CN106659758A - 用于免疫调节的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本文所述的方法和用途涉及通过调节Sema3F水平和/或活性对免疫系统进行的调节，例如，通过给予Sema3F激动剂来阻抑同种异体移植物排斥或炎症，或者通过给予Sema3F抑制剂来增加免疫应答。

Description

用于免疫调节的组合物和方法
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2014年6月2日提交的美国临时申请号62/006,441的权益，以引用的方式将其内容整体并入本文。
政府支持
本发明是在由美国国立卫生研究院授予的基金号1RO1AI092305的联邦基金支持下做出的。美国政府对本发明拥有一定的权利。
序列表
本申请包含序列表，所述序列表已经以ASCII格式通过电子提交，并在此以引用的方式将其整体并入。所述ASCII副本创建于2015年5月29日，命名为701039-080591-PCT_SL.txt并且大小为63,543字节。
技术领域
本文所述的技术涉及免疫调节。
背景技术
第3类脑信号蛋白家族(Sema3A-G)结合至神经毡蛋白和丛蛋白(Plexin)家族蛋白，并引发抑制细胞迁移和增殖的调控信号。具体地，SEMA3A与NRP-1的结合以及SEMA3F与NRP-2的结合在神经元细胞和血管内皮细胞中引发抑制信号。
发明内容
如本文所述，本发明人已经发现Sema3F具有免疫调节性质，并且，这一效应部分地经由与NRP-2和丛蛋白A1的相互作用来介导。因此，本文提供了免疫调节方法，该方法基于对结合至其受体的SEMA3F以及相关信号传导进行的操作。非限制性实例包括：通过增加或增强Sema3F和NRP-2的相互作用来阻抑免疫系统或免疫应答，和/或通过降低Sema3F和NRP-2的活性和/或相互作用来上调免疫系统或免疫应答。
在一个方面，本文描述了阻抑受试者中的免疫系统的方法，该方法包括向有需要的受试者给予Sema3F激动剂。在一个方面，本文描述了阻抑同种异体移植物排斥的方法，该方法包括向同种异体移植物受者给予Sema3F激动剂，由此阻抑同种异体移植物的免疫排斥。在一个方面，本文描述了在有需要的受试者中治疗炎性病症的方法，该方法包括向受试者给予Sema3F激动剂。在一些实施方式中，炎性病症是自身免疫性疾病。在一些实施方式中，自身免疫性疾病选自于由以下所组成的组：1型糖尿病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、银屑病、炎性肠病、克罗恩氏病以及自身免疫性甲状腺炎。在一些实施方式中，炎性病症是局部病症。在一些实施方式中，局部炎性病症选自于由皮疹和变应性反应所组成的组。
在一些实施方式中，Sema3F激动剂是Sema3F多肽或编码Sema3F多肽的核酸。在一些实施方式中，Sema3F多肽包含序列SEQ ID NO：5。在一些实施方式中，Sema3F多肽可结合Sema3F受体。在一些实施方式中，Sema3F多肽可结合选自于由以下所组成的组中的NRP-2的结构域：A1结构域、A2结构域、B1结构域和B2结构域。在一些实施方式中，Sema3F激动剂是弗林蛋白酶样(furin-like)抑制剂。在一些实施方式中，静脉内给予Sema3F激动剂。在一些实施方式中，肌内、皮下或真皮内给予Sema3F激动剂。在一些实施方式中，将Sema3F激动剂局部给予至炎症部位。在一些实施方式中，所述方法进一步包括给予额外的抗炎剂。在一些实施方式中，额外的抗炎剂选自于由以下所组成的组：类固醇、钙调磷酸酶抑制剂、mTOR抑制剂(例如雷帕霉素)或其类似物以及抗增殖剂。
在一个方面，本文描述了增加有需要的受试者中的免疫应答的方法，该方法包括向受试者给予一种或多种Sema3F抑制剂或NRP-2抑制剂或丛蛋白A1抑制剂。在一些实施方式中，Sema3F抑制剂是抗Sema3F抗体试剂。在一些实施方式中，NRP-2抑制剂是抗NRP-2抗体试剂。在一些实施方式中，Sema3F抑制剂是可溶性NRP-2受体。在一些实施方式中，Sema3F抑制剂是NRP-2受体的可溶性片段，所述NRP-2受体包含选自于由A1结构域、A2结构域、B1结构域或B2结构域所组成的组中的至少一种结构域。在一些实施方式中，Sema3F抑制剂是弗林蛋白酶样多肽或编码弗林蛋白酶样多肽的核酸。
附图说明
图1描绘了说明神经毡蛋白-1和神经毡蛋白-2具有脑信号蛋白结合结构域和VEGF结合结构域的示意图(改良自Bagri等，2009)。
图2描绘了移植物存活曲线。将心脏同种异体移植物(Balb/c)移植到MHC完全不匹配的受者(C57BL/6)中。在7天-8天内，未经处理的受者排斥这些同种异体移植物。编码Sema3F的腺病毒的IV注射使得同种异体移植物存活延长，表明这一试剂具有抑制免疫应答的有效作用。
图3描绘了移植物存活曲线。将心脏同种异体移植物(Balb/c)移植到MHC完全不匹配的受者(C57BL/6)中。在7天-8天内，未经处理的受者排斥这些同种异体移植物。腹膜内注射表达Sema3F的细胞(以增加Sema3F的全身性水平)使得同种异体移植物存活延长，表明这一试剂具有抑制免疫应答的强效作用。将表达Sema3F的细胞与封闭性抗Sema3F抗体组合注射不会引起移植物存活延长。
图4描绘了用Balb/C供体心脏进行移植后，C56BL6受者小鼠的移植物存活曲线。腹膜内注射表达Sema3F的细胞(以增加Sema3F的全身性水平)使得同种异体移植物存活延长。在第0天和第2天给予雷帕霉素(0.2mg/kg)以起始耐受原性刺激。雷帕霉素与表达Sema3F的细胞组合未能进一步增加存活率。
图5描绘了移植物存活曲线。将心脏同种异体移植物(B6.C-H2bm12(BM12))移植到MHC轻微不匹配的受者野生型(WT C57BL/6)、NRP-2+/-(在BL6上的Het)或NRP-2-/-(BL6敲除小鼠)中。虽然心脏同种异体移植物在WT受者中长期存活，但KO小鼠产生加速的排斥反应。
图6描绘了在用对照腺病毒或编码Sema3F的腺病毒处理的小鼠中的噁唑酮迟发型超敏反应。在单次IV注射腺病毒(109pfu)三天后，使用标准技术对小鼠进行致敏(primed)并在5天后用噁唑酮在耳中进行攻击(challenged)。该图表显示出响应于噁唑酮的耳肿胀。
图7描绘了在鼠CD4+T细胞中的Sema3F受体神经毡蛋白-2(mRNA(顶部)和蛋白(底部))的表达的图表。将CD4+T细胞从脾脏中分离，用培养板结合的抗CD3(1mcg/ml)孵育6h-48h。分离RNA并进行qPCR。在底部子图中示出了通过蛋白质印迹分析的表达。
图8描绘了在鼠CD4+T细胞中的神经毡蛋白-1和神经毡蛋白-2的mRNA表达的图表。从淋巴结和脾脏分离初始C57BL6CD4+T细胞进行分离。将CD4+T细胞亚群经FACS分选为CD25高亚群和CD25低亚群。将来自CD4+亚群的RNA分离，并通过qPCR确定表达水平。
图9描绘了CD4+T细胞以及Foxp3pos细胞和Foxp3neg细胞的FACS分析的结果。使用兔抗NRP-2Ab(Bioss)来检测NRP-2表达。
图10描绘了在未活化或丝裂原活化后的鼠CD4+T细胞上的丛蛋白家族分子从6小时至48小时的表达水平。在野生型小鼠和NRP-2杂合子小鼠中对表达进行检查。
图11描绘了CD4+增殖的图表。将野生型CD4+细胞、NRP-2杂合子CD4+细胞和NRP-2敲除CD4+细胞从脾脏中分离，并以5×104个/孔接种且用指示浓度为0mcg/ml-3mcg/ml的培养板结合的抗CD3进行处理。图表描绘了使用不同组的小鼠的两次实验(代表n>5次实验)。
图12描绘了在来自图10的野生型细胞和NRP-2敲除细胞中的细胞因子产生的图表。对CD4+T细胞进行丝裂原活化(3mcg/ml，如图10所示)，并在72小时后通过Luminex测定法对培养物上清液中的指示的细胞因子的水平进行检测。
图13描绘了丝裂原诱导的CD4+CD25neg T细胞增殖的图表。在C57BL/6背景下，来自WT小鼠、NRP-2+/-(Hets)小鼠和NRP-2-/-(KO)小鼠的脾CD4+T细胞被分选到CD25neg T效应亚群中，并在培养板结合的抗CD3(如所指示的0μg/mL、0.3μg/mL、1μg/mL或3μg/mL)的存在下，以5×104个/孔接种。上部的图表示出了在抗CD28不存在的情况下接种的细胞，而下部的图表描绘了在1mcg/ml的激动性的抗CD28的存在下接种的细胞。
图14描绘了在来自图12所示的实验的NRP-2敲除CD4+CD25neg细胞中的细胞因子产生的图表。用抗CD3(3mcg/ml)对NRP-2敲除细胞进行丝裂原活化，并在72小时后通过Luminex测定法对培养物上清液中的指示的细胞因子的水平进行检测。
图15描绘了通过ELISPOT测定法测量的丝裂原活化的CD25negCD4+T细胞中的IFNγ产生的图表。在具有(下部的图表)或不具有(上部的图表)激动性的抗CD28(1mcg/ml)时，将野生型(WT)细胞、NRP-2HET细胞和NRP-2KO细胞(1×105个/孔，与APCs以1:1的比例)暴露至0mcg/ml、1mcg/ml或3mcg/ml的抗CD3。
图16描绘了通过ELISPOT测定法测量的丝裂原活化的CD25negCD4+T细胞中的IL-2产生的图表。在具有(下部的图表)或不具有(上部的图表)激动性的抗CD28(1μg/mL)时，将野生型(WT)细胞、NRP-2HET细胞和NRP-2KO细胞(1×105个/孔，与APCs以1:1的比例)暴露至0mcg/ml、1mcg/ml或3mcg/ml的抗CD3。
图17描绘了CD4+CD25+T细胞增殖的图表。在具有(下部的图表)或不具有(上部的图表)抗CD28(1mcg/ml)时，将野生型(WT)细胞、NRP-2HET细胞和NRP-2KO细胞(5×104个/孔)暴露至0mcg/ml、0.3mcg/ml、1mcg/ml或3mcg/ml的培养板结合的抗CD3。
图18描绘了Sema3F对PI-3K/Akt-mTOR信号传导(上部的印迹)和MAPK信号传导(下部的印迹)的时程效应。将表达NRP-2的U87MG用于这一测定。如通过蛋白质印迹分析所测量的，观察到用Sema3F(约640ng/mL)处理长达60分钟的细胞具有降低水平的pAkt(mTORC2)和pS6K(mTORC1)以及pERK。
图19描绘了NRP-2(上部)和丛蛋白A1(下部)敲低对Sema3F抑制PI-3K/Akt-mTOR信号传导的作用。用对照siRNA、NRP-2siRNA或丛蛋白A1siRNA对U87MG细胞进行处理。然后，用约640ng/mL的Sema3F对细胞处理长达60分钟。通过蛋白质印迹分析对敲低效率进行评价。通过评价pAkt(mTORC2)、pmTOR和pS6K(mTORC1)的表达水平，对PI-3K-Akt信号传导活性进行测量。
图20描绘了用增高浓度的SEMA3F处理30分钟的表达NRP-2的Jurkat T细胞的蛋白质印迹的结果。通过蛋白质印迹对pAkt(S473)的表达进行评价。
图21表明了SEMA3F在多种细胞类型中抑制Akt/mTOR信号传导。描绘了蛋白质印迹的结果，表明增高浓度的Sema3F在指示的细胞类型中对Akt/mTOR信号传导的作用。
图22表明了NRP-1和NRP-2通过人T细胞表达。将CD4+T细胞从人PBMC纯化，并在丝裂原依赖性活化(抗CD3/抗CD28)后，对VEGFR1(Flt-1)mRNA、NRP-1mRNA和NRP-2mRNA的表达进行评价。对代表性qPCR数据(来自使用不同T细胞的n＝3次实验)进行了说明，所述数据示出了Flt-1mRNA、NRP-1mRNA和NRP-2mRNA表达之间的对比。底部子图描绘了蛋白质印迹分析，其对NRP-2蛋白在未活化和活化的人CD4+T细胞与内皮细胞(EC)上的表达进行了比较。
图23描绘了如下数据的图表：该数据显示出响应于刺激，NRP-2敲低细胞过度活化。左侧子图描绘了如通过标准的胸腺嘧啶核苷掺入测定法所测量的，响应于丝裂原活化的CD4+T细胞增殖。右侧子图描绘了响应于用APC和抗CD3进行的培养，CD4+T细胞中的IFNg水平。
图24描绘了在NRP-2敲除CD4+CD25neg细胞中的细胞因子产生的图表。用抗CD3对NRP-2敲除细胞进行丝裂原活化，在48小时后通过Luminex测定法对培养物上清液中的指示的细胞因子的水平进行检测。这些发现类似于图12所示的发现。
图25描绘了慢性同种异体移植物排斥模型中的移植物存活曲线。将心脏同种异体移植物B6.C-Hbm12(BM12)移植到MHC轻微不匹配的受者中：野生型C57BL/6(WT)小鼠、NRP-2敲除(NRP-2-/-)小鼠或选定的CD4+T细胞NRP-2敲除小鼠(CD4Cre-NRP-2fl/fl)。
图26A-图26C示出了表明NRP-2在人CD4+T细胞上的表达的数据。图26A描绘了在未活化和丝裂原(抗CD3/CD28)活化的人CD4+T细胞上通过qPCR评价的NPR-2表达的图表。图26B描绘了在通过Ficoll分离法分离的人外周血细胞的CD4+亚群上通过FACS评价的NRP-2表达的图表。图26C描绘了通过FACS评价的外周血细胞中的CD4、FoxP3和NRP-2蛋白水平的图表。该数据类似于图22所示的数据。
图27A-图27F示出了表明NRP-2在鼠CD4+T细胞上的表达的数据。图27A表明了在小鼠脾脏和淋巴结内的CD4+T细胞上的NRP-2的FACS分析。图27B描绘了通过阴性选择从鼠脾脏中分离的CD4+T细胞的图表。在未活化和丝裂原(抗CD3/CD28)活化的细胞上，通过qPCR对NRP-2的表达进行评价。图27C描绘了在分离的CD4+T细胞上的丛蛋白A家族分子的表达的图表。图27D描绘了在通过从鼠脾脏进行阴性选择而分离的CD4+T细胞的Foxp3+和Foxp3阴性亚群上的NRP-2表达。图27E描绘了在丝裂原活化(抗CD3-1mcg/ml)的经分离的脾CD4+T细胞上的NRP-2表达。图27F描绘了在标准培养基(丝裂原+TGFb+抗IL-4+抗IFNg+视黄酸)中的被驱动分化为诱导的Treg细胞的CD4+T细胞上的NRP-1/2表达。这些数据类似于图7和图9所示的数据。
图28A-图28D示出了表明SEMA3F抑制Akt、mTOR和S6K的磷酸化的数据。图28A描绘了未处理(对照)或用SEMA3F(640ng/ml)处理30分钟后的U87MG细胞。通过磷蛋白激酶抗体阵列对细胞裂解物进行评价。如表1所示，使用Image J软件对各点/磷蛋白的强度进行测量。图28B描绘了通过蛋白质印迹分析验证的阵列的结果。图28C描绘了用SEMA3F(640ng/ml)以长达60分钟的时程处理的U87MG细胞，并通过蛋白质印迹对其进行分析。图28B-图28C代表3次独立实验。图28D描绘了用SEMA3F(200ng/ml、600ng/ml、1800ng/ml，从左到右的棒)处理15分钟(灰色棒)或30分钟(黑色棒)的U87MG细胞、Jurkat细胞和HUVEC细胞；作为阳性对照，用VEGF-A(25ng/ml)对HUVEC处理15分钟和30分钟。另外，用SEMA3F(1800ng/ml)或PBS(作为对照)对HUVEC预处理30分钟，并随后向培养物中加入VEGF-A(25ng/ml)15分钟和30分钟。根据制造商的说明书，通过ELISA对PI-3K活性进行分析。数据以3次实验的平均值±SD表示。
图29A-图29D示出了表明SEMA3F干扰mTORC1和mTORC2复合物的形成的数据。图29A描绘了用SEMA3F(640ng/ml)处理30分钟的U87MG细胞，并使其接受用所示出的抗mTOR、抗raptor和抗rictor进行的蛋白质印迹分析和免疫沉淀。图29B描绘了在SEMA3F(640ng/ml)处理60分钟之前，用雷帕霉素(10nM)或Torin 1(10nM)处理30分钟的U87MG细胞；通过蛋白质印迹对裂解物进行分析。图29C描绘了表示所示印迹的光密度分析的条形图，其示出了相对于未处理的对照(*，p<0.01；**，p<0.001vs.未处理的对照)而言的强度(平均值±SD)方面的倍数变化。图29D描绘了用pcDNA3.1空白载体或组成型激活Akt(2DAkt)瞬时转染的U87MG细胞。用SEMA3F(640ng/ml)处理细胞，并通过蛋白质印迹对裂解物进行分析。所有数据代表3次独立实验。
图30A-图30E示出了表明mTORC2参与SEMA3F诱导的RhoA失活和应力纤维损失的数据。图30A描绘了用SEMA3F(640ng/ml)、雷帕霉素(10nM)或Torin 1(10nM)处理30分钟的U87MG细胞。随后，将细胞用Alexa Fluor 488鬼笔环肽和Hoechst 33342染色，以分别识别F-肌动蛋白细胞骨架应力纤维和细胞核。在各子图中示出了代表性的细胞染色；条形图示出了在平均3次独立实验中的纤维/细胞的数量(平均值±SD)。比例尺表示20μm。图30B描绘了用pcDNA3.1空白载体或野生型(WT)mTOR质粒瞬时转染、并在18小时后用SEMA3F(640ng/ml)处理30分钟的U87MG细胞。如以上图30A所述，对细胞进行染色。示出了代表性细胞染色；条形图表示来自3次独立实验的纤维/细胞的数量(平均值±SD)。图30C描绘了用对照siRNA或raptor特异性siRNA或rictor特异性siRNA(20nM)转染的U87MG细胞。48小时后，将它们用SEMA3F处理30分钟，并用如上所述的Alexa Fluor 488鬼笔环肽和Hoechst 33342染色。在3次独立实验中对应力纤维的数量进行评价，并将其以平均值±SD示出。图30D描绘了用pcDNA3.1空白载体或用我们的WT mTOR质粒瞬时转染的U87MG细胞。18小时后，用SEMA3F(640ng/ml)处理细胞10分钟并评价RhoA活性。图30E描绘了用SEMA3F(640ng/ml)对经对照siRNA或raptor特异性siRNA或rictor特异性siRNA(20nM)转染的U87MG细胞处理10分钟，并分析RhoA活性。在图30D-图30E中，将激活RhoA的强度归一化为各自的总的RhoA；各凝胶泳道下方的数字表示相对于对照而言的强度方面的倍数变化。图30D-图30E代表3次独立实验。
图31A-图31D示出了表明SEMA3F通过抑制mTOR-Akt信号来阻抑VEGF的数据。图31A-图31B描绘了用全长人VEGF启动子荧光素酶质粒和pGL4.74[hRluc/TK]质粒(作为内部对照)瞬时共转染的U87MG细胞。在加入DFO(250μM)或在缺氧室(1％O2)中培养细胞之前，用SEMA3F(640ng/ml，30分钟)对细胞进行处理。18小时后，对VEGF启动子荧光素酶活性进行分析。图31C描绘了用以下进行瞬时共转染的U87MG细胞的图表：我们的VEGF启动子荧光素酶和pGL4.74[hRluc/TK]质粒、以及pcDNA3.1空白载体或者我们的组成型激活Akt(2DAkt)。在加入DFO之前，用SEMA3F对细胞处理30分钟。18小时后，对VEGF启动子荧光素酶活性进行分析。图31D描绘了在加入DFO之前，根据所指示的用SEMA3F、雷帕霉素(10nM)、Torin 1(10nM)单独或组合处理30分钟的亲代U87MG细胞的图表，并在18小时后收集培养物上清液；通过ELISA对VEGF蛋白水平进行分析。在各子图中，数据代表3次独立实验。条形图表示以三重复进行的n＝3次实验的平均值±SD，*，p<0.01vs.对照。
图32A-图32E示出了表明SEMA3F在体内抑制异种移植物中的人肿瘤生长的数据。图32A描绘了皮下(1×106个细胞/注射)植入裸鼠中的亲代U87MG细胞(Mock)和人SEMA3F稳定克隆物(S3F)。插图示出了各细胞系中的SEMA3F表达的蛋白质印迹分析。在所指示的时间点使用标准卡尺来测量肿瘤大小。括号中的数字表示各组中的动物的数量。图32B描绘了在24天后收集的肿瘤的代表性免疫组织化学抗CD31染色。图32C描绘了向裸鼠中皮下给予的U87MG细胞(1×106个细胞/注射)。2天后，将对照(Ad-Cont)或人SEMA3F-His(Ad-3F)-重组腺病毒(1×109pfu)经由尾静脉进行静脉内注射。在所指示的时间点使用标准卡尺来测量肿瘤大小。括号中的数字表示各组中的动物的数量。在第14天处死小鼠。插图示出了使用抗His抗体通过蛋白质印迹分析的肝脏内的SEMA3F表达(在第14天)。图32D描绘了用抗CD31进行的肿瘤的代表性的免疫组织化学染色。图32E描绘了肿瘤样品内的Akt/mTOR信号传导通路的蛋白质印迹分析。图32B、图32D和图32E是3次独立实验的代表性结果。
图33描绘了显示出通过SEMA3F-NRP2/丛蛋白A1相互作用介导的调控性的信号传导通路的卡通示意图。SEMA3F结合至NRP2-丛蛋白A1复合物并与PTEN联合，以使PI-3K和mTORC2/Akt依赖性信号传导失活。受体介导的信号还可经由肿瘤细胞系中的PTEN非依赖性机制使mTORC2/Akt信号传导失活。在功能上，这些调控/促消退信号阻抑了细胞增殖、迁移、细胞骨架应力纤维重排和细胞存活。SEMA3F还通过经由ABL2激酶和p190RhoGAP6二者使RhoA失活而部分抑制细胞骨架结构；目前的研究显示出还经由mTORC2的抑制介导了RhoA的失活和细胞骨架应力纤维重排。
图34A-图34D描绘了通过SEMA3F调控的细胞内信号传导通路的分析。图34A描绘了在用SEMA3F或PBS处理60分钟的U87MG细胞中的pAkt、pmTOR和pS6K的表达的蛋白质印迹。图34B描绘了蛋白质印迹。用对照或丛蛋白A1-特异性siRNA(20nM)对U87MG细胞进行转染。48小时后，将细胞用SEMA3F(640ng/ml)处理30分钟和60分钟，并通过蛋白质印迹进行分析。图34C描绘了用多种细胞系通过蛋白质印迹分析的NRP2和丛蛋白A1的表达。图34D描绘了用SEMA3F处理30分钟的多种表达NRP2的细胞系的蛋白质印迹。所有呈现的数据代表3次独立实验。
图35A-图35B描绘了SEMA3F对mTORC2活性的作用的分析。图34A描绘了蛋白质印迹。用pcDNA3.1空白载体或组成型激活Akt(2DAkt)对U87MG细胞进行瞬时转染。用SEMA3F(640ng/ml)对细胞进行处理，并通过蛋白质印迹对裂解物进行分析。图35B描绘了蛋白质印迹。用pcDNA3.1空白载体或2DAkt对U87MG细胞进行瞬时转染。将细胞用SEMA3F(640ng/ml)处理30分钟，并使其接受用所示出的抗mTOR和抗rictor进行的蛋白质印迹分析和免疫沉淀。
图36A描绘了蛋白质印迹。将HUVEC用SEMA3F(1800ng/ml)处理30分钟，并使其接受用所示出的抗NRP2和抗PTEN进行的蛋白质印迹分析和免疫沉淀。图36B描绘了蛋白质印迹。在SEMA3F处理(1800ng/ml)之前，用对照siRNA或丛蛋白A1特异性siRNA(20nM)对HUVEC进行转染；使裂解物接受用所示出的抗NRP2和抗PTEN进行的蛋白质印迹分析和免疫沉淀。图36C描绘了蛋白质印迹。在SEMA3F处理(1800ng/ml)之前，用对照siRNA或PTEN特异性siRNA(20nM)对HUVEC进行转染；通过蛋白质印迹对裂解物进行分析。图36D描绘了蛋白质印迹。用对照siRNA或GIPC1特异性siRNA(20nM)对U87MG细胞进行转染。48小时后，将细胞用SEMA3F(200ng/ml、600ng/ml、1800ng/ml，从左到右)处理30分钟，并通过蛋白质印迹进行分析。图36E描绘了蛋白质印迹。在与SEMA3F(640ng/ml)组合30分钟和60分钟之前，将U87MG细胞用U0126(10μM)处理30分钟。通过蛋白质印迹对Akt和MAPK信号传导进行分析。所有呈现的数据代表3次独立实验。
图37描绘了在移植后第5天，从在图2中识别的小鼠收集的细胞的表型。FACS分析和图形化总结表明在移植后的早期，在CD3、CD4、CD8和Treg群中没有观察到差异。
图38描绘了脑信号蛋白-神经毡蛋白-2相互作用的示意模型。
图39是图11-图16和图23的跟进，其中发现NRP-2的敲低引起过度活化。在该图中，在培养物中对T细胞进行丝裂原活化，所述培养物将应答驱动到不同效应表型(effectorphenotypes)中。如图表中所示，在NRP-2敲除的CD4+T细胞中，CD4+T效应细胞分化得以增强。
图40是来自图5和图25的综合数据，其表明NRP-2缺乏引起加速的心脏同种异体移植物排斥。该图描绘了在将MHC轻微不匹配的B6.C-H2bm12供体心脏移植到以下受者中之后的存活图表：C57BL6(WT)受者、或NRP-2杂合子受者以及球形(global)或CD4+T细胞KO受者。
图41示出了表明NRP-2配体Sema3F在体内通过腺病毒进行的产生的数据。在图2、图6和图32中，将含有Sema3F的腺病毒或空白对照给予到小鼠中。在该图中，表明了这一方法引起Sema3F的产生。右侧示出了蛋白质印迹，说明Sema3F通过肝脏进行的产生和感染。左侧示出了通过ELISA观察到Sema3F水平在给予后第14天达到峰值。因此，对于图2、图6和图32而言，Sema3F可能在给予后14天达到表达峰值，并且该水平在第23天后降低。
具体实施方式
本文描述了免疫调节方法，该方法基于本发明人的以下发现：Sema3F和NRP-2的相互作用起到阻抑免疫系统的作用。因此，增加或增强这种相互作用可阻制免疫应答，而抑制或降低该相互作用可上调免疫应答。
在一个方面，本文描述了阻抑受试者中的免疫系统的方法，该方法包括向有需要的受试者给予Sema3F激动剂。在一些实施方式中，免疫系统的阻抑可包括治疗炎性病症。在一些实施方式中，免疫系统的阻抑可包括阻抑移植物排斥(例如，同种异体移植物排斥)等。在一个方面，本文描述了抑制细胞中的Akt/mTOR信号传导的方法，该方法包括使所述细胞与Sema3F激动剂接触。在一个方面，本文描述了抑制受试者中的Akt/mTOR信号传导的方法，该方法包括向有需要的受试者给予Sema3F激动剂。
如本文所使用的“免疫系统的阻抑”是指如通过免疫系统的各种免疫功能的任何参数所测量的降低或抑制动物的免疫功能。免疫功能的参数的非限制性实例可包括以下的量级(magnitude)：抗体应答、B细胞的应答、T细胞的应答、T细胞的增殖、免疫调节细胞因子的产生和/或对抗原(例如对同种异体细胞或异种细胞)的应答。相反，“免疫系统的刺激”是指如通过免疫系统的各种免疫功能的任何参数所测量的动物的免疫功能的增加或活化。
本文所使用的“移植物排斥(graft rejection或transplant rejection)”是指对源自除宿主以外的来源的组织或器官的任何免疫学上介导的超急性、急性或慢性损伤。因此，该术语涵盖了细胞介导的排斥和抗体介导的排斥、以及同种异体移植物和异种移植物的排斥。
在一些实施方式中，阻抑免疫系统可包括阻抑移植物抗宿主病。“移植物抗宿主病”(GVHD)是捐献的组织针对患者自身组织的反应。GVHD最常见于骨髓移植，但可与其它组织或细胞的移植一起发生。GVHD最常见于以下情况：其中，组织供体与患者不相关，或当供体与患者相关但不完全匹配时。存在两种形式的GVHD：早期形式(称为急性GVHD)，当白细胞在增长时，急性GVHD在移植后迅速发生；以及晚期形式(称为慢性GVHD)。
