 15表达，并与适当对照例如得自正常受试者、指示正常受试者的表达水平的参考值等的可比较样品进行比较。在含癌细胞生物样品中Siglec 15的上调可指示该受试者将受益于降低Siglec 15表达和/或活性的药剂。
在一些实施方案中，前述方法可包括筛选步骤，其中正罹患自身免疫疾病的患者被排除在用Siglec 15调节剂的治疗之外。在其他实施方案中，适用于本发明方法的Siglec15的调节剂不会引起受试者的非特异性自身免疫疾病。可选择接受包含Siglec 15调节剂的治疗的受试者使其不会自发地发生自身免疫疾病。
B.通过增强Siglec 15的表达和/或活性而降低炎症的方法
本发明的另一方面提供通过给予受试者有效量的Siglec 15的调节剂在受试者中降低有害的免疫或炎症反应的方法，其中该调节剂在受试者中增强Siglec 15的表达和/或活性。在一个实施方案中，此方法可用于降低受试者中的T细胞例如CD4T细胞和/或CD8T细胞的数量。在另一个实施方案中，此方法可用于降低受试者中的T细胞例如CD4T细胞和/或CD8T细胞的活性。
前述方法可用于治疗将受益于减低受试者中的免疫反应或炎症反应的病症。例如，可使用增强Siglec 15表达和/或活性的Siglec 15的调节剂以治疗需要的受试者的自身免疫疾病。该方法包括给予受试者有效量的Siglec 15的调节剂，其中该调节剂增强受试者中Siglec 15的表达和/或活性，从而治疗该受试者的自身免疫疾病。
本发明的另一方面提供治疗需要的受试者的自身免疫疾病的方法。该方法包括给予受试者有效量的Siglec 15蛋白或编码该Siglec 15蛋白的核酸，从而治疗该受试者的自身免疫疾病。
在一方面中，本发明的特征在于降低需要的受试者的脑炎症反应的方法。该方法包括给予受试者有效量的Siglec 15的调节剂，其中该调节剂增强Siglec 15的表达和/或活性水平，从而降低受试者的脑炎症反应。
在另一方面中，本发明提供降低需要的受试者的脑炎症反应的方法。该方法包括给予受试者有效量的Siglec 15蛋白或编码该Siglec 15蛋白的核酸，从而降低该受试者的脑炎症反应。
适用于前述方法的Siglec 15的调节剂包括，例如，可通过调节Siglec 15的mRNA表达和/或蛋白质表达、Siglec 15的mRNA和/或蛋白质稳定性和/或Siglec 15的生物活性正向调控Siglec 15的表达和/或活性的任何化合物或分子。调节剂可直接或间接地调节Siglec 15的表达和/或活性。在一些实施方案中，该调节剂增强Siglec 15的表达和/或活性。Siglec 15的刺激性调节剂可直接作用于Siglec 15，例如结合Siglec 15并刺激其功能的激动剂抗体。在其他实施方案中，Siglec 15的刺激性调节剂间接作用于Siglec 15(例如，通过另一分子，如Siglec 15的结合伴体)，从而导致增强的活性。适用于本发明方法的示例调节剂包括小分子活化剂、激动剂抗体或其抗原结合片段或者激活Siglec 15的转录和/或翻译的蛋白质和核酸。替代地，用于本发明方法中以增强Siglec 15的表达和/或活性的调节剂包括Siglec 15蛋白或编码该Siglec 15蛋白的核酸。在一些实施方案中，该Siglec 15蛋白选自全长Siglec 15蛋白、Siglec 15的功能性片段或Siglec 15的IgV结构域。适用于本发明方法的调节剂在下文中详细讨论。
本发明的Siglec 15的调节剂也可促进Siglec 15与结合配体之间的相互作用。Siglec 15的结合配体可利用本领域中已知的任何方法鉴定。例如，Siglec 15与结合配体之间的蛋白质-蛋白质相互作用可通过共免疫沉淀法分析鉴定，其中通过在体外与抗体形成共沉淀物而确定感兴趣的蛋白质对的结合。替代地，可使用酵母双杂交蛋白或噬菌体展示分析以筛选Siglec 15的结合配体。在一些实施方案中，化学交联分析和随后质谱测定法可用于分析相互作用的蛋白质。
在一些实施方案中，适用于本发明的Siglec 15的结合配体可利用如本文所述的受体阵列技术进行鉴定。
在一些实施方案中，Siglec 15的结合配体为MAG。在其他实施方案中，Siglec 15的结合配体为LRRC4C。在一些实施方案中，Siglec 15的结合配体为Sialyl-Tn。
适用于实施本文所述方法的某些实施方案的示例的Siglec 15的调节剂可通过刺激参与Siglec 15途径的活性，例如，通过增强Siglec 15的结合配体例如MAG、LRRC4C或Sialyl-Tn的表达和/或活性而降低炎症。在一些实施方案中，适用于本发明方法的调节剂是MAG或LRRC4C的小分子活化剂、MAG或LRRC4C的激动剂抗体或其抗原结合片段、激活MAG或LRRC4C的转录和/或翻译的蛋白质或核酸。在其他实施方案中，适用于本发明方法的调节剂是MAG蛋白质或编码该MAG蛋白质的核酸。在另一个实施方案中，适用于本发明方法的调节剂是LRRC4C蛋白或编码该LRRC4C蛋白的核酸。在一个实施方案中，该调节剂是合成的Sialyl-Tn分子。例如，Sialyl-Tn可单独施用或结合，例如共价或非共价缀合支架分子而施用。在一个实施方案中，该调节剂是携带Sialyl-Tn的合成肽。Sialyl-Tn可结合并激活Siglec 15，而用作Siglec 15活性的激动剂。适用于本发明方法的增强Siglec 15表达和/或活性的调节剂在下文中详细讨论。
可用本发明方法治疗的疾病包括，但不限于，自身免疫疾病或癌症。"治疗"是指对例如罹患疾病或处在形成疾病风险的患者赋予益处的任何类型的处理。治疗包括为了改善患者状况的目的，例如缓和一种或多种症状或延缓疾病的发作或进展，而采取的行动和避免采取的行动。
本文所述的"自身免疫疾病"为由身体对正常存在身体中的物质与组织的异常免疫反应所引起的那些疾病，且包括，但不限于，类风湿性关节炎(RA)、幼年型慢性关节炎(JCA)、甲状腺炎、移植物抗宿主病(GVHD)、硬皮症、糖尿病、格雷弗氏(Graves)病、过敏、与例如但不限于肾脏移植、心脏移植、骨髓移植、肝脏移植、胰脏移植、小肠移植、肺移植和皮肤移植的同种异体移植相关的急性或慢性免疫疾病。在一些实施方案中，自身免疫疾病是炎性脑疾病。在其他实施方案中，炎性脑疾病是多发性硬化症。在其他实施方案中，炎性脑疾病是实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)。
III.药物制剂
包含本发明的Siglec 15或Siglec 15的调节剂的药物制剂可通过混合具有期望纯度的蛋白质或核酸与任选的生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington'sPharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980))，以水溶液、冻干或其他干燥制剂的形式制备。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量与浓度下对接受者不具有毒性；且包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基芐基氯化铵、氯化六烃季铵、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯酚、丁醇或苄醇、烷基对羟苯甲酸酯例如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚)；低分子量(低至约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷胺酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂例如EDTA；糖类，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的对应离子，例如钠；金属复合物(例如锌蛋白复合物)；和/或非离子性表面活性剂例如TweenTM、PluronicsTM或聚乙二醇(PEG)。
如所治疗特定适应症需要的，本文的制剂也可含有一种以上的活性化合物。例如，欲治疗自身免疫疾病时，则含有Siglec 15或Siglec 15的调节剂的本发明制剂可与已知用于治疗自身免疫疾病的药物组合，例如甲强龙、丙酮化去炎松(kenalog)、美卓乐(medrol)、泼尼松龙、氢化可的松(cortef)、氢可的松、可的松、曲安奈德(triamcinoloneacetonide)、倍他米松磷酸酯钠(celestone soluspan)、乙酸甲泼尼龙、泼尼松龙口崩片(orapred ODT)、去氢皮质醇磷酸钠口服液(veripred 20)、舒汝美卓乐(Solu-Medrol)或甲泼尼龙钠。若欲治疗癌症，则含有Siglec 15或Siglec 15的调节剂的本发明制剂可与已知用于治疗癌症的药物组合，例如乙酸阿比特龙(Abiraterone Acetate)、ABITREXATE(氨甲喋呤(Methotrexate))、ABRAXANE(白蛋白稳定化的紫杉醇纳米颗粒制剂)、ADCETRIS(贝伦妥单抗-维多汀(Brentuximab Vedotin))、贺癌宁(Ado-Trastuzumab Emtansine)、ADRIAMYCIN(盐酸多柔比星(Doxorubicin Hydrochloride))、ADRUCIL(氟尿嘧啶(Fluorouracil))、马来酸阿法替尼(Afatinib Dimaleate)、AFINITOR(依维莫司(Everolimus))、ALDARA(咪喹莫特(Imiquimod))、阿地介白素(Aldesleukin)、阿仑单抗(Alemtuzumab)、ALIMTA(培美曲塞二钠(Pemetrexed Disodium))、ALOXI(盐酸帕洛诺司琼(Palonosetron Hydrochloride))、AMBOCHLORIN(苯丁酸氮芥(Chlorambucil))、氨基乙酰丙酸、阿那曲唑(Anastrozole)、阿瑞吡坦(Aprepitant)、AREDIA(帕米膦酸二钠(Pamidronate Disodium))、ARIMIDEX(阿那曲唑)、AROMASIN(依西美坦(Exemestane))、ARRANON(奈拉滨(Nelarabine))、三氧化二砷、ARZERRA(奥法木单抗(Ofatumumab))、菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)天冬酰氨酸酶、AVASTIN(贝伐单抗(Bevacizumab))、阿西替尼(Axitinib)、阿扎胞苷(Azacitidine)、盐酸苯达莫司汀(BendamustineHydrochloride)、贝伐单抗、贝沙罗汀(Bexarotene)、BEXXAR(托西莫单抗(Tositumomab)和碘131托西莫单抗)、博莱霉素(Bleomycin)、硼替佐米(Bortezomib)、BOSULIF(伯舒替尼(Bosutinib))、卡巴他赛(Cabazitaxel)、苹果酸卡博替尼(Cabozantinib-S-Malate)、CAMPATH(阿仑单抗)、CAMPTOSAR(盐酸伊立替康(Irinotecan Hydrochloride))、卡培他滨(Capecitabine)、卡铂(Carboplatin)、卡菲佐米(Carfilzomib)、CEENU(洛莫司汀(Lomustine))、CERUBIDINE(盐酸道诺霉素(Daunorubicin Hydrochloride))、西妥昔单抗(Cetuximab)、苯丁酸氮芥、顺铂(Cisplatin)、CLAFEN(环磷酰胺)、氯伐拉滨(Clofarabine)、COMETRIQ(苹果酸卡博替尼)、COSMEGEN(放线菌霉素D(Dactinomycin))、克唑替尼(Crizotinib)、环磷酰胺、CYFOS(异环磷酰胺(Ifosfamide))、阿糖胞苷(Cytarabine)、达拉非尼(Dabrafenib)、达卡巴嗪(Dacarbazine)、DACOGEN(地西他滨(Decitabine))、放线菌霉素D、达沙替尼(Dasatinib)、盐酸道诺霉素、地西他滨、地加瑞克(Degarelix)、地尼白介素(Denileukin Diftitox)、地诺单抗(Denosumab)、盐酸右雷佐生(Dexrazoxane Hydrochloride)、多西他赛(Docetaxel)、盐酸多柔比星、EFUDEX(氟尿嘧啶)、ELITEK(拉布立酶(Rasburicase))、ELLENCE(盐酸表柔比星(EpirubicinHydrochloride))、ELOXATIN(奥沙利铂(Oxaliplatin))、艾曲波帕(EltrombopagOlamine)、EMEND(阿瑞吡坦)、恩杂鲁胺(Enzalutamide)、盐酸表柔比星、ERBITUX(西妥昔单抗)、甲磺酸艾日布林(Eribulin Mesylate)、ERIVEDGE(维莫德吉(Vismodegib))、盐酸厄洛替尼(Erlotinib Hydrochloride)、ERWINAZE(菊欧文氏菌天冬酰氨酸酶)、依托泊苷(Etoposide)、依维莫司、EVISTA(盐酸雷洛昔芬(Raloxifene Hydrochloride))、依西美坦、FARESTON(托瑞米芬(Toremifene))、FASLODEX(氟维司群(Fulvestrant))、FEMARA(来曲唑(Letrozole))、非格司亭(Filgrastim)、FLUDARA(磷酸氟达拉滨(FludarabinePhosphate))、磷酸氟达拉滨、FLUOROPLEX(氟尿嘧啶)、氟尿嘧啶、亚叶酸、FOLOTYN(普拉曲沙(Pralatrexate))、氟维司群、吉非替尼(Gefitinib)、盐酸吉西他滨(GemcitabineHydrochloride)、吉妥珠单抗(Gemtuzumab Ozogamicin)、GEMZAR(盐酸吉西他滨)、GILOTRIF(马来酸阿法替尼)、GLEEVEC(苯磺酸伊马替尼(Imatinib Mesylate))、HALAVEN(甲磺酸艾日布林)、HERCEPTIN(曲妥珠单抗(Trastuzumab))、HYCAMTIN(盐酸拓扑替康(Topotecan Hydrochloride))、替伊莫单抗(Ibritumomab Tiuxetan)、ICLUSIG(盐酸普纳替尼(Ponatinib Hydrochloride))、异环磷酰胺、苯磺酸伊马替尼、咪喹莫特、INLYTA(阿西替尼)、INTRON A(重组干扰素α-2b)、碘131托西莫单抗和托西莫单抗、伊匹单抗(Ipilimumab)、IRESSA(吉非替尼)、盐酸伊立替康、ISTODAX(罗米地辛(Romidepsin))、伊沙匹隆(Ixabepilone)、JAKAFI(磷酸鲁索替尼(Ruxolitinib Phosphate))、JEVTANA(卡巴他赛)、Kadcyla(贺癌宁)、KEOXIFENE(盐酸雷洛昔芬)、KEPIVANCE(帕利夫明(Palifermin))、KYPROLIS(卡菲佐米)、二对甲苯磺酸拉帕替尼(Lapatinib Ditosylate)、来那度胺(Lenalidomide)、来曲唑、甲酰四氢叶酸钙(Leucovorin Calcium)、乙酸亮丙瑞林(Leuprolide Acetate)、洛莫司汀、LUPRON(乙酸亮丙瑞林)、MARQIBO(硫酸长春花新碱(Vincristine