本文所使用的“炎症”是指对有害刺激(例如病原体、受损细胞或刺激物)的复杂生物应答。炎症是通过生物体去除有害刺激并引发组织治愈过程而进行的保护性尝试。因此，术语“炎症”包括引起以下的产生的任何细胞过程：促炎性细胞因子；炎症介质；和/或由细胞因子的作用所产生的相关下游细胞事件，由此产生例如发热、积液、肿胀、脓肿形成和细胞死亡。促炎性细胞因子和炎症介质包括但不限于IL-1-α、IL-1-β、IL-6、IL-8、IL-11、IL-12、IL-17、IL-18、TNF-α、白细胞抑制因子(LIF)、IFN-γ、制瘤素M(OSM)、睫状神经营养因子(CNTF)、TGF-β、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及化学吸引炎性细胞的趋化因子。炎症可包括急性应答(即，其中的炎性过程活跃的应答)和慢性应答(即，特点是新的结缔组织的形成和进展缓慢的应答)两者。急性和慢性炎症可通过所涉及的细胞类型来区分。急性炎症通常涉及多形核嗜中性粒细胞；而慢性炎症其特征通常在于淋巴细胞组织细胞应答和/或肉芽肿性应答。
炎性病症是特征在于如下炎性过程或炎性组织(例如，诸如淋巴细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和树突状细胞的白细胞的浸润)的任何疾病状态，所述炎性过程或炎性组织引发或有助于疾病状态的异常的临床和组织学特征。炎性病症包括但不限于皮肤的炎性病症、肺的炎性病症、关节的炎性病症、肠的炎性病症、眼的炎性病症、内分泌系统的炎性病症、心血管系统的炎性病症、肾的炎性病症、肝脏的炎性病症、中枢神经系统的炎性病症或败血症相关的病症。在一些实施方式中，炎性病症与创伤愈合相关。在一些实施方式中，待根据本文所述的方法进行治疗的炎症可以是皮肤炎症、通过物质滥用或药物成瘾引起的炎症、与感染相关的炎症、角膜炎症、视网膜炎症、脊髓炎症、与器官再生相关的炎症以及肺部炎症。
在一些实施方式中，炎性病症可以是自身免疫性疾病。自身免疫性疾病的非限制性实例可包括：1型糖尿病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、银屑病、炎性肠病、克罗恩氏病以及自身免疫性甲状腺炎。自身免疫性疾病是本领域熟知的，例如，参见“AutomimmueDiseases Research Plan”自身免疫性疾病协调委员会(Autoimmune DiseaseCoordinating Committee)，NIH公开号03-510，2002年12月；以引用的方式将其整体并入本文。
在一些实施方式中，需要治疗炎症、创伤愈合或疼痛管理的受试者可以是患有或被诊断为患有以下的受试者：颞下颌关节紊乱、COPD、烟雾诱导的肺损伤、肾透析相关的紊乱、脊髓损伤、移植物抗宿主病、骨髓移植或其并发症、感染、外伤、疼痛、切口、手术切口、慢性疼痛紊乱、慢性骨紊乱、乳腺炎和关节疾病。在一些实施方式中，外伤可包括与搏斗相关的损伤或在手术期间发生的组织受损。烟雾诱导的肺损伤可能由暴露至烟草烟雾、环境污染物(例如烟或森林火灾)或工业暴露造成。通过非限制性实例的方式，炎性病症可以是皮肤的炎性病症，例如Sweet综合征、坏疽性脓皮病、角质层下脓疱性皮肤病、持久性隆起性红斑、Behcet病或急性全身发疹性脓疱病、大疱性紊乱、银屑病、导致脓疱性病变的病症、痤疮、寻常痤疮、皮炎(例如接触性皮炎、特应性皮炎、脂溢性皮炎、湿疹性皮炎、裂纹性湿疹、光变应性皮炎、光毒性皮炎、植物日光性皮炎、放射性皮炎、淤滞性皮炎或变应性接触性皮炎)、湿疹；由创伤、烧伤、粘膜或皮肤的缺血产生的溃疡和糜烂；多种形式的鱼鳞病、大疱性表皮松解、增生性瘢痕、瘢痕瘤、内源性老化的皮肤变化、光老化的皮肤变化、由皮肤的机械剪切引起的摩擦起疱、由局部使用皮质类固醇产生的皮肤萎缩、以及粘膜的炎症(例如唇炎、唇裂、鼻刺激、粘膜炎和外阴阴道炎)。
通过非限制性实例的方式，炎性病症可以是肺的炎性疾病，例如哮喘、支气管炎、慢性支气管炎、细支气管炎、肺炎、鼻窦炎、气肿、成人呼吸窘迫综合征、肺部炎症、肺纤维化以及囊性纤维化(其可额外地或可替代地涉及胃肠道或其它组织)。通过非限制性实例的方式，炎性病症可以是关节的炎性病症，例如类风湿性关节炎、类风湿性脊椎炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、痛风性关节炎、感染性关节炎、银屑病关节炎以及其它关节炎病症。通过非限制性实例的方式，炎性病症可以是消化道或肠的炎性病症，例如炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和远端直肠炎。通过非限制性实例的方式，炎性病症可以是眼的炎性疾病，例如干眼综合征、葡萄膜炎(包括虹膜炎)、结膜炎、巩膜炎和干燥性角膜结膜炎。通过非限制性实例的方式，炎性病症可以是内分泌系统的炎性病症，例如自身免疫性甲状腺炎(桥本氏病(Hashimoto’s disease))、格雷夫斯病(Graves’disease)、I型糖尿病和肾上腺皮质的急性和慢性炎症。通过非限制性实例的方式，炎性病症可以是心血管系统的炎性病症，例如冠状动脉梗死性损害、外周血管疾病、心肌炎、血管炎、狭窄血管重建、动脉粥样硬化以及与II型糖尿病相关的血管疾病。通过非限制性实例的方式，炎性病症可以是肾的炎性病症，例如肾小球性肾炎、间质性肾炎、狼疮性肾炎以及Wegener继发的肾炎、急性肾炎继发的急性肾衰竭、后阻塞综合征(post-obstructive syndrome)和肾小管缺血。通过非限制性实例的方式，炎性病症可以是肝脏的炎性病症，例如肝炎(产生自病毒感染、自身免疫应答、药物治疗、毒素、环境因素或作为原发性紊乱的继发后果)、胆道闭锁、原发性胆汁性肝硬变以及原发性硬化性胆管炎。通过非限制性实例的方式，炎性病症可以是中枢神经系统的炎性病症，例如多发性硬化和神经退行性疾病，例如阿尔茨海默氏病或HIV感染相关的痴呆。通过非限制性实例的方式，炎性病症可以是中枢神经系统的炎性病症，例如MS、所有类型的脑炎和脑膜炎、急性播散性脑脊髓炎、急性横贯性脊髓炎、视神经脊髓炎、局灶性脱髓鞘综合征(例如Balo同心圆硬化和MS的Marburg变型)、进行性多灶性白质脑病、亚急性硬化性全脑炎、急性出血性白质脑炎(Hurst病)、人T-淋巴细胞病毒1型相关的脊髓病/热带痉挛性瘫痪、德维克氏病(Devic’s disease)；人类免疫缺陷病毒脑病、人免疫缺陷病毒空泡性脊髓病、外周神经病、Guillame-Barre综合征和其它免疫介导的神经病以及重症肌无力。通过非限制性实例的方式，炎性病症可以是败血症相关病症，例如全身炎性反应综合征(SIRS)、感染性休克或多器官功能障碍综合征(MODS)。炎性病症的进一步的非限制性实例包括：内毒素休克、牙周病、多软骨炎、关节周紊乱(periarticular disorder)、胰腺炎、系统性红斑狼疮、Sjogren综合征、血管炎、结节病、淀粉样变性、变态反应、过敏性反应、系统性肥大细胞增多症、盆腔炎性疾病、多发性硬化、多发性硬化(MS)、乳糜泻、吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barre syndrome)、硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、雷诺氏现象(Raynaud’sphenomenon)、古德帕斯彻氏综合征(Goodpasture’s syndrome)、Wegener肉芽肿、风湿性多肌痛、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、慢性疲劳综合征(CFS)、自身免疫性Addison病、强直性脊柱炎、急性播散性脑脊髓炎、抗磷脂抗体综合征、再生障碍性贫血、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力、眼阵挛肌阵挛综合征、视神经炎、Ord甲状腺炎、天疱疮、恶性贫血、狗中的多发性关节炎、莱特尔氏综合征(Reiter’s syndrome)、高安氏动脉炎(Takayasu’sarteritis)、温抗体型自身免疫性溶血性贫血、纤维肌痛(FM)、自身炎症性PAPA综合征、家族性地中海热、风湿性多肌痛、结节性多动脉炎、churg strauss综合征、纤维性肺泡炎、过敏性肺炎、变应性曲霉病、隐源性肺嗜酸性粒细胞增多症、闭塞性细支气管炎组织肺炎、荨麻疹、狼疮样肝炎、家族性寒冷性自主炎症综合征、Muckle-Wells综合征、新生儿发作多系统炎性疾病、移植物排斥(包括同种异体移植物排斥和移植物抗宿主病)、耳炎、慢性阻塞性肺病、鼻窦炎、慢性前列腺炎、再灌注损伤、矽肺、炎性肌病、超敏反应和偏头痛。在一些实施方式中，炎性病症与感染(例如病毒感染、细菌感染、真菌感染、寄生虫感染或朊病毒感染)相关。在一些实施方式中，炎性病症与变应性应答相关。在一些实施方式中，炎性病症与污染物相关(例如石棉沉着病、矽肺或铍中毒)。
在一些实施方式中，炎性病症可以是局部病症，例如皮疹或变应性反应。
在一些实施方式中，炎症与创伤相关。在一些实施方式中，本文所述的技术涉及促进创伤愈合的方法。本文所使用的“创伤”泛指归因于外部暴力、机械机构或传染病的对生物体的组织或器官的损伤，通常涉及组织分裂或膜(例如皮肤)破裂。创伤可以是其中的组织完整性和/或强度已被降低(例如，外伤已经对组织造成损害)的上皮创伤、内皮创伤、结缔组织创伤、眼部创伤或任何其它类型的创伤。术语“创伤”涵盖损伤，包括但不限于撕裂伤(laceration)、擦伤、扯裂伤(avulsion)、割伤、烧伤、速度创伤(例如枪伤)、戳伤、刺伤、挫伤、糖尿病创伤、血肿、撕裂创伤和/或挤压损伤。在一个方面，术语“创伤”是指以多种方式中的任一种所引发的对皮肤和皮下组织的损伤(例如，来自长期卧床的褥疮；通过外伤、割伤、溃疡、烧伤等引起的创伤)，并且具有不同的特性。本文所使用的术语“创伤愈合”是指受伤生物体的机体在创伤部位(例如皮肤)处开始修复组织的过程。创伤愈合过程部分地需要受创伤的组织的血管生成和血管重建。可通过评估本领域技术人员已知的诸如以下的参数来测量创伤愈合：收缩、创伤面积、闭合百分比、闭合百分率和/或血管浸润。在一些实施方式中，可局部施用本文所述的颗粒和组合物，以促进创伤愈合。
本文所使用的术语“激动剂”是指增加靶标(例如NRP-2)的活性和/或水平的任何试剂。本文所使用的术语“激动剂”是指使靶标的活性和/或表达增加至少10％以上、例如10％以上、50％以上、100％以上、200％以上、500％以上或者1000％以上。Sema3F的激动剂的非限制性实例可包括Sema3F多肽或其激动剂片段以及编码Sema3F多肽的核酸，例如包含序列SEQ SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5的多肽或者包含序列SEQ ID NO：2或其变体的核酸。
本文所使用的术语“Sema3F”是指与NRP-1相比优先结合至NRP-2的第III类脑信号蛋白的成员。对于许多物种而言，Sema3F多肽和核酸的序列是本领域已知的，例如人Sema3F(NCBI基因ID：6405)多肽(SEQ ID NO：1；NCBI参考序列：NP_004177)和核酸(SEQ ID NO：2；NCBI参考序列：NM_004186)。可通过例如测定Sema3F与NRP-2的结合水平、选择NRP-2信号传导应答、免疫应答参数的水平和/或活性方面的变化，对血液、血清和/或血浆中的Sema3F水平进行评估，并可对Sema3F的活性进行测量，其中，通过降低的免疫应答和/或同种免疫应答(例如移植后的细胞迁移、细胞因子应答性或致敏(priming))证实了增高的Sema3F活性。
在一些实施方式中，Sema3F激动剂可以是Sema3F多肽或其功能性片段或者编码Sema3F多肽或其功能性片段的核酸。本文所使用的“Sema3F多肽”可包括人多肽(SEQ IDNO：1，NCBI参考序列：NP_004177)、成熟人多肽(SEQ ID NO：5)；以及来自其它物种(包括但不限于牛、犬、猫、鸡、小鼠、大鼠、猪、羊、火鸡、马、鱼、狒狒和其它灵长类动物)的同源物。该术语还指例如在合适的动物模型中所测量的维持SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5的全长Sema3F的至少50％活性或效应(例如阻抑同种异体移植物排斥)的Sema3F的片段或变体。维持野生型Sema3F活性的保守性置换变体将包括本文所定义的保守性置换。通过例如与来自其它物种的Sema3F同源物或旁系同源物的序列比对，对最可能耐受保守性置换并同时维持野生型活性的至少50％的氨基酸的识别进行指导。在Sema3F同源物之间相同的氨基酸不太可能耐受变化，而显示出保守性差异的氨基酸显然更容易在人工变体的情况下耐受保守性变化。类似地，具有非保守性差异的位置对于功能而言不太可能是关键的，并且更可能耐受人工变体中的保守性置换。通过例如将变体给予至本文所述的同种异体移植物排斥的合适的动物模型，可对变体、片段和/或融合蛋白的活性进行测试。Sema3F和NRP-2的结构的进一步讨论可见于例如Klagsbrun M，Eichmann A，Cytokine Growth Factor Rev，2005；以引用的方式将其整体并入本文。
在一些实施方式中，多肽(例如Sema3F多肽)可以是本文所述序列的变体，例如包含氨基酸序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5的Sema3F多肽的变体。在一些实施方式中，变体是保守性置换变体。变体可通过例如天然核苷酸序列的突变来获得。本文所提及的“变体”是与天然多肽或参考多肽基本上同源的多肽，但由于一个或多个缺失、插入或置换，该变体具有与天然多肽或参考多肽的氨基酸序列不同的氨基酸序列。当与天然DNA序列或参考DNA序列相比时，编码多肽的DNA序列涵盖了包含核苷酸的一个或多个添加、缺失或置换，但编码变体蛋白或其片段的序列，所述变体蛋白或其片段相对于参考蛋白保留了相关的生物活性(例如可阻抑至少50％的同种异体移植物排斥以及野生型Sema3F)。对于氨基酸序列，技术人员将认识到改变经编码的序列中的单个氨基酸或小比例(即5％以下、例如4％以下或3％以下或1％以下)氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白序列的个别置换、缺失或添加是“保守修饰的变体”，其中所述改变引起用化学上类似的氨基酸对氨基酸进行置换。在考虑之列的是，一些变化可有效地改进相关活性，以便使得变体(无论是保守的还是非保守的)具有超过100％(例如110％、125％、150％、175％、200％、500％、1000％以上)的野生型Sema3F活性。
对可被置换的氨基酸残基进行识别的一种方法是将例如人Sema3F与来自一种或多种非人物种的Sema3F同源物进行比对。比对不仅可在对于功能而言可能是必需的残基方面，而且相反地在可能耐受变化的那些残基方面提供了指导。其中，例如，当比对在相应位置显示出两个相同或相似的氨基酸时，该位点更有可能在功能上是重要的。其中，相反，当比对显示出在相应位置的残基在大小、电荷、疏水性等方面显著不同时，该位点更有可能可耐受功能性多肽的变异。变体氨基酸或DNA序列可与天然序列或参考序列(例如SEQ ID NO：1或编码那些氨基酸序列之一的核酸)具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％以上的一致性。可例如通过使用万维网上常用于此目的的免费可得的计算机程序对两个序列进行比较，确定天然序列和突变序列之间的同源性程度(一致性百分比)。变体氨基酸或DNA序列可与其来源的序列(本文称为“原始”序列)具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％以上的相似性。可例如通过使用相似矩阵，确定原始序列和突变序列之间的相似程度(相似性百分比)。相似矩阵在本领域中是熟知的，并且使用相似矩阵以用于比较两个序列的许多工具可从线上免费获得并具有缺省参数设置，例如BLASTp(可在万维网http://blast.ncbi.nlm.nih.gov上获得)。
给定的氨基酸可通过具有类似生化特性的残基替换，例如，用一个脂肪族残基置换另一个(例如Ile、Val、Leu或Ala彼此置换)，或用一个极性残基置换另一个(例如Lys和Arg之间的置换；Glu和Asp之间的置换；或者Gln和Asn之间的置换)。其它此类保守性置换(例如具有类似疏水性特性的整个区域的置换)是熟知的。能够以本文所述的任何一种测定法对包含保守性氨基酸置换的多肽进行测试，以确认天然多肽或参考多肽的期望活性得以保留。提供了功能上类似的氨基酸的保守性置换表是本领域熟知的。除了此类保守性修饰变体之外，并不排除与本公开内容一致的多态变体、种间同源物和等位基因。通常彼此的保守性置换包括：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；以及8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton，Proteins(1984))。
通常，还可用丝氨酸对不参与维持多肽的适当构象的任何半胱氨酸残基进行置换，以改进分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反，可将半胱氨酸键添加至多肽，以改进多肽的稳定性或促进寡聚化。
在一些实施方式中，向受试者给予的多肽(例如Sema3F多肽)可包含一个或多个氨基酸置换或修饰。在一些实施方式中，置换和/或修饰可在受试者中防止或降低蛋白水解和/或延长多肽的半衰期。在一些实施方式中，可通过将多肽与其它多肽或多肽结构域(例如作为非限制性实例的运铁蛋白(WO06096515A2)、白蛋白(Yeh等，1992)、生长激素(US2003104578AA)、纤维素(Levy和Shoseyov，2002)和/或Fc片段(Ashkenazi和Chamow，1997))缀合或融合，对多肽进行修饰。将上述段落中的参考文献以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方式中，本文所述的多肽(例如Sema3F多肽)可包含至少一个肽键替换。本文所述的Sema3F多肽可包含一种类型的肽键替换或多种类型的肽键替换，例如，2种类型、3种类型、4种类型、5种类型或更多类型的肽键替换。肽键替换的非限制性实例包括脲、硫脲、氨基甲酸酯、磺酰脲、三氟乙胺、邻-(氨基烷基)-苯乙酸、对-(氨基烷基)-苯乙酸、间-(氨基烷基)-苯乙酸、硫代酰胺、四唑、硼酸酯、烯烃基团以及它们的衍生物。
在一些实施方式中，本文所述的多肽(例如Sema3F多肽)可包含天然存在的氨基酸，所述天然存在的氨基酸通常发现于通过活生物体产生的多肽和/或蛋白质中，例如Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)、Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)、Asp(D)、Glu(E)、Lys(K)、Arg(R)和His(H)。在一些实施方式中，本文所述的Sema3F多肽可包含替代的氨基酸。替代的氨基酸的非限制性实例包括：D-氨基酸；β-氨基酸；同型半胱氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸、磷酸酪氨酸、羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸盐/酯；马尿酸、八氢吲哚-2-羧酸、抑胃酶氨酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、青霉胺(3-巯基-D-缬氨酸)、鸟氨酸、瓜氨酸、α-甲基-丙氨酸、对-苯甲酰基苯丙氨酸、对-氨基苯丙氨酸、p-氟苯丙氨酸、苯基甘氨酸、炔丙基甘氨酸、肌氨酸和叔丁基甘氨酸、二氨基丁酸、7-羟基-四氢异喹啉羧酸、萘基丙氨酸、联苯基丙氨酸、环己基丙氨酸、氨基-异丁酸、正缬氨酸、正亮氨酸、叔亮氨酸、四氢异喹啉羧酸、哌啶酸、苯基甘氨酸、高苯丙氨酸、环己基甘氨酸、脱氢亮氨酸、2,2-二乙基甘氨酸、1-氨基-1-环戊烷羧酸、1-氨基-1-环己烷羧酸、氨基苯甲酸、氨基萘甲酸、γ-氨基丁酸、二氟苯丙氨酸、哌啶甲酸、α-氨基丁酸、噻吩基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、三氟缬氨酸；六氟亮氨酸；氟化类似物；叠氮化物修饰的氨基酸；炔修饰的氨基酸；氰基修饰的氨基酸；以及它们的衍生物。
在一些实施方式中，可通过例如向一起组成肽的一个或多个氨基酸添加基团(moiety)，对多肽(例如Sema3F多肽)进行修饰。在一些实施方式中，本文所述的多肽可包含一个或多个基团分子，例如每个多肽1个或多个基团分子、每个多肽2个以上基团分子、每个多肽5个以上基团分子、每个多肽10个以上基团分子或每个多肽更多的基团分子。在一些实施方式中，本文所述的多肽可包含一种或多种类型的修饰和/或基团，例如1种类型的修饰、2种类型的修饰、3种类型的修饰或更多类型的修饰。修饰和/或基团的非限制性实例包括：PEG化、糖基化、HES化、ELP化、脂化、乙酰化、酰胺化、封端修饰、氰基基团、磷酸化、白蛋白以及环化。在一些实施方式中，封端修饰可包括在N-末端的乙酰化、N-末端酰化和N-末端甲酰化。在一些实施方式中，封端修饰可包括：在C末端的酰胺化；C末端醇、醛、酯和硫酯基团的引入。可通过添加基团(例如PEG、白蛋白或其它融合标签(例如免疫球蛋白的Fc片段))，增加多肽的半衰期。
在一些实施方式中，向受试者给予的Sema3F多肽可以是本文所述的Sema3F氨基酸序列之一的功能性片段。本文所使用的“功能性片段”是Sema3F多肽的片段或区段，根据本文以下所述的测定法，其可阻抑受试者中的免疫应答(例如阻抑同种异体移植物排斥)。功能性片段可包含本文所公开的序列的保守性置换。
原始氨基酸序列的改变可通过本领域技术人员已知的多种技术的任一种来完成。例如，可通过合成含有突变序列的寡核苷酸而在特定基因座引入突变，所述寡核苷酸侧翼位允许与天然序列的片段连接的限制性位点。连接后，所得到的重构序列编码具有期望的氨基酸插入、置换或缺失的类似物。或者，可使用寡核苷酸指导的位点特异性的突变发生程序，以提供具有特定密码子的改变的核苷酸序列，所述特定密码子根据所需的置换、缺失或插入而改变。用于进行此类改变的技术包括通过以下所公开的技术，以引用的方式将它们整体并入本文：Khudyakov等“Artificial DNA：Methods and Applications”CRC Press，2002；Braman“In Vitro Mutagenesis Protocols”Springer，2004；以及Rapley“TheNucleic Acid Protocols Handbook”Springer 2000。在一些实施方式中，可化学合成本文所述的多肽，并且可将突变作为化学合成过程的一部分而并入。
在一些实施方式中，Sema3F多肽或其功能性片段可以是能够结合Sema3F受体的Sema3F多肽，例如NRP-2。在一些实施方式中，Sema3F多肽或其功能性片段可以是能够结合NRP-2的结构域(选自于由A1结构域、A2结构域、B1结构域和B2结构域所组成的组)的Sema3F多肽。
本文所使用的“NRP-2”或“神经毡蛋白-2”是指识别第3类脑信号蛋白和VEGF的跨膜糖蛋白受体。NRP调控轴突生长和血管生成。NRP2和NRP1的区别可在于，NRP2对Sema-3F(而非Sema-3A)具有更高的亲和力。NRP-2基因、转录物和多肽的序列在多种物种中是已知的，例如，人NRP-2mRNA(例如SEQ ID NO：3；NCBI参考序列：NM_201266)和多肽(例如SEQ IDNO：4；NCBI参考序列：NP_957718)序列(NCBI基因ID：8828)。NRP-2包含A1结构域(例如对应于SEQ ID NO：4的第28-141位的氨基酸)、A2结构域(例如对应于SEQ ID NO：4的第149-265位的氨基酸)、B1结构域(例如对应于SEQ ID NO：4的第277-427位的氨基酸)以及B2结构域(例如对应于SEQ ID NO：4的第433-592位的氨基酸)。NRP-2结构的进一步讨论可见于本领域的例如Appleton等，The EMBO Journal 2007 26：4901-4912；以引用的方式将其整体并入本文。可溶性NRP-2多肽可以是对应于SEQ ID NO：4的第1-862位的氨基酸的至少一部分的NRP-2多肽。在一些实施方式中，可溶性NRP-2多肽可包含SEQ ID NO：4的至少第1-862位的氨基酸。在一些实施方式中，可溶性NRP-2多肽可包含选自SEQ ID NO：4的第1-862位氨基酸中的至少25个连续氨基酸，例如选自SEQ ID NO：4的第1-862位氨基酸中的至少25个、至少50个、至少100个、至少200个、至少250个、至少300个或至少500个连续氨基酸。在一些实施方式中，可溶性NRP-2多肽可包含选自A1、A2、B1和/或B2的至少一种NRP-2结构域。在一个实施方式中，用于调节免疫炎性应答的可溶性NRP-2多肽将结合Sema3F。
本发明的多肽可通过使用熟知的方法进行合成，包括重组方法和化学合成。通过将包含编码多肽的核酸的载体引入合适的宿主细胞中来产生多肽的重组方法是本领域熟知的，例如在如下中描述的，以引用的方式将两者的内容并入本文：Sambrook等，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第2版，卷1至8，Cold Spring Harbor，NY(1989)；M.W.Pennington和B.M.Dunn，Methods in Molecular Biology：Peptide SynthesisProtocols，卷35，Humana Press，Totawa，NJ(1994)。还可使用本领域熟知的方法对肽进行化学合成。参见例如Merrifield等，J.Am.Chem.Soc.85：2149(1964)；Bodanszky,M.，Principles of Peptide Synthesis，Springer-Verlag，New York，NY(1984)；Kimmerlin,T.和Seebach,D.J.Pept.Res.65：229-260(2005)；Nilsson等，Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(2005)34：91-118；W.C.Chan和P.D.White(编)FmocSolid Phase Peptide Synthesis：A Practical Approach，Oxford University Press，Cary，NC(2000)；N.L.Benoiton，Chemistry of Peptide Synthesis，CRC Press，BocaRaton，FL(2005)；J.Jones，Amino Acid and Peptide Synthesis，第2版，OxfordUniversity Press，Cary，NC(2002)；以及P.Lloyd-Williams，F.Albericio和E.Giralt，Chemical Approaches to the synthesis of peptides and proteins，CRC Press，BocaRaton，FL(1997)，以引用的方式将其所有内容并入本文。还可按照美国专利号4,612,302、4,853,371和4,684,620以及美国专利申请公开号2009/0263843中所描述的，对肽衍生物进行制备，以引用的方式将其所有内容并入本文。
在一些实施方式中，本文所述的技术涉及编码本文所述的多肽(例如Sema3F多肽)的核酸。本文所使用的术语“核酸”或“核酸序列”是指并入核糖核酸、脱氧核糖核酸或它们的类似物的单元的任何分子，优选聚合分子。核酸可以是单链或双链的。单链核酸可以为变性的双链DNA的一条核酸链。或者，单链核酸可以是并非源自任何双链DNA的单链核酸。在一个方面，模板核酸是DNA。在另一方面，模板是RNA。合适的核酸分子包括DNA(包括基因组DNA或cDNA)。其它合适的核酸分子包括RNA(包括mRNA)。核酸分子可以是如在基因组DNA中天然存在的，或者可以是合成的(即基于人的行为制备的)或者可以是两者的组合。核酸分子还可具有一些修饰，例如美国专利申请20070213292中所描述的2’-脱氧、2’-脱氧-2’-氟、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)、胆固醇添加和硫代磷酸酯主链；以及美国专利号6,268,490中描述的在2’-氧原子和4’-碳原子之间用亚甲基单元连接的一些核糖核苷，将专利和专利申请以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方式中，编码本文所述的Sema3F多肽的核酸被包含在载体中。在本文所述的一些方面中，将编码本文所述的Sema3F多肽的核酸序列可操作地连接至载体。本文所使用的术语“载体”是指被设计用于递送至宿主细胞或用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。本文所使用的载体可以是病毒的或非病毒的。术语“载体”涵盖了当与合适的控制元件相关联时能够复制并且可将基因序列转移至细胞的任何遗传元件。载体可包括但不限于克隆载体、表达载体、质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒粒等。
本文所使用的术语“表达载体”是指对从连接至载体上的转录调控序列的序列进行的RNA或多肽的表达进行指导的载体。所表达的序列通常但不必须对于细胞而言是异源的。表达载体可包含额外的元件，例如表达载体可具有两种复制系统，从而允许其保持在两种生物体中，例如在人细胞中用于表达并在原核宿主中用于克隆和扩增。术语“表达”是指参与产生RNA和蛋白质以及适当时分泌蛋白质的细胞过程，包括(如果适用的话)但不限于例如转录、转录物加工、翻译和蛋白质折叠、修饰和加工。“表达产物”包括转录自基因的RNA以及通过转录自基因的mRNA的翻译而获得的多肽。术语“基因”意为当可操作地连接至合适的调控序列时，在体外或体内转录(DNA)成RNA的核酸序列。基因可包括或可不包括编码区域之前和之后的区域，例如，5’未翻译(5’UTR)或“前导”序列以及3’UTR或“尾随”序列、以及个体编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
本文所使用的术语“病毒载体”是指包含病毒来源的至少一种元件并且具有包装到病毒载体颗粒的能力的核酸载体构建体。病毒载体可包含编码本文所述的Sema3F多肽的核酸，以代替非必需的病毒基因。可出于在体外或体内将核酸转移到细胞中的目的来使用载体和/或颗粒。许多形式的病毒载体是本领域已知的。
“重组载体”意为包含异源核酸序列或能够在体内表达的“转基因”的载体。应当理解的是，在一些实施方式中，本文所述的载体可与其它合适的组合物和治疗剂组合。在一些实施方式中，载体是附加型的。合适的附加型载体的使用提供了使受试者中的感兴趣的核苷酸维持在高拷贝数的染色体外DNA的手段，从而消除了染色体整合的潜在影响。
在一些实施方式中，受试者中的例如Sema3F的水平比治疗之前的受试者中(或靶组织或系统中)的Sema3F水平增加至少20％、例如20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、100％以上、150％以上、200％以上、250％以上、300％以上或350％以上。在一些实施方式中，受试者中的Sema3F水平比治疗之前的受试者中的Sema3F水平增加至少100％。在一些实施方式中，受试者中的Sema3F的水平比治疗之前的受试者中的Sema3F水平增加至少200％。
在一些实施方式中，可静脉内给予Sema3F激动剂。在一些实施方式中，可肌内、皮下或真皮内给予Sema3F激动剂。在一些实施方式中，可将Sema3F激动剂局部给予至炎症部位。
在一个方面，本文描述了增加有需要的受试者中的免疫应答的方法，该方法包括向受试者给予Sema3F抑制剂或NRP-2抑制剂或丛蛋白A1抑制剂中的一种或多种。在一些实施方式中，需要增加免疫应答的受试者可以是患有癌症(例如患有肿瘤)的受试者。在一些实施方式中，需要增加免疫应答的受试者可以是患有感染(例如细菌或病毒感染)的受试者。
本文所使用的术语“抑制剂”是指能够将所靶向的表达产物(例如编码靶标的mRNA或靶多肽)的表达和/或活性降低例如至少10％以上(例如10％以上、50％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上或98％以上)的试剂。可通过例如测量Sema3F的表达产物的水平和/或Sema3F的活性，对例如Sema3F的抑制剂的效力(例如其降低Sema3F的活性和/或水平的能力)加以确定。用于测量给定mRNA和/或多肽的水平的方法是本领域技术人员已知的，例如RTPCR可用于确定RNA的水平，抗体(例如抗Sema3F抗体，例如Cat No.ab39956；Abcam；Cambridge，MA)的蛋白质印迹可用于确定多肽的水平。可使用本领域已知的和本文上述方法来确定例如Sema3F的活性。在一些实施方式中，抑制剂可以是抑制性核酸；适体；抗体试剂；抗体；或小分子。
可通过弗林蛋白酶样酶来切割Sema3F。因此，在一些实施方式中，Sema3F的抑制剂可以是弗林蛋白酶样多肽或编码弗林蛋白酶样多肽的核酸。相反，在一些实施方式中，Sema3F的激动剂可以是弗林蛋白酶样多肽抑制剂，例如抑制性核酸或小分子抑制剂。小分子弗林蛋白酶样多肽抑制剂是本领域已知的，并且可包括但不限于弗林蛋白酶抑制剂I(例如Cat No.344930；EMD Millipore；Billerica MA)、弗林蛋白酶抑制剂II(例如Cat.No.344931；EMD Millipore；Billerica MA)以及前蛋白转化酶抑制剂(例如Cat.No.537076；EMD Millipore；Billerica MA)。弗林蛋白酶抑制剂的进一步讨论可见于例如Becker等，J Med Chem 2010，53：1067-1075和Becker等，JBC 2012，287：21992-22003；以引用的方式将其各自整体并入本文。
本文所使用的“弗林蛋白酶样多肽”是指具有以下的前蛋白转化酶(PCSK)：枯草杆菌蛋白酶相关的催化结构域以及处于枯草杆菌蛋白酶结构域的羧基末端的P-结构域。PCSK切割前蛋白，以产生活性成熟蛋白。弗林蛋白酶样多肽和/或PCSK可以是一种或多种PCSK1(例如PC1、PC3、PC1/3；NCBI基因ID：5122)、PCSK2(例如PC2；NCBI基因ID：5126)、PCSK3(例如弗林蛋白酶，Pace；NCBI基因ID：5045)、PCSK4(例如PC4；NCBI基因ID：54760)、PCSK5(例如PC5、PC6、PC5/6；NCBI基因ID：5125)、PCSK6(例如PACE4；NCBI基因ID：5046)、PCSK7(例如PC7、PC8；NCBI基因ID：9159)、PCSK8(例如位点1蛋白酶、S1P、SK1；NCBI基因ID：8720)、PCSK9(例如NARC-1；NCBI基因ID：255738)。弗林蛋白酶样多肽和编码弗林蛋白酶样多肽的相应核酸的序列是本领域已知的，并且对于许多物种而言，可从例如公共数据库(如NCBI)通过搜索所提供的基因名称而容易地获得。
本文所使用的“丛蛋白A1”是指可与NRP-2组合以结合至第III类脑信号蛋白(例如Sema3F)的跨膜蛋白。丛蛋白A1多肽和核酸的序列对于许多物种而言是已知的，例如人丛蛋白A1(NCBI基因ID：5361)的多肽(SEQ ID NO：6；NCBI参考序列：NP_115618)和核酸(SEQ IDNO：7；NCBI参考序列：NM_032242)。
在一些实施方式中，Sema3F抑制剂可以是可溶性NRP-2受体、例如可溶性NRP-2多肽。在一些实施方式中，NRP-2受体的可溶性片段包含选自于由A1结构域、A2结构域、B1结构域或B2结构域所组成的组中的至少一种结构域。可溶性NRP-2受体片段通常缺乏跨膜结构域。
在一些实施方式中，多肽的抑制剂可以是对于该多肽而言特异性的抗体试剂。在一些实施方式中，Sema3F抑制剂可以是抗Sema3F抗体试剂。在一些实施方式中，NRP-2抑制剂可以是抗NRP-2抗体试剂。在一些实施方式中，NRP-2抑制剂结合至NRP-2的细胞外结构域。
无论是衍生自天然产生抗体的任何物种，还是通过重组DNA技术创建，无论是否分离自血清、B细胞、杂交瘤、转染瘤、酵母或细菌，本文所使用的“抗体”是指IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子或它们的抗原特异性抗体片段(包括但不限于Fab、F(ab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、单域抗体、封闭构象多特异性抗体、二硫键连接的scfv、双特异抗体)。
本文所述的“抗原”是通过抗体试剂上的结合位点结合的分子。一般，抗原通过抗体配体结合并能够引发体内的抗体应答。抗原可以是多肽、蛋白、核酸或其它分子或它们的部分。术语“抗原决定簇”是指通过抗原结合分子、特别是通过所述分子的抗原结合位点识别的抗原上的表位。
本文所使用的术语“抗体试剂”是指多肽，所述多肽包含至少一个免疫球蛋白可变结构域或免疫球蛋白可变结构域序列，并特异性地结合给定的抗原。抗体试剂可包括抗体或含有抗体的抗原结合结构域的多肽。在一些实施方式中，抗体试剂可包括单克隆抗体或含有单克隆抗体的抗原结合结构域的多肽。例如，抗体可包括重(H)链可变区(本文中缩写为VH)和轻(L)链可变区(本文中缩写为VL)。在另一实例中，抗体包含两个重(H)链可变区和两个轻(L)链可变区。术语“抗体试剂”涵盖了抗体的抗原结合片段(例如单链抗体、Fab片段和sFab片段、F(ab’)2、Fd片段、Fv片段、scFv、CDR和结构域抗体(dAb)片段(参见例如deWildt等，Eur J.Immunol.1996；26(3)：629-39；以引用的方式将其整体并入本文))以及完整抗体。抗体可具有IgA、IgG、IgE、IgD或IgM(以及其亚型及它们的组合)的结构特性。抗体可来自于任何来源，包括小鼠抗体、兔抗体、猪抗体、大鼠抗体和灵长类动物(人和非人灵长类动物)抗体、以及灵长类动物化抗体。抗体还包括midibodies、人源化抗体、嵌合抗体等。
VH区和VL区可进一步细分为高变区(称为“互补决定区”(“CDR”))和插有的更为保守的区域(称为“框架区”(“FR”))。框架区和CDR的范围已被精确定义(参见Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department ofHealth and Human Services，NIH Publication No.91-3242，以及Chothia,C.等(1987)J.Mol.Biol.196：901-917；以引用的方式将其整体并入本文)。各VH和VL通常由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
本文所使用的术语“特异性结合”是指两个分子、化合物、细胞和/或颗粒之间的化学相互作用，其中，与第一实体结合至非靶标的第三实体相比，第一实体以更高的特异性和亲和力与第二靶实体结合。在一些实施方式中，特异性结合可以指与第一实体对第三非靶标实体的亲和力相比，第一实体对第二靶标实体的亲和力为至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍或者更高。
此外，如本文所述，用于人的治疗的重组人源化抗体可以进一步被优化，以降低潜在的免疫原性，同时保持功能活性。在这方面，功能活性是指多肽能够显示与本文所述的该多肽的重组抗体或抗体试剂相关的一种或多种已知的功能活性。此类功能活性包括例如结合至Sema3F的能力。
在一些实施方式中，本文所述的方法涉及用本文所述试剂(例如Sema3F激动剂)对患有或诊断为患有炎性病症的受试者进行治疗。可通过医师使用现有的诊断方法识别患有例如炎性病症的受试者。表征这些病症以及辅助诊断的例如炎性病症的症状和/或并发症为本领域所熟知的，包括但不限于升高水平的免疫应答标志物、肿胀和/或热度。炎性病症的家族史或暴露至炎性病症的危险因素也可帮助确定受试者是否有可能患炎性病症、或者帮助对具体的炎性病症进行诊断。
本文所述的组合物和方法可给予至患有或诊断为患有例如炎性病症、或者需要免疫阻抑(例如已经接受同种异体移植物或移植)的受试者。在一些实施方式中，本文所述的方法包括将本文所述的有效量的组合物给予至受试者，以缓解例如炎性病症的症状。本文所使用的“缓解症状”是改善与病症有关的任何病症或症状。与同等的未经处理的对照相比，此类降低是通过任何标准技术测量降低至少10％。本领域技术人员已知用于将本文所述的组合物给予至受试者的多种手段。此类方法可以包括但不限于：胃肠外给予、静脉内给予、肌内给予、皮下给予、经皮给予、气道(气溶胶)给予、肺部给予、皮肤给予、局部给予或注射给予。给予可以是局部的或全身性的。
本文所使用的术语“有效量”是指缓解疾病或紊乱的至少一种或多种症状所需的组合物的量，并涉及足以提供期望效果的药物组合物的量。因此，术语“治疗有效量”是指当给予至典型受试者时，足以提供特定效果的量。在各种背景下，本文所使用的有效量也包括足以推迟疾病症状进展的量、足以改变疾病症状进程(例如但不限于延缓疾病症状的进展)的量、或足以逆转疾病症状的量。因此，指定确切的“有效量”通常是不实际的。然而，对于任何给定的情况，适当的“有效量”可以由本领域普通技术人员仅使用常规实验来确定。
有效量、毒性和治疗效果可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定，例如用于确定LD50(使群体50％致死的剂量)和ED50(在群体50％中治疗有效的剂量)的药学程序。剂量可以根据所采用的剂型和所利用的给予途径而变化。毒性作用和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并可表示为比例LD50/ED50。表现出大的治疗指数的组合物和方法是优选的。治疗有效剂量可以从细胞培养物检测初步估算。另外，剂量可在动物模型中制定以达到循环血浆浓度范围，所述循环血浆浓度范围包括在细胞培养物中或在合适的动物模型中确定的IC50(即，达到症状的半数最大抑制的组合物的浓度)。血浆中的水平可以通过例如免疫测定法或色谱法进行测量。任何特定剂量的影响可以通过合适的生物测定法进行监测，例如用于其中包括免疫应答的测定法。所述剂量可以由医师来确定并在必要时进行调整，以适合所观察到的治疗效果。
在一些实施方式中，本文所述的技术涉及本文所述的药物组合物以及任选的药学上可接受的载体。药学上可接受的载体和稀释剂包括盐水、水性缓冲溶液、溶剂和/或分散媒介物。通常将多肽(例如Sema3F)配制用于胃肠外给予，并且可以与适于胃肠外给予途径的任何载体组合。本领域公知此类载体和稀释剂的使用。可作为药学上可接受的载体的材料的一些非限制性实例包括：(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和醋酸纤维素；(4)黄蓍胶粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，例如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石；(8)赋形剂，例如可可脂和栓蜡；(9)油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG)；(12)酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；(22)填充剂，例如多肽和氨基酸；(23)血清成分，例如血清白蛋白、HDL和LDL；(24)C2-C12醇，例如乙醇；以及(25)用于药物制剂中的其它无毒相容物质。润湿剂、着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于制剂中。术语例如“赋形剂”、“载体”、“药学上可接受的载体”等在本文中可互换使用。在一些实施方式中，如本文所述的，载体抑制活性试剂的降解。
在一些实施方式中，本文所述的药物组合物可以是胃肠外剂型。由于胃肠外剂型的给予通常绕开患者对污染物的天然防御，胃肠外剂型优选是无菌的或能够在给予患者之前灭菌。胃肠外剂型的实例包括但不限于：准备用于注射的溶液剂、待溶解或悬浮于用于注射的药学上可接受的载体中的干燥产品、准备用于注射的混悬剂、以及乳液。此外，可制备控释的胃肠外剂型用来给予患者，包括但不限于型剂型和剂量倾泻(dose-dumping)。
可以用来提供胃肠外剂型的合适的载体对本领域技术人员来说是公知的。实例包括但不限于：无菌水；USP注射用水；盐水溶液；葡萄糖溶液；水性载体，例如但不限于氯化钠注射液、林格氏注射液、右旋糖注射液、右旋糖和氯化钠注射液、以及乳酸林格氏注射液；与水混溶的载体，例如但不限于乙醇、聚乙二醇和丙二醇；以及非水性载体，例如但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。改变或修饰本文所公开的组合物的药学上可接受的盐的溶解度的化合物也可以纳入本公开内容的胃肠外剂型中，包括常规和控释的胃肠外剂型。
常规剂型通常提供药物从制剂中的快速或立即释放。根据药物的药理学和药代动力学，使用常规剂型可使得患者的血液和其它组织中的药物浓度的大幅波动。这些波动可能影响许多参数，例如剂量频率、起效时间、疗效的持续时间、治疗性血液水平的维持、毒性、副作用等。有利的是，控释制剂可用于控制药物的起效时间、作用持续时间、治疗窗内的血浆水平以及峰值血液水平。特别是，控释或缓释(extended-release)剂型或制剂可用于确保实现药物的最大效果，同时使潜在的副作用和安全隐患最小化，副作用和安全隐患可能在药物的不足量给药(即，低于最低治疗水平)以及超过药物的毒性水平时出现。在一些实施方式中，组合物能够以持续释放(sustained release)制剂给予。
控释药物产品具有改进药物治疗高于通过它们的非控释对应物所实现的治疗的共同目标。理想的是，在医学治疗中使用优化设计的控释制剂的特性在于，使用最少的药物物质在最短时间内治愈或控制病情。控释制剂的优点包括：1)延长药物活性；2)降低剂量频率；3)提高患者依从性；4)使用较少的药物总量；5)减少局部或全身性副作用；6)使药物累积最小化；7)减少血液水平的波动；8)改善治疗功效；9)减少药物活性的增强作用或损失；以及10)改善疾病或病情的控制速度(Kim，Cherng-ju，Controlled Release Dosage FormDesign，2(Technomic Publishing，Lancaster，Pa.:2000))。
大多数控释制剂被设计为最初释放一定量的药物(有效成分)，以立即产生期望的治疗效果，并逐步且持续地释放另外量的药物以在一段长的时间内维持这一水平的治疗或预防作用。为了在体内维持药物的这一恒定水平，药物必须从剂型中以一定速度释放以置换药物从体内代谢和排出的量。活性成分的控释可以受到多种条件的刺激，包括但不限于：pH、离子强度、渗透压、温度、酶、水以及其它的生理病症或化合物。
各种已知的控释或缓释剂型、制剂和装置可适于用于本公开所述的盐和组合物。实例包括但不限于在以如下中描述的实例：美国专利号3,845,770、3,916,899、3,536,809、3,598,123、4,008,719、5,674,533、5,059,595、5,591,767、5,120,548、5,073,543、5,639,476、5,354,556、5,733,566以及6,365,185B1；以引用的方式将其各自并入本文。这些剂型可用于使用例如羟丙基甲基纤维素、其它聚合物基质、凝胶、可透膜、渗透系统(如(Alza Corporation，Mountain View，Calif.USA))或它们的组合提供一种或多种活性成分的缓慢释放或控释，从而提供期望的不同比例的释放曲线。
本文所述的方法可以进一步包括向受试者给予第二试剂和/或治疗，例如作为组合治疗的一部分。通过非限制性实例的方式，如果受试者待根据本文所述的方法进行炎症治疗，还可以向受试者给予已知对患有疼痛或炎症的受试者有益的第二试剂和/或治疗。此类试剂和/或治疗的实例包括但不限于：非甾体抗炎药(NSAIDs，例如阿司匹林、布洛芬或萘普生)；皮质类固醇，包括糖皮质激素(例如皮质醇、泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、地塞米松、倍他米松、曲安西龙和倍氯米松)；氨甲喋呤；柳氮磺胺吡啶；来氟米特；抗TNF药物；环磷酰胺；促消退药物(pro-resolving drugs)；麦考酚酯；或阿片剂(例如内啡肽、脑啡肽和强啡肽)、类固醇、镇痛药、巴比妥酸盐、羟考酮、吗啡、利多卡因等。在一些实施方式中，额外的抗炎剂可以是类固醇(例如皮质类固醇或糖皮质激素)；钙调磷酸酶抑制剂(例如环孢菌素、他克莫司、吡美莫司或FK506)；mTOR抑制剂(例如依维莫司、替西罗莫司、雷帕霉素、deforolimus、TOP216、OSI-027、TAFA93、nab-雷帕霉素、他克莫司、佐他莫司、CI-779、ABT-578、AP-23675、BEZ-235、QLT-0447、ABI-009、BC-210、salirasib、AP-23841、AP-23573、KU-0059475、32-脱氧雷帕霉素、16-戊-2-炔基氧基-32-脱氧雷帕霉素、16-戊-2-炔基氧基-32(S或R)-二氢-雷帕霉素、16-戊-2-炔基氧基-32(S或R)-二氢-40-O-(2-羟基乙基)-雷帕霉素、40-O-(2-羟基乙基)-雷帕霉素、32-脱氧雷帕霉素；16-戊-2-炔基氧基-32(S)-二氢雷帕霉素；所谓的雷帕霉素类似物(rapalogs)；AP23464；PI-103、PP242、PP30、Torin1；以及它们的衍生物或药学上可接受的盐；以及在例如如下中描述的化合物,以引用的方式将其整体并入本文：美国专利公开2011/0178070、2011/0021515、2007/0112005、2011/0054013，国际专利公开WO98/02441、WO01/14387、WO99/15530、WO07/135411、WO03/64383、WO96/41807、WO95/16691、WO94/09010，欧洲专利号EP1880723，以及美国专利号8,163,775、6,329,386、6,200,985、6,117,863、6,015,815、6,015,809、6,004,973、5,985,890、5,955,457、5,922,730、5,912,253、5,780,462、5,665,772、5,637,590、5,567,709、5,563,145、5,559,122、5,559,120、5,559,119、5,559,112、5,550,133、5,541,192、5,541,191、5,532,355、5,530,121、5,530,007、5,525,610、5,521,194、5,519,031、5,516,780、5,508,399、5,508,290、5,508,286、5,508,285、5,504,291、5,504,204、5,491,231、5,489,680、5,489,595、5,488,054、5,486,524、5,486,523、5,486,522、5,484,791、5,484,790、5,480,989、5,480,988、5,463,048、5,446,048、5,434,260、5,411,967、5,391,730、5,389,639、5,385,910、5,385,909、5,385,908、5,378,836、5,378,696、5,373,014、5,362,718、5,358,944、5,346,893、5,344,833、5,302,584、5,262,424、5,262,423、5,260,300、5,260,299、5,233,036、5,221,740、5,221,670、5,202,332、5,194,447、5,177,203、5,169,851、5,164,399、5,162,333、5,151,413、5,138,051、5,130,307、5,120,842、5,120,727、5,120,726、5,120,725、5,118,678、5,118,677、5,100,883、5,023,264、5,023,263以及5,023,262；雷帕霉素(西罗莫司)或其类似物(例如依维莫司、替西罗莫司、地磷莫司(ridaforolimus)、deforolimus)；或抗增殖剂(例如麦考酚酸莫酯、硫唑嘌呤)。在一些实施方式中，mTOR抑制剂可以是雷帕霉素或其类似物，例如依维莫司、替西罗莫司、地磷莫司或deforolimus。通过非限制性实例的方式，抗增殖剂可包括烷化剂(例如环磷酰胺、铂化合物和亚硝基脲)、抗代谢物(例如氨甲蝶呤、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、氟尿嘧啶等)和细胞毒性抗生素(例如放线菌素D、蒽环类抗生素、丝裂霉素C、博来霉素和光辉霉素)。
在一些实施方式中，本文所述的组合物的有效剂量可以一次给予患者。在一些实施方式中，组合物的有效剂量可以重复给予患者。对于全身给药，可以给予患者治疗量的组合物，例如1μg/kg、10μg/kg、0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、或更多。