Sulfate)脂质体)、MATULANE(盐酸丙卡巴肼(ProcarbazineHydrochloride))、盐酸氮芥(Mechlorethamine Hydrochloride)、MEGACE(乙酸甲地孕酮(Megestrol Acetate))、乙酸甲地孕酮、MEKINIST(曲美替尼(Trametinib))、巯基嘌呤(Mercaptopurine)、美司钠(Mesna)、METHAZOLASTONE(替莫唑胺(Temozolomide))、氨甲喋呤、丝裂霉素(Mitomycin)、MOZOBIL(普乐沙福(Plerixafor))、MUSTARGEN(盐酸氮芥)、MUTAMYCIN(丝裂霉素C)、MYLOSAR(阿扎胞苷)、MYLOTARG(吉妥珠单抗)、纳米紫杉醇颗粒(白蛋白稳定的紫杉醇纳米颗粒制剂)、NAVELBINE(酒石酸长春瑞滨(VinorelbineTartrate))、奈拉滨、NEOSAR(环磷酰胺)、NEUPOGEN(非格司亭)、NEXAVAR(甲苯磺酸索拉非尼(Sorafenib Tosylate))、尼罗替尼(Nilotinib)、NOLVADEX(柠檬酸它莫西芬(TamoxifenCitrate))、NPLATE(罗米司亭(Romiplostim))、奥法木单抗、高三尖杉酯碱(OmacetaxineMepesuccinate)、ONCASPAR(培门冬酶(Pegaspargase))、ONTAK(地尼白介素)、奥沙利铂、紫杉醇、白蛋白稳定的紫杉醇纳米颗粒制剂、帕利夫明、盐酸帕洛诺司琼、帕米膦酸二钠、帕尼单抗(Panitumumab)、盐酸帕唑帕尼(Pazopanib Hydrochloride)、培门冬酶、PEG化干扰素(Peginterferon)α-2b、PEG-INTRON(PEG化干扰素α-2b)、培美曲塞二钠、帕妥珠单抗(Pertuzumab)、PLATINOL(顺铂)、PLATINOL-AQ(顺铂)、普乐沙福、泊马度胺(Pomalidomide)、POMALYST(泊马度胺)、盐酸普纳替尼、普拉曲沙、强的松(Prednisone)、盐酸丙卡巴肼、PROLEUKIN(阿地介白素)、PROLIA(地诺单抗)、PROMACTA(艾曲波帕)、PROVENGE(西普鲁塞(Sipuleucel)-T)、PURINETHOL(巯基嘌呤)、镭223二氯化物、盐酸雷洛昔芬、拉布立酶、重组干扰素α-2b、瑞戈菲尼(Regorafenib)、REVLIMID(来那度胺)、RHEUMATREX(氨甲喋呤)、利妥昔单抗(Rituximab)、罗米地辛、罗米司亭、RUBIDOMYCIN(盐酸道诺霉素)、磷酸鲁索替尼、西普鲁塞-T、甲苯磺酸索拉非尼、SPRYCEL(达沙替尼)、STIVARGA(瑞戈菲尼)、苹果酸苏尼替尼(Sunitinib Malate)、SUTENT(苹果酸苏尼替尼)、SYLATRON(PEG化干扰素α-2b)、SYNOVIR(沙利度胺(Thalidomide))、SYNRIBO(高三尖杉酯碱)、TAFINLAR(达拉非尼)、柠檬酸它莫西芬、TARABINE PFS(阿糖胞苷)、TARCEVA(盐酸厄洛替尼)、TARGRETIN(贝沙罗汀)、TASIGNA(尼罗替尼)、TAXOL(紫杉醇)、TAXOTERE(多西他赛)、TEMODAR(替莫唑胺)、替莫唑胺、西罗莫司(Temsirolimus)、沙利度胺、TOPOSAR(依托泊苷)、盐酸拓扑替康、托瑞米芬、TORISEL(西罗莫司)、托西莫单抗和碘131托西莫单抗、TOTECT(盐酸右雷佐生)、曲美替尼、曲妥珠单抗、TREANDA(盐酸苯达莫司汀)、TRISENOX(三氧化二砷)、TYKERB(二对甲苯磺酸拉帕替尼)、凡德他尼(Vandetanib)、VECTIBIX(帕尼单抗)、VelP、VELBAN(硫酸长春花碱(Vinblastine Sulfate))、VELCADE(硼替佐米)、VELSAR(硫酸长春花碱)、维罗非尼(Vemurafenib)、VEPESID(依托泊苷)、VIADUR(乙酸亮丙瑞林)、VIDAZA(阿扎胞苷)、硫酸长春花碱、硫酸长春新碱、酒石酸长春瑞滨、维莫德吉、VORAXAZE(谷卡匹酶(Glucarpidase))、伏立诺他(Vorinostat)、VOTRIENT(盐酸帕唑帕尼)、WELLCOVORIN(甲酰四氢叶酸钙)、XALKORI(克里替尼)、XELODA(卡培他滨)、XGEVA(地诺单抗)、XOFIGO(镭223二氯化物)、XTANDI(恩杂鲁胺)、YERVOY(伊匹单抗)、ZALTRAP(阿柏西普(Ziv-Aflibercept))、ZELBORAF(维罗非尼)、ZEVALIN(替伊莫单抗)、ZINECARD(盐酸右雷佐生)、阿柏西普、唑来磷酸(Zoledronic Acid)、ZOLINZA(伏立诺他)、ZOMETA(唑来磷酸)和ZYTIGA(乙酸阿比特龙)。在一个实施方案中，Siglec 15的调节剂可与PD-L1拮抗剂组合，例如抗PD-L1拮抗剂抗体或其抗原结合部分。在另一个实施方案中，Siglec 15的调节剂可与PD-1拮抗剂组合，例如抗PD-1拮抗剂抗体或其抗原结合部分。
活性成分也可在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或粗乳液中，包装在例如通过凝聚技术或通过界面聚合反应(分别例如羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)制备的微胶囊中。这些技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)中。
用于体内施用的制剂必须是无菌的。这利用通过无菌过滤膜的过滤容易地实现。
通常，组合物的成分单独地或混合在一起以单位剂型供应，例如，作为在指明活性剂的量的气密容器如安瓿或小袋中的干燥冻干粉末或无水浓缩物。在给药方式为输注时，组合物可用含无菌药用级水或盐水的输注瓶分配。在给药方式是通过注射时，可提供无菌注射用水或盐水的安瓿，以使得可在施用前混合这些成分。在替代实施方案中，一种或多种本发明的药物组合物以液体形式在显示药剂量和浓度的气密容器中供应。
活性剂可加入适于胃肠外给药的药物组合物中，基通常制备为可注射溶液。可注射溶液可由在燧石或琥珀小瓶、安瓿或预充注射器中的液体或冻干剂型组成。液体或冻干剂型可进一步包含缓冲剂(例如L-组氨酸、琥珀酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾、氯化钠)、低温保护剂(例如蔗糖、海藻糖或乳糖)、填充剂(例如甘露糖醇)、稳定剂(例如L-甲硫氨酸、甘氨酸、精氨酸)、佐剂(透明质酸酶)。
本发明的组合物，例如Siglec 15或Siglec 15的调节剂，可呈多种形式。它们包括，例如液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液(如，可注射和可输注溶液)、微乳液、分散液、微脂体或悬浮液、片剂、丸剂、粉剂、微脂体和栓剂。优选形式根据预期给药方式和治疗应用而定。包含本文所述Siglec 15或Siglec 15的调节剂的药物组合物可配制用于施用至特定组织。例如，在特定实施方案中，可能需要给予Siglec 15或Siglec 15的调节剂至结缔组织、脑组织和/或多种器官中的肿瘤位点。
适用于本发明方法的Siglec 15和Siglec 15的调节剂可利用任何适当方式给药，包括胃肠外给药(例如注射、输注)，和可通过皮下、腹膜内、肺内及鼻内给药，和视需要用于局部治疗时，病灶内给药，例如，肿瘤内给药。胃肠外输注包括静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮内或皮下给药。此外，Siglec 15和Siglec 15的调节剂可适当地通过脉冲式输注给药，特别是以递减的剂量时。给药可通过注射给予，例如静脉内或皮下注射。可根据各种因素选择给药途径，给药是否是短期或长期的。可考虑其他给药方法，包括局部，特别是经皮、经黏膜、直肠、口服或局部给药，例如通过在接近所需位点布置的导管。注射，尤其是静脉内注射，是令人感兴趣的。
在一些实施方案中，本发明的方法包括给予受试者治疗有效量的本文所述的Siglec 15。在一些实施方案中，本发明的方法包括给予受试者治疗有效量的Siglec 15的调节剂。Siglec 15或Siglec 15的调节剂的治疗有效量是足以用于治疗受试者中的疾病例如自身免疫疾病或癌症的量。本文所述的Siglec 15或Siglec 15的调节剂的治疗有效剂量将随受试者而有些不同，且将取决于例如受试者的年龄、体重和状况以及递送途径的因素。这些剂量可根据本领域普通技术人员已知的程序确定。在示例实施方案中，Siglec 15拮抗剂的治疗有效量是在受试者中有效降低Siglec 15的水平或活性的量。在另一示例实施方案中，Siglec 15激动剂的治疗有效量是在受试者中有效增强Siglec 15的水平或活性的量。
在一个实施方案中，本文所述的治疗方法是在人类中进行。
IV.用于本发明方法中的Siglec 15调节剂
如上所述，降低Siglec 15的表达缩减肿瘤大小并延长具有脑肿瘤的小鼠的存活期，而降低Siglec 15的表达和/或活性使脑炎症恶化，表明Siglec 15在调控对癌症和炎症的免疫反应中作为免疫调节分子发挥关键性作用。因此，调节例如抑制或激活Siglec 15的表达和/或活性的分子，和/或调节例如抑制或激活Siglec 15结合伴体(例如MAG或LRRC4C)的表达和/或活性的分子在本发明的方法中均有用。示例的调节剂可调节例如抑制或促进Siglec 15和Siglec 15配体(例如，MAG、LRRC4C或Sialyl-Tn)之间的结合。抑制性调节剂(即，抑制剂)或激活调节剂(即，活化剂)可为核酸、多肽、抗体或小分子化合物。在一些实施方案中，抑制剂或活化剂在转录、mRNA稳定性、翻译、蛋白质稳定性/降解、蛋白质修饰和蛋白质结合水平上起作用。
A.抑制性调节剂
在一些实施方案中，用于本发明方法的调节剂是抑制性调节剂。在一些实施方案中，抑制性调节剂为小分子，例如Siglec 15的小分子抑制剂、Siglec 15结合配体(例如，MAG、LRRC4C和/或Sialyl-Tn)的小分子抑制剂。在其他实施方案中，用于本发明方法的抑制性调节剂是细胞内结合分子，其作用为特异性抑制Siglec 15和/或其结合配体(例如，MAG、LRRC4C和/或Sialyl-Tn)的表达、稳定性和/或活性。在其他实施方案中，抑制性调节剂为Siglec 15和/或其结合配体(例如MAG或LRRC4C)的拮抗剂抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抑制性调节剂为Siglec 15和/或其结合配体(例如MAG或LRRC4C)的重组融合蛋白。在其他实施方案中，Siglec 15融合蛋白是Siglec 15-Fc融合蛋白。在一些实施方案中，用于本发明方法的抑制性调节剂是核酸分子，其作用为特异性降低Siglec 15和/或其结合配体(例如MAG或LRRC4C)的表达、稳定性和/或活性。
本文所用的"细胞内结合分子"一词意欲包括通过结合于蛋白质或编码该蛋白质的核酸(例如mRNA分子)在细胞内起作用以抑制蛋白质的表达或活性的分子。
本发明的Siglec 15的调节剂也可调节，例如阻断，Siglec 15与结合配体之间的相互作用。在一些实施方案中，Siglec 15的结合配体选自MAG和LRRC4C。在一些实施方案中，该调节剂是在残基143处具有单一置换突变的突变体Siglec 15蛋白。在其他实施方案中，该调节剂是具有IgV结构域缺失的突变体Siglec 15蛋白。在一些实施方案中，Siglec15的调节剂结合Siglec 15的IgV结构域。在其他实施方案中，Siglec 15的调节剂结合Siglec 15的残基143。在一些实施方案中，Siglec 15的调节剂结合Siglec 15的配体(例如MAG或LRRC4C)中的区域，其中发生Siglec 15与其配体之间的相互作用。
i.抑制性核酸
在一个实施方案中，本文所述的方法包括使用抑制性核酸靶向Siglec 15和/或其结合配体(例如MAG或LRRC4C)。核酸抑制剂可编码靶向Siglec 15和/或其结合配体(例如MAG或LRRC4C)并抑制其表达或活性的小干扰RNA(例如，RNAi剂)。"RNAi剂"一词指具有与靶RNA的足够序列互补性以指导RNA干扰的RNA或其类似物。实例也包括可用于制备该RNA的DNA。
RNA干扰：RNA干扰(RNAi)指靶分子(例如靶基因、蛋白质或RNA)通过其下调的序列特异性或选择性的过程。通常，干扰RNA("RNAi")为导致特定mRNA的催化降解的双链短干扰RNA(siRNA)、短发夹型RNA(shRNA)或单链微RNA(miRNA)，且也可用于降低或抑制基因表达。RNA干扰(RNAi)为双链RNA(dsRNA)借以诱导动物和植物细胞中及细菌中的基因表达的序列特异性调控的过程(Aravin和Tuschl,FEBS Lett.26:5830-5840,2005；Herbert et al.,Curr.Opin.Biotech.19:500-505,2008；Sharp,Genes Dev.,15:485-490,2001；Valencia-Sanchez et al.Genes Dev.20:515-524,2006)。于哺乳动物细胞中，RNAi可由小干扰RNA(siRNA)的21-核苷酸(nt)双链体(Chiu et al.,Mol.Cell.10:549-561,2002)、由微RNA(miRNA)、功能性小发夹RNA(shRNA)或使用DNA模板和RNA聚合酶II或III启动子在体内表达的其他dsRNA触发(Zeng et al.,Mol.Cell 9:1327-1333,2002；Paddison et al.,GenesDev.16:948-958,2002；Denti,et al.,Mol.Ther.10:191-199,2004；Lee et al.,NatureBiotechnol.20:500-505,2002；Paul et al.,Nature Biotechnol.20:505-508,2002；Rossi,Human Gene Ther.19:313-317,2008；Tuschl,T.,Nature Biotechnol.20:440-448,2002；Yu et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(9):6047-6052,2002)。
siRNA分子："短干扰RNA"或"siRNA"(也为所谓"小干扰RNA")等词指RNA剂，优选长度约10至50个，优选为长度约15-25个核苷酸的双链剂，更优选长度约17、18、19、20、21、22、23、24、或25个核苷酸，该链任选具有包含例如1、2或3个突出端核苷酸(或核苷酸类似物)的突出端，其能够引导或介导RNA干扰。天然存在的siRNA是经由细胞的RNAi机制从较长(例如，长度大于25个核苷酸)的dsRNA分子产生。
一般而言，本文所述的方法可使用各链中包含16至30，例如16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的dsRNA分子，其中一链与mRNA中的靶区域基本上相同，例如至少80％(或80％以上，例如85％、90％、95％或100％)相同，例如，具有3、2、1或0个错配的核苷酸；且另一链与第一链互补。dsRNA分子可化学合成或可在体外或体内从DNA模板转录，例如shRNA。可使用本领域中已知的任何方法设计dsRNA分子。阴性对照siRNA不应与适宜基因组有显著的序列互补性。此类阴性对照可通过随机拼凑所选siRNA的核苷酸序列来设计；可进行同源检索以确保阴性对照缺少与适宜基因组中的任何其他基因的同源性。阴性对照siRNA可经由引入一或多个碱基错配至序列中来设计。