在一些实施方式中，在初始治疗方案之后，可以在不太频繁的基础上给予治疗。例如，在每两周治疗进行三个月后，治疗可每月重复一次至六个月或一年或更长时间。根据本文所述的方法的治疗可以降低标志物的水平或病症的症状，例如免疫应答标志物降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％或更多。
本文所述的组合物的剂量可以由临床医师确定并在必要时进行调整，以适应观察到的治疗效果。至于治疗持续时间和治疗的频率，一般由熟练的临床医师监测受试者以确定何时治疗提供治疗效果，并确定是否增加或减少剂量、增加或降低给予频率、不继续治疗、恢复治疗或对治疗方案作出其它改变。给药计划可以每周至每天变化，这取决于许多临床因素，例如受试者对活性成分的敏感性。活性作用的期望的剂量或量可一次给予或分成亚剂量，例如2-4个亚剂量并在一段时间内(例如，以一天内的适当时间间隔或其它适当的计划)给予。在一些实施方式中，给予可以是长期的，例如在数周或数月的时间段内每天一次或多次给药和/或治疗。给药和/或治疗计划的实例是在1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月或更长的时间段内，每天给予、每天两次、每天三次或每天四次或更多次给予。组合物可以在一段时间内给予，例如在5分钟、10分钟、15分钟、20分钟或25分钟内。
根据本文所述的方法的组合物的给予剂量范围取决于：例如活性成分的形式、其效力，以及期望降低的本文所述的病症的症状、标记或指标的程度，例如对免疫反应而言期望的降低百分比，或者例如期望引起的免疫应答的程度。剂量不应大到以至于造成不利的副作用。通常，剂量会随患者的年龄、病症和性别而变化，并可由本领域的技术人员确定。在任何并发症的情况下，剂量也可由医师个体进行调整。
组合物在例如治疗本文所述的病症方面的效力、或者引起如本文所述的应答的效力可以由熟练的临床医师确定。然而，如同在本文中所使用的术语，如果本文所述的病症的一种或多种指征或症状以有益的方式改变、其它临床上接受的症状改善或甚至缓解、或诱发了期望的应答(例如，根据本文所述的方法在治疗后改变至少10％)，则治疗被认为是“有效的治疗”。效力可例如通过测量根据本文所述的方法处理的标记、指标、症状和/或病症的发生率或者适当测量任何其它可测量的参数(例如移植物排斥)进行评估。效力还可通过住院治疗或需要医学干预(即，疾病的进展停止)评估个体不再恶化而测量。测量这些指标的方法对于本领域技术人员来说是已知的和/或在本文得以描述。治疗包括个体或动物(一些非限制性实例包括人或动物)中的疾病的任何治疗，并包括：(1)抑制疾病，例如防止或者减缓症状(例如疼痛或炎症)的恶化；或(2)缓解疾病的严重程度，例如引起症状的复原。当该术语在本文中加以定义时，疾病治疗的有效量是指在向有需要的患者给予时，足以对疾病产生有效治疗的量。试剂的效力可以通过评估病症或期望的应答的物理指标确定。通过测量此类参数的任一者或参数的任何组合来监测给予和/或治疗的效力完全在本领域技术人员的能力范围内。可以在本文所述的病症的动物模型中评估效力，例如小鼠中的同种异体移植物排斥的治疗。当使用实验动物模型时，在观察到标记(例如活化的T细胞或B细胞的水平和/或增殖)中的统计学上显著的变化时，治疗的效力被证实。
本文提供了体外分析和动物模型分析，所述分析允许对给定剂量的本文所述组合物(例如Sema3F的激动剂)进行评估。通过非限制性实例的方式，可通过在组合物的存在和不存在下用丝裂原(抗CD3)处理CD4+T细胞以及通过测量细胞因子的增殖和/或产生，对组合物的作用和剂量应答进行评估，所述细胞因子包括但不限于IL-2、IL-4、IFN-γ、IL-17、IL-10、IL-15等，其中，通过细胞因子的程序和/或选择的降低的生产和/或较低水平的增殖，对神经毡蛋白-2活性进行指示。
还可以在动物模型(例如同种异体移植物排斥、结肠炎或皮肤炎症/迟发型超敏反应(DTH)的小鼠模型)中对给定剂量的组合的功效进行评估。例如，C57BL/6小鼠可以是来自BALB/c小鼠的心脏或皮肤同种异体移植物的受者。可以在例如至少1周-3周内对排斥和/或存活进行监测。在DTH中，可以在1天-7天内对皮肤肿胀进行监测。如本文所证实的，用Sema3F处理同种异体移植物受者抑制了同种异体移植物排斥。在用Sema3F处理后，炎性应答和DTH应答减少。此外，在移植物的受者中敲除神经毡蛋白-2导致加速的排斥。
为了方便起见，在说明书、实施例和附加的权利要求书中使用的一些术语和短语的含义在如下提供。除非另有说明或从上下文中暗示得到，下列术语和短语包含下面所提供的含义。提供这些定义以帮助描述特定的实施方式，而并不打算限制所要求保护的发明，因为本发明的范围仅通过权利要求书加以限定。除非另有定义，本文所使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。如果在本领域中的术语的使用与本文所提供的定义之间存在明显的差异，则以本说明书中提供的定义为准。
为了方便起见，本文在说明书、实施例和附加的权利要求书中使用的一些术语汇集在此处。
本文所使用的术语“减少”、“降低的”、“降低”或“抑制”都是指降低统计学上显著的量。在一些实施方式中，“下降”、“降低”、“减少”或“抑制”通常是指与参照水平(例如，缺少给定的治疗)相比减少至少10％，并且可以包括例如减少至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％、或更多。如本文所使用的“降低”或“抑制”并未涵盖与参照水平相比的完全抑制或降低。“完全抑制”是与参照水平相比的100％的抑制。减少可以优选下降至在没有给定的紊乱的个体的正常范围内接受的水平。
本文所使用的术语“增加的/增高的”、“增加/增高”、“增强”或“激活/活化”都是指增加统计学上显著的量。在一些实施方式中，术语“增加的/增高的”、“增加/增高”、“增强”或“激活/活化”可意味着与参照水平相比增加至少10％，例如增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或上至并包括100％的增加、或与参照水平相比的10-100％之间的任意增加、或者至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍的增加、或与参照水平相比的2倍至10倍之间的任意增加或更多。在标志物或症状的语境下，“增加/增高”是以此类水平的统计学上的显著增加/增高。
本文所使用的“受试者”是指人或动物。通常动物是脊椎动物，例如灵长类动物、啮齿类动物、家养动物或狩猎动物。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴、以及猕猴例如恒河猴。啮齿类动物包括小鼠、大鼠、旱獭、雪貂、兔和仓鼠。家养动物和狩猎动物包括奶牛；马；猪；鹿；野牛；水牛；猫科动物，例如家猫；犬科动物，例如狗、狐狸、狼；鸟类，例如鸡、鸸鹋、鸵鸟；以及鱼类，例如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼。在一些实施方式中，受试者是哺乳动物，例如灵长类动物，例如人。术语“个体”、“患者”和“受试者”在本文中可互换使用。
优选地，受试者是哺乳动物。所述哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或奶牛，但不限于这些实例。除了人之外的哺乳动物可以有利地用作代表例如同种异体移植物排斥的动物模型的受试者。受试者可以是雄性或雌性。
受试者可以是先前已被诊断或确认为患有或具有需要治疗的病症(例如经受同种异体移植物或患有自身免疫性疾病的受试者)或者患有或具有与此类病症相关的一种或多种并发症的受试者，并且可选地已经接受对病症的治疗或对与病症相关的一种或多种并发症的治疗。或者，受试者也可以是先前没有被诊断为患有病症或与病症相关的一种或多种并发症的受试者。例如，受试者可以是显示出病症的一个或多个风险因素或者显示出与病症相关的一种或多种并发症的一个或多个风险因素的受试者、或未显示风险因素的受试者。
治疗特定病症的“有需要的受试者”可以是具有下述病症的受试者：诊断为具有该病症或诊断为具有发展出该病症的风险。
术语“试剂”一般是指通常不存在或者不以向细胞、组织或受试者给予的水平存在的任何实体。试剂可以从如下组中选择，所述组包括但不限于：多核苷酸；多肽；小分子；以及抗体或其抗原结合片段。多核苷酸可以是RNA或DNA，并且可以是单链或双链的，并且可以从如下组中选择，所述组包括例如：编码多肽的核酸和核酸类似物。多肽可以是但不限于：天然存在的多肽、突变的多肽或保留了感兴趣的功能的多肽片段。试剂的进一步实例包括但不限于：核酸适体、肽-核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、有机小分子或无机小分子；糖；寡糖；多糖；生物大分子、拟肽；核酸类似物和核酸衍生物；从生物材料如细菌、植物、真菌或者哺乳动物细胞或组织、以及天然存在的成分或合成的成分产生的提取物。试剂可以施用至培养基，在其中它接触细胞并诱导其效果。或者，试剂可以是胞内的作为如下的结果：将编码试剂的核酸序列导入细胞中，以及试剂的转录引起胞内的核酸和/或蛋白的环境刺激的产生。在一些实施方式中，试剂是任何化学的实体或部分，包括但不限于合成和天然存在的非蛋白实体。在一些实施方式中，试剂是具有所选择的化学部分的小分子，例如选自包括大环内酯、来普霉素和它们的相关的天然产物或类似物在内的未取代或取代的烷基部分、芳基部分或杂环基部分。试剂可以已知具有期望活性和/或特性、或可以从不同的化合物的库中选择。本文所使用的术语“小分子”可以指“天然产物样”的化合物，然而，术语“小分子”并不限于“天然产物样”化合物。相反，一般小分子的特征在于它含有数个碳-碳键，并具有大于约50道尔顿但小于约5000道尔顿(5kD)的分子量。优选小分子具有小于3kD、更优选小于2kD、最优选小于1kD的分子量。在一些情况下，优选小分子具有等于或小于700道尔顿的分子质量。
本文所使用的术语“蛋白”和“多肽”在本文中互换使用，以指定一连串的氨基酸残基，所述氨基酸残基通过在相邻残基的α-氨基基团和羧基基团之间的肽键相互连接。无论其大小或功能，术语“蛋白”和“多肽”是指氨基酸的聚合物，所述氨基酸包括经修饰的氨基酸(例如，磷酸化、糖化、糖基化等)和氨基酸类似物。“蛋白”和“多肽”通常用来指比较大的多肽，而术语“肽”通常用于指小的多肽，但是在本领域中这些术语的用法重叠。当指基因产物及其片段时，术语“蛋白”和“多肽”在本文中互换使用。因此，示例性的多肽或蛋白包括基因产物、天然存在的蛋白、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段和上述物质的其它等同物、变型、片段和类似物。
本文所使用的术语“核酸”或“核酸序列”是指并入核糖核酸、脱氧核糖核酸或它们的类似物的单元的任何分子，优选聚合分子。核酸可以是单链或双链的。单链核酸可为变性的双链DNA的一条核酸链。或者，单链核酸可为并非衍生自任何双链DNA的单链核酸。在一个方面，核酸可以是DNA。在另一方面，核酸可以是RNA。合适的核酸分子是DNA、包括基因组DNA或cDNA。其它合适的核酸分子是RNA、包括mRNA。
给定基因的表达的抑制剂可为抑制性核酸。在一些实施方式中，抑制性核酸为抑制性RNA(iRNA)。双链RNA分子(dsRNA)已显示出以称为RNA干扰(RNAi)的高度保守的调控机制阻断基因表达。本文所述的抑制性核酸可以包括具有长度为30个或更少的核苷酸(即，长度为15-30个核苷酸、长度通常为19-24个核苷酸)的区域的RNA链(反义链)，该区域实质上与靶向mRNA转录物的至少一部分互补。使用这些iRNA使得可以靶向降解mRNA转录物，引起靶标的表达和/或活性降低。
本文所使用的术语“iRNA”是指含有本文所定义的术语RNA、并通过RNA诱导的沉默复合物(RISC)通路来介导RNA转录物的靶向切割的试剂。在一个实施方式中，本文所述的iRNA引起NRP-2、Sema3F和/或丛蛋白A1的表达和/或活性的抑制。在一些实施方式中，与不存在iRNA的细胞中发现的靶mRNA水平相比，用抑制剂(例如iRNA)接触细胞造成细胞中的靶mRNA水平降低至少约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％、上至并包括100％。
在一些实施方式中，iRNA可以是dsRNA。dsRNA包括两条RNA链，两条RNA链充分互补，以在使用dsRNA的情况下杂交形成双链结构。dsRNA的一条链(反义链)包括互补区域，该区域与靶序列大体上互补、且通常完全互补。靶序列可以衍生自在靶标的表达过程中形成的mRNA的序列。另一条链(正义链)包含互补于反义链的区域，从而使得当在适当的条件下结合时，两条链杂交并形成双链结构。通常，双链结构的长度介于15至30个碱基对之间，包括端值；长度更通常在18至25个碱基对之间，包括端值；长度更通常在19至24个碱基对之间，包括端值；并且长度最通常在19至21个碱基对之间，包括端值。类似地，与靶序列互补的区域的长度介于15至30个核苷酸之间，包括端值；长度更通常在18至25个核苷酸之间，包括端值；长度更通常在19至24个核苷酸之间，包括端值；并且长度最通常在19至21个核苷酸之间，包括端值。在一些实施方式中，dsRNA的长度介于15至20个核苷酸之间，包括端值；并且在其它实施方式中，dsRNA的长度介于25和30个核苷酸之间，包括端值。正如普通技术人员会认识到的，靶向用于切割的RNA的靶向区域最通常是较大的RNA分子(通常是mRNA分子)的一部分。相关地，mRNA靶标的“部分”是具有足以成为RNAi引导的切割(RNAi-directedcleavage)(即，通过RISC通路切割)的底物的长度的mRNA靶标的连续序列。在一些情况下，具有短至9个碱基对的双链的dsRNA可以介导RNAi引导的RNA切割。最常见的靶标是至少15个核苷酸的长度、优选15-30个核苷酸的长度。
在又一实施方式中，iRNA(例如dsRNA)的RNA为化学修饰的，以增强稳定性或其它有益的特性。可以通过本领域完善建立的方法修饰和/或合成作为本发明特性的核酸，例如描述于“Current protocols in nucleic acid chemistry”，Beaucage，S.L.等(编)，JohnWiley&Sons，Inc.，New York，NY，USA中的方法，以引用的方式由此将其并入本文。修饰包括：例如(a)末端修饰，例如5’端修饰(磷酸化、缀合、反向连接等)、3’端修饰(缀合、DNA核苷酸、反向连接等)；(b)碱基修饰，例如，用稳定碱基、不稳定碱基、或与扩大库中的伴侣配对的碱基进行的置换；移除碱基(脱碱基核苷酸)或缀合碱基；(c)糖修饰(例如，在2’位或4’位)或糖置换；以及(d)骨架修饰，包括磷酸二酯连接的修饰或置换。用于本文所述的实施方式中的RNA化合物的具体实例包括但不限于含有经修饰的骨架或无天然核苷间连接的RNA。其中，具有经修饰的骨架的RNA包括在骨架中不具有磷原子的RNA。为了本申请文件的目的，如本领域有时所引用的，在核苷间的骨架中不具有磷原子的经修饰的RNA也可以被认为是寡核苷酸。在特定的实施方式中，经修饰的RNA将会在其核苷间的骨架中具有磷原子。
经修饰的RNA骨架可以包括例如：具有正常的3’-5’连接的硼烷磷酸酯、磷硫酰、手性磷硫酰、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯(包括3’-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、亚磷酸酯、氨基磷酸酯(包括3’-氨基磷酸氨基酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫羰氨基磷酸酯(thionophosphoramidates)、硫羰烷基膦酸酯(thionoalkylphosphonates)和硫羰烷基磷酸三酯；它们的2’-5’连接的类似物；以及具有反极性的物质(其中，相邻的核苷单元对以3’-5’至5’-3’或2’-5’至5’-2’连接)。各种盐、混合盐和游离酸形式也包括在内。教导制备上述含磷连接的代表性的美国专利包括但不限于：美国专利号3,687,808、4,469,863、4,476,301、5,023,243、5,177,195、5,188,897、5,264,423、5,276,019、5,278,302、5,286,717、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、5,466,677、5,476,925、5,519,126、5,536,821、5,541,316、5,550,111、5,563,253、5,571,799、5,587,361、5,625,050、6,028,188、6,124,445、6,160,109、6,169,170、6,172,209、6,239,265、6,277,603、6,326,199、6,346,614、6,444,423、6,531,590、6,534,639、6,608,035、6,683,167、6,858,715、6,867,294、6,878,805、7,015,315、7,041,816、7,273,933、7,321,029和美国专利RE39464，以引用的方式将其各自并入本文。
在骨架中不包含磷原子的经修饰的RNA骨架具有通过如下形成的骨架：短链烷基或环烷基核苷间连接、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间连接、或者一个或多个短链杂原子或杂环核苷间连接。这些骨架包括：具有吗啉代连接(部分上由核苷的糖部分形成)的骨架；硅氧烷骨架；硫化物骨架、亚砜骨架或砜骨架；formacetyl骨架和thioformacetyl骨架；methylene formacetyl骨架和methylene thioformacetyl骨架；含烯烃骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基骨架和亚甲基肼基骨架；磺酸酯骨架和磺胺骨架；酰胺骨架；以及其它的具有混合的N、O、S和CH2组成部分的骨架。教导制备上述寡核苷酸的代表性的美国专利包括但不限于：美国专利号5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5,216,141、5,235,033、5,64,562、5,264,564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,596,086、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,633,360、5,677,437和5,677,439，以引用的方式将其各自并入本文。
适于或考虑用于iRNA中的其它RNA模拟物中，核苷酸单元的糖和核苷间连接(即骨架)用新的基团置换。碱基单元被保留用于与适当的核酸靶化合物杂交。一种此类寡聚化合物(已显示具有良好的杂交性质的RNA模拟物)被称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，RNA的糖骨架被含酰胺骨架(特别是氨基乙基甘氨酸骨架)置换。核碱基保留并且直接或间接地结合至骨架的酰胺部分的氮杂氮原子。教导制备PNA化合物的代表性的美国专利包括但不限于：美国专利号5,539,082、5,714,331和5,719,262，以引用的方式将其各自并入本文。PNA化合物的进一步教导可见于例如Nielsen等，Science，1991，254，1497-1500。
本发明中的一些特色的实施方式包括：具有磷硫酰骨架的RNA和具有杂原子骨架的寡核苷酸，特别是上述引用的美国专利号5,489,677中的--CH2--NH--CH2--、--CH2--N(CH3)--O--CH2--[称为亚甲基(甲基亚氨基)骨架或MMI骨架]、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--和--N(CH3)--CH2--CH2--[其中，天然磷酸二酯骨架表示为--O--P--O--CH2--]；以及上述引用的美国专利号5,602,240中的酰胺骨架。在一些实施方式中，本文的特色的RNA具有上文的上述引用的美国专利号5,034,506的吗啉代骨架结构。
经修饰的RNA还可以包含一个或多个置换的糖部分。本文的特色的iRNA(例如dsRNA)在2’位置可以包含如下中的一种：OH；F；O-烷基、S-烷基或N-烷基；O-烯基、S-烯基或N-烯基；O-炔基、S-炔基或N-炔基；或者O-烷基-O-烷基，其中，烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C1-C10烷基或C2-C10烯基或C2-C10炔基。示例性的适当的修饰包括：O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中，n和m为从1至约10。在其它实施方式中，dsRNA在2’位置包含如下中的一种：C1-C10低级烷基；取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基；SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2；杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报告子基团、嵌入剂、改善iRNA的药代动力学性质的基团、或改善iRNA的药效动力学性质的基团、以及具有类似性质的其它取代基。在一些实施方式中，所述修饰包括2’-甲氧基乙氧基(2’-O--CH2CH2OCH3，也称为2’-O-(2-甲氧基乙基)或2’-MOE)(Martin等，Helv.Chim.Acta，1995，78:486-504)，即烷氧基-烷氧基基团。另一示例性的修饰是如下文的实施例所述的2’-二甲基氨基氧基乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团，又称为2’-DMAOE；以及如下文的实施例所述的2’-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域也称为2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2’-DMAEOE)，即2’-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2。
其它修饰包括2’-甲氧基(2’-OCH3)、2’-氨基丙氧基(2’-OCH2CH2CH2NH2)和2’-氟(2’-F)。类似的修饰也可以在iRNA的RNA上的其它位置进行，特别是2’-5’连接的dsRNA中或3’末端核苷酸上的糖的3’位、以及5’末端核苷酸的5’位置。iRNA也可以具有糖模拟物，例如替换戊呋喃糖的环丁基部分。教导制备此类经修饰的糖结构的代表性的美国专利包括但不限于：美国专利号4,981,957、5,118,800、5,319,080、5,359,044、5,393,878、5,446,137、5,466,786、5,514,785、5,519,134、5,567,811、5,576,427、5,591,722、5,597,909、5,610,300、5,627,053、5,639,873、5,646,265、5,658,873、5,670,633和5,700,920，其中的一些通常由本申请拥有，并以引用的方式将其各自并入本文。
iRNA还可包括核碱基(在本领域通常仅仅称作“碱基”)修饰或置换。本文所使用的“未修饰的”或“天然的”核碱基包括：嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)；以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰的核碱基包括其它合成和天然的核碱基，例如：5-甲基胞嘧啶(5-me-C)；5-羟甲基胞嘧啶；黄嘌呤；次黄嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基衍生物和其它烷基衍生物；腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基衍生物和其它烷基衍生物；2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶；5-卤素尿嘧啶和5-卤素胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶和6-偶氮胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；8-卤素、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其它的8-置换的腺嘌呤和鸟嘌呤；5-卤素(特别是5-溴)、5-三氟甲基和其它的5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤；8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤；7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。进一步的核碱基包括：在美国专利号3,687,808中公开的碱基；在Modified Nucleosides in Biochemistry，Biotechnology and Medicine，Herdewijn，P.编，Wiley-VCH，2008中公开的碱基；在The Concise Encyclopedia OfPolymer Science And Engineering，858-859页，Kroschwitz，J.L编，John Wiley&Sons，1990中公开的碱基；通过Englisch等，Angewandte Chemie，International Edition，1991，30，613公开的碱基；以及通过Sanghvi，Y S.，dsRNA Research and Applications，第15章，289-302页，Crooke，S.T.和Lebleu，B.编，CRC Press，1993公开的碱基。这些核碱基中的一些对于增高本发明中的特色的寡聚化合物的结合亲和力是特别有用的。这些核碱基包括：5-取代的嘧啶；6-氮杂嘧啶；以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已表明5-甲基胞嘧啶取代增高了核酸双链稳定性0.6-1.2℃(Sanghvi，Y.S.，Crooke，S.T.和Lebleu，B.编，dsRNA Research and Applications，CRCPress，Boca Raton，1993，276-278页)，并且是示例性的碱基取代，甚至更特别是当与2’-O-甲氧乙基糖修饰组合时。
教导制备一些上述经修饰的核碱基以及其它经修饰的核碱基的代表性的美国专利包括但不限于上面提到的美国专利号3,687,808，及美国专利号4,845,205、5,130,30、5,134,066、5,175,273、5,367,066、5,432,272、5,457,187、5,459,255、5,484,908、5,502,177、5,525,711、5,552,540、5,587,469、5,594,121、5,596,091、5,614,617、5,681,941、6,015,886、6,147,200、6,166,197、6,222,025、6,235,887、6,380,368、6,528,640、6,639,062、6,617,438、7,045,610、7,427,672和7,495,088，以引用的方式将其各自并入本文；以及美国专利号5,750,692，以引用的方式将其也并入本文。
iRNA的RNA也可以被修饰成包含一个或多个锁核酸(LNA)。锁核酸是具有经修饰的核糖部分的核苷酸，其中，所述核糖部分包含连接2’位和4’位碳原子的另外的桥。这一结构有效地将核糖“锁定”在3’-内向结构构象中。已经表明，将锁核酸添加至siRNA增加了血清中的siRNA的稳定性，并降低了脱靶效应(Elmen，J.等，(2005)Nucleic Acids Research33(1):439-447；Mook，OR.等，(2007)Mol Canc Ther 6(3):833-843；Grunweller，A.等，(2003)Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193)。教导制备锁核酸核苷酸的代表性的美国专利包括但不限于如下：美国专利号6,268,490、6,670,461、6,794,499、6,998,484、7,053,207、7,084,125和7,399,845，以引用的方式将其各自整体并入本文。
本文所述的iRNA的RNA的另一修饰涉及将一个或多个配体、部分或缀合物在化学上连接至RNA，所述配体、部分或缀合物增强了iRNA的细胞摄取、活性、细胞分布或药代动力学性质。此类部分包括但不限于：脂质部分如胆固醇部分(Letsinger等，Proc.Natl.Acid.Sci.USA，1989，86:6553-6556)；胆酸(Manoharan等，Biorg.Med.Chem.Let.，1994，4:1053-1060)；硫醚，例如beryl-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660:306-309；Manoharan等，Biorg.Med.Chem.Let.，1993，3:2765-2770)；硫代胆固醇(Oberhauser等，Nucl.Acids Res.，1992，20:533-538)；脂肪链，例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等，EMBO J，1991，10:1111-1118；Kabanov等，FEBS Lett.，1990，259:327-330；Svinarchuk等，Biochimie，1993，75:49-54)；磷脂，例如二-十六烷基-消旋-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-消旋-甘油-3-磷酸酯(Manoharan等，Tetrahedron Lett.，1995，36:3651-3654；Shea等，Nucl.Acids Res.，1990，18:3777-3783)；聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等，Nucleosides&Nucleotides，1995，14:969-973)，或金刚烷乙酸(Manoharan等，Tetrahedron Lett.，1995，36:3651-3654)；棕榈酰部分(Mishra等，Biochim.Biophys.Acta，1995，1264:229-237)；或十八胺或己基氨基-羰基氧基胆固醇部分(Crooke等，J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996，277:923-937)。
本文所使用的术语“治疗(treat/treatment/treating)”或“减轻”是指治疗剂治疗，其中，目的是逆转、缓解、减轻、抑制、减缓或停止与疾病或紊乱相关的病症的进展或严重程度。术语“治疗”包括降低或缓解病症、疾病或紊乱的至少一种不利影响或症状。如果一种或多种症状或临床标志物减少，则治疗通常是“有效”的。或者，如果疾病的进展减弱或停止，则治疗是“有效”的。也就是说，“治疗”不仅包括症状或标志物的改善，还包括与未进行治疗时所预期的情况相比症状的进展或恶化中止或至少减缓。有益或期望的临床结果(无论可测定或不可测定)包括但不限于：缓解一种或多种症状、减小疾病程度、稳定疾病状态(即，不恶化)、延迟或减缓疾病进展、减轻或减缓疾病状态、缓和(部分或全部)、和/或减少死亡率。术语“治疗”疾病还包括提供疾病的症状或副作用的舒解(包括姑息治疗)。
“癌细胞”是在体内、离体，或者在组织培养中的癌细胞、癌前细胞(pre-cancerouscell)或转化细胞，其具有自发的或诱发的表型变化，所述表型变化无需涉及对新遗传物质的吸收。尽管转化可由转化病毒的感染和新基因组核酸的并入而引起、或由对外源核酸的吸收而引起，它也可自发引起或在暴露于致癌物质(carcinogen)后使得内源性基因发生突变而引起。转化/癌症与如下有关：例如，在适合的动物宿主(如裸鼠)中的形态学变化、细胞永生化、异常生长控制、病灶形成、锚着非依赖性(anchorage independence)、恶性肿瘤(malignancy)、接触抑制和生长密度限制的缺失、生长因子或血清非依赖性、肿瘤特异性标志物、侵袭或转移、以及肿瘤生长。参见例如Freshney，CULTURE ANIMAL CELLS:MANUALBASIC TECH.(第三版，1994年)。本文所使用的术语“癌症”是指干扰机体器官和系统的正常功能的不受控的细胞生长。患有癌症或肿瘤的受试者是在受试者体内存在客观上可测量的癌细胞的受试者。这一定义中包括的是良性癌症和恶性癌症、以及休眠肿瘤或微转移。从它们的起始位置迁移并播撒于要害器官的癌症可通过受影响器官的功能退化而最终导致受试者死亡。
本文所使用的术语“药物组合物”是指与药学上可接受的载体(例如在制药工业中常用的载体)组合的活性试剂。本文采用的短语“药学上可接受的”是指下述化合物、材料、组合物和/或剂型：在合理的医学判断范围内，适于与人类和动物的组织接触而无过度的毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的收益/风险比相匹配。
本文所使用的术语“给予”是指通过一定的方法或途径向受试者中放置本文所公开的化合物，使得至少将试剂部分递送至期望部位。含有本文所公开的化合物的药物组合物可以通过任何适当的途径给予，从而在受试者中产生有效的治疗。
术语“统计上显著”或“显著地”是指统计显著性，并且通常是指2个标准差(2SD)或更大的差异。
除了在操作实施例中或另有指示以外，本文所使用的表示成分的量或反应条件的所有数字均应理解为在所有情况下均由术语“约”加以修饰。术语“约”在与百分比连接使用时可以表示±1％。
本文所使用的术语“包含”或“包括”是指对于方法或组合物而言必不可少的组成、方法及其各自的成分，对于包含未指定的要素(无论是必要的要素或是非必要的要素)而言也是开放性的。
术语“由……组成”是指本文所述的组合物、方法及其各自的成分，排除了在实施方式的描述中未列举的任何要素。
本文所使用的术语“基本上由……组成”是指对于给定的实施方式而言所需的要素。该术语允许存在实质上不会影响实施方式的基本和新颖的或功能性的特性的要素。
除非上下文另有明确指示，单数术语“一/该/所述(a/an/the)”包括复数的指示对象。类似地，除非上下文另有明确指示，词语“或”意在包括“和”。尽管与本文描述的相似或相当的方法和材料可用于本公开的实践或试验中，在下文中对合适的方法和材料进行了描述。缩写“例如(e.g.)”源自拉丁文的例如(exempli gratia)，并且在本文中用于表示非限制性的实例。因此，缩写“e.g.”与术语“例如(for example)”同义。
细胞生物学和分子生物学中的常用术语的定义可以在下述文献中找到：“TheMerck Manual of Diagnosis and Therapy”，第19版，Merck Research Laboratories出版，2006(ISBN 0-911910-19-0)；Robert S.Porter等(编)，The Encyclopedia ofMolecular Biology，Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN 0-632-02182-9)；Benjamin Lewin，Genes X，Jones&Bartlett Publishing出版，2009(ISBN-10：0763766321)；Kendrew等(编)，Molecular Biology and Biotechnology:a ComprehensiveDesk Reference，VCH Publishers，Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)；以及CurrentProtocols in Protein Sciences 2009，Wiley Intersciences，Coligan等编。
除非另有说明，本发明采用在以下文献中描述的标准程序来实施，例如：Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第4版)，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，USA(2012)；Davis等，Basic Methods in MolecularBiology，Elsevier Science Publishing Inc.，New York,USA(1995)；或Methods inEnzymology:Guide to Molecular Cloning Techniques 152卷，S.L.Berger和A.R.Kimmel编，Academic Press Inc.，San Diego，USA(1987)；Current Protocols in ProteinScience(CPPS)(John E.Coligan等编，John Wiley and Sons，Inc.)；Current Protocolsin Cell Biology(CPCB)(Juan S.Bonifacino等编，John Wiley and Sons，Inc.)；以及Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique，R.Ian Freshney著，Wiley-Liss出版，第5版(2005)；Animal Cell Culture Methods(Methods in Cell Biology，57卷，Jennie P.Mather和David Barnes编，Academic Press，第1版，1998)，以引用的方式将其整体并入本文。
本文在对本发明各个方面的描述中对其它术语进行定义。
出于描述和公开的目的，将本申请全文中引用的所有专利和其它出版物(包括文字出版物、发行的专利、公开的专利申请和同时待审的专利申请)以引用的方式明确地并入本文，例如，在此类出版物中描述的可与本文描述的技术关联使用的方法学。这些出版物仅由于它们的公开早于本申请的申请日而提供。在这一方面，不应当视作承认了本发明人没有权利借助于先前的发明或因为任何其它原因而将此类公开内容提前。所有关于这些文件的日期的声明或关于这些文件的内容的表述是基于申请人可获得的信息，并不构成关于这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。
对本公开的实施方式的描述并非旨在进行穷举或将本公开限制为所公开的明确的形式。尽管本文中出于说明性目的描述了本公开的具体实施方式和实施例，然而正如相关领域的技术人员将了解的，可在本公开的范围内进行各种等同修改。例如，当以给定的顺序给出方法步骤或功能时，替代的实施方式能够以不同的顺序执行功能、或可以实质上同时执行功能。本文所提供的本公开的教导可以施用至其它适当的程序或方法。本文所述的各种实施方式可以组合以提供进一步的实施方式。如果需要的话，可对本公开的方面进行修改，以采用上述参考文献和应用的组合、功能和构思，从而提供本公开的进一步的实施方式。此外，由于生物功能对等性的考虑，可以在种类或数量上对蛋白结构进行不影响生物或化学作用的一些改变。根据详细的说明书的启示，可以对本公开作出这些改变和其它改变。所有这些修饰都旨在包含于所附的权利要求的范围之内。
可将任何上述实施方式中的特定要素与其它实施方式中的要素组合或置换。此外，尽管在这些实施方式的上下文中已经描述了与本公开的一些实施方式相关的优点，然而其它实施方式也可以表现出此类优点，并且，并非所有的实施方式都必须表现出这样的优点才能落入本公开的范围之内。
本文所述的技术通过以下实施例进行进一步说明，而不应被解释为进行了进一步的限定。
本文所述的技术的一些实施方式可以根据下列编号段落的任何一段进行定义：
1.一种阻抑同种异体移植物排斥的方法，所述方法包括向同种异体移植物受者给予Sema3F激动剂，由此阻抑同种异体移植物的免疫排斥。
2.一种阻抑受试者中的免疫系统的方法，所述方法包括向有需要的受试者给予Sema3F激动剂。
3.一种治疗有需要的受试者中的炎性病症的方法，所述方法包括向所述受试者给予Sema3F激动剂。
4.如段落3所述的方法，其中，所述炎性病症是自身免疫性疾病。
5.如段落4所述的方法，其中，所述自身免疫性疾病选自于由以下所组成的组：1型糖尿病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、银屑病、炎性肠病、克罗恩氏病以及自身免疫性甲状腺炎。
6.如段落3所述的方法，其中，所述炎性病症是局部病症。
7.如段落6所述的方法，其中，所述局部炎性病症选自于由皮疹和变应性反应所组成的组。
8.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向需要对其进行治疗的受试者给予Sema3F激动剂。
9.一种减少血管生成的方法，所述方法包括向需要对其进行治疗的受试者给予Sema3F激动剂。
10.如段落1-9中任一段所述的方法，其中，所述Sema3F激动剂是Sema3F多肽或编码Sema3F多肽的核酸。
11.如段落1-10中任一段所述的方法，其中，所述Sema3F多肽包含序列SEQ ID NO：5。
12.如段落10所述的方法，其中，所述Sema3F多肽可结合Sema3F受体。
13.如段落1-12中任一段所述的方法，其中，所述Sema3F多肽可结合选自于由A1结构域、A2结构域、B1结构域和B2结构域所组成的组中的NRP-2的结构域。
14.如段落1-13中任一段所述的方法，其中，所述Sema3F激动剂是弗林蛋白酶样抑制剂。
15.如段落1-14中任一段所述的方法，其中，静脉内给予所述Sema3F激动剂。
16.如段落1-14中任一段所述的方法，其中，肌内、皮下或真皮内给予所述Sema3F激动剂。
17.如段落1-16中任一段所述的方法，其中，将所述Sema3F激动剂局部给予至炎症部位。
18.如段落1-17中任一段所述的方法，所述方法进一步包括给予额外的抗炎剂。
19.如段落18所述的方法，其中，所述额外的抗炎剂选自于由以下所组成的组：类固醇；钙调磷酸酶抑制剂；mTOR抑制剂或其类似物；以及抗增殖剂。
20.一种增加有需要的受试者中的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者给予Sema3F抑制剂或NRP-2抑制剂或丛蛋白A1抑制剂中的一种或多种。
21.如段落20所述的方法，其中，所述Sema3F抑制剂是抗Sema3F抗体试剂。
22.如段落20所述的方法，其中，所述NRP-2抑制剂是抗NRP-2抗体试剂。
23.如段落20所述的方法，其中，所述Sema3F抑制剂是可溶性NRP-2受体。
24.如段落23所述的方法，其中，所述Sema3F抑制剂是所述NRP-2受体的可溶性片段，所述NRP-2受体包含选自于由A1结构域、A2结构域、B1结构域或B2结构域所组成的组中的至少一种结构域。
25.如段落20所述的方法，其中，所述Sema3F抑制剂是弗林蛋白酶样多肽或编码弗林蛋白酶样多肽的核酸。
26.Sema3F激动剂在同种异体移植物受者中用于阻抑同种异体移植物排斥的用途。
27.Sema3F激动剂的用途，所述用途包括向需要免疫系统阻抑的受试者给予Sema3F激动剂。
28.Sema3F激动剂在有需要的受试者中用于治疗炎性病症的用途。
29.如段落28所述的用途，其中，所述炎性病症是自身免疫性疾病。
30.如段落29所述的用途，其中，所述自身免疫性疾病选自于由以下所组成的组：1型糖尿病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、银屑病、炎性肠病、克罗恩氏病以及自身免疫性甲状腺炎。
31.如段落28所述的用途，其中，所述炎性病症是局部病症。
32.如段落31所述的用途，其中，所述局部炎性病症选自于由皮疹和变应性反应所组成的组。
33.Sema3F激动剂用于治疗癌症的用途。
34.Sema3F激动剂用于在有需要的受试者中阻抑血管生成的用途。
35.如段落26-34中任一段所述的用途，其中，所述Sema3F激动剂是Sema3F多肽或编码Sema3F多肽的核酸。
36.如段落26-35中任一段所述的用途，其中，所述Sema3F多肽包含序列SEQ IDNO：5。
37.如段落35所述的用途，其中，所述Sema3F多肽可结合Sema3F受体。
38.如段落35-37中任一段所述的用途，其中，所述Sema3F多肽可结合选自于由A1结构域、A2结构域、B1结构域和B2结构域所组成的组中的NRP-2的结构域。
39.如段落26-38中任一段所述的用途，其中，所述Sema3F激动剂是弗林蛋白酶样抑制剂。
40.如段落26-39中任一段所述的用途，其中，静脉内给予所述Sema3F激动剂。
41.如段落26-39中任一段所述的用途，其中，肌内、皮下或真皮内给予所述Sema3F激动剂。
42.如段落26-41中任一段所述的用途，其中，将所述Sema3F激动剂局部给予至炎症部位。
43.如段落26-42中任一段所述的用途，所述用途进一步包括给予额外的抗炎剂。
44.如段落43所述的用途，其中，所述额外的抗炎剂选自于由以下所组成的组：类固醇；钙调磷酸酶抑制剂；mTOR抑制剂或其类似物；以及抗增殖剂。
45.Sema3F抑制剂或NRP-2抑制剂或丛蛋白A1抑制剂中的一种或多种用于在有需要的受试者中促进免疫应答的用途。
46.如段落45所述的用途，其中，所述Sema3F抑制剂是抗Sema3F抗体试剂。
47.如段落45所述的用途，其中，所述NRP-2抑制剂是抗NRP-2抗体试剂。
48.如段落45所述的用途，其中，所述Sema3F抑制剂是可溶性NRP-2受体。
49.如段落46所述的用途，其中，所述Sema3F抑制剂是所述NRP-2受体的可溶性片段，所述NRP-2受体包含选自于由A1结构域、A2结构域、B1结构域或B2结构域所组成的组中的至少一种结构域。
50.如段落45所述的用途，其中，所述Sema3F抑制剂是弗林蛋白酶样多肽或编码弗林蛋白酶样多肽的核酸。
实施例
实施例1：脑信号蛋白3f和神经毡蛋白-2在同源异体移植物排斥中的新的免疫调节功能
第3类脑信号蛋白家族(Sema3A-G)结合至丛蛋白和神经毡蛋白家族分子，并引发导致抗迁移和抗增殖的调控信号。本文证实了Sema3F经由结合至神经毡蛋白-2(NRP-2)来调节PI-3K-Akt和MAPK信号传导，表明这一配体-受体相互作用可以抑制T细胞活化应答。然而，先前未曾探索过Sema3F和NRP-2在免疫中的作用。
本文描述的是用Sema3F对完全不匹配的BALB/c心脏同种异体移植物的C57BL/6受者进行处理。本文证实了Sema3F强效地抑制了排斥；平均移植物存活>22天(当经由腺病毒给予时，n＝4只小鼠，P<0.000)和23.4天(当经由i.p.注射给予时，n＝16只小鼠)vs.未处理的对照(平均存活6.5天，n＝8，P<0.000)。用封闭性抗Sema3F抗体(在第0天、第2天、第4天和第6天)对Sema3F处理受者(i.p.注射模型)进行的共同处理使移植物存活降低至对照(平均存活7.5天，n＝4)。
通过qPCR、FACS和蛋白质印迹，证实了Sema3F配体NRP-2在处于基线的T细胞亚群上表达，并且在丝裂原活化(抗CD3)6小时后，其在CD4+效应细胞和调控细胞上的表达得到显著诱导。通过qPCR还发现CD4+T细胞表达丛蛋白A1-4家族分子，进一步表明Sema3F可经由NRP-2和丛蛋白引发Sema3F的调控性的信号传导。为了确定功能，我们制成了NRP-2+/-(Hets)和NRP-2-/-(ko)小鼠；在体外，响应于丝裂原(抗CD3)，相比于WT细胞，源自于这些小鼠的CD4+T细胞过度增殖(增加约3倍)并产生增加的IL-2和IFNγ。在初始的NRP-2koCD4+CD25neg T细胞vs.CD4+CD25+亚群中，过度活化是最显著的。
最后，将NRP-2ko小鼠用作完全不匹配的BALB/c和轻微不匹配的B6.C-H-2bm12供体心脏移植物的受者。NRP-2ko小鼠排斥BM12心脏(平均移植物存活32天，n＝5)vs.WT小鼠(平均移植物存活>54天，n＝11，P<0.00)。相比之下，NRP-2ko小鼠以与WT移植物相同的节奏排斥完全不匹配的同种异体移植物。此外，Sema3F可以抑制NRP-2KO小鼠中的排斥，表明Sema3F可以具有独立于NRP-2的免疫调节作用。总的来说，这些发现首次将Sema3F和NRP-2定义为新的免疫调节蛋白。这些发现还表明，Sema3F-NRP-2相互作用对于同种异体应答的调节而言是高度显著的。
实施例2：脑信号蛋白3F对细胞内PI-3K-Akt和MAPK信号传导的调控的新的作用。
第三类脑信号蛋白结合神经毡蛋白(NRP)和丛蛋白家族分子，并充当导向分子引发导致抗迁移和细胞骨架瓦解的信号。如本文所述，脑信号蛋白3F(SEMA3F)在完全不匹配的心脏同种异体移植物模型中强效地抑制了同种异体移植物排斥。此外，本文描述了NRP2敲除小鼠具有过度活化的T细胞和加速的排斥，表明Sema3F经由与NRP2的相互作用介导了免疫调节。另外，本文证实了NRP2在效应CD4+T细胞和调控性CD4+T细胞上表达，表明NRP2是靶向T细胞活化应答的新的蛋白。然而，SEMA3F诱导的对免疫应答进行调控的分子机制是未知的。
使用磷酸激酶抗体阵列，将表达高水平的NRP2的两种细胞系(U87MG和U343)用于筛选Sema3F调控的细胞内信号传导通路。观察到Sema3F(例如640ng/ml)的最强效作用是抑制pAkt(T308和S473)pmTOR和pS6K以及pERK的活性，这在时程中通过蛋白质印迹分析得以确认。
SEMA3F结合NRP2并与丛蛋白A1形成复合物。使用siRNA敲低U87MG细胞中的NRP2或丛蛋白A1抑制了SEMA3F诱导的p-Akt(S473)和p-S6K的降低。这些观察结果表明，Sema3F的抑制作用通过将SEMA3F结合至处于细胞表面的NRP2/丛蛋白A1来介导。
使用免疫沉淀，还观察到SEMA3F破坏了raptor和rictor与mTOR的结合。此外，当用雷帕霉素(10ng/ml)对细胞处理30分钟以靶向mTORC1时，Sema3F强效地抑制了pAkt(S473)/mTORC2。此外，在用2DAkt转染以组成型地激活mTORC1之后，再次发现Sema3F抑制了pAkt，确认了Sema3F-NRP-2相互作用的主要效果是用于靶向mTORC2/Akt诱导的应答。
最后，在表达NRP-2的人Jurkat T细胞系中对Sema3F诱导的应答进行评价，并且进一步确认其引发显著的调控性信号传导应答，包括例如pAKT活性的抑制。Sema3F抑制了多种细胞类型中的Akt/mTOR信号传导(图21)。总的来说，这些发现首次将SEMA3F识别为新的分泌蛋白，该蛋白经由细胞内信号转导的调节在生理炎症消退中发挥作用。本文所述的发现表明Sema3F作为强效的抗炎性治疗剂具有广泛的应用。
实施例3：神经毡蛋白-2(脑信号蛋白受体)在CD4+T细胞亚群上的表达和功能
神经毡蛋白NRP-1和神经毡蛋白NRP-2分别结合包含SEMA3A和SEMA3F的第3类脑信号蛋白家族分子，并结合血管内皮生长因子。SEMA3A与NRP-1的结合以及SEMA3F与NRP-2的结合在内皮细胞中引发抑制信号。NRP-1在T细胞上表达，并且其在CD25+FoxP3+T调控性的细胞亚群上是非常重要的。在这些研究中，使用qPCR、蛋白质印迹分析和FACS，对NRP-2在未活化和丝裂原活化的人CD4+T细胞(抗CD3/抗CD28，各1mg/ml)上的表达进行评价。一贯地，发现NRP-2表达在未活化的细胞上最低，但是在活化后得到显著诱导(3倍至5倍，p＝0.06，n＝3)。还对NRP-2在鼠白细胞上的表达模式进行了分析，并且发现了在脾细胞以及富集的CD4+T细胞上的表达。尽管NRP-1在CD25hiTreg上是显性受体，但发现了NRP-2存在于CD4+CD25+T调控性亚群和CD4+CD25-T效应亚群上。为了定义功能，将CD4+T细胞从野生型C57/BL6小鼠中分选，并在用增高浓度的抗CD3(0.001mg/ml-1mg/ml)培养后对活化应答进行评估。总体而言，这些研究首次识别了NRP-2在CD4+T淋巴细胞上表达，并表明SEMA3F-NRP-2相互作用在T细胞活化应答中起作用。这些发现为对以下的全新理解创造了条件：第3类脑信号蛋白如何可在细胞介导的免疫和同种异体移植物排斥中充当新的调控性细胞因子。
在人T细胞中，丝裂原活化增加了NRP-1和NRP-2的表达(图7)。NRP-1在CD4+CD25高T细胞中表达，而NRP-2通常在CD4+T细胞的富集群中表达(图8)。
用同种异体脾细胞或同基因脾细胞致敏7天后，将受者脾细胞用CD4和NRP-2(来自Cell Signaling的单克隆兔抗小鼠NRP-2)以及随后的FITC缀合的驴抗兔二级Ab进行染色，并使之接受FACS。FACS后的定量表明，当与同基因致敏或未处理的脾细胞相比时，同种异体致敏的脾CD4显示出增加的NRP-2表达(数据未示出)。
总体而言，这些研究识别了NRP-2在CD4+T淋巴细胞上的表达，并表明SEMA3F-NRP-2相互作用在T细胞活化应答中起作用。
参考文献
Bagri A等，Clin Cancer Res 2009；15:1860-1864.