本文所述的方法可使用siRNA和修饰的siRNA衍生物二者，例如经修饰以改变性质(例如组合物的特异性和/或药代动力学，例如，增强体内的半衰期)的siRNA，例如，交联的siRNA。因此，本发明包括给予包含具有两个互补的核酸链的siRNA以使得两链交联的siRNA衍生物的方法。寡核苷酸修饰包括，但不限于，2'-O-甲基、2'-氟、2'-O-甲氧乙基和硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯、4'-硫代核糖(Wilson和Keefe,Curr.Opin.Chem.Biol.10:607-614,2006；Prakash et al.,J.Med.Chem.48:4247-4253,2005；Soutschek et al.,Nature 432:173-178,2004)。
在一些实施方案中，siRNA衍生物在其3'末端具有生物素分子(例如，光可切割生物素)、肽(例如，Tat肽)、纳米颗粒、肽模拟物、有机化合物(例如，染料如荧光染料)或树状聚合物。以此方式修饰的siRNA衍生物相较于对应的siRNA可增进细胞摄取或增强所产生siRNA衍生物的细胞靶向活性，可用于追踪细胞中的siRNA衍生物，或相较于对应的siRNA提高siRNA衍生物的稳定性。
抑制性核酸组合物可为未缀合的或可缀合于另一部分，例如纳米颗粒，以增强组合物的性质，例如，药代动力学参数如吸收、功效、生物利用度和/或半衰期。缀合可利用本领域中已知的方法，例如使用Lambert et al.,Drug Deliv.Rev.:47(1),99-112,2001；Fattal et al.,J.Control Release 53(1-3):137-43,1998；Schwab et al.,Ann.Oncol.5Suppl.4:55-8,1994；和Godard et al.,Eur.J.Biochem.232(2):404-10,1995的方法达成。抑制性核酸分子也可使用本领域中已知的任何方法标记；例如，核酸组合物可用荧光团(例如Cy3、荧光素或罗丹明)标记。可使用试剂盒[例如SILENCERTM siRNA标记试剂盒(Ambion)]进行标记。此外，siRNA可放射标记，例如使用3H、32P或其他适当的同位素。
siRNA递送：siRNA在盐水或其他赋形剂中的直接递送可沉默组织(例如眼、肺和中枢神经系统)中的靶基因(Bitko et al.,Nat.Med.11:50-55(2005)；Shen et al.,GeneTher.13:225-234(2006)；Thakker et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2004))。在成年小鼠中，siRNA的有效递送可利用"高压"递送技术，经由尾静脉快速注射(5秒钟内)大量含siRNA溶液至动物中而达成(Lewis,Nature Genetics 32:107-108,2002)。
脂质体和纳米颗粒也可用于递送siRNA至动物中。使用脂质体例如稳定的核酸脂质颗粒(SNALP)、基于二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)的递送系统以及例如Lipofectamine(脂质体)2000、TransIT-TKO的脂质体复合物(lipoplexes)的递送方法已显示有效地抑制靶mRNA(de Fougerolles,Human Gene Ther.19:125-132(2008)；Landen et al.,Cancer Res.65:6910-6918(2005)；Luo et al.,Mol.Pain 1:29(2005)；Zimmermann et al.,Nature 441:111-114(2006))。使siRNA缀合于肽、RNA适体、抗体或聚合物如动态多缀合物(dynamicpolyconjugates)、环糊精基纳米颗粒、去端肽胶原蛋白和几丁聚糖可增进siRNA稳定性和/或摄取(Howard et al.,Mol.Ther.14:476-484(2006)；Hu-Lieskovan et al.,CancerRes.65:8984-8992(2005)；Kumar,et al.,Nature 448:39-43；McNamara et al.,Nat.Biotechnol.24:1005-1015(2007)；Rozema et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104:12982-12987(2007)；Song et al.,Nat.Biotechnol.23:709-717(2005)；Wolfrum et al.,Nat.Biotechnol.25:1149-1157(2007))。
病毒介导的递送机制也可用于经由siRNA的表达诱导靶基因的特异性沉默，例如，通过产生携带在RNA Pol II启动子转录控制下的siRNA的重组腺病毒。通过这些重组腺病毒感染HeLa细胞容许减少内源性靶基因表达。注射重组腺病毒载体到表达siRNA的靶基因的转基因小鼠中导致体内靶基因表达的减少；同前(Id.)。在动物模型中，全胚胎电穿孔可有效地递送合成的siRNA到移植后小鼠胚胎中(Calegari et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(22):14236-40(2002))。
使用工程化RNA前体诱导RNAi：如本文所述被引入细胞或整个生物体中的工程化RNA前体导致期望siRNA分子的产生。这种siRNA分子接着与RNAi途径的内源性蛋白质组分结合，以结合并靶向用于切割、去稳定和/或翻译抑制破坏的特定mRNA序列。以此方式，被从工程化RNA前体产生的siRNA所靶向的mRNA将从细胞或生物体耗尽，导致细胞或生物体中由该mRNA编码的蛋白质浓度降低。
反义："反义"核酸可包括与编码蛋白质的"正义"核酸互补，例如与双链cDNA分子的编码链互补或与靶mRNA序列互补，的核苷酸序列。反义核酸可与靶序列的整个编码链或仅其部分(例如，靶基因的编码区)互补。于另一实施方案中，反义核酸分子与编码所选靶基因的核苷酸序列的编码链的"非编码区"(例如，5'和3'非翻译区)反义。
反义核酸可经设计以使其与靶mRNA的整个编码区互补，但也可为仅与靶mRNA的部分编码区或非编码区反义的寡核苷酸。举例而言，该反义寡核苷酸可与靶mRNA的翻译起始位点周围区域(例如所关注的靶基因核苷酸序列的-10与+10区域之间)互补。反义寡核苷酸的长度可为，例如，约7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80或更多个核苷酸。
本发明的反义核酸可使用本领域中已知的程序利用化学合成和酶连接反应构建。举例而言，反义核酸(例如，反义寡核苷酸)可使用天然存在的核苷酸或经设计以增强分子的生物稳定性或增强反义和正义核酸间形成的双链体的物理稳定性的多样修饰的核苷酸来化学合成，例如，可使用硫代磷酸酯衍生物及吖啶取代的核苷酸。反义核酸也可使用其中核酸已以反义定向亚克隆的表达载体(即，从插入的核酸转录的RNA具有与所关注靶核酸的反义定向，于下节中进一步叙述)以生物方式产生。
根据本文关于Siglec 15和/或其结合配体(例如MAG和LRRC4C)所公开的序列，本领域技术人员可容易地挑选并合成多种适当反义分子中的任一以依照本发明使用。举例而言，可制备包含跨越靶核酸长度的15-30个核苷酸的一系列寡核苷酸的"基因步移"，随后测试靶基因表达的抑制。视需要，可在寡核苷酸之间留下5至10个核苷酸的空隙以减少合成及测试的寡核苷酸数目。在一些实施方案中，反义分子靶向Siglec 15的IgV结构域。在其他实施方案中，反义分子靶向其中与Siglec 15发生相互作用的MAG或LRRC4C中的区域。在一些实施方案中，反义分子靶向跨越Siglec 15的残基143的区域。
本发明的反义核酸分子通常给予受试者(例如，通过直接注射于组织部位)，或于原位产生，以使其与编码靶蛋白的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或结合，从而抑制该蛋白质的表达，例如通过抑制转录和/或翻译。替代地，反义核酸分子可经修饰以靶向所挑的细胞，和然后全身性给药。为了全身性给药，可修饰反义分子以使其特异性结合于选择的细胞表面上表达的受体或抗原，例如通过连接该反义核酸分子至结合细胞表面受体或抗原的肽或抗体。反义核酸分子也可使用本文所述的载体递送至细胞。为了达到反义分子的足够细胞内浓度，可使用其中反义核酸分子置于强pol II或pol III启动子控制下的载体构建体。
CRISPR技术：可通过允许CRISPR复合体结合于多核苷酸改变靶多核苷酸(例如，Siglec 15和/或其结合配体如MAG和LRRC4C的DNA或RNA)的表达，其中该CRISPR复合体包含与靶多核苷酸内的靶序列杂交的引导序列复合的CRISPR酶，其中该引导序列连接至随之与反式激活(tracr)序列杂交的反式激活配对序列。在一些实施方案中，CRISPR复合体与靶多核苷酸的结合导致增强靶多核苷酸的表达。在另一实施方案中，CRISPR复合体与靶多核苷酸的结合导致降低靶多核苷酸(例如，Siglec 15和/或其结合配体如MAG和LRRC4C的DNA或RNA)的表达。
本发明包括成簇有规律间隔排列的短回文重复序列(CRISPR)技术作为用于产生具有可定制特异性的RNA指导核酸酶以供靶向基因组编辑的方法。由这些核酸酶介导的基因组编辑已用于在传统上对遗传操纵具有挑战性的各式各样生物医学上重要的细胞类型及生物体中迅速、容易且有效地修饰内源基因。
一般而言，"CRISPR系统"一词统称涉及CRISPR关联("Cas")基因的表达或指导其活性的转录和及其他/元件，包括编码Cas基因的序列、tracr(反式激活CRISPR)序列(例如，tracrRNA或活性的部分tracrRNA)、tracr配对序列(包括内源性CRISPR系统的情况中的"定向重复(direct repeat)序列"和tracrRNA加工的部分定向重复序列)、引导序列(在内源CRISPR系统的情况中也称为"间隔序列")或CRISPR基因座的其他序列和转录物。在本发明实施方案中，引导序列与引导RNA等词可互换使用。在一些实施方案中，CRISPR系统的一个或多个元件衍生自I型、II型或III型CRISPR系统。在一些实施方案中，CRISPR系统的一个或多个元件衍生自包含内源CRISPR系统的特定生物体，例如酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)。一般而言，CRISPR系统特征在于在靶序列位点处促进形成CRISPR复合体的元件(在内源CRISPR系统的情况中也称为前间隔序列(protospacer))。在形成CRISPR复合体的情况中，"靶序列"指引导序列设计为与其具有互补性的序列，其中靶序列与引导序列间的杂交促进CRISPR复合体的形成。靶序列可包含任何多核苷酸，例如DNA或RNA多核苷酸(例如，Siglec 15和/或其结合配体如MAG和LRRC4C的DNA或RNA)。在一些实施方案中，靶序列位于细胞的细胞核或细胞质中。
在本发明的优选实施方案中，CRISPR/Cas系统为II型CRISPR系统，且Cas酶为Cas9，其催化DNA切割。通过衍生自酿脓链球菌的Cas9或任何密切相关的Cas9的酶作用产生与引导序列的20个核苷酸杂交且在靶序列20个核苷酸后具有前间隔序列邻近基序(PAM)序列NGG的靶部位序列处的双链断裂。通过Cas9对于部位特异性DNA识别和切割的CRISPR活性由引导序列、部分地与引导序列杂交的tracr序列及PAM序列所限定。CRISPR系统的更多方面描述于Karginov和Hannon,The CRISPR system:small RNA-guided defense inbacteria and archae,Mol.Cell 2010,37(1):7中。
含有Cas9、Cas1、Cas2和Csn1四个基因的簇以及两个非编码RNA元件、tracrRNA及重复序列(定向重复序列)的特征性阵列的来自酿脓链球菌SF370的II型CRISPR基因座由短延伸的非重复序列(间隔序列，各约30个bp)所间隔。在此系统中，靶向的DNA双链断裂(DSB)以四个连续步骤产生。首先，从CRISPR基因座转录两个非编码RNA、pre-crRNA阵列和tracrRNA。其次，tracrRNA与pre-crRNA的定向重复序列杂交，其然后加工成含单个间隔序列的成熟crRNA。第三，成熟crRNA：tracrRNA复合体经由crRNA的间隔序列区与前间隔序列DNA之间的异双链的形成指引Cas9至由前间隔序列和对应PAM组成的DNA靶。最后，Cas9介导PAM上游靶DNA的切割以在前间隔序列内产生DSB。CRISPR系统的数个方面可进一步改进以增强CRISPR靶向的效率和通用性。最适Cas9活性可取决于高于在哺乳动物细胞核中存在的水平的游离Mg2+可利用性(参见例如Jinek et al.,2012,Science,337:816)，及对于紧接在前间隔序列下游的NGG基序的偏好限制靶向于人基因组中的平均每12个bp的能力。
前述抑制性核酸策略也可用于降低Sialyl-Tn的水平。举例而言，RNA干扰、siRNA分子、反义核酸和/或CRISPR技术可用于调节负责形成Sialyl-Tn的酶的表达水平。如本文所述，Sialyl-Tn是含有α-2,6连接于GalNAcα-O-Ser/Thr的唾液酸的截短O-聚糖。参与Sialyl-Tn合成的示例性的酶包括唾液酸转移酶ST6GalNAc1和COSMC(核心1β3-Gal-T-特异性分子伴侣蛋白)。涉及Sialyl-Tn产生的酶(例如唾液酸转移酶ST6GalNAc1或COSMC)的调节(例如，使用抑制性核酸)可用以降低体内或体外的Sialyl-Tn水平。
ii.拮抗剂抗体
本发明进一步涵盖包含抑制Siglec 15和/或其结合配体(例如，MAG、LRRC4C和/或Sialyl-Tn)的方法和组合物，从而降低Siglec 15的表达和/或活性并促进对抗癌症的免疫反应。
在一些实施方案中，Siglec 15和/或其结合配体(例如，MAG、LRRC4C和/或Sialyl-Tn)的拮抗剂抗体或其抗原结合部分降低Siglec 15和/或其结合配体(例如，MAG、LRRC4C和/或Sialyl-Tn)的表达和/或活性。
在一些实施方案中，Siglec 15的拮抗剂抗体和/或Siglec 15配体(例如，MAG、LRRC4C和/或Sialyl-Tn)的拮抗剂抗体或其抗原结合部分阻断Siglec 15与其结合配体(例如，MAG、LRRC4C和/或Sialyl-Tn)之间的相互作用。在一些实施方案中，Siglec 15和/或其结合配体(例如，MAG、LRRC4C和/或Sialyl-Tn)的拮抗剂抗体或其抗原结合部分结合于Siglec 15的IgV结构域。在其他实施方案中，Siglec 15和/或其结合配体(例如，MAG、LRRC4C和/或Sialyl-Tn)的拮抗剂抗体或其抗原结合部分结合于Siglec 15的残基143。在一些实施方案中，Siglec 15和/或其结合配体(例如，MAG、LRRC4C和/或Sialyl-Tn)的拮抗剂抗体或其抗原结合部分结合于其中发生Siglec 15与其配体间的相互作用的Siglec 15配体(例如，MAG、LRRC4C和/或Sialyl-Tn)中的区域。