实施例4
本文证实了神经毡蛋白-2在人T细胞和T细胞系(Jurkat T细胞)上表达，并且Sema3F的结合导致活化应答。进一步证实了神经毡蛋白将在鼠T细胞上表达。
用Sema3F腺病毒处理同种异体移植物受者使存活延长。
将过量表达脑信号蛋白3F的细胞i.p注射到心脏移植物的小鼠受者中与以下相关：同种异体移植物存活的延长和急性排斥应答的延迟(在第6天-第8天于未处理对照中排斥，在转移细胞后的第21天-第28天排斥)。不表达Sema3F的对照细胞不会延迟同种异体移植物排斥。另外，在同样接受封闭性抗Sema3F抗体(封闭sema3F的作用)的小鼠中，转移细胞不能延长存活和延迟排斥。在初步研究中，转移细胞的这种效应不会在NRP-2缺乏的小鼠中出现。
来自缺少NRP-2的小鼠(杂合子小鼠和NRP-2KO小鼠)的细胞过度增殖，并且在用丝裂原活化后比起野生型细胞产生更多的细胞因子。缺少NRP-2的小鼠(杂合子小鼠和NRP-2KO小鼠)具有加速的同种异体移植物排斥应答。
本文特别考虑了：
a.脑信号蛋白3F或相关分子可在许多炎性疾病状态中用作抗炎性剂或免疫调节剂。
b.脑信号蛋白3F和NRP-2激动剂可用于治疗和/或预防同种异体移植物排斥。增加这些相互作用可起到免疫阻抑剂的作用。
c.靶向的抗-脑信号蛋白或抗NRP-2(A结构域分子)作为用来增强免疫应答的试剂的用途。
d.在免疫调节中使用NRP-A结构域、B结构域或A+B结构域的肽的可溶性蛋白的不同的拮抗机制。
实施例5：脑信号蛋白3F在体内充当了免疫阻抑剂以抑制急性同种异体移植物排斥
将Balb/C供体心脏移植到C56BL6小鼠中。对照小鼠在第7天-第8天经历排斥。在心脏移植后向小鼠中IV注射编码Sema3F的腺病毒使存活延长直至第40天(图2)。
在第0天-第2天给予0.2mg/kg的雷帕霉素，并给予Sema3F。在该受限模型中没有观察到额外的移植物延长作用(存活的延长不显著)(图4)。
T细胞亚群上的NRP-2的表达处于mRNA水平(图7和图22)、处于通过FACS(图9)和通过蛋白质印迹(图7和图22)得到的蛋白水平。如图所示，在活化的CD4+T细胞、Foxp3pos细胞和Foxp3neg细胞上观察到NRP-2的显著表达。
在C57BL/6背景下，将CD4+T细胞分选到来自WT小鼠、NRP-2+/-(Hets)小鼠和NRP-2-/-(KO)小鼠的CD25neg T效应亚群中。对丝裂原诱导的增殖和细胞因子的产生(ELISPOT)进行评估。在源自于NRP-2Hets小鼠和NRP-2KO小鼠的CD25neg亚群以及CD4+T细胞的整个群中，观察到显著增强的活化应答。这种显著的过度活化应答确认了如下假说：NRP-2为CD4+T细胞提供新的调控信号。在抗CD28的存在下，还用增高浓度的丝裂原(抗CD3)对CD4+CD25negT效应亚群的分选群进行培养。CD4+T细胞响应于共刺激信号而最大程度地增殖，然而，NRP-2KO细胞仍保持过度活化，并相比源自于WT小鼠的CD4+T细胞产生显著更多的IFNg和IL-2。这一观察结果进一步证实了NRP-2在CD4+T细胞中起作用，并且可能引发调控信号。
慢性排斥
将MHC轻微不匹配的B6.C-H2bm12(BM12)同种异体移植物移植到C57BL/6(野生型/WT)小鼠、NRP-2+/-(在BL6上的Het)小鼠或NRP-2-/-(在BL6上的KO)小鼠中。如所预期的，WT受者中的同种异体移植物长期存活，但在移植后约30天之后发展成慢性排斥；在第45天存在疾病的明显证据(图5)。据报道，这一模型中的长期存活与移植后第21天的T调控细胞的扩增有关，该扩增限制了T效应细胞的扩增(104)。NRP-2+/-Het受者中的存活率降低，NRP-2/-KO受者中的存活率显著降低(P<0.05)。这些观察结果与NRP-2在CD4+T细胞中具有调控功能的发现一致。
NRP-2可以与丛蛋白家族分子复合以引发调控信号，并且丛蛋白家族分子在CD4+T细胞上表达(图10)。因此，NRP-2可经由与丛蛋白的相互作用来引发T细胞中的调控信号。通过将野生型细胞、NRP-2het细胞和NRP-2敲除细胞以不同的浓度接种在具有培养板结合的抗CD3的培养板上，检查NRP-2对CD4+细胞增殖的作用。在具有降低的NRP-2增殖水平的细胞中，通过细胞因子产生和增殖所显示出的T细胞活化得到增加(图11)。还通过抗CD28(1μg/mL)用附加的共刺激进行了测量CD4+CD25-细胞增殖的类似实验(图13)。NRP-2敲除显示出增加的活化，但在aCD28的存在下活化增加的较少。这表明NRP-2可在T细胞活化应答的消退与活化应答的起始中起作用。
使NRP-2敲除CD4+T细胞接受丝裂原活化，并在活化后72小时检查培养物上清液中的细胞因子产生。NRP-2敲除显示出细胞因子的产生增加(图12)。在用抗CD3丝裂原活化后48小时和72小时，在NRP2敲除CD4+CD25-T细胞中也观察到增加的细胞因子产生(图14和图24)。还通过ELISPOT测定法对IFNγ和IL2的产生进行了检测(图15和图16)，类似地证实了NRP2敲除细胞中的增加的细胞因子产生。
Sema3F调节PI-3K/Akt-mTOR信号传导
用处于已知刺激信号传导应答的水平(～640ng/mL)的Sema3F对U87MG细胞(已知表达高水平的NRP-2)进行处理。观察到pAkt(mTORC2)和pS6K(mTORC1)依赖性活化的抑制(图18)。在～600ng/ml下观察到SEMA3F的峰值效应，并且将这一浓度的SEMA3F用于所有的信号传导分析。如图18的上部子图所示，10分钟后，SEMA3F抑制pAkt(S473)(光密度法>80％)的表达，并且pAkt(S473)、pAkt(T308)、pmTOR和pS6K中的降低在30分钟时最显著。如图18的下部子图所示，在SEMA3F处理后的细胞中的pERK1/2的表达显著降低，在30分钟时具有峰值效应。
将siRNA用于敲低U87MG细胞中的NRP-2或丛蛋白A1，然后用Sema3F对U87MG细胞进行处理。对在对照siRNA细胞和靶向siRNA细胞中的抑制pAkt(mTORC2)和pS6K(mTORC1)依赖性活化的作用进行的时程观察表明，NRP-2和丛蛋白A1的敲低抑制了Sema3F的作用(图19)。如图19的顶部子图所示，在NRP2敲低后，SEMA3F不能抑制pAkt和pS6K。这一发现确认了SEMA3F经由NRP2引发调控性的信号传导。
如上所述，NRP-2与丛蛋白A1形成复合物，并且据报道，丛蛋白引发了NRP信号传导应答。为了测试在SEMA3F-NRP-2-引发的应答中的这种可能性，在丛蛋白A1的敲低后，对SEMA3F在U87MG细胞中的作用进行了评价。如图19的底部子图所示，SEMA3F在对照siRNA转染的细胞中强效地抑制了pAkt和pS6K，但是再次，SEMA3F未能在丛蛋白A1siRNA转染的细胞中引发反应。这些观察结果表明，SEMA3F对Akt诱导的信号的功能性作用需要处于细胞表面的丛蛋白A1和NRP-2之间的相互作用。
另外，如图20所示，用增高浓度的SEMA3F对表达NRP-2的JurkatT细胞处理30分钟，并通过蛋白质印迹对pAkt(S473)的表达进行评价。用高浓度的SEMA3F(>600ng/ml)处理后，表达得到降低。
实施例6：调控性NRP-2受体在人CD4+T细胞上的表达。
NRP-1和NRP-2分别结合VEGF以及调控性的SEMA3A和SEMA3F。NRP-1通过Tregs表达。从人PBMC纯化CD4+T细胞，并且在丝裂原依赖性活化(抗CD3/抗CD28)后，对VEGFR1(Flt-1)mRNA、NRP-1mRNA和NRP-2mRNA的表达进行评价。NRP-2表达在活化后得到显著诱导，并且比任何其它受体处于更高的水平(图22)。
实施例7
用对照腺病毒或本文上述的编码Sema3F的腺病毒对小鼠进行注射。在腺病毒注射后的第3天和第5天，将小鼠进一步用噁唑酮处理，以诱发耳肿胀。相对于接受对照处理的小鼠，接受Sema3F处理的小鼠显示出降低的肿胀(图6)。
实施例8
从CD4creNRP-2fl/fl小鼠中分离CD4+T细胞，并对其评价处于mRNA和蛋白水平的NRP-2表达。注意到最低的表达。用增高浓度的丝裂原对细胞进行活化，并通过标准胸腺嘧啶核苷掺入测定法对增殖进行测定。此外，用APC和增高浓度的抗CD3对CD4+T细胞进行培养，并通过ELISPOT测定法对IFNg进行评估。将NRP-2T细胞活化应答与野生型小鼠进行比较。总的来说，NRP-2敲低细胞是过度活化的，这与它们产生过大的排斥应答的体内发现一致(图23)。
实施例9
图25描绘了慢性同种异体移植物排斥模型中的移植物存活曲线。将心脏同种异体移植物B6.C-Hbm12(BM12)移植到MHC轻微不匹配的受者中，所述受者为野生型C57BL/6(WT)小鼠、NRP-2敲除(NRP-2-/-)小鼠或选择CD4+T细胞NRP-2敲除小鼠(CD4Cre-NRP-2fl/fl)。如所预期的，心脏同种异体移植物体在WT小鼠中长期存活；然而，敲除小鼠产生加速的排斥应答。
实施例10：NRP-2在人CD4+T细胞上的表达。
通过从人外周血的阴性选择对人CD4+T细胞进行分离。在未活化和丝裂原(抗CD3/CD28)活化的细胞上，通过qPCR对NRP-2的表达进行评价(图26A)。注意到，mRNA表达在活化时增加。还在人Jurkat T细胞系上对表达进行了评价。通过FACS，Jurkats表达高水平的NRP-2。
将人外周血细胞通过标准Ficoll分离法进行分离，并且未活化时使用或在丝裂素原激活后使用。在CD4+亚群上，通过FACS对NRP-2表达进行评价(图26B)。蛋白表达在活化后增加。
将外周血细胞用抗CD4、抗FoxP3和NRP-2染色(图26C)。示出的是通过FACS评价的表达，该表达显示出FoxP3+人CD4+T调控细胞和非FoxP3/T效应细胞均表达NRP-2。
实施例11：NRP-2在鼠CD4+T细胞上的表达。
图27A描绘了鼠脾脏和淋巴结内的CD4+T细胞上的NRP-2的FACS分析。注意到，不同的CD4+T细胞群表达NRP-2。通过阴性筛选从鼠脾脏分离CD4+T细胞。在未活化和丝裂原(抗CD3/CD28)活化的细胞上，通过qPCR对NRP-2的表达进行评价(图27B)。注意到，表达在活化后增加。还在分离的CD4+T细胞上对丛蛋白A家族分子进行了评价。在该亚群上，丛蛋白A1和丛蛋白A4的表达最高(图27C)。通过阴性筛选从鼠脾脏分离CD4+T细胞，并且在Foxp3+和Foxp3阴性亚群上对NRP-2的表达进行评价(图27D)。在两个未活化的CD4+细胞亚群上均表达NRP-2。对分离的脾CD4+T细胞经丝裂原活化(抗CD3-1mcg/ml)，并通过蛋白质印迹分析对NRP-2的表达进行评价(图27E)。再次发现NRP-2在活化后表达增加。在标准培养基(丝裂原+TGFb+抗IL-4+抗IFNg+视黄酸)中，驱使CD4+T细胞分化成诱导的Treg细胞，并通过蛋白质印迹对NRP-1/2的表达进行评价(图27F)。NRP-2与NRP-1在这一细胞类型上共表达。
实施例12：通过脑信号蛋白3F和神经毡蛋白2的体外和体内相互作用调控MTOR信号传导
经由其结合神经毡蛋白2(NRP2)和丛蛋白A家族分子的能力，脑信号蛋白3F(SEMA3F)提供了神经元导向因子(neuronal guidance cues)。本文描述了使用磷酸激酶阵列、免疫沉淀和蛋白质印迹分析在人内皮细胞、T细胞和肿瘤细胞中对SEMA3F-NRP2信号传导应答进行的分析。一贯地，SEMA3F抑制了PI-3K和Akt活性，而且应答与mTOR/rictor组装的破坏以及RhoA GTP酶的mTOR依赖性活化相关。本文还描述了在体外通过SEMA3F-NRP2的相互作用抑制了血管内皮生长因子的表达以及mTOR可诱导的细胞活化应答和细胞骨架稳定性。在体内，SEMA3F的局部和全身性的过度产生降低了表达NRP2的异种移植物中的肿瘤生长。总体而言，SEMA3F在多种人细胞类型中调控mTOR信号传导，表明其生物学在慢性疾病中具有深远的意义。
介绍
神经元网(Neuronal networking)通过轴突生长锥对环境因子(正向和负向)的应答来调控。例如，通过netrin-1引发的因子是化学吸引性的，而由脑信号蛋白3F(SEMA3F)支配的因子是化学排斥性的。这些过程(已知统称为轴突导向)在中枢神经系统的发展中起重要作用(1、2)。SEMA3F是第3类脑信号蛋白(SEMA3A-G)的成员，其受体是神经毡蛋白1(NRP1)、神经毡蛋白2(NRP2)和丛蛋白(3、4)。脑信号蛋白参与了血管生物学和肿瘤生物学(5、6)，并且越来越多的数据表明脑信号蛋白调控了与肿瘤免疫相关的免疫应答(7、8、9、10)。此外，脑信号蛋白在体外抑制了肿瘤细胞和内皮细胞(EC)的迁移，并在体内减缓了肿瘤进展、转移和血管生成(5、6)。然而，关于T细胞、EC、平滑肌细胞和肿瘤细胞对SEMA3F的应答了解甚少，但功能性作用的特征在于调控性应答包括抗迁移、细胞骨架瓦解和应力纤维损失(5、6、11)。对SEMA3F信号传导机制的分析证实，SEMA3F与NRP2和丛蛋白A1形成复合物。该复合物吸引了ABL2酪氨酸激酶，该激酶激活了p190RhoGAP，引起RhoA(将GTP转化为GDP的小GTP酶)的失活，致使F-肌动蛋白的解聚和应力纤维的损失，并伴随着相关的降低的EC和肿瘤细胞迁移应答(6)。
在胶质母细胞瘤细胞和EC中，格列卫(伊马替尼，ABL2酪氨酸激酶抑制剂)消除了SEMA3介导的应力纤维形成的损失以及运动性损失(12)。用SEMA3F稳定转染的H157肺癌细胞具有降低水平的磷酸化Akt(S473)、STAT3和Erk(13)，并且降低的Akt活性与血管生成因子、血管内皮生长因子(VEGF)的较低的表达水平相关(13)。
尽管脑信号蛋白和NRP引发的应答能够调控多个细胞内信号通路，但共同特点是Akt激酶的磷酸化的抑制(2、13)。该作用高度暗示了脑信号蛋白诱导的信号传导的主要生物学作用牵涉mTOR信号传导的抑制。实际上，最近的研究证实在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中，无脊椎动物的脑信号蛋白-丛蛋白相互作用可以调控TOR信号传导，对于其表皮细胞中的形态变化而言，所述TOR信号传导是需要的(14)。mTOR是以两种不同的多蛋白复合物存在的丝氨酸/苏氨酸激酶，所述复合物由mTOR、raptor和mLST8(mTORC1)构成(15、16)或者由mTOR、rictor、Sin1、protor和mLST8(mTORC2)构成(17、18、19)。mTORC1通过使S6K1和4EBP1磷酸化来部分控制细胞生长，而且是蛋白质翻译的关键调控因子(20、21)。通过使Akt(22)和血清/糖皮质激素调控的激酶-1(SGK1)和PKCα(18、23)磷酸化，mTORC2介导了细胞存活和活化。存在极大的兴趣将mTOR信号通路作为自身免疫性疾病、慢性炎症和同种异体移植物排斥的目标治疗剂(24、25、26)，以及作为癌症治疗的目标辅助剂(27)。然而，尽管其NRP2受体在人免疫细胞、上皮细胞和肿瘤细胞上广泛表达，但关于SEMA3F在这种信号通路上或此类疾病过程中的作用的报道很少(5、6、28)。
本文描述了SEMA3F与NRP2和丛蛋白A1相互作用，以降低PI-3K活性、抑制mTORC2的组装并减少下游的Akt信号传导。还证实了SEMA3F可通过抑制PI-3K活性和Akt诱导的VEGF的反式活化来引发抗肿瘤作用和抗血管生成作用，其已良好建立以在肿瘤发生和慢性炎症中起作用。总的来说，这些研究将SEMA3F定义为哺乳动物细胞中的新的PI-3K/mTORC2抑制剂，表明SEMA3F具有深远的生物学意义和临床意义，并且是用于增强慢性疾病的消退的治疗剂。
结果
SEMA3F抑制Akt、mTOR和S6K磷酸化。为了确定SEMA3F对细胞内信号传导应答的作用，对表达NRP2的人胶质母细胞瘤细胞系U87MG中的磷酸激酶的水平进行了分析。发现SEMA3F抑制了许多激酶(特别是Akt(T308和S473)、Erk(T202/Y204和T185/Y187)以及mTOR(S2448))的磷酸化(图28A；表1)，其通过蛋白质印迹分析得到确认(图28B)。时程分析进一步表明，在SEMA3F处理的10分钟-20分钟内，pAkt(T308和S473)、pmTOR及其下游信号传导(pS6K和pS6)受到抑制，并且该抑制作用持续大于60分钟(图28C和图34A)。SEMA3F不能在NRP2和丛蛋白A1-siRNA转染的细胞中抑制pAkt、pS6K和pS6，表明SEMA3F对Akt/mTOR活性的调控作用需要处于细胞表面的NRP2/丛蛋白A1复合物的相互作用(图19，顶部子图和图34B)。SEMA3F还在表达NRP2的数种其它细胞系(包括U251胶质母细胞瘤细胞、黑素细胞细胞系、Jurkat T淋巴细胞和内皮细胞)中抑制Akt(S473)和S6K磷酸化(图34C-图34D)。使用标准的基于ELISA的测定法(29)，还发现SEMA3F以时间依赖性方式抑制了各细胞系中的PI-3K活性(图28D)。此外，用SEMA3F预处理内皮细胞(进行30分钟)抑制了随后的VEGF诱导的PI-3K活化(图28D)。这些结果表明对于抑制PI-3K-Akt/mTOR信号传导的活性而言，SEMA3F-NRP2相互作用是调控性的。
SEMA3F主要抑制mTORC2的组装。mTORC1和mTORC2信号传导对于细胞代谢(30、31)以及许多正常细胞类型的分化、增殖和存活而言是至关重要的(27、32、33、34、35)。通过免疫沉淀，发现SEMA3F分别抑制了mTOR与raptor和rictor之间的结合(图29A)，表明对mTORC1和mTORC2均有生物学作用。实际上，用SEMA3F处理60分钟的细胞具有降低水平的pAkt(T308和S473)和pS6K(vs.未处理的细胞，图29B，泳道1vs.泳道4)。为了确定其主要功能模式是否涉及mTORC1vs.mTORC2的抑制，将细胞用雷帕霉素进行预处理(10nM进行30分钟，以抑制mTORC1)，并随后在雷帕霉素和SEMA3F的存在或不存在下，对细胞培养另外的60分钟。如先前所报道的(36、37、38)，单独用雷帕霉素作为对照进行处理(90分钟)引起pS6K的显著抑制，但是pAkt(T308和S473)水平分别得到1.9倍(p<0.001)和2.0倍(p<0.01)的诱导(图29B，泳道1vs.泳道2和图29C)。相比之下，用雷帕霉素处理30分钟、并随后用SEMA3F和雷帕霉素处理额外的60分钟的U87MG细胞具有降低水平的pAkt和pS6K(图29B，泳道2vs.泳道5)。值得注意的是，SEMA3F对抑制pAkt表达的这一作用与当用ATP竞争性mTORC1/C2抑制剂Torin 1处理细胞时所观察到的作用类似(图29B，泳道3vs.泳道4)。SEMA3F还抑制了mTORC2活性的其它的已知靶标pSGK1(S422)和pPKCα(S657，图28B和图35A)(23)。
为了进一步评价SEMA3F的主要生物学作用是否针对于mTORC2复合物形成，接下来用2DAkt对U87MG细胞进行转染，其中，使T308和S473位点突变，以编码组成型激活形式的激酶(36、37)。2DAkt在EC中的过表达引起mTORC1活化，并且雷帕霉素抑制了2DAkt诱导的信号传导应答(37)。类似地，在U87MG细胞vs.对照转染子中，2DAkt的转染与pS6K和pS6的诱导表达水平相关(图29D，泳道1vs.泳道4)，但是在用SEMA3F处理转染细胞后，表达没有变化。还发现SEMA3F降低了2DAkt转染子中的pAkt(S473)的水平(图35A)。此外，通过免疫沉淀，用SEMA3F处理2DAkt转染的细胞抑制了mTOR/rictor的相互作用(图35B)，这与SEMA3F对mTORC2组装的主要作用一致。总之，这些结果证实了SEMA3F/NRP2/丛蛋白A1相互作用对抑制mTORC2/Akt活性具有直接作用。
mTORC2使SEMA3F生物学与F-肌动蛋白细胞骨架相关联。接下来确定mTORC2的抑制是否充当了使SEMA3F活性与细胞骨架瓦解相关联的媒介物应答。用SEMA3F(640ng/ml)、雷帕霉素(10nM)或Torin 1(10nM)对U87MG细胞处理30分钟，并使用鬼笔环肽染色使肌动蛋白细胞骨架可视化。与未处理的细胞相比，SEMA3F显著抑制了应力纤维形成和细胞骨架重排(图30A，p＝0.002)。此外，在用mTORC1/C2抑制剂Torin 1处理后的细胞中观察到类似的作用(p＝0.01)。相比之下，用mTORC1抑制剂雷帕霉素进行的处理未能引起任何的细胞骨架变化(图30A；图35A-图35B)。此外，尽管在pcDNA3.1对照载体转染的细胞中，SEMA3F抑制了90％的应力纤维形成，但其在用mTOR过表达构建体转染的U87MG细胞中，对应力纤维形成的影响极小(图30B)。这些发现表明SEMA3F对mTORC1具有极小的直接影响。与这一解释一致的是，raptor的敲低还对应力纤维形成和细胞骨架瓦解具有极小的影响(图30C)。然而，在raptor-siRNA处理的细胞中，SEMA3F减少了应力纤维形成(图30C)；并且值得注意的是，单独的rictor的siRNA敲低足以引起瓦解(p＝0.02)。这些数据表明mTORC2充当媒介物，以调节SEMA3F诱导的细胞骨架瓦解。
在用mTOR过表达构建体转染的U87MG细胞中，使用rhotekin下拉(pulldown)测定法对RhoA活性进行测量(39)(图30D)。在对照的pcDNA3.1转染的细胞中，SEMA3F阻抑了RhoA活性(88％)，但在过表达mTOR的细胞中，活性得到部分恢复(55％)。此外，使用siRNA(如上所述)，发现rictor(而非raptor)敲低、RhoA活性减弱(图30E)。总的来说，这些观察结果证实，通过SEMA3F/NRP2/丛蛋白A1相互作用对mTORC2活性进行的抑制对于失活的RhoA而言起作用，其转而导致细胞骨架瓦解。因此，SEMA3F对mTORC2活性的上游调控具有靶向多种生物应答的潜力。
SEMA3F经由mTOR途径抑制缺氧诱导的VEGF的生成。VEGF的局部表达和调控对于许多生理和病理过程而言是关键的(40、41)。这些发现表明，SEMA3F可经由其靶向mTOR激酶活性的能力来靶向VEGF的转录活化(36、42)。为了测试SEMA3F对VEGF表达调控的作用，用全长2.6kb的VEGF启动子-荧光素酶构建体对U87MG细胞进行转染，并使其暴露至缺氧模拟剂去铁胺(DFO)或缺氧(1％O2)。发现用DFO进行处理诱导了VEGF启动子活性(16倍，p<0.001)，该活性受到SEMA3F的部分抑制(43％，p<0.005)(预处理30分钟，图31A)。在1％O2中培养18小时后，VEGF启动子活性也得到增加(如43所预期的)(图31B)；在用SEMA3F处理后再次降低了VEGF启动子活性(44％，p<0.05)，但不降低至基础水平。为了测试SEMA3F对mTORC1/C2的相对作用，用2DAkt构建体和全长VEGF启动子报告子构建体对U87MG细胞进行瞬时共转染，并在SEMA3F的存在或不存在下对细胞进行培养。发现在用DFO处理后的2DAkt转染的细胞中，SEMA3F未能减弱VEGF启动子活性(图31C)。最后，在DFO存在或不存在下，通过ELISA测定了SEMA3F对VEGF向条件培养基中的分泌的作用。DFO显著增加了VEGF产生(与未处理的细胞相比增加160％，p<0.001(数据未显示))。此外，SEMA3F、mTORC1抑制剂雷帕霉素(18小时，以靶向mTORC1/C2)以及mTORC1/C2抑制剂Torin1显著降低了DFO诱导的VEGF蛋白分泌(图31D，p<0.01)。与单独的SEMA3F或Torin 1相比，用雷帕霉素和SEMA3F对细胞进行的联合处理未能进一步阻抑VEGF的产生，但SEMA3F和Torin 1的组合轻微地(但显著时，p<0.05)抑制了VEGF水平(图31D)。总的来说，这些发现表明，SEMA3F经由mTOR活性的调控而部分地阻抑了诱导型VEGF的表达。
SEMA3F在体内抑制U87MG肿瘤生长和血管生成。为了确定我们的信号传导研究的体内相关性，在完善建立的异种移植物模型中评价了SEMA3F对肿瘤生长的作用(5、44、45)。在一种方法中，将经工程化以组成型地过表达SEMA3F的亲代U87MG细胞或U87MG细胞皮下植入裸鼠(1×106个/小鼠)中；在3周的时间段内，在所指示的时间点对肿瘤大小(mm3)进行测量。发现当植入产生SEMA3F的细胞时，与亲代细胞相比，基本上不存在肿瘤生长(p<0.0005，图32A)。此外，表达CD31的EC的免疫组织化学分析证实，亲代U87MG肿瘤中存在大量血管(图32B)；相比之下，U87MG/SEMA3F来源的肿瘤内的毛细血管受到抑制，并且没有可辨别的管腔(图32B)。第二种方法涉及将1×106个U87MG细胞注射到裸鼠的皮肤中，2天后，使小鼠接受编码用His标记的人SEMA3F的腺病毒(Ad-3F)或对照腺病毒(Ad-Cont)的单次静脉内注射。在30天的时间段内，向小鼠中注射Ad-3F(1×109pfu)没有导致任何毒性；小鼠体重增加，并且典型行为是正常的。蛋白质印迹分析显示出给予Ad-3F在肝脏中引起高水平的SEMA3F产生(图32C)，并且通过ELISA，SEMA3F水平在血清中是可测量的。SEMA3F蛋白的循环血清水平在给予腺病毒后第8天达到峰值(注射肿瘤细胞后的第10天)，并持续到第14天的实验结束(平均值为26ng/ml，n＝4)。因此，这一方法使得能够在小鼠中已确立肿瘤生长后的时间开始SEMA3F生产的循环。在Ad-Cont处理的小鼠中，肿瘤体积在第14天达到400mm3，而在注射Ad-3F的小鼠中肿瘤生长在14天的时间段内是最小的(p<0.0001，图32C)。通过免疫染色，在收集自Ad-3F处理的小鼠的肿瘤内，存在表达CD31的毛细血管的显著的瓦解表型，而且大多数血管腔看起来并不明显(图32D)。此外，通过蛋白质印迹分析，发现与Ad-Cont处理的小鼠相比，在Ad-3F处理后的肿瘤中，pAkt、pmTOR和pS6K水平得到阻抑(图32E)。因此，在两种非常不同的方法中，SEMA3F给予(局部和/或全身性)具有相似的抗肿瘤作用。总之，这些结果证实通过抑制Akt/mTOR信号传导通路，SEMA3F抑制了肿瘤生长和血管生成。
讨论
首次示出了脑信号蛋白是轴突导向和寻路的介导物，并且随后发现脑信号蛋白调控了血管稳态和肿瘤发展(1、2)。在这些研究中，将SEMA3F定义为强效的mTOR抑制剂，并且其作用通过抑制PI-3K活性以及mTOR/rictor和mTOR/raptor复合物的组装来介导。还发现SEMA3F的功能性作用经由与NRP2-丛蛋白A1受体的相互作用来介导。在多种细胞类型(包括T细胞、内皮细胞和肿瘤细胞系)中发现了SEMA3F对mTOR的调控，所有调控均被完善建立以利用该信号传导通路进行细胞活化、分化和增殖。这些发现表明，SEMA3F生物学在许多生理和病理状况(包括癌症以及与慢性炎症(如同种异体移植物排斥)相关的疾病)中具有广泛相关性。
虽然关于mTORC1的细胞内调控已经了解很多，而关于mTORC2活性的上游调控相对了解较少。在秀丽隐杆线虫中，已经显示出无脊椎动物的脑信号蛋白-丛蛋白相互作用减少了TOR与rictor的结合，但促进了TOR/raptor的结合，引起通过4EBP-eIF4F通路进行的mRNA翻译(14)。相比之下，在哺乳动物细胞中，目前所呈现的研究表明，SEMA3F可充当独特的可溶性配体，以选择性地靶向mTORC2活性以及由此进行的细胞活化后的促消退。例如，用2DAkt转染表达NRP2的细胞系以活化mTORC1证实了，SEMA3F对mTOR和raptor之间的结合(数据未显示)或S6K和S6的磷酸化/活化的影响极小。此外，相比用雷帕霉素(已知主要靶向mTORC1)短时程处理后所观察到的应答，SEMA3F应答显著不同。相比之下，在多种测定法中，发现SEMA3F对细胞活化和细胞骨架瓦解的抑制作用主要通过其对mTORC2的作用来介导，并且与用Torin 1(mTORC1/C2的药理学抑制剂)处理后所观察到的抑制作用相似。
重要地，还发现SEMA3F降低了PI-3K活性，据报道PI-3K活性在mTORC246的活化中起作用，47。因此，SEMA3F可能经由PI-3K的上游抑制来使mTORC2失活。另一相关的家族成员NRP1结合并活化第10号染色体上缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物(PTEN)(7)(PI-3K的负调控因子)。不希望受理论的束缚，由此假定NRP2通过SEMA3F的连接可引起PTEN的募集，SEMA3F转而充当了调控PI-3K活性的媒介物。与这种可能性一致的是，发现PTEN与人脐静脉EC(HUVEC，图36A)中的NRP2共免疫沉淀。此外，在丛蛋白A1敲低和siRNA转染后，通过免疫沉淀，PTEN维持了与NRP2的结合(图36B)，表明HUVEC中的PTEN和NRP2(而不是丛蛋白A1)之间的直接相互作用。此外，在HUVEC中的PTEN的siRNA敲低后，SEMA3F不能抑制pAkt表达(图36C)。这些发现主要表明对于其对PI-3K/Akt/mTOR信号传导的调控作用而言，PTEN对NRP2的募集是僵化的。