在一个实施方案中，拮抗剂抗体或其抗原结合部分结合Siglec 15的细胞外表位。举例而言，拮抗剂抗体或其抗原结合部分可在负责Siglec 15与Siglec 15配体(例如，MAG、LRRC4C和/或Sialyl-Tn)之间的相互作用的细胞外表位处结合Siglec 15。这些抗体可部分或完全阻断Siglec 15与Siglec 15配体(例如，MAG、LRRC4C和/或Sialyl-Tn)之间的相互作用。在示例实施方案中，抗Siglec 15拮抗剂抗体或其抗原结合部分在包含残基143的表位处结合Siglec 15。在一个实施方案中，拮抗剂抗Siglec 15抗体不通过Siglec 15转导信号。在一个实施方案中，拮抗剂抗Siglec 15抗体诱导Siglec 15的胞吞作用。在另一实施方案中，拮抗剂抗Siglec 15抗体不诱导Siglec 15的胞吞作用。
可使用标准方法针对拮抗Siglec 15功能的能力筛选抗Siglec 15抗体。示例的抗Siglec 15拮抗剂抗体包括本文所述的S15m03和S15m02。衍生自S15m03或S15m02的抗体或其抗原结合片段也可作为Siglec 15拮抗剂用。举例而言，S15m03或S15m02的衍生物可为S15m03或S15m02的嵌合、人源化或人变体。S15m03或S15m02的示例衍生物包含S15m03或S15m02的一个、两个、三个、四个、五个或六个互补决定区(CDR)。举例而言，S15m03或S15m02的衍生物可包含S15m03或S15m02的重链和/或轻链CDR3。在另一实例中，S15m03或S15m02的衍生物可含S15m03或S15m02的重链和/或轻链CDR2。在另一实例中，S15m03或S15m02的衍生物可含S15m03或S15m02的重链和/或轻链CDR1。在另一实例中，S15m03或S15m02的衍生物可含S15m03或S15m02的重链和/或轻链CDR1、CDR2和CDR3。在优选实施方案中，S15m03或S15m02的衍生物维持S15m03或S15m02对Siglec 15的抗原结合特异性。
在一个实施方案中，抗Siglec 15抗体是2016年9月21日提出申请的美国专利临时申请No.62/397,794中阐述的抗体，该申请的全部内容并入本文以资参考。
可作为Siglec 15拮抗剂使用的其他示例抗Siglec 15抗体包括，但不限于，mAbA9E8(描述于US 9,447,192中)、mAb DS-1501(Daiichi Sankyo)、mAb 32A1(描述于US 8,575,316中)、mAb AB-25E9(Alethia Biotherapeutics)、mAb 25B8、mAb 25E6和mAb 25E9(描述于US 9,388,242中)。US 9,447,192、US 8,575,316和US 9,388,242的全部内容并入本文以资参考。其他示例抗Siglec 15抗体包括与前述抗Siglec 15抗体竞争结合的抗体，和/或结合Siglec 15中与前述抗Siglec 15抗体相同或重迭的表位的抗体。在一个实施方案中，Siglec 15拮抗剂不为mAb A9E8或其抗原结合片段。在另一实施方案中，Siglec 15拮抗剂不为mAb DS-1501或其抗原结合片段。在另一实施方案中，Siglec 15拮抗剂不为mAbAB-25E9或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，拮抗剂抗体或其抗原结合部分结合MAG的细胞外表位。举例而言，拮抗剂抗体或其抗原结合部分可在负责MAG与Siglec 15之间的相互作用的细胞外表位处结合MAG。这些抗体可部分或完全阻断MAG与Siglec 15之间的相互作用。在示例实施方案中，抗MAG拮抗剂抗体或其抗原结合部分在与Siglec 15的残基143相互作用的表位处结合MAG。在一个实施方案中，拮抗剂抗MAG抗体不经由MAG转导信号。
在一个实施方案中，拮抗剂抗体或其抗原结合部分结合LRRC4C的细胞外表位。举例而言，拮抗剂抗体或其抗原结合部分可在负责LRRC4C与Siglec 15之间的相互作用的细胞外表位处结合LRRC4C。这些抗体可部分或完全阻断LRRC4C与Siglec 15之间的相互作用。在示例实施方案中，抗LRRC4C拮抗剂抗体或其抗原结合部分在与Siglec 15的残基143相互作用的表位处结合LRRC4C。在一个实施方案中，拮抗剂抗LRRC4C抗体不经由LRRC4C转导信号。
在一个实施方案中，拮抗剂抗体或其抗原结合部分结合Sialyl-Tn。这些抗体可部分或完全阻断Sialyl-Tn与Siglec 15之间的相互作用。在示例实施方案中，抗Sialyl-Tn拮抗剂抗体或其抗原结合部分在与Siglec 15相互作用的表位处结合Sialyl-Tn。在一个实施方案中，拮抗剂抗Sialyl-Tn抗体不经由含Sialyl-Tn的多肽转导信号。
适用于本发明方法的拮抗剂抗体可通过本领域中已知的各种分析法鉴定、筛选(例如，使用噬菌体展示)或表征其物理/化学性质和/或生物活性(参见，例如，Antibodies:A Laboratory Manual,Second edition,Greenfield,ed.,2014)。抗体对其抗原的结合特异性可利用本领域中已知的方法例如ELISA、蛋白质印迹法或表面等离子体共振测试。
抗体可使用本领域中已知的重组方法和组合物产生，例如描述于美国专利No.4,816,567中的，将其并入本文以资参考。使用编码例如抗Siglec 15抗体的分离的核酸转化宿主细胞以供表达。此类核酸可编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在进一步实施方案中，提供一或多个包含此类核酸的载体(例如，表达载体)。在进一步实施方案中，提供包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如，用其转化)：包含编码含抗体VL的氨基酸序列及含抗体VH的氨基酸序列的核酸的载体，或包含编码含抗体VL的氨基酸序列的核酸的第一载体及包含编码含抗体VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或类淋巴细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。
为了重组产生抗Siglec 15抗体，分离编码抗体的核酸并插入一个或多个载体中以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类核酸可使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序。
用于克隆或表达抗体编码载体的适当宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。举例而言，可在细菌中产生抗体，特别是在不需要糖基化和Fc效应子功能时。关于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见，例如美国专利No.5,648,237、5,789,199和5,840,523。抗体可从可溶性部分中的细菌细胞糊状物分离并可进一步纯化。
除原核生物外，真核微生物例如丝状真菌或酵母是抗体编码载体的合适克隆或表达宿主，包括其糖基化路径已被"人源化"的真菌和酵母菌株，导致产生具有部分或完全人类糖基化模式的抗体。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)和Li et al.,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
用于表达糖基化抗体的适当宿主细胞也衍生自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定出许多可与昆虫细胞结合使用，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的杆状病毒株。
脊椎动物细胞也可作为宿主使用。举例而言，适应于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能有用。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例为通过SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7)；人胚肾细胞系(描述于，例如，Graham et al.,J.Gen Virol.36:59(1977)中的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠赛托利(sertoli)细胞(描述于，例如，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人子宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；描述于，例如，Mather et al.,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中的TR1细胞；MRC 5细胞；和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR.sup.-CHO细胞(Urlaub et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系如Y0、NS0和Sp2/0。对于适用于产生抗体的特定哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如Yazaki和Wu,Methods inMolecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,N.J.),pp.255-268(2003)。
iii.小分子抑制剂
可用于特异性抑制Siglec 15蛋白活性的其他抑制性调节剂为直接抑制Siglec15活性或抑制Siglec 15与其结合配体(例如，MAG、LRRC4C和/或Sialyl-Tn)之间的相互作用的化合物。此类化合物可为天然产物或组合化学文库的成员，且可使用如下文详述的筛选分析法鉴定。
在一些实施方案中，本发明的小分子抑制剂可阻断Siglec 15与其结合配体之间的相互作用。举例而言，该小分子抑制剂结合于Siglec 15的IgV结构域。在其他实施方案中，本发明的小分子抑制剂可结合于MAG、LRRC4C或Sialyl-Tn中与Siglec 15的IgV结构域相互作用的区域，从而阻断Siglec 15与其结合配体(例如，MAG、LRRC4C或Sialyl-Tn)间的相互作用。
在一些实施方案中，小分子抑制剂选择以结合与Siglec 15的结构域具有同源性的结构域。举例而言，本发明的小分子可针对与Siglec 15的IgV结构域至少50％相同、至少60％相同、至少70％相同、至少80％相同、至少90％相同或者至少95％或99％相同的结构域。如此的小分子能够结合可能在Siglec 15中的蛋白结构域，其功能上类似于例如Siglec15的IgV结构域。
本发明的小分子抑制剂也可结合于衍生自Siglec 15的IgV结构域的特定基序或共有序列，以允许该小分子抑制剂特异性地结合Siglec家族成员间共有的结构域。在另一实施方案中，本发明的小分子结合代表该蛋白质三维结构的蛋白质基序或共有序列。此类基序或共有序列不代表连续的氨基酸串，而是由Siglec 15三维折叠产生的非线性氨基酸排列(即，结构基序)。此类基序的实例是根据Siglec 15的IgV结构域设计的基序。此类基序与共有序列可根据本领域中已知的任何方法设计。
在一些实施方案中，小分子结合Siglec 15蛋白的特定序列，例如Siglec 15的残基143。
iv.融合蛋白或突变体蛋白
作为拮抗剂发挥作用并抑制Siglec 15活性的Siglec 15蛋白的变异体或Siglec15结合配体(例如MAG和LRRC4C)的变体可用于本发明方法中。举例而言，以与抗Siglec 15拮抗剂抗体类似的方式作为阻断蛋白质发挥功能的Siglec 15的Fc-融合蛋白可在本发明中用作抑制性调节剂。在示例实施方案中，该Siglec 15-Fc融合蛋白拮抗剂是可溶性Siglec 15-Fc融合蛋白。替代地，具有降低的对其配体的结合活性的Siglec 15突变体也作为用于本发明方法中的抑制性调节剂发挥作用。举例而言，具有残基143处的单一置换突变的Siglec 15突变体或无IgV结构域的Siglec 15突变体可在本发明中作为抑制性调节剂使用。
在一些实施方案中，Siglec 15的结合配体(例如，MAG和LRRC4C)的变体阻断Siglec 15与其结合配体之间的相互作用。在一些实施方案中，以与抗Siglec 15拮抗剂抗体类似的方式作为阻断蛋白质作用的MAG或LRRC4C的Fc-融合蛋白可在本发明中用作抑制性调节剂。在另一实例中，含Sialyl-Tn的蛋白质可通过结合和隔离Siglec 15而作为阻断剂发挥作用。替代地，对Siglec 15具有降低的结合活性的MAG或LRRC4C突变体也在本发明方法中作为抑制性调节剂发挥作用。举例而言，具有消除与Siglec 15IgV结构域的相互作用的突变的MAG或LRRC4C突变体可在本发明中作为抑制性调节剂使用。
用于本发明方法中的Siglec 15和/或其结合配体(例如，MAG或LRRC4C)的重组融合蛋白可根据本领域中已知的方法由重组载体产生。重组载体可包含以适合于宿主细胞中核酸表达的形式编码Siglec 15蛋白的核酸。在一些实施方案中，编码IgG的Fc结构域的核酸序列可在表达载体中可操作地连接编码受关注蛋白质(例如Siglec 15和/或其结合配体(例如，MAG和LRRC4C)或其功能性区段)的核酸分子。然后所产生的融合蛋白可经由本领域公认的方法，例如使用抗Fc抗体，容易地从细胞纯化。
在一些实施方案中，重组载体可包含根据用于表达的宿主细胞所选择的一个或多个调控序列，其可操作地连接于待表达的核酸序列(即，重组表达载体)。在重组表达载体内，"可操作地连接"意指受关注的核苷酸序列以容许该核苷酸序列表达的方式连接于调控序列(例如，在体外转录/翻译系统中或在将载体引入至宿主细胞时的宿主细胞中)。"调控序列"一词旨在包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多聚腺苷酸化信号)。此类调控序列描述于，例如，Goeddel,Methods in Enzymology:Gene Expression Technologyvol.185,Academic Press,San Diego,CA(1991)中。调控序列包括在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列的组成型表达的那些序列，及仅在特定宿主细胞中指导核苷酸序列的表达的那些序列(例如，组织特异性调控序列)。本领域技术人员应理解，表达载体的设计可取决于如待转化宿主细胞的选择、期望蛋白质的表达水平等的因素。本发明的表达载体可被引入宿主细胞中以由此产生由本文所述核酸编码的蛋白质或肽，包括融合蛋白或肽。
本发明的重组表达载体可经设计用于在原核(例如，大肠杆菌)或真核细胞(例如，使用杆状病毒表达载体的昆虫细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞)中表达多肽或其功能性片段。适当的宿主细胞可包括，但不限于，大肠杆菌细胞、芽孢杆菌细胞、酵母属细胞、毕赤酵母属(Pochia)细胞、NS0细胞、COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、骨髓瘤细胞或如本文所述的细胞。
本发明的另一方面涉及其中已引入本发明的重组载体的宿主细胞。"宿主细胞"和"重组宿主细胞"等词于本文中可互换使用。应理解，此类术语不仅意指特定受试者细胞，且也指此种细胞的后代或潜在后代。因为后继世代中可能由于突变或环境影响而发生某些修饰，所以此类后代事实上可能与亲本细胞不相同，但仍包括在本文所用术语的范围内。
载体DNA可经由常规的转化或转染技术引入原核或真核细胞中。本文所用的"转化"和"转染"等词意指用于引入外来核酸至宿主细胞中的多种本领域认可的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沈淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质转染或电穿孔。
v.Siglec 15衍生的肽
用于本发明方法中的抑制性调节剂是衍生自Siglec 15和/或其结合配体的氨基酸序列(例如，本文公开为SEQ ID NO：2、4和6的序列)的肽类化合物。特别地，抑制性化合物包含介导Siglec 15与结合配体(例如，MAG、LRRC4C或Sialyl-Tn)的相互作用的Siglec 15(或其模拟物)的一部分，以使Siglec 15与这种肽类化合物的接触竞争性地抑制Siglec 15与其结合配体(例如，MAG、LRRC4C或Sialyl-Tn)的相互作用。举例而言，衍生自包含IgV结构域中的氨基酸序列的Siglec 15的肽可用作抑制性调节剂。替代地，衍生自包含Siglec 15的残基143周围的氨基酸序列的Siglec 15的肽可用作抑制性调节剂。在其他实施方案中，衍生自包含其中发生与Siglec 15的相互作用的区域中的氨基酸序列的MAG或LRRC4C的肽可用作抑制性调节剂。
本发明的肽类化合物可通过将编码该肽的表达载体引入细胞内而在细胞中细胞内产生。此类表达载体可利用标准技术制造。该肽可作为与另一蛋白质或肽的融合体(例如，GST融合体)在细胞内表达。作为细胞中肽的重组合成的替代方案，可使用标准肽合成技术经由化学合成来制备肽。然后可通过本领域中已知用于将肽引入细胞中的多种方式(例如，脂质体等)将合成的肽引入细胞中。
B.刺激性调节剂
在一些实施方案中，用于本发明方法中的调节剂是刺激性调节剂，其增强Siglec15和/或其结合配体(例如，MAG、LRRC4C或Sialyl-Tn)的表达和/或活性，从而降低需要的受试者中的炎症。此类刺激性调节剂的实例包括蛋白质；核酸分子，例如，包含核酸分子的表达载体；及在细胞中刺激Siglec 15和/或其结合配体(例如，MAG、LRRC4C或Sialyl-Tn)的表达和/或活性的小分子。
本文所用的"核酸分子"一词旨在包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。该核酸分子可为单链或双链的，但优选为双链DNA。本发明方法中所用的核酸分子可使用标准分子生物学技术分离。在一些实施方案中，适用于本发明方法的刺激性调节剂是Siglec 15蛋白。举例而言，刺激性调节剂为全长Siglec 15蛋白、Siglec 15的功能性片段或Siglec 15的IgV结构域。刺激性调节剂促进Siglec 15与其结合配体(例如，MAG、LRRC4C或Sialyl-Tn)之间的相互作用。在其他实施方案中，适用于本发明方法的刺激性调节剂是编码Siglec 15蛋白的核酸分子。举例而言，使用标准分子生物学技术将cDNA(全长或部分cDNA序列)克隆至重组表达载体中，然后将该载体转染至细胞中。该cDNA可经由，例如，使用聚合酶链式反应(PCR)的扩增或经由筛选适当的cDNA文库获得。
在一些实施方案中，适用于本发明方法的刺激性调节剂是Siglec 15蛋白的结合配体，例如MAG、LRRC4C或Sialyl-Tn。刺激性调节剂促进Siglec 15与其结合配体之间的相互作用。在其他实施方案中，适用于本发明方法的刺激性调节剂是编码Siglec 15蛋白的结合配体(例如MAG和LRRC4C)的核酸分子。
在一些实施方案中，用于本发明方法的刺激性调节剂是起到特异性激活Siglec15和/或其结合配体(例如，MAG、LRRC4C或Sialyl-Tn)的表达、稳定性和/或活性的细胞内结合分子。本文所用的"细胞内结合分子"一词旨在包括在细胞内发挥作用以通过结合于蛋白质或编码该蛋白质的核酸(例如，mRNA分子)而增强蛋白质的表达或活性的分子。
在其他实施方案中，刺激性调节剂是Siglec 15和/或其结合配体(例如MAG或LRRC4C)的激动剂抗体或其抗原结合片段。Siglec 15和/或其结合配体(例如MAG或LRRC4C)的此类激动剂抗体可使用如本文所述的方法鉴定和产生。
在一个实施方案中，刺激性调节剂是Siglec 15融合蛋白。在示例实施方案中，该刺激性Siglec 15融合蛋白被固定在例如细胞上或固体支持物(例如，珠粒)上。举例而言，膜锚定的Siglec 15-Fc融合蛋白可增强Siglec 15或Siglec 15结合配体的活性，并可作为Siglec 15激动剂发挥作用。在另一实施方案中，激动剂是含有在FcR结合中的突变的Siglec-Fc融合蛋白。
在一些实施方案中，根据本文所述的CRISPR技术，刺激性核酸可用于激活Siglec15和/或其结合配体(例如MAG和LRRC4C)的表达和/或活性。
可用于特异性激活Siglec 15蛋白和/或其结合配体(例如，MAG、LRRC4C或Sialyl-Tn)的活性的其他刺激性调节剂为直接激活Siglec 15活性或促进Siglec 15和/或其结合配体(例如，MAG、LRRC4C或Sialyl-Tn)之间的相互作用的化合物。此类化合物可如下文所详述的使用对于此类化合物选择的筛选分析法加以鉴定。
V.筛选分析
影响Siglec 15活性的调节剂可是已知的(例如，干扰Siglec 15活性的抗体、或Siglec 15突变体蛋白)或可使用本文所述方法鉴定。本发明提供用于鉴定其他调节剂，即，调节Siglec 15的表达和/或活性的候选物或测试化合物或调节剂(例如，肽、小分子或其他药物)及用于测试或优化其他调节剂的活性的方法(在本文中也称为"筛选分析")。
在一些实施方案中，可鉴定结合Siglec 15和/或其结合配体，例如，MAG、LRRC4C或Sialyl-Tn，或对Siglec 15或其结合配体例如，MAG、LRRC4C或Sialyl-Tn的表达和/或活性具有刺激性或抑制性效应的分子。
在一个实施方案中，使用本发明的筛选分析测量化合物直接调节Siglec 15或其结合配体(例如，MAG、LRRC4C或Sialyl-Tn)的表达、翻译后修饰或活性的能力作为指标。
如通过本发明方法所鉴定的能够抑制Siglec 15或其结合配体(例如，MAG、LRRC4C或Sialyl-Tn)的表达、稳定性和/或活性的调节剂可用作用于治疗需要的受试者的癌症、缩减肿瘤大小或延长需要的受试者的存活期或者增强需要的受试者中对抗肿瘤的免疫反应的候选化合物。
如通过本发明方法所鉴定的能够增强Siglec 15或其结合配体(例如，MAG、LRRC4C或Sialyl-Tn)的表达、稳定性和/或活性的调节剂可用作用于治疗自身免疫疾病、或降低需要的受试者的炎症反应的候选化合物。
举例而言，在一方面中，本发明提供用于鉴定可用于治疗在受试者中的自身免疫疾病或癌症的化合物的方法。该方法包括提供测试化合物(或多种测试化合物)，测定该测试化合物对Siglec 15的表达和/或活性的影响，及选择调节Siglec 15的表达和/或活性的化合物，从而鉴定可用于治疗受试者的自身免疫疾病或癌症的化合物。在一些实施方案中，Siglec 15的表达和/或活性的增强指示该化合物可用于治疗自身免疫疾病。在其他实施方案中，Siglec 15的表达和/或活性的降低指示该化合物可用于治疗癌症。
在另一方面中，本发明提供用于鉴定可用于增强需要的受试者中对抗肿瘤的免疫反应的化合物的方法。该方法包括提供测试化合物(或多种测试化合物)，测定该测试化合物对Siglec 15的表达和/或活性的影响，及选择降低Siglec 15的表达和/或活性的化合物，从而鉴定可用于增强受试者中对抗肿瘤的免疫反应的化合物。
在又另一方面中，本发明提供用于鉴定可用于降低需要的受试者中的脑炎症反应的化合物的方法。该方法包括提供测试化合物(或多种测试化合物)，测定该测试化合物对Siglec 15的表达和/或活性的影响，及选择增强Siglec 15的表达和/或活性的化合物，从而鉴定可用于降低受试者的脑炎症反应的化合物。
调节剂、候选化合物或测试化合物的实例包括，但不限于，核酸(例如，DNA和RNA)、碳水化合物、脂质、蛋白质、肽、拟肽物、小分子和其他药物。调节剂可使用本领域中已知的组合文库(combinatorial library)方法中的许多途径的任一种获得，其包括：生物文库；空间定址(spatially addressable)的平行固相或液相文库；需要解卷积(deconvolution)的合成文库法；"一珠一化合物(one-bead one-compound)"文库方法；及使用亲和层析选择的合成文库方法。生物文库方法限制于肽文库，而其他四种方法适用于肽、非肽寡聚物或化合物的小分子文库(Lam(1997)Anticancer Drug Des.12:145；美国专利No.5,738,996；和美国专利No.5,807,683；前述各参考文献的全部内容均并入本文以资参考)。
用于合成分子文库的方法的实例可于本领域中找到，例如在DeWitt et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6909；Erb et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:11422；Zuckermann et al.(1994)J.Med.Chem.37:2678；Cho et al.(1993)Science261:1303；Carrell et al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059；Carell et al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061；和Gallop et al.(1994)J.Med.Chem.37:1233中；前述各参考文献的全部内容均并入本文以资参考。化合物文库可，例如，呈现于溶液中(例如，Houghten(1992)Bio/Techniques 13:412-421)、或在珠粒上(Lam(1991)Nature354:82-84)、芯片上(Fodor(1993)Nature 364:555-556)、细菌上(美国专利No.5,223,409)、孢子上(美国专利No.5,571,698；5,403,484；和5,223,409)、质粒上(Cull et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1865-1869)或噬菌体上(Scott和Smith(19900Science 249:386-390；Devlin(1990)Science 249:404-406；Cwirla et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6378-6382；和Felici(1991)J.Mol.Biol.222:301-310)。前述各参考文献的全部内容均并入本文以资参考。
测试化合物可与表达Siglec 15蛋白或与Siglec 15直接相互作用的分子(例如，MAG或LRRC4C)的细胞接触。举例而言，可以通过引入编码蛋白质的表达载体至细胞中使测试化合物与天然表达或经工程化以表达该蛋白质的细胞接触。
替代地，测试化合物可经受包括蛋白质的无细胞组合物(例如，细胞提取物或包含例如纯化的天然或重组蛋白质的组合物)。
调节Siglec 15或Siglec 15的结合配体(例如，MAG、LRRC4C或Sialyl-Tn)的表达和/或活性的化合物可使用各种"读出装置"鉴定。
举例而言，细胞可以用表达载体转染，在测试化合物存在或不存在下孵育，且可测定化合物对Siglec 15的表达或对由Siglec 15调控的生物反应的影响。Siglec 15的生物活性包括根据标准技术在体内或体外测定的活性。活性可为直接活性，例如与结合配体(例如，MAG、LRRC4C或Sialyl-Tn)的结合。或者，活性为间接活性，例如脑炎症反应的增强。
为了确定测试化合物是否调节Siglec 15蛋白表达，可进行体外转录分析。为了确定测试化合物是否调节Siglec 15 mRNA表达，可进行各种方法，例如定量或实时PCR。
多种报导基因是本领域中已知的，并适用于本发明的筛选分析中。适当的报导基因的实例包括编码氯霉素乙酰转移酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、绿色荧光蛋白或荧光素酶的那些。用于测量这些基因产物的活性的标准方法是本领域中已知的。
多种细胞类型适合在筛选分析中用作指示细胞(indicator cell)。优选地使用表达低水平内源性Siglec 15且然后工程化以表达重组蛋白质的细胞系。用于所述分析法中的细胞包括真核细胞。举例而言，在一个实施方案中，细胞为真菌细胞，例如酵母细胞。在另一实施方案中，细胞为植物细胞。在又另一实施方案中，细胞为脊椎动物细胞，例如，鸟类细胞或哺乳动物细胞(例如，鼠细胞或人细胞)。
可用于表达例如Siglec 15的重组表达载体为本领域中已知的。举例而言，使用标准分子生物学技术，将cDNA首先引入重组表达载体中。cDNA可，例如，通过使用聚合酶链式反应(PCR)扩增或通过筛选适当的cDNA文库而获得。在涉及的信号转导途径(例如，人、鼠和酵母)中的cDNA的核苷酸序列或分子为本领域中已知的，且可用于设计容许通过标准PCR方法扩增cDNA的PCR引物或用于设计可用于使用标准杂交方法筛选cDNA文库的杂交探针。
在另一实施方案中，测试化合物可经受包含蛋白质的无细胞组合物(例如，细胞提取物或包含例如纯化的天然或重组蛋白质的组合物)。在宿主细胞或培养基中通过重组方法表达的Siglec 15可使用用于蛋白质纯化的标准方法从宿主细胞或细胞培养基分离。举例而言，可使用离子交换色谱、凝胶过滤色谱、超滤、电泳和使用抗体的免疫亲和纯化以产生可用于无细胞组合物中的纯化或半纯化蛋白。替代地，可制备表达受关注蛋白质的细胞溶解产物或提取物以用作无细胞组合物。
在一个实施方案中，在涉及Siglec 15的信号转导途径中特异性地调节Siglec 15活性或结合配体的活性的化合物是根据其调节Siglec 15与其结合配体的相互作用的能力而鉴定。结合配体可为mRNA分子或蛋白质分子，例如，MAG或LRRC4C。容许检测蛋白质-蛋白质相互作用(例如，免疫沉淀、双杂交分析法等)或容许检测Siglec 15与mRNA的相互作用(例如，电泳迁移率变化分析、DNAse I足迹分析法等)的适当分析法为本领域中已知的。通过在测试化合物存在及不存在下进行此类分析时，这些分析可用于鉴定调节(例如，抑制或增强)Siglec 15与结合配体的活性的化合物。