然而，据报道U87MG、U251和Jurkat细胞是相对的PTEN缺陷的(48、49、50)(参见图34C)，表明SEMA3F还可经由PTEN非依赖性机制来引发其调控性应答。实际上，如所预期的，PTEN不能在U87MG细胞中与NRP2共免疫沉淀(数据未显示)。为此，对有潜力将NRP2信号与PI-3K活性机制性地连接的其它接头(adaptor)进行筛选。这些接头包括GIPC1(GAIP/RGS19相互作用蛋白，也称为神经毡蛋白相互作用蛋白或synectin，图36D)(51、52、53)、其它GIPC家族成员(52)和含有mTOR相互作用蛋白的DEP结构域(DEPTOR)(32、54)。然而，这些接头的siRNA敲低没有改变SEMA3F对pAkt表达的调控作用(数据未显示)。评价了SEMA3F对mTOR/Akt和MAPK信号传导的作用之间的交互作用(crosstalk)。药理学MEK抑制剂U0126并不调节SEMA3F对pAkt水平的调控作用，表明SEMA3F对Akt-mTOR信号传导的抑制作用是MAPK非依赖性的(图36E)。因此，尽管SEMA3F-NRP2相互作用可以募集PTEN，以在正常细胞的原代培养物中调控PI-3K和mTORC2，额外的接头/激酶还可以在该应答中起作用。
对轴突导向分子的脑信号蛋白家族(包括SEMA3F)进行完善建立，以促进由伴随的肌动蛋白细胞骨架应力纤维的重排所导致的神经元生长锥瓦解。SEMA3F是肿瘤细胞和EC在体外和体内的粘附、扩散和运动性的强效抑制剂(5、6)。此外，SEMA3F在24小时内不会诱导U87MG细胞中的凋亡(6)。在肿瘤和血管内皮细胞中，SEMA3F使RhoA失活，从而抑制细胞骨架应力纤维形成(6、12)。本文证实了mTORC2在该应答中是媒介物，并且对于RhoA失活而言是必不可少的。例如，在用mTOR转染细胞后(以诱导mTORC1)，SEMA3F处理导致细胞瓦解，表明这种作用是mTOR非依赖性的和/或与mTORC2的靶向相关。与对mTORC2的作用一致，如在用SEMA3F处理后所观察到的，rictor的siRNA敲低和用mTORC2抑制剂Torin 1对U87MG细胞的处理一致地降低了应力纤维的数量。此外，SEMA3F降低了raptor siRNA(mTORC1)敲低细胞中的应力纤维的数量。重要地，SEMA3F进一步降低了rictor siRNA处理的细胞中的应力纤维，表明SEMA3F可能部分经由mTORC2通路并且部分经由ABL2/p190RhoGAP通路来使RhoA失活(图33)。尽管据报道，mTORC2与Rho GTP酶家族相互作用并介导F-肌动蛋白细胞骨架重组(18、55)，但是本文证实了可通过刺激NRP2诱导的信号来靶向这一作用。
在内皮细胞中，Akt的mTORC2依赖性活化在VEGF的转录活化中起作用(36)。VEGF起到促血管生成因子的作用，以增加肿瘤生长，并起到与慢性炎症相关的白细胞化学吸引物的作用(43)。由于SEMA3F靶向mTORC2活性，还评估了其是否对VEGF的诱导型表达具有任何生物学影响。发现SEMA3F经由抑制mTORC2和mTORC1两者显著抑制了诱导型VEGF表达。然而，在用诱导mTORC1活化的2DAkt构建体将细胞转染后，SEMA3F未能抑制VEGF的反式活化。在U87MG细胞中，还发现用SEMA3F或雷帕霉素(长期处理以抑制mTORC1/C2两者)或mTORC1/C2抑制剂Torin 1处理引起VEGF表达的类似水平的抑制。不存在组合的SEMA3F和雷帕霉素的额外的抑制作用，表明SEMA3F和雷帕霉素靶向相同的信号传导通路。然而，令人惊讶地，SEMA3F部分增加了Torin 1对VEGF表达的抑制作用。这可能表明这些研究中所使用的Torin1剂量不足以完全抑制mTORC2，或可替代地，Torin 1可能揭露了额外的SEMA3F引发的调控性机制。值得注意的是，单独的SEMA3F未能将VEGF表达抑制到基础水平，然而，先前已经报道了单独的SEMA3F抑制VEGF诱导的EC增殖(56)。尽管如此，这些新的发现表明，SEMA3F的这种抗VEGF作用对于其在体内的生物学作用而言可能是最显著的，例如我们对SEMA3F的肿瘤生长抑制潜力的过去的观察结果(5、6)和当前的观察结果。
在异种移植物小鼠模型中，SEMA3F在肿瘤细胞(例如肺癌细胞、脑癌细胞和乳腺癌细胞)中的过表达显著抑制了肿瘤发展和血管生成(5、13、44、45、57)。在这些研究中，将对照或产生SEMA3F的U87MG细胞皮下植入裸鼠中，发现SEMA3F的表达强烈抑制了肿瘤生长和血管生成。此外，在肿瘤发展后，将腺病毒用于评价高水平的循环SEMA3F蛋白对肿瘤生长和血管生成的作用。最值得注意的是，循环SEMA3F显著抑制了肿瘤生长。然而，在生长的肿瘤内，所有新血管生成的血管具有显著的瓦解表型，这与已知的SEMA3F对细胞骨架的作用一致(6)。此外，来自SEMA3F处理的小鼠的肿瘤裂解物显示出降低水平的pAkt、pmTOR和pS6K，这与其在体外的作用一致。因此，在体内模型中，经由对肿瘤内的VEGF分泌的阻抑和对Akt-mTOR信号传导的直接抑制，以及经由对抑制血管生成的内皮细胞的作用，SEMA3F可能对肿瘤生长具有较大影响。此外，通过两种不同方法(通过肿瘤的局部过表达和通过全身性给予)所获得的显著抑制的肿瘤生长确认了SEMA3F是强效的体内mTOR抑制剂。
这些发现证实了SEMA3F-NRP2相互作用抑制了细胞内PI-3K活性、mTORC2依赖性信号转导、RhoA活性和细胞骨架应力纤维形成。SEMA3F还在转录水平和蛋白水平上在体外抑制了VEGF的诱导型表达，并且其在体内具有强力的抗肿瘤作用。SEMA3F是分泌的生理性mTOR抑制剂，其在细胞活化后起到促进消退的作用。这些发现具有广泛的临床意义，包括出于治疗目的而使用SEMA3F以例如靶向慢性免疫介导性疾病、同种异体移植物排斥或血管生成相关的病理(例如肿瘤生长和肿瘤进展)。
方法
抗体和试剂：以下抗体全部购自Cell Signaling Technology(Danvers，MA)：兔单克隆抗磷酸-Akt(Thr308)抗体(#2965)、小鼠单克隆抗磷酸-Akt(Ser473)抗体(#4051)、兔多克隆抗Akt抗体(#9272)、兔多克隆抗磷酸-Erk1/2(Thr202/Tyr204)抗体(#9101)、小鼠单克隆抗Erk1/2抗体(#4696)、兔单克隆抗磷酸-S6K(Thr389)抗体(#9234)、兔单克隆抗S6K抗体(#2708)、兔单克隆抗磷酸-S6(Ser235/236)抗体(#4856)、小鼠单克隆抗S6抗体(#2317)、兔单克隆抗磷酸-mTOR(Ser2448)抗体(#5536)、兔多克隆抗mTOR抗体(#2972)、兔多克隆抗丛蛋白A1抗体(#3813)、兔单克隆抗raptor抗体(#2280)、兔单克隆抗RhoA抗体(#2117)、兔单克隆抗PTEN抗体(#9188)。山羊多克隆抗磷酸-SGK(S422，sc-16745)、小鼠单克隆抗NRP2抗体(C-9，sc-13117)、山羊多克隆抗GIPC抗体(N-19，sc-9648)购自Santa CruzBiotechnology，Inc(Dallas，TX)。兔多克隆抗rictor抗体(A300-458A)购自BethylLaboratories，Inc(Montgomery，TX)，小鼠单克隆抗β-肌动蛋白抗体(AC-15)购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。
VEGF-A(DVE00)ELISA试剂盒获得自R&D Systems(Minneapolis，MN)。PI3-激酶活性ELISA(K-1000s)购自Echelon Biosciences(Salt Lake City，UT)。mTOR抑制剂雷帕霉素和Torin 1分别购自Lc Laboratories(Woburn，MA)和R&D Systems。去铁胺(DFO)购自Sigma-Aldrich，并且MEK抑制剂(U0126)购自EMD-Millipore(Billerica，MA)。在荧光素酶测定法中，使用pGL4.74[hRluc/TK]载体(Promega Madison，WI)作为内部对照。
细胞培养：U87MG和U251人胶质母细胞瘤细胞、肾293细胞和293T细胞以及JurkatT淋巴细胞获得自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)，并将其培养于所推荐的含有10％FBS(Denville Scientific，South Plainfield，NJ)和1％L-谷氨酰胺/青霉素G/硫酸链霉素(1％GPS，Life Technologies)的培养基中。HUVEC购自Lonza(Walkersville，MD)，并将其培养于补充有EGM2 SingleQuot的EBM2培养基中。用补充有人黑素细胞生长补充剂(Life Technologies)的培养基254，将人黑素细胞(HEMn-LP，Life Technologies)维持在37℃下的5％CO2孵育箱中。对于所有缺氧实验，将细胞培养于37℃下的1％O2中的缺氧室(Heracell，Thermo Scientific，Hudson，NH)中。
人重组SEMA3F：使用FuGENE HD转染试剂(Roche，Basel，瑞士)将全长的His-Myc标记的人SEMA3F构建体转染到293T细胞中。在HiTrapTM HP Chelating柱(GE HealthcareBio-Sciences Corp.，Pittsburgh，PA)上，对分泌到培养基中的SEMA3F进行纯化(60)。
磷酸激酶阵列：人磷酸激酶阵列试剂盒(ARY003)获得自R&DSystems。用先前发现的诱导细胞骨架瓦解并抑制RhoA活性的SEMA3F对U87MG细胞进行处理(6)。此前用320ng/ml的SEMA3F对U87MG细胞进行处理，发现SEMA3F诱导形态变化并抑制HUVEC和U87MG细胞中的细胞迁移。与这些结果一致，我们发现SEMA3F(甚至在最低浓度200ng/ml)抑制pAkt和pS6K信号传导(图34D)。然而，在其它细胞类型中，发现该浓度对于阻抑这些信号而言并不是最佳的。因此，对640ng/ml的浓度进行优化，以分析SEMA3F信号传导通路。在SEMA3F处理后30分钟对细胞裂解物进行收集，并根据制造商的说明用该阵列对磷蛋白的水平进行分析。
蛋白质印迹：通过SDS-PAGE对各样品中的蛋白质进行分离，并将其转移到硝酸纤维素膜。用处于TBS-T(处于tris-缓冲盐水[TBS]中的0.1％Tween 20)中的4％脱脂乳对膜封闭30分钟，随后用一抗进行孵育。在用TBS-T洗涤后，用适当的辣根过氧化物酶缀合的二抗对膜进行孵育，并通过使用ECL检测试剂对免疫反应性进行检测。
免疫沉淀：使用适当的抗体在4℃下对细胞裂解物免疫沉淀过夜。向各样品加入蛋白G-Sepharose 4Fast Flow珠(GE Healthcare)，随后在4℃下混合1小时。将样品溶解在SDS样品缓冲液中并煮沸5分钟。
F-肌动蛋白染色：将细胞用4％多聚甲醛(PFA)固定，随后用处于PBS中的0.2％Triton X-100透化。分别用Alexa Fluor 488鬼笔环肽和Hoechst 33342对F-肌动蛋白和细胞核进行染色。对来自各培养物的3个-5个区域的共聚焦图像进行考查，并且使用所描述的标准方法学在代表性个体细胞(约5个/实验)中对应力纤维进行计数(6)。
RhoA活性：根据制造商的说明(Cytoskeleton，Denver，CO)，使用基于rhotekin下拉的RhoA活化测定法对RhoA活性进行测量。
RNA干扰：根据制造商的方案，用siLentFect脂类试剂(Bio-Rad，Hercules，CA)进行siRNA(20nM)转染。对照siRNA(Silencer阴性对照#2siRNA)购自Life Technologies。ON-TARGETplusTM人NRP2siRNA购自Thermo Scientific(Hudson，NH)，丛蛋白A1(Hs_PLXNA1_3)、rictor(Hs_RICTOR_5)、PTEN(Hs_PTEN_6)和GIPC1(Hs_RGS19IP1_1)siRNA来自Qiagen(Valencia，CA)，并且Raptor siRNA(sc-44069)来自Santa Cruz Biotechnology，Inc.(Dallas，TX)。通常，在测定之前，进行siRNA转染48小时。
转染和荧光素酶测定法：根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000试剂(LifeTechnologies)，用所指示的质粒构建体(pcDNA3.1，WT mTOR，2DAkt，VEGF荧光素酶报告子质粒或pGL4.74[hRluc/TK])对U87MG细胞进行瞬时转染。18小时后，按照各实验设计中所概述的，对细胞进行处理。使用双荧光素酶报告子测定系统(Dual-Luciferase ReporterAssay System，Promega)对VEGF启动子活性进行分析，并通过Renilla荧光素酶作为内部对照，对荧光素酶活性进行归一化。
腺病毒：重组对照(#000047A)和人SEMA3F-His(#129755A)腺病毒购自AppliedBiological Materials，Inc.(Richmond，加拿大)。将每个腺病毒用293个细胞扩增，并使用Fast Trap腺病毒纯化和富集试剂盒(EMD-Millipore)进行纯化。通过Adeno-XTM RapidTiter试剂盒(Clontech Laboratories，Inc.，Mountain View，CA)对腺病毒滴度进行测定。以大于1×1010pfu/ml的滴度获得腺病毒。
肿瘤异种移植物模型：将亲代U87MG细胞或人SEMA3F稳定的U87MG克隆物(1×106个/注射)皮下给予裸鼠中(雄性，8周龄-10周龄)。在一个模型中，使用标准卡尺每3天-4天测量肿瘤大小。在第24天处死小鼠，并取出肿瘤。在第二个模型中，将亲代U87MG细胞皮下给予裸鼠。在初步研究中，在肿瘤细胞注射(1×106个U87MG细胞/注射)前3天，经由尾静脉将编码SEMA3F的腺病毒(Ad-3F)或对照腺病毒(Ad-Cont)进行静脉内注射；我们观察到Ad-3F组中的所有肿瘤未能生长(数据未显示)。因此，我们修改了我们的方法，并将Ad-3F的给予延迟到肿瘤注射后的第2天，以便在处于循环中的峰值SEMA3F产生之前起始肿瘤生长(给予后约8天-10天，数据未显示)。使用标准卡尺每隔一天测量肿瘤大小，在第5天和第8天从尾静脉收集血清样品，并在第14天在收集肿瘤、肝脏和血清样品时处死小鼠。通过以下来确认SEMA3F的产生：用抗His/抗SEMA3F抗体对肝脏进行的蛋白质印迹分析，以及使用来自MyBioSource(San Diego，CA)的人SEMA3F ELISA试剂盒(MBS454602)对SEMA3F的血清水平进行的分析。
免疫组织化学：将石蜡包埋的切片脱蜡，并在37℃下于0.2M Tris缓冲液(pH7.2)中用蛋白酶K(36μg/ml)活化30分钟，并进行免疫组织化学染色。根据制造商的说明，用抗小鼠CD31抗体(BD Biosciences，San Jose，CA)、VectaStain试剂盒(Vector，Burlingame，CA)和酪胺信号放大(Tyramide Signal Amplification，TSA)生物素系统(NEN Life ScienceProducts，Boston，MA)进行免疫组织化学。
统计分析：所有测定法均独立进行至少三次。结果表示为平均值±标准偏差(SD)。使用Student’s t检验对组进行比较，并且认为p值＜0.05是统计学上显著的。
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实施例13
在图2所示的第5天，通过在移植后早期检查Treg表型，对Sema3F的免疫调控功能进行评价。如FACS以及下部子图中的总结所示(图37)，在CD3、CD4、CD8和Treg中没有观察到差异。
实施例14
在NRP-2敲除和条件性敲除中，对CD4+T效应细胞分化进行检查。在NRP-2敲除CD4+T细胞中，分化得到增强(图39)。数据表明NRP-2抑制效应T细胞的扩增。
实施例15
将MHC轻微不匹配的B6.C-H2bm12供体心脏移植到C57BL6(WT)或NRP-2KO受者中，并对存活率进行测定。NRP-2缺乏导致加速的心脏同种异体移植物排斥(图40)。
实施例16
为了研究NRP-2配体Sema3F在体内的作用，在心脏移植模型中，将包含Sema3F的腺病毒或空白对照给予小鼠。Sema3F载体增加了Sema3F在肝脏中的产生。Sema3F水平在给予后第14天达到峰值(图41)。
表1
坐标 靶标 对照 SEMA3F 比例
A1，A2 阳性对照 0.513 0.544 106.0
A3，A4 p38a(T180/Y182) 0.292 0.268 91.8
A5，A6 ERK1/2(T202/Y204，T185/Y187) 0.330 0.301 91.2
A7，A8 JNK pan(T183/Y185，T221/Y223) 0.313 0.287 91.5
A9，A10 GSK-3a/b(S21/S9) 0.312 0.284 910
A13，A14 p53(S392) 0.332 0.312 94.0
A17，A18 阳性对照 0.412 0.392 95.1
B3，B4 MEK1/2(S218/S222，S222/S226) 0.299 0.277 92.8
B5，B6 MSK1/2(S376/S360) 0.317 0.293 92.4
B7，B8 AMPKa1(T174) 0.290 0.269 92.7
B9，B10 Akt(S473) 0.512 0.396 77.4
B11，B12 Akt(T308) 0.317 0.294 92.6
B13，B14 p53(S46) 0.343 0.321 93.6
C1，C2 TOR(S2448) 0.306 0.281 91.8
C3，C4 CREB(S133) 0.323 0.295 91.3
C5，C6 HSP27(S78/S82) 0.294 0.277 94.0
C7，C8 AMPKa2(T172) 0.317 0.300 94.5
C9，C10 b-连环蛋白 0.352 0.323 91.6
C11，C12 p70 S6激酶(T389) 0.252 0.241 95.6
C13，C14 p53(S15) 0.322 0.312 96.7
C15，C16 p27(T198) 0.257 0.242 94.0
C17，C18 桩蛋白(Y118) 0.275 0.264 95.8
D1，D2 Src(Y419) 0.317 0.289 91.0
D3，D4 Lyn(Y397) 0.287 0.269 93.7
D5，D6 Lck(Y394) 0.286 0.269 94.2
D7，D8 STAT2(Y689) 0.320 0.305 95.3
D9，D10 STAT5a(Y694) 0.297 0.281 94.8
D11，D12 p70 S6激酶(T421/S424) 0.307 0.299 97.4
D13，D14 RSK1/2/3(S380/S386/S377) 0.324 0.320 98.8
D15，D16 p27(T157) 0.264 0.249 94.3
D17，D18 PLCq-1(Y783) 0.275 0.262 95.1
E1，E2 Fyn(Y420) 0.297 0.276 93.1
E3，E4 Yes(Y426) 0.305 0.289 94.6
E5，E6 Fgr(Y412) 0.280 0.264 94.1
E7，E8 STAT3(Y705) 0.289 0.270 93.4
E9，E10 STAT5b(Y699) 0.291 0.270 92.6
E11，E12 p70 S6激酶(T229) 0.264 0.264 100.0
E13，E14 RSK1/2(S221/S227) 0.314 0.307 97.8
E15，E16 c-Jun(S63) 0.279 0.263 94.3
E17，E18 Pyk2(Y402) 0.269 0.251 93.1
F1，F2 Hck(Y411) 0.295 0.270 91.4
F3，F4 Chk-2(T68) 0.318 0.297 93.4
F5，F6 FAK(Y397) 0.314 0.275 87.7
F7，F8 STAT6(Y641) 0.315 0.304 96.3
F9，F10 STAT5a/b(Y694/Y699) 0.345 0.311 90.1
F11，F12 STAT1(Y701) 0.304 0.298 98.2
F13，F14 STAT4(Y693) 0.295 0.285 96.4
F15，F16 eNOS(S1177) 0.255 0.240 93.9
F17，F18 PBS(阴性对照) - - -
G1，G2 阳性对照 0.490 0.487 99.4
G5，G6 PBS(阴性对照) - - -
序列表
<110> CHILDREN'S MEDICAL CENTER CORPORATION
<120> 用于免疫调节的组合物和方法
<130> 701039-080591-PCT
<140>
<141>
<150> 62/006,441
<151> 2014-06-02
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 785
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Leu Val Ala Gly Leu Leu Leu Trp Ala Ser Leu Leu Thr Gly Ala
1 5 10 15
Trp Pro Ser Phe Pro Thr Gln Asp His Leu Pro Ala Thr Pro Arg Val
20 25 30
Arg Leu Ser Phe Lys Glu Leu Lys Ala Thr Gly Thr Ala His Phe Phe
35 40 45
Asn Phe Leu Leu Asn Thr Thr Asp Tyr Arg Ile Leu Leu Lys Asp Glu
50 55 60
Asp His Asp Arg Met Tyr Val Gly Ser Lys Asp Tyr Val Leu Ser Leu
65 70 75 80
Asp Leu His Asp Ile Asn Arg Glu Pro Leu Ile Ile His Trp Ala Ala
85 90 95
Ser Pro Gln Arg Ile Glu Glu Cys Val Leu Ser Gly Lys Asp Val Asn
100 105 110
Gly Glu Cys Gly Asn Phe Val Arg Leu Ile Gln Pro Trp Asn Arg Thr
115 120 125
His Leu Tyr Val Cys Gly Thr Gly Ala Tyr Asn Pro Met Cys Thr Tyr
130 135 140
Val Asn Arg Gly Arg Arg Ala Gln Ala Thr Pro Trp Thr Gln Thr Gln
145 150 155 160
Ala Val Arg Gly Arg Gly Ser Arg Ala Thr Asp Gly Ala Leu Arg Pro
165 170 175
Met Pro Thr Ala Pro Arg Gln Asp Tyr Ile Phe Tyr Leu Glu Pro Glu
180 185 190
Arg Leu Glu Ser Gly Lys Gly Lys Cys Pro Tyr Asp Pro Lys Leu Asp
195 200 205
Thr Ala Ser Ala Leu Ile Asn Glu Glu Leu Tyr Ala Gly Val Tyr Ile
210 215 220
Asp Phe Met Gly Thr Asp Ala Ala Ile Phe Arg Thr Leu Gly Lys Gln
225 230 235 240
Thr Ala Met Arg Thr Asp Gln Tyr Asn Ser Arg Trp Leu Asn Asp Pro
245 250 255
Ser Phe Ile His Ala Glu Leu Ile Pro Asp Ser Ala Glu Arg Asn Asp
260 265 270
Asp Lys Leu Tyr Phe Phe Phe Arg Glu Arg Ser Ala Glu Ala Pro Gln
275 280 285
Ser Pro Ala Val Tyr Ala Arg Ile Gly Arg Ile Cys Leu Asn Asp Asp
290 295 300
Gly Gly His Cys Cys Leu Val Asn Lys Trp Ser Thr Phe Leu Lys Ala
305 310 315 320
Arg Leu Val Cys Ser Val Pro Gly Glu Asp Gly Ile Glu Thr His Phe
325 330 335
Asp Glu Leu Gln Asp Val Phe Val Gln Gln Thr Gln Asp Val Arg Asn
340 345 350
Pro Val Ile Tyr Ala Val Phe Thr Ser Ser Gly Ser Val Phe Arg Gly
355 360 365
Ser Ala Val Cys Val Tyr Ser Met Ala Asp Ile Arg Met Val Phe Asn
370 375 380
Gly Pro Phe Ala His Lys Glu Gly Pro Asn Tyr Gln Trp Met Pro Phe
385 390 395 400
Ser Gly Lys Met Pro Tyr Pro Arg Pro Gly Thr Cys Pro Gly Gly Thr
405 410 415
Phe Thr Pro Ser Met Lys Ser Thr Lys Asp Tyr Pro Asp Glu Val Ile
420 425 430
Asn Phe Met Arg Ser His Pro Leu Met Tyr Gln Ala Val Tyr Pro Leu
435 440 445
Gln Arg Arg Pro Leu Val Val Arg Thr Gly Ala Pro Tyr Arg Leu Thr
450 455 460
Thr Ile Ala Val Asp Gln Val Asp Ala Ala Asp Gly Arg Tyr Glu Val
465 470 475 480
Leu Phe Leu Gly Thr Asp Arg Gly Thr Val Gln Lys Val Ile Val Leu
485 490 495
Pro Lys Asp Asp Gln Glu Leu Glu Glu Leu Met Leu Glu Glu Val Glu
500 505 510
Val Phe Lys Asp Pro Ala Pro Val Lys Thr Met Thr Ile Ser Ser Lys
515 520 525
Arg Gln Gln Leu Tyr Val Ala Ser Ala Val Gly Val Thr His Leu Ser
530 535 540
Leu His Arg Cys Gln Ala Tyr Gly Ala Ala Cys Ala Asp Cys Cys Leu
545 550 555 560
Ala Arg Asp Pro Tyr Cys Ala Trp Asp Gly Gln Ala Cys Ser Arg Tyr
565 570 575
Thr Ala Ser Ser Lys Arg Arg Ser Arg Arg Gln Asp Val Arg His Gly
580 585 590
Asn Pro Ile Arg Gln Cys Arg Gly Phe Asn Ser Asn Ala Asn Lys Asn
595 600 605
Ala Val Glu Ser Val Gln Tyr Gly Val Ala Gly Ser Ala Ala Phe Leu
610 615 620
Glu Cys Gln Pro Arg Ser Pro Gln Ala Thr Val Lys Trp Leu Phe Gln
625 630 635 640
Arg Asp Pro Gly Asp Arg Arg Arg Glu Ile Arg Ala Glu Asp Arg Phe
645 650 655
Leu Arg Thr Glu Gln Gly Leu Leu Leu Arg Ala Leu Gln Leu Ser Asp
660 665 670
Arg Gly Leu Tyr Ser Cys Thr Ala Thr Glu Asn Asn Phe Lys His Val