在所述筛选分析中所鉴定的化合物可用于调节通过Siglec 15调控的一个或多个生物反应的方法中。可理解的是，可能希望的是此类化合物与细胞接触之前将其配制为如本文所述的药物组合物。
一旦通过上文中叙述的多种方法之一鉴定直接或间接调节例如Siglec 15的表达或活性的测试化合物，则然后可进一步评估所选测试化合物(或"关注的化合物")对细胞的影响，例如通过在体内(例如，施用关注化合物于生物体)或在活体外(例如，通过使细胞与生物体分离并使该分离的细胞与关注化合物接触或，替代地，使关注化合物与细胞系接触)而使关注化合物与细胞接触，并测定关注化合物与适当对照组(例如未处理的细胞或用不调节生物反应的对照化合物或载剂处理的细胞)相比的对细胞的影响。
在另一方面中，本发明涉及本文所述的二个或更多个分析的组合。举例而言，可使用基于细胞或无细胞分析法鉴定调节剂，且可在体内，例如，在动物中(例如在动物模型，例如神经母细胞瘤肿瘤模型的动物模型中)证实调节剂增强或降低Siglec 15或Siglec 15与其相互作用的蛋白质的活性的能力。
此外，如本文所述鉴定的Siglec 15的调节剂或涉及Siglec 15的信号传导途径中的分子(例如，反义核酸分子或特异性抗体或小分子)可用于动物模型中以确定使用这种调节剂的治疗的功效、毒性或副作用。替代地，如本文所述鉴定的调节剂可用于动物模型中以确定这种调节剂的作用机制。
在另一实施方案中，应理解的是，类似的筛选分析可用于鉴定间接调节Siglec 15的活性和/或表达的化合物，例如，通过使用Siglec 15与其相互作用的分子(例如，MAG、LRRC4C或Sialyl-Tn，或在该途径中Siglec 15的上游或下游发挥作用的任何分子)进行筛选分析，例如上述那些筛选分析。
如本文所述，通过本发明筛选分析所鉴定的化合物被认为是可用于治疗疾病例如癌症或自身免疫疾病的候选治疗化合物。因此，本发明也包括在筛选分析法中鉴定的化合物，及用于其施用和用于治疗、预防或延迟本文所述疾病的形成或进展的方法。
应理解的是，本发明不限于所述的特定分析方法或者测试剂和实验条件，因为这些方法和试剂可变化。也应理解的是，本文所用的术语仅为达到说明特定实施方案的目的而不旨在构成限制。
通过以下实施例进一步说明本发明，其不意图以任何方式构成限制。整个本申请中引用的所有参考文献、专利和公布的专利申请以及附图的全部内容特此并入本文以资参考。
实施例
实施例1.通过基因组规模T细胞活性阵列技术鉴定Siglec 15
为了进行免疫疗法靶标的人全基因组检索，开发了基因组规模的T细胞活性阵列(GS-TCAA)。使用凯杰(Qiagen)微量制备试剂盒制备涵盖90％的人类膜基因组的6402个人类膜cDNA，定量并稀释用于GS-TCAA构建。
将含四个1536孔培养板的一组人受体阵列离心(600g，2分钟)，随后反转染。简言之，使用机器人分配器(Multidrop Combi，Thermo Scientific)，在1536孔阵列培养板分配每孔2μl含脂质体3000(7μl lipo/ml)的optiMEM，并通过超速回转式振荡器迅速振荡1分钟。在室温下所有培养板储存20分钟，随后通过Multidrop添加293T.2A.m.抗CD3细胞用于T细胞刺激(每孔4μl中的2000个细胞)。之后，将平板进一步离心(1000g，4分钟)以在37℃下进行孵育之前去除各孔内的气泡。转染24小时后，将T细胞报道细胞或原代T细胞(4000个细胞)，例如具有不同GFP报道基因的工程化Jurkat细胞系，加载至阵列平板中。在共培养T细胞和293T基T细胞刺激剂后12小时，利用InCell图像分析仪(GE)进行平板成像(plateimaging)。使用Cellprofiler软件进行最适成像分析后，鉴定具有潜在调控功能的候选基因。例如，如果分子不能有效地调节T细胞活性，GFP信号保持相似。如果该分子起到对T细胞活性的刺激信号的作用，则将检测到相对较强的GFP信号。替代地，如果该分子为抑制性，将观察到弱得多的GFP信号。根据基因组规模的T细胞活性阵列，鉴定Siglec15为免疫调节剂，表明Siglec 15可具有免疫功能。
实施例2.Siglec 15的脑和骨髓相关表达
使用RT-PCR连同小鼠cDNA文库(Clontech Laboratories)评估在不同小鼠组织中的Siglec 15表达。使用Siglec 15质粒(Origene)作为阳性对照。结果示于图1A。人组织中Siglec 15RNA表达的微阵列分析(BioGPS.org)示于图1B。此数据指示，在正常条件下，Siglec 15在人和小鼠两者的脑和骨髓相关细胞中表达。来自BioGPS的微阵列数据呈现在图1C中，证明Siglec 15在单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、B细胞和破骨细胞上表达。因此，Siglec 15可能在脑相关的疾病和/或免疫反应的调节中具有生理功能。
实施例3.Siglec 15在癌症中的表达
使用TCGA癌症微阵列数据库进行人癌症中Siglec 15表达的荟萃分析。将Siglec15mRNA在许多人类癌症中的表达与正常组织对应物进行比较(图2)。使用UCSC CancerGenomics Browser软件(https://genome-cancer.ucsc.edu)对原始数据集标准化，并使用R程序进行分析。此数据表明，Siglec 15在许多人类癌症中过表达，并可能在癌症发育和进展中起作用。
也评估在数种人类癌症细胞系中的Siglec 15表达。通过NCI60微阵列(BioGPS)测定人类癌症细胞系中的Siglec 15表达(图3A，表达值以任意单位显示)。用抗Siglec 15抗体m03进行数种人类癌症细胞系的染色。抗体m03通过用小鼠Siglec15胞外结构域融合蛋白免疫NZB/W F1小鼠产生，并与人Siglec 15交叉反应。使用FACS分析经染色细胞的Siglec15表达(图3B)。此数据表明，在人类肿瘤细胞系中Siglec 15也被上调。
实施例4.通过受体阵列技术鉴定MAG或LRRC4C为Siglec 15的配体
为了鉴定Siglec 15的配体，通过融合各分子的细胞外结构域与小鼠或人Fc标签产生Siglec 15-Fc融合蛋白(Dong H,et al.,Nat Med.1999；5(12):1365-9)，并在新建立的基因组规模人受体阵列中进行筛选(Yao,S et al.,Immunity 2011,34(5):729-40)。简言之，收集、维持和用OPTI-MEM培养其稀释含超过6,200个基因的完整人类膜基因文库，并通过机器人系统以每孔40ng单独地置于四个1,536孔平板中。在各孔添加脂质体2000并与质粒混合30分钟。接着，在各孔添加2000个HEK293T细胞以进行瞬时转染。转染8小时后，在各孔添加10ng人Siglec 15-Fc和抗Fc FMAT蓝二抗。转染24小时后，使用AppliedBiosystems 8200细胞检测系统读取平板，并使用CDS 8200软件分析。用人Fc受体基因作为该分析的内部阳性对照。
对于Siglec 15的配体鉴定两个阳性命中(positive hit)：髓鞘相关糖蛋白(MAG)和含富亮氨酸重复序列的4C(LRRC4C)(图4A)。MAG，也称为Siglec 4，主要在脑中发现并参与神经元髓鞘形成。它也存在于骨髓细胞中，尤其是小神经胶质细胞中。MAG基因敲除(KO)小鼠具有胞吞作用的问题。LRRC4C为与神经元相关生长、树突形成和轴突延伸相关的LRR家族分子。LRRC4C主要定位于兴奋性突触的突触后侧，并与突触前配体，轴突生长诱向因子-G1，相互作用以调控兴奋性突触形成。MAG表达显示在脑或脑相关肿瘤中富集(图5)；且在如脑癌、乳腺癌、卵巢癌、肾细胞癌和Ewing氏肉瘤的数种癌症中，LRRC4C mRNA水平也上调(图6)。先前已报道，Siglec 15与Sialyl-Tn相互作用。为证实此观察，使用Octet链霉亲和素生物传感器(ForteBio)测量Sialyl-Tn抗原Neu5Acα2-6GalNAc与Siglec 15融合蛋白(Siglec15-mIg)的结合。用NeuAa-2-6GalNac-生物素(Glycotech，50μg/ml)预加载该Octet链霉亲和素生物传感器，并测定对Siglec15-mIg或对照mIg(从100μg/ml开始的2倍系列稀释)随时间的反应(图4B)。在许多人与小鼠癌症中已证明Sialyl-Tn表达。因此，Sialyl-Tn可以是用作Siglec15的配体/受体的另外的结合伴体。
通过流式细胞术分析进一步证实Siglec 15与MAG或LRRC4C之间相互作用的特异性。用于流式细胞术染色的所有抗体购自BD Bioscience(San Jose,CA)或eBioscience(San Diego,CA)。Siglec 15融合蛋白牢固地结合用MAG或LRRC4C转染的HEK293T细胞，但不与对照细胞结合，且包括抗Siglec15mAb完全阻断此相互作用。事实上，Siglec 15与MAG或LRRC4C之间的相互作用在小鼠和人之间是高度保守的。如图4A中所显示，人Siglec 15可结合人与小鼠MAG两者，且小鼠Siglec 15也可以识别小鼠与人LRRC4两者，表明跨物种相互作用。
实施例5.Siglec 15对于MAG和LRRC4C的结合结构域的鉴定
为了确定Siglec 15对于MAG或LRRC4C的结合结构域，构建和纯化具有结构域缺失的Siglec 15突变体。Siglec 15包含细胞内结构域、跨膜结构域、IgC结构域和IgV结构域。通过类似先前描述的PCR方法制备人或小鼠Siglec 15(Sedy JR,et al.,NatImmunol.2005；6(1):90-8)。Siglec 15点突变根据先前的出版物选择和使用PCR产生(Cheung TC,et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.2005；102(37):13218-23；Compaan DM,et al.,J Biol Chem.2005；280(47):39553-61)。如图7所示，IgV结构域从Siglec 15的缺失完全消除其与MAG和LRRC4C的相互作用。此外，IgV结构域的残基143处的点突变(R143A突变)能够消除Siglec 15与MAG或LRRC4C之间的相互作用，表明Siglec 15的IgV结构域为与MAG或LRRC4C的相互作用所必需的，更具体而言，该相互作用涉及IgV结构域中的R143残基。
实施例6.Siglec 15直接抑制T细胞活性
为了测定Siglec 15对人T细胞活性的影响，用固定的抗CD3抗体(范围0.03μg/ml至1μg/ml)和固定的人Siglec15-mIgG融合蛋白(S15-mIg)或对照小鼠IgG(mIg)(5μg/ml)刺激人PBMC达72小时。16小时后，分析增殖的T细胞中的3H胸腺嘧啶核苷掺入(图8A)。暴露于S15-mIg的细胞具有显著降低的3H胸腺嘧啶核苷掺入水平，表明与作为配体的Siglec 15接触降低T细胞的增殖。
通过融合编码抗人CD3抗体OKT3的scFv片段的核酸与编码CD14的核酸产生膜相关OKT3表达构建体。将此构建体转染至293T细胞中以产生293T.m.OKT3细胞，其在细胞表面上表达OKT3 scFv。使JurkatNF-AT荧光素酶报道细胞与过表达模拟(Mock)质粒、全长FASLG(Fas配体)、LRRC4C、Siglec 15或编码具有B7-H6跨膜结构域的Siglec15胞外结构域的基因(Siglec15ATM)的293T.m.OKT3细胞共培养12小时；在共培养后4小时，监测荧光素酶活性(图8B)。在此系统中，相较于模拟质粒，FASLG的过表达几乎消除NF-AT信号。此外，我们观察到Siglec15全长或Siglec15ATM表达可类似地显著抑制NF-AT荧光素酶信号。
前述实验显示，作为配体发挥作用的人Siglec 15可抑制T细胞活性。
为了证实鼠Siglec 15类似地抑制鼠T细胞的活性，在暴露于鼠Siglec 15后分析小鼠脾细胞中的3H胸腺嘧啶核苷掺入。用固定化抗CD3(范围0μg/ml至2μg/ml)刺激小鼠脾细胞，并暴露于固定化或可溶性小鼠Siglec15-mIgG融合蛋白(S15-mIg)或对照小鼠IgG(mIg)(5ug/ml)达72小时。16小时后分析增殖T细胞中的胸腺嘧啶核苷掺入。暴露于固定化Siglec15-mIgG的细胞中的胸腺嘧啶核苷掺入显示于图9A中。暴露于可溶性Siglec15-mIgG的细胞中的3H胸腺嘧啶核苷掺入显示于图9B。暴露于鼠S15-mIg的细胞具有减少的3H胸腺嘧啶核苷掺入水平，表明与Siglec 15配体的接触减少小鼠脾细胞的增殖。
用编码与OVA肽(SIINFEKL)融合的H2-Kb的质粒转染293T细胞以产生293T-Kb-OVA细胞。然后，用编码全长Siglec 15的慢病毒载体感染该细胞以产生293T-Kb-OVA-S15细胞。通过FACS筛选，分离具有可变Siglec 15表达的数种细胞系。对于识别H-2kb OVA SIINFEKL肽的OVA特异性TCR转基因的OT-1小鼠获自杰克逊实验室(The Jackson Laboratory)。来自OT-1转基因小鼠的脾细胞用SIINFEKL肽加IL-2预活化3天。然后，使活化细胞与过表达全长小鼠Siglec 15(KbOVA-S15)或模拟转染对照(KbOVA-对照)的293T-KbOVA细胞共培养3天。16小时后，分析增殖T细胞中的3H胸腺嘧啶核苷掺入(图9C)。293T-KbOVA细胞的情况下，暴露于Siglec 15的脾细胞具有降低的3H胸腺嘧啶核苷掺入水平，表明与细胞基Siglec 15的接触减少小鼠脾细胞的增殖。
如通过用抗Siglec15抗体m03染色后的FACS分析所示的，在过表达小鼠Siglec15的3个293T-KbOVA细胞系上鉴定小鼠Siglec15表达的不同水平(图9D)。如上所述，来自OT-1转基因小鼠的脾细胞用SIINFEKL肽和IL-2预活化。然后，活化的脾细胞与如图9D中所示具有增强的Siglec15表达水平的293T-KbOVA细胞系共培养3天。通过流式微珠阵列(CBA)(BDPharmingen)测量上清液中的IFN-γ水平(图9E)与TNF-α水平(图9F)。IFN-γ与TNF-α的产生随Siglec 15表达的水平增加而减少，指示Siglec 15以剂量依赖性的方式抑制T细胞功能。
实施例7.细胞相关的Siglec 15降低T细胞细胞毒性
使用基于粘附性的细胞毒性分析检验Siglec15对T细胞的细胞毒性的影响和与肿瘤杀伤的相关性。
以104个细胞/孔的密度将293T-KbOVA靶细胞置于384E-平板(ACEA Biosciences)中并生长过夜。粘附于平板的细胞产生增强的电信号。如果保持未受干扰，该电信号将随时间增强，和然后由于细胞的过度生长而下降。为了测试此系统中抗原特异性T细胞的作用，使293T-KbOVA靶细胞与不同比率的预活化OT-1T细胞(范围0：1至2：1)共培养。随时间生长的靶细胞的粘附信号显示于图10A。观察到关于293T-KbOVA靶细胞的OT-1T细胞杀伤水平的剂量反应关系。分析中存在的OT-1T细胞：293T-KbOVA靶细胞的比率越高，则检测到的信号越低，指示随着OT-1T细胞的量增加，检测到更少的活293T-KbOVA靶细胞。
在此系统中，在不同比率的OT-1T细胞的存在下，具有Siglec15过表达的靶细胞(293T-KbOVA-S15)的T细胞杀伤与Siglec 15阴性的靶细胞(293T-KbOVA-对照)的T细胞杀伤进行比较。T细胞不存在(比率0：1)下，过表达Siglec15的293T-KbOVA细胞的信号比对照细胞弱。然而，在T细胞存在(比率1：1或2：1)下，过表达Siglec15的细胞产生较强的信号，这指示对T细胞杀伤的抗性(图10B)。此数据表明细胞相关的Siglec 15(例如，表达Siglec 15的肿瘤细胞上)可赋予细胞对T细胞细胞毒性的抗性。
实施例8.缺乏Siglec 15引起增强的T细胞反应
根据图11A的时间表，使野生型(WT)或Siglec15全体敲除(KO)小鼠静脉内(i.v.)接受得自OT-1/RagKO小鼠的脾细胞。简言之，小鼠在第-1天接受2×106个脾细胞，并在第0天用100μg OVA肽加上100μg聚i:c腹膜内(i.p.)加强。评估第4天的血液中及第5天的脾脏中OT-1细胞相对于总CD8T细胞群体的百分比(图11B)。使用OT-1四聚体通过FACS染色测定OT-1细胞的百分比。
相较于WT小鼠，Siglec 15 KO小鼠血液与脾脏中的抗原特异性CD8T细胞的百分比增加。此结果表明，移除Siglec 15的抑制性作用容许T细胞更强烈地响应于抗原激发。
如图11A所示，第-1天将OT-1T细胞注射至WT或S15KO小鼠中，随后在第0天进行肽刺激。第0天开始，用饮水中的5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)(0.8mg/ml)饲养小鼠，每两天更换。第5天通过抗EdU染色分析血液OT-1细胞的增殖，并计算为EdU阳性OT-1细胞/总OT-1阳性细胞的百分比(图11C)。也在无刺激的情况下分离脾脏细胞和培养过夜，并针对膜联蛋白V染色。通过膜联蛋白V-阳性OT-1细胞/总OT-1阳性细胞计算细胞凋亡(图11D)。
实施例9.骨髓来源的Siglec 15在体内主要负责Siglec 15的功能
为了确认负责Siglec15反应的细胞群体，开发了巨噬细胞特异性Siglec15敲除小鼠(LysM-Cre KO)，其允许分析哪些细胞表达Siglec15并抑制T细胞。使购自MMRRC(突变小鼠资源和研究中心)(品系B6.Cg-Siglec15tm1.1Cfg/Mmucd；参考号MMRRC:032723-UCD)的Siglec 15条件敲除小鼠与LysM-Cre小鼠(Jax Labs)回交，以产生LysM-Cre Siglec 15敲除小鼠。这些小鼠随后与C57BL6小鼠回交超过6代，然后进行实验。
使用实施例8中描述的OT-1T细胞转移系统比较Siglec 15全体基因敲除小鼠(KO)与巨噬细胞特异性Siglec 15敲除小鼠(LysM-Cre KO)中OT-1T细胞的扩增。在不同时间点收集血液，并测定总CD8 T细胞群体中OT-1细胞的百分比(图12A)。OT-1T细胞的扩增对于WT在第3天达到峰值，且两种类型的KO小鼠则稍后。收缩期，即T细胞在其初始扩增后的收缩时期，在两种KO模型中皆维持较高，表明在缺少Siglec15抑制的情况下，T细胞维持在较高数量。Siglec15全体KO与LysM-Cre KO表现相似，表明巨噬细胞可能主要负责Siglec 15分子的抑制性作用。在OT-1T细胞反应期间，也评估全体KO与LysM-Cre KO小鼠的血浆中的IL-10水平，并与野生型相比较(图12B)。相对于野生型，确认在全体KO与LysM-Cre KO小鼠血浆中IL-10的较低水平。
实施例10.缺乏Siglec 15对内源性免疫细胞池具有很小影响
为了确定基因敲除小鼠中Siglec 15缺乏是否影响内源性免疫细胞池的组成，测定11月龄的野生型(WT)与Siglec 15基因敲除(S15KO)小鼠血液中的骨髓、CD8或CD4群体的百分比(图13)。
这些数据显示，尽管在Siglec 15KO小鼠中抗原特异性T细胞反应显著增强，但此类小鼠在正常条件下无明显的遗传性免疫表型(骨髓免疫细胞或T细胞)。此发现表明Siglec15可能以表达和/或功能性的诱导模式进行运作。
实施例11.细胞基Siglec 15抑制巨噬细胞反应
在不同剂量LPS存在下，使小鼠腹膜巨噬细胞与过表达模拟质粒(对照)、全长LRRC4C或Siglec 15的293T细胞共培养24小时。利用流式微珠粒阵列(CBA)(BDPharmingen)测量上清液中的细胞因子水平。当巨噬细胞与过表达Siglec 15的细胞共培养时，巨噬细胞的IL-6、TNF-α和TGF-β1产生下降(图14)。此数据指示细胞基Siglec 15直接抑制骨髓细胞反应。因此，作为配体，Siglec 15可通过骨髓细胞和T细胞两者发挥作用以对免疫系统施加抑制性活性。
实施例12.EAE小鼠中阻断Siglec 15与MAG或LRRC4C之间的相互作用的效应
为了确定Siglec 15与MAG或LRRC4C之间的相互作用在调控脑炎性疾病中的作用，使用实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的小鼠模型。EAE为脑炎和脱髓鞘的炎性模型，其影响脊髓和脑而导致麻痹。该EAE模型被广泛用作人炎性脱髓鞘疾病多发性硬化症(MS)的模型。麻痹的程度可通过EAE评分量化。
简言之，雌性C57BL/6小鼠(6至10周龄)是购自美国国家癌症研究院，NIH(Frederick,MD)。在第0天，用在完全弗氏佐剂(CFA)(Difco)中乳化的100μg MOG肽(35-55)对8至12周龄C57BL/6小鼠进行皮下免疫以诱导EAE。在第0天和第2天，注射在200μl PBS中的400ng百日咳毒素(Sigma)两次。在第7天和第10天，各小鼠用200μgSiglec 15mAb(S15m02、S15m03)或对照抗体或所示的融合蛋白腹膜内注射。通过用小鼠Siglec 15-Ig融合蛋白免疫NZB/W F1小鼠产生小鼠抗小鼠Siglec 15mAb。所有融合蛋白通过融合各分子的细胞外结构域与小鼠或人Fc标签而产生(Dong H,et al.,Nat Med.1999；5(12):1365-9)。
疾病严重程度如先前所述(Stromnes IM,et al.,Nature protocols.2006；1(4):1810-9)依照下述标准评分：0，无疾病；1，尾部麻痹；2，下肢轻瘫；3，截瘫；4，前肢虚弱或麻痹的截瘫；5，濒死或死亡。图15说明Siglec 15抗体克隆S15m02充当破坏Siglec 15与MAG或LRRC4C的结合的阻断抗体。结果，接受S15m02抗体的小鼠与注射对照mAb或接受S15m03抗体的对应体相比形成更严重的疾病症状(图16)，表明Siglec 15与MAG或LRRC4C之间的相互作用在调控脑中的炎症反应上是关键的。该结果通过用Siglec 15-Fc融合蛋白Siglec 15-mIg处理EAE小鼠进一步证实。小鼠接受Siglec 15-Fc融合蛋白后，EAE加速(图17)。
实施例13.Siglec 15在抑制脑炎症反应中的作用
为了证实Siglec 15发挥调控脑炎症的作用，Siglec 15基因敲除(KO)小鼠模型购自MMRRC(UC Davis)(Tao et al.J Immunol.2008；180(10):6649-55)。野生型(WT)和Siglec15基因敲除小鼠两者均用MOG(33-35)肽免疫处理以诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)，接着测量EAE疾病的临床评分。如图18中所示，Siglec 15KO小鼠比WT小鼠展现更严重的EAE疾病症状，指示Siglec 15在调控脑炎症反应中的抑制性作用。
实施例14.Siglec 15的缺乏增强自身免疫
野生型(WT)和Siglec15基因敲除(Siglec15KO)小鼠用MOG肽免疫以诱导EAE。在第0天和第1天，所有小鼠用百日咳毒素加强。测定WT和Siglec15KO小鼠的EAE临床评分，证实Siglec 15KO小鼠显示比WT小鼠更严重的EAE疾病症状。
野生型(WT)小鼠的单独群组用MOG肽免疫，并在第0天和第1天用百日咳毒素加强，随后在第6天开始每周两次用Siglec 15-mIg融合蛋白(Siglec15-mIg)或对照mIg或者用Siglec 15-hIg融合蛋白(Siglec15-hIg)或对照hIg(100μg)处理，总共4个剂量。随时间评估EAE临床评分(图19A)。在第12天，在5ug/ml Siglec15-mIg(S15-mIg)或对照mIg(mIg)存在下，用MOG肽(60μg/ml)再刺激来自对照mIg处理的小鼠的脾细胞3天。进一步孵育16小时后，测量两组中的3H-胸腺嘧啶核苷掺入(图19B)。此数据指示，可溶性Siglec15-mIg在体内可用作拮抗剂，并刺激抗原特异性的T细胞反应。这一机理研究促进对Siglec15融合蛋白在脑发炎模型(EAE)中的功能作用的理解。
实施例15.Siglec 15在脑癌中抑制免疫反应的作用
为了测试Siglec 15在癌症中调控免疫反应的作用，使用脑肿瘤模型。C57BL/6小鼠用含有用于定量肿瘤大小的荧光素酶报道基因的GL261肿瘤细胞颅内注射。肿瘤注射后第4天，使小鼠接受低剂量的全脑辐射疗法，然后在第5天和第10天用Siglec 15-Fc或对照Ig处理。密集监测两个组的肿瘤大小。如图20和21中所示，通过Siglec 15-Fc处理阻断Siglec 15显著缩减肿瘤大小(图20)并延长小鼠的存活期(图21)。当用抗PD-L1抗体处理时，Siglec15-Fc处理的小鼠也显示协同作用，其显著地促进抗PD-L1在肿瘤缩减与存活期利益中的功效(图22)。这些结果表明，阻断或用其他方式抑制Siglec 15的活性可增强对癌症的免疫反应。
实施例16.肿瘤相关CD8T细胞在荷瘤小鼠中的显著浸润
如上所示，Siglec 15在脑中表达。检测野生型(WT)和Siglec 15基因敲除(Siglec15 KO)脑肿瘤模型中的T细胞数量和活性。在第0天，用GL261胶质母细胞瘤细胞颅内接种WT或Siglec15KO小鼠。在不同时间点通过测量荧光素酶活性监测脑中的肿瘤负荷(图23A)。接种GL261细胞后第13天和第18天，使WT和KO小鼠的脑中的荧光素酶活性成像(图23B)。接种GL261的WT和KO小鼠的存活曲线显示Siglec 15KO小鼠比WT存活更久(图23C)。第14天，二组的一些小鼠处死。监测脑或脾脏中CD8T细胞(图24A)、CD4T细胞(图24B)或骨髓细胞群体(图24C)的数量和百分比。此外，用GL-261肿瘤细胞再刺激来自荷瘤WT或KO小鼠的脑淋巴细胞过夜，然后测定IFN-γ阳性CD8或CD4T细胞的百分比和总数(图24D)。
在Siglec15KO小鼠的肿瘤位点中确认功能性CD8T细胞的显著浸润，而在WT小鼠的肿瘤位点则无。此效应与肿瘤相关，因为在脾脏中没有差异。此外，观察到脑树突细胞/巨噬细胞群体中的显著差异。此数据指示Siglec15可影响肿瘤位点处的免疫细胞反应。特别地，在肿瘤/脑微环境处的Siglec 15表达可抑制T细胞和/或骨髓细胞，并关闭对抗肿瘤的免疫反应。
实施例17.表达Siglec 15的肿瘤细胞的生长
用编码Siglec 15(S15+)或对照(S15-)的慢病毒表达构建体感染MC38结肠腺癌细胞。慢病毒感染后，使用FACS分选MC38-S15-和MC38-S15+细胞群体。通过利用单克隆抗体的FACS染色证实在MC38-S15-和MC38-S15+细胞上的Siglec 15表达(图25A)。用MC38-S15-和MC38-S15+细胞皮下接种B6小鼠(0.4M个细胞/小鼠)，并监测肿瘤生长(图25B)。衍生自表达Siglec 15的MC38细胞的肿瘤大于衍生自缺乏Siglec 15表达的MC38细胞的肿瘤。
实施例18.Siglec 15拮抗剂抑制表达Siglec 15的肿瘤细胞的生长
将MC38-S15+稳定细胞系皮下接种在B6小鼠中(0.4M个细胞/小鼠)。在第6天和随后的每四天，小鼠用对照抗体、抗Siglec 15抗体m01或S15-mIg(腹膜内注射，200μg/小鼠)处理，总共4个剂量。各组的平均肿瘤大小示于图26中；用Siglec 15拮抗剂m01或S15-mIg处理的小鼠中肿瘤大小显著缩小。
等效物
本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验确定本文描述的本发明特定实施方案的许多等效物。这些等效物意欲为下述权利要求范围所涵盖。

Claims (92)

1.一种治疗需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量的Siglec 15的调节剂，其中所述调节剂降低所述受试者中的Siglec 15的表达和/或活性，从而治疗所述受试者的癌症。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述调节剂选自由Siglec 15的小分子抑制剂、Siglec 15的拮抗剂抗体或其抗原结合片段、重组Siglec 15融合蛋白或者靶向Siglec 15的抑制性肽或核酸组成的组。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述Siglec 15融合蛋白是Siglec 15-Fc融合蛋白。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述调节剂阻断Siglec 15与结合配体之间的相互作用。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述结合配体选自由MAG、LRRC4C和Sialyl-Tn组成的组。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述调节剂是具有残基143处的单一置换突变的突变体Siglec 15蛋白。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述调节剂是具有IgV结构域缺失的突变体Siglec15蛋白。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述调节剂降低MAG和LRRC4C的表达和/或活性水平。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述调节剂选自由MAG的小分子抑制剂、MAG的拮抗剂抗体或其抗原结合片段、重组MAG融合蛋白、靶向MAG的抑制性肽或核酸、LRRC4C的小分子抑制剂、LRRC4C的拮抗剂抗体或其抗原结合片段、重组LRRC4C融合蛋白、或者靶向LRRC4C的抑制性肽或核酸组成的组。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症选自由脑癌、肺癌、胰腺癌、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、肾细胞癌、直肠腺癌、肝细胞癌和Ewing氏肉瘤组成的组。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述脑癌是胶质母细胞瘤。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者是人类。