675 680 685
Val Thr Arg Val Gln Leu His Val Leu Gly Arg Asp Ala Val His Ala
690 695 700
Ala Leu Phe Pro Pro Leu Ser Met Ser Ala Pro Pro Pro Pro Gly Ala
705 710 715 720
Gly Pro Pro Thr Pro Pro Tyr Gln Glu Leu Ala Gln Leu Leu Ala Gln
725 730 735
Pro Glu Val Gly Leu Ile His Gln Tyr Cys Gln Gly Tyr Trp Arg His
740 745 750
Val Pro Pro Ser Pro Arg Glu Ala Pro Gly Ala Pro Arg Ser Pro Glu
755 760 765
Pro Gln Asp Gln Lys Lys Pro Arg Asn Arg Arg His His Pro Pro Asp
770 775 780
Thr
785
<210> 2
<211> 3531
<212> DNA
<213> 智人
<400> 2
ccgcggcgcc gatcccggct gaggcgcagc ggcgagaggt cgcgggcagg gccatggccc 60
cggggggccg ctagcgcgga ccggcccaac gggagccgct ccgtgccgcc gccgccgccc 120
gggcgcccag gccccgccgc tgcggaagag gtttctagag agtggagcct gcttcctggg 180
ccctaggccc ctcccacaat gcttgtcgcc ggtcttcttc tctgggcttc cctactgacc 240
ggggcctggc catccttccc cacccaggac cacctcccgg ccacgccccg ggtccggctc 300
tcattcaaag agctgaaggc cacaggcacc gcccacttct tcaacttcct gctcaacaca 360
accgactacc gaatcttgct caaggacgag gaccacgacc gcatgtacgt gggcagcaag 420
gactacgtgc tgtccctgga cctgcacgac atcaaccgcg agcccctcat tatacactgg 480
gcagcctccc cacagcgcat cgaggaatgc gtgctctcag gcaaggatgt caacggcgag 540
tgtgggaact tcgtcaggct catccagccc tggaaccgaa cacacctgta tgtgtgcggg 600
acaggtgcct acaaccccat gtgcacctat gtgaaccgcg gacgccgcgc ccaggccaca 660
ccatggaccc agactcaggc ggtcagaggc cgcggcagca gagccacgga tggtgccctc 720
cgcccgatgc ccacagcccc acgccaggat tacatcttct acctggagcc tgagcgactc 780
gagtcaggga agggcaagtg tccgtacgat cccaagctgg acacagcatc ggccctcatc 840
aatgaggagc tctatgctgg tgtgtacatc gattttatgg gcactgatgc agccatcttc 900
cgcacacttg gaaagcagac agccatgcgc acggatcagt acaactcccg gtggctgaac 960
gacccgtcgt tcatccatgc tgagctcatt cctgacagtg cggagcgcaa tgatgataag 1020
ctttacttct tcttccgtga gcggtcggca gaggcgccgc agagccccgc ggtgtacgcc 1080
cgcatcgggc gcatttgcct gaacgatgac ggtggtcact gttgcctggt caacaagtgg 1140
agcacattcc tgaaggcgcg gctcgtctgc tctgtcccgg gcgaggatgg cattgagact 1200
cactttgatg agctccagga cgtgtttgtc cagcagaccc aggacgtgag gaaccctgtc 1260
atttacgctg tctttacctc ctctggctcc gtgttccgag gctctgccgt gtgtgtctac 1320
tccatggctg atattcgcat ggtcttcaac gggccctttg cccacaaaga ggggcccaac 1380
taccagtgga tgcccttctc agggaagatg ccctacccac ggccgggcac gtgccctggt 1440
ggaaccttca cgccatctat gaagtccacc aaggattatc ctgatgaggt gatcaacttc 1500
atgcgcagcc acccactcat gtaccaggcc gtgtaccctc tgcagcggcg gcccctggta 1560
gtccgcacag gtgctcccta ccgccttacc actattgccg tggaccaggt ggatgcagcc 1620
gacgggcgct atgaggtgct tttcctgggc acagaccgcg ggacagtgca gaaggtcatt 1680
gtgctgccca aggatgacca ggagttggag gagctcatgc tggaggaggt ggaggtcttc 1740
aaggatccag cacccgtcaa gaccatgacc atctcttcta agaggcaaca actctacgtg 1800
gcgtcagccg tgggtgtcac acacctgagc ctgcaccgct gccaggcgta tggggctgcc 1860
tgtgctgact gctgccttgc ccgggaccct tactgtgcct gggatggcca ggcctgctcc 1920
cgctatacag catcctccaa gaggcggagc cgccggcagg acgtccggca cggaaacccc 1980
atcaggcagt gccgtgggtt caactccaat gccaacaaga atgccgtgga gtctgtgcag 2040
tatggcgtgg ccggcagcgc agccttcctt gagtgccagc cccgctcgcc ccaagccact 2100
gttaagtggc tgttccagcg agatcctggt gaccggcgcc gagagattcg tgcagaggac 2160
cgcttcctgc gcacagagca gggcttgttg ctccgtgcac tgcagctcag cgatcgtggc 2220
ctctactcct gcacagccac tgagaacaac tttaagcacg tcgtcacacg agtgcagctg 2280
catgtactgg gccgggacgc cgtccatgct gccctcttcc caccactgtc catgagcgcc 2340
ccgccacccc caggcgcagg ccccccaacg cctccttacc aggagttagc ccagctgctg 2400
gcccagccag aagtgggcct catccaccag tactgccagg gttactggcg ccatgtgccc 2460
cccagcccca gggaggctcc aggggcaccc cggtctcctg agccccagga ccagaaaaag 2520
ccccggaacc gccggcacca ccctccggac acatgaggcc agctgcctgt gcctgccatg 2580
ggccagccta gcccttgtcc cttttaatat aaaagatata tatatatata tatatatata 2640
aaatatctat attctataca caccctgccc ctgcaaagac agtatttatt ggtgggttga 2700
atatagcctg cctcagtggc agcatcctcc aaaacttaga cccatgctgg tcagagacgg 2760
cagaaaacag agcctgccta accaggccca gccagttggt ggggccaggc caggaccaca 2820
cagtccccag actcagctgg aagtctacct gctggacagc ctccgccaag atctacagga 2880
caaagggagg gagcaagccc tactcggatg gggcacggac tgtccacctt ttctgatgtg 2940
tgttgtcagc ctgtgctgtg gcatagacat ggatgcgagg accactttgg agactggggt 3000
ggcctcaaga gcacacagag aagggaagaa ggggccatca caggatgcca gcccctgcct 3060
gggttggggg cactcagcca cgaccagccc cttcctgggt atttattctc tatttattgg 3120
ggataggaga agaggcatcc tgcctgggtg ggacagcctc ttcagcccct tctcccctcc 3180
ccgcctggcc agggcagggc caccccactc tacctcctta gctttccctg tgccactttg 3240
actcagaggc tgggagcata gcagaggggc caggcccagg cagagctgac gggaggcccc 3300
agctctgagg ggagggggtc cgtggtagag gcctggggcc ggtagaggct ccccagggct 3360
cccttatgtc caccacttca ggggatgggt gtggatgtaa ttagctctgg ggggcagttg 3420
ggtagatggg tgggggctcc tggtggcctt ctgctgccca ggccacagcc gcctttgggt 3480
tccatcttgc taataaacac tggctctggg actagaaaaa aaaaaaaaaa a 3531
<210> 3
<211> 6671
<212> DNA
<213> 智人
<400> 3
cagagatcgc gagcgaggca ccagcctgca gccggccccc agcacatcct cagccgcaca 60
gacactcggc gaggtggagg tgagggcggg cgccagcgaa ctcggagagg ggctcgctca 120
ctcccaggcg atcccagccg ccaccgccgc cgcaccagca gcagcaacag cagcagcagc 180
ttccttcctc agactcccct cgagaggctg gccaagcggg tgtagccgtt gggggaggct 240
cccgccgggg gaacccggcg aggacaagag cagggcggcc gccttccact cgggctgtcc 300
ggcggcggct gcctccgccc gtgtgtccgt caagggtgcc gcgggatgtg tgtcagttta 360
cgcctctgag atcacacagc tgcctggggg ccgtgtgatg cccaaggcaa gtcttggttt 420
taattattat tattatcatt attgttacgc ttggctttcg ggaaatactc gtgatatttg 480
taggataaag gaaatgacac tttgaggaac tggagagaac atatatgcgt tttgttttta 540
agaggaaaac cgtgttctct tcccggcttg ttccctcttt gctgatttca ggagctactc 600
tcctcctggt gaggtggaaa ttccagcaag aatagaggtg aagacaagcc accaggactc 660
aggagggaaa cgctgaccat tagaaacctc tgcataagac gttgtaagga ggaaaataaa 720
agagagaaaa acacaaagat ttaaacaaga aacctacgaa cccagctctg gaaagagcca 780
ccttctccaa aatggatatg tttcctctca cctgggtttt cttagccctc tacttttcaa 840
gacaccaagt gagaggccaa ccagacccac cgtgcggagg tcgtttgaat tccaaagatg 900
ctggctatat cacctctccc ggttaccccc aggactaccc ctcccaccag aactgcgagt 960
ggattgttta cgcccccgaa cccaaccaga agattgtcct caacttcaac cctcactttg 1020
aaatcgagaa gcacgactgc aagtatgact ttatcgagat tcgggatggg gacagtgaat 1080
ccgcagacct cctgggcaaa cactgtggga acatcgcccc gcccaccatc atctcctcgg 1140
gctccatgct ctacatcaag ttcacctccg actacgcccg gcagggggca ggcttctctc 1200
tgcgctacga gatcttcaag acaggctctg aagattgctc aaaaaacttc acaagcccca 1260
acgggaccat cgaatctcct gggtttcctg agaagtatcc acacaacttg gactgcacct 1320
ttaccatcct ggccaaaccc aagatggaga tcatcctgca gttcctgatc tttgacctgg 1380
agcatgaccc tttgcaggtg ggagaggggg actgcaagta cgattggctg gacatctggg 1440
atggcattcc acatgttggc cccctgattg gcaagtactg tgggaccaaa acaccctctg 1500
aacttcgttc atcgacgggg atcctctccc tgacctttca cacggacatg gcggtggcca 1560
aggatggctt ctctgcgcgt tactacctgg tccaccaaga gccactagag aactttcagt 1620
gcaatgttcc tctgggcatg gagtctggcc ggattgctaa tgaacagatc agtgcctcat 1680
ctacctactc tgatgggagg tggacccctc aacaaagccg gctccatggt gatgacaatg 1740
gctggacccc caacttggat tccaacaagg agtatctcca ggtggacctg cgctttttaa 1800
ccatgctcac ggccatcgca acacagggag cgatttccag ggaaacacag aatggctact 1860
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agctccacgc tccactgctg acaaggtttg ttagaatccg ccctcagacc tggcactcag 2040
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cagtgaaagg tgtcatcatc cagggagccc gcggaggaga cagtatcact gctgtggaag 2340
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tcctcctggg ggccacctgt gcaggcctcc tgctctactg cacctgttcc tactcgggcc 3480
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aatcctatct gacgtttcat tccagcaaga ggggctgggg aagattacat ttttttttcc 3660
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ggacagaaaa gcgagtcgca ggaggaaggg agatgcagcc gcacagggga tgattaccct 3780
cctaggaccg cggtggctaa gtcattgcag gaacggggct gtgttctctg ctgggacaaa 3840
acaggagctc atctctttgg ggtcacagtt ctattttgtt tgtgagtttg tattattatt 3900
attattatta ttattattat attttatttc tttggtctgt gagcaactca aagaggcaga 3960
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tttctaatca acacttgaaa agcaaagtgt cttttcagcc tttccatctt tacaaataaa 4080
actcaaaaaa gccgtccagc ttatcccatc ctctgattgt cttctgactt aagggattta 4140
ctgtggtgta ggttctgcca gccaacccta caagctgcca tttccagtcc tagcatttaa 4200
gtaggatgtt gttgccttta acttttctta tccaggggaa aattgccatt ttagggtcag 4260
catgaacagc tctttcttgt atgcgattta aaacaaactg gaaaggaaac ttcacacgtc 4320
aaaatccata gaagcgcctg gacgaggctt aaagtgcttt gtgagtgaat aggagccatt 4380
cgctaattct agacccacag tgtctggtgg tggggcttcc cttgtggggc ttctggtggt 4440
ggttttgcct tttcttttcc ctcctccatg ttcttctaaa acatatacat atatacatac 4500
acacatacac atattcttca ggtctctaag cccctggaag cagcattgtg tgatattctc 4560
agaggcaggg gaaaatagag ggaaaaatag agactattgg tatgttctcc ccatcagcga 4620
gttattgtaa ctggtcacca ctggacggga aggagaacag aggagaggga aagagaagcc 4680
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gcatttgtct ctcaaataga ctagtaaaca ccgacttctc ctttgggtta caaacaccat 4800
ttcaaccttt cgggagagtc agagctagga tgtacaagaa ctgattctaa ccagaagtcc 4860
gcaagtactg tggacaagaa tgcttaacca tgctgcttca gccttgagag acctaggttc 4920
ttacacatat gcacacacgc atacacacat gcacgcacac acacatacac acatgcacgc 4980
acgcacgcat gcacaccaat ttatgttttt attaagtgcc ttgaaaaaat gaagaaaaat 5040
gtattttccc tttatgtaaa aattagtgaa tatcttatga attaaggcat tcctctttcc 5100
ctaaccccga tggctccatt cccaagtacc ccaactcact gctgatccta ttaaaggaat 5160
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cacgatttca tttgtcttat acccaggtga aaggggaagg gtgaatggga ctggctggtt 5460
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taaaaaaaaa a 6671
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<213> 智人
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Met Asp Met Phe Pro Leu Thr Trp Val Phe Leu Ala Leu Tyr Phe Ser
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Arg His Gln Val Arg Gly Gln Pro Asp Pro Pro Cys Gly Gly Arg Leu
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Asn Ser Lys Asp Ala Gly Tyr Ile Thr Ser Pro Gly Tyr Pro Gln Asp
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Tyr Pro Ser His Gln Asn Cys Glu Trp Ile Val Tyr Ala Pro Glu Pro
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Asn Gln Lys Ile Val Leu Asn Phe Asn Pro His Phe Glu Ile Glu Lys
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His Asp Cys Lys Tyr Asp Phe Ile Glu Ile Arg Asp Gly Asp Ser Glu
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Ser Ala Asp Leu Leu Gly Lys His Cys Gly Asn Ile Ala Pro Pro Thr
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Ile Ile Ser Ser Gly Ser Met Leu Tyr Ile Lys Phe Thr Ser Asp Tyr
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Ser Thr Gly Ile Leu Ser Leu Thr Phe His Thr Asp Met Ala Val Ala
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Lys Asp Gly Phe Ser Ala Arg Tyr Tyr Leu Val His Gln Glu Pro Leu
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Glu Asn Phe Gln Cys Asn Val Pro Leu Gly Met Glu Ser Gly Arg Ile
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Asn Leu Asp Ser Asn Lys Glu Tyr Leu Gln Val Asp Leu Arg Phe Leu
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Thr Pro Pro Tyr Gln Glu Leu Ala Gln Leu Leu Ala Gln Pro Glu Val
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Ser Pro Arg Glu Ala Pro Gly Ala Pro Arg Ser Pro Glu Pro Gln Asp
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Leu Arg Ala His Val Thr Gly Pro Val Glu Asp Asn Glu Lys Cys Tyr
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Pro Pro Pro Ser Val Gln Ser Cys Pro His Gly Leu Gly Ser Thr Asp
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Val Ser Ser Gln Leu Lys Ile Pro Ser Asp Thr Leu Ser Lys Phe Pro
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Ala Phe Asp Ile Tyr Tyr Val Tyr Ser Phe Arg Ser Glu Gln Phe Val
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Gly Arg Ala Leu Ala His Gln Leu Gly Leu Ala Glu Asp Glu Asp Val
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835 840 845
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850 855 860
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Arg Thr Pro Met Ile Thr Pro Asp Leu Glu Ser Gly Thr Lys Leu
1640 1645 1650
Trp His Leu Val Lys Asn His Asp His Leu Asp Gln Arg Glu Gly
1655 1660 1665
Asp Arg Gly Ser Lys Met Val Ser Glu Ile Tyr Leu Thr Arg Leu
1670 1675 1680
Leu Ala Thr Lys Gly Thr Leu Gln Lys Phe Val Asp Asp Leu Phe
1685 1690 1695
Glu Thr Ile Phe Ser Thr Ala His Arg Gly Ser Ala Leu Pro Leu
1700 1705 1710
Ala Ile Lys Tyr Met Phe Asp Phe Leu Asp Glu Gln Ala Asp Lys
1715 1720 1725
His Gln Ile His Asp Ala Asp Val Arg His Thr Trp Lys Ser Asn
1730 1735 1740
Cys Leu Pro Leu Arg Phe Trp Val Asn Val Ile Lys Asn Pro Gln
1745 1750 1755
Phe Val Phe Asp Ile His Lys Asn Ser Ile Thr Asp Ala Cys Leu
1760 1765 1770
Ser Val Val Ala Gln Thr Phe Met Asp Ser Cys Ser Thr Ser Glu
1775 1780 1785
His Lys