13.一种缩减需要的受试者的肿瘤大小的方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量的Siglec 15的调节剂，其中所述调节剂降低Siglec 15的表达和/或活性，从而缩减所述受试者的肿瘤大小。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述调节剂选自由Siglec 15的小分子抑制剂、Siglec 15的拮抗剂抗体或其抗原结合片段、重组Siglec 15融合蛋白或者靶向Siglec 15的抑制性肽或核酸组成的组。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述Siglec 15融合蛋白是Siglec 15-Fc融合蛋白。
16.根据权利要求13所述的方法，其中所述调节剂阻断Siglec 15与结合配体之间的相互作用。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述结合配体选自由MAG、LRRC4C和Sialyl-Tn组成的组。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述调节剂是具有残基143处的单一置换突变的突变体Siglec 15蛋白。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述调节剂是具有IgV结构域缺失的突变体Siglec 15蛋白。
20.根据权利要求13所述的方法，其中所述调节剂降低MAG、LRRC4C或Sialyl-Tn的表达和/或活性。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述调节剂选自由MAG的小分子抑制剂、MAG的拮抗剂抗体或其抗原结合片段、重组MAG融合蛋白、靶向MAG的抑制性肽或核酸、LRRC4C的小分子抑制剂、LRRC4C的拮抗剂抗体或其抗原结合片段、重组LRRC4C融合蛋白或者靶向LRRC4C的抑制性肽或核酸组成的组。
22.根据权利要求13所述的方法，其中所述肿瘤与选自由脑癌、肺癌、胰腺癌、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、肾细胞癌、直肠腺癌、肝细胞癌和Ewing氏肉瘤组成的组的癌症相关。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述脑癌是胶质母细胞瘤。
24.根据权利要求13所述的方法，其中所述受试者是人类。
25.一种延长罹患癌症的受试者的存活期的方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量的Siglec 15的调节剂，其中所述调节剂降低Siglec 15的表达和/或活性，从而延长所述受试者的存活期。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述调节剂选自由Siglec 15的小分子抑制剂、Siglec 15的拮抗剂抗体或其抗原结合片段、重组Siglec 15融合蛋白或者靶向Siglec 15的抑制性肽或核酸组成的组。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述Siglec 15融合蛋白是Siglec 15-Fc融合蛋白。
28.根据权利要求25所述的方法，其中所述调节剂阻断Siglec 15与结合配体之间的相互作用。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述结合配体选自由MAG、LRRC4C和Sialyl-Tn组成的组。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述调节剂是具有残基143处的单一置换突变的突变体Siglec 15蛋白。
31.根据权利要求28所述的方法，其中所述调节剂是具有IgV结构域缺失的突变体Siglec 15蛋白。
32.根据权利要求25所述的方法，其中所述调节剂降低MAG和LRRC4C的表达和/或活性。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述调节剂选自由MAG的小分子抑制剂、MAG的拮抗剂抗体或其抗原结合片段、重组MAG融合蛋白、靶向MAG的抑制性肽或核酸、LRRC4C的小分子抑制剂、LRRC4C的拮抗剂抗体或其抗原结合片段、重组LRRC4C融合蛋白或者靶向LRRC4C的抑制性肽或核酸组成的组。
34.根据权利要求25所述的方法，其中所述癌症选自由脑癌、肺癌、胰腺癌、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、肾细胞癌、直肠腺癌、肝细胞癌和Ewing氏肉瘤组成的组。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述脑癌是胶质母细胞瘤。
36.根据权利要求25所述的方法，其中所述受试者是人类。
37.一种增强需要的受试者中对抗肿瘤的免疫反应的方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量的Siglec 15的调节剂，其中所述调节剂降低Siglec 15的表达和/或活性，从而增强所述受试者中对抗所述肿瘤的免疫反应。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述调节剂选自由Siglec 15的小分子抑制剂、Siglec 15的拮抗剂抗体或其抗原结合片段、重组Siglec 15融合蛋白或者靶向Siglec 15的抑制性肽或核酸组成的组。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述Siglec 15融合蛋白是Siglec 15-Fc融合蛋白。
40.根据权利要求37所述的方法，其中所述调节剂阻断Siglec 15与结合配体之间的相互作用。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述结合配体选自由MAG、LRRC4C和Sialyl-Tn组成的组。
42.根据权利要求40所述的方法，其中所述调节剂是具有残基143处的单一置换突变的突变体Siglec 15蛋白。
43.根据权利要求40所述的方法，其中所述调节剂是具有IgV结构域缺失的突变体Siglec 15蛋白。
44.根据权利要求37所述的方法，其中所述调节剂降低MAG和LRRC4C的表达和/或活性。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述调节剂选自由MAG的小分子抑制剂、MAG的拮抗剂抗体或其抗原结合片段、重组MAG融合蛋白、靶向MAG的抑制性肽或核酸、LRRC4C的小分子抑制剂、LRRC4C的拮抗剂抗体或其抗原结合片段、重组LRRC4C融合蛋白或者靶向LRRC4C的抑制性肽或核酸组成的组。
46.根据权利要求37所述的方法，其中所述肿瘤与选自由脑癌、肺癌、胰腺癌、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、肾细胞癌、直肠腺癌、肝细胞癌和Ewing氏肉瘤组成的组的癌症相关。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述脑癌是胶质母细胞瘤。
48.根据权利要求37所述的方法，其中所述受试者是人类。
49.一种治疗需要的受试者中的自身免疫疾病的方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量的Siglec 15的调节剂，其中所述调节剂增强所述受试者中Siglec 15的表达和/或活性，从而治疗所述受试者的自身免疫疾病。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述调节剂选自由Siglec15的小分子活化剂、Siglec 15的激动剂抗体或其抗原结合片段或者激活Siglec 15的转录和/或翻译的蛋白质和核酸组成的组。
51.根据权利要求49所述的方法，其中所述调节剂促进Siglec 15与结合配体之间的相互作用。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述结合配体选自由MAG、LRRC4C和Sialyl-Tn组成的组。
53.根据权利要求49所述的方法，其中所述调节剂增强MAG和LRRC4C的表达和/或活性。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述调节剂选自由MAG的小分子活化剂、MAG的激动剂抗体或其抗原结合片段、激活MAG的转录和/或翻译的蛋白质和核酸、LRRC4C的小分子活化剂、LRRC4C的激动剂抗体或其抗原结合片段或者激活LRRC4C的转录和/或翻译的蛋白质和核酸组成的组。
55.根据权利要求53所述的方法，其中所述调节剂选自由MAG蛋白质、编码MAG蛋白质的核酸、LRRC4C蛋白质或编码LRRC4C蛋白质的核酸组成的组。
56.根据权利要求49所述的方法，其中所述自身免疫疾病是炎性脑疾病。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述炎性脑疾病是多发性硬化症。
58.根据权利要求49所述的方法，其中所述受试者是人类。
59.一种治疗需要的受试者中的自身免疫疾病的方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量的Siglec 15蛋白、编码Siglec 15蛋白的核酸，从而治疗所述受试者的自身免疫疾病。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述Siglec 15蛋白选自由全长Siglec 15蛋白、Siglec 15的功能性片段或Siglec 15的IgV结构域组成的组。
61.根据权利要求59所述的方法，其中所述自身免疫疾病是炎性脑疾病。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述炎性脑疾病是多发性硬化症。
63.根据权利要求59所述的方法，其中所述受试者是人类。
64.一种降低需要的受试者中的脑炎症反应的方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量的Siglec 15的调节剂，其中所述调节剂增强Siglec 15的表达和/或活性，从而降低所述受试者中的脑炎症反应。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述调节剂选自由Siglec 15的小分子活化剂、Siglec 15的激动剂抗体或其抗原结合片段或者激活Siglec 15的转录和/或翻译的蛋白质和核酸组成的组。
66.根据权利要求64所述的方法，其中所述调节剂促进Siglec 15与结合配体之间的相互作用。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述结合配体选自由MAG、LRRC4C和Sialyl-Tn组成的组。
68.根据权利要求64所述的方法，其中所述调节剂增强MAG和LRRC4C的表达和/或活性。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述调节剂选自由MAG的小分子活化剂、MAG的激动剂抗体或其抗原结合片段、激活MAG的转录和/或翻译的蛋白质和核酸、LRRC4C的小分子活化剂、LRRC4C的激动剂抗体或其抗原结合片段或者激活LRRC4C的转录和/或翻译的蛋白质和核酸组成的组。
70.根据权利要求68所述的方法，其中所述调节剂选自由MAG蛋白质、编码MAG蛋白质的核酸、LRRC4C蛋白质或编码LRRC4C蛋白质的核酸组成的组。
71.根据权利要求64所述的方法，其中所述脑炎症反应与多发性硬化症相关。
72.根据权利要求64所述的方法，其中所述受试者是人类。
73.一种降低针对有其需要的受试者中的脑炎症反应的方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量的Siglec 15蛋白或编码Siglec 15蛋白的核酸，从而降低所述受试者中的脑炎症反应。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述Siglec 15蛋白选自由全长Siglec 15蛋白、Siglec 15的功能性片段或Siglec 15的IgV结构域组成的组。
75.根据权利要求73所述的方法，其中所述脑炎症反应与多发性硬化症相关。
76.根据权利要求73所述的方法，其中所述受试者是人类。
77.一种鉴定可用于治疗受试者的自身免疫疾病或癌症的化合物的方法，所述方法包括：
提供测试化合物；
测定所述测试化合物对Siglec 15的表达和/或活性的影响；和
选择调节Siglec 15的表达和/或活性的化合物，从而鉴定可用于治疗所述受试者中的自身免疫疾病或癌症的化合物。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述Siglec 15的表达和/或活性的增强指示所述化合物可用于治疗自身免疫疾病。
79.根据权利要求77所述的方法，其中所述Siglec 15的表达和/或活性的降低指示所述化合物可用于治疗癌症。
80.一种鉴定可用于增强需要的受试者中对抗肿瘤的免疫反应的化合物的方法，所述方法包括：
提供测试化合物；
测定所述测试化合物对Siglec 15的表达和/或活性的影响；和
选择降低所述Siglec 15的表达和/或活性的化合物，从而鉴定可用于增强所述受试者中对抗所述肿瘤的免疫反应的化合物。
81.一种鉴定可用于降低需要的受试者中的脑炎症反应的化合物的方法，所述方法包括：
提供测试化合物；
测定所述测试化合物对Siglec 15的表达和/或活性的影响；和
选择增强所述Siglec 15的表达和/或活性的化合物，从而鉴定可用于降低所述受试者中的脑炎症反应的化合物。
82.一种Siglec 15的调节剂，其中所述调节剂调节Siglec 15与MAG、LRRC4C和Sialyl-Tn之间的相互作用。
83.根据权利要求82所述的调节剂，其中所述调节剂结合Siglec 15的IgV结构域。
84.根据权利要求82所述的调节剂，其中所述调节剂结合包含Siglec 15的残基143的表位。
85.根据权利要求82所述的调节剂，其中所述调节剂是Siglec 15的抑制剂。
86.根据权利要求85所述的调节剂，其中所述抑制剂选自由Siglec 15的小分子抑制剂、Siglec 15的拮抗剂抗体或其抗原结合片段、重组Siglec 15融合蛋白或者靶向Siglec15的抑制性肽或核酸组成的组。
87.根据权利要求82所述的调节剂，其中所述调节剂是Siglec 15的活化剂。
88.根据权利要求87所述的调节剂，其中所述活化剂选自由Siglec 15的小分子活化剂、Siglec 15的激动剂抗体或其抗原结合片段或者激活Siglec 15的转录和/或翻译的蛋白质和核酸组成的组。
89.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者未罹患进行中的自身免疫疾病。
90.根据权利要求13所述的方法，其中所述受试者未罹患进行中的自身免疫疾病。
91.根据权利要求25所述的方法，其中所述受试者未罹患进行中的自身免疫疾病。
92.根据权利要求37所述的方法，其中所述受试者未罹患进行中的自身免疫疾病。
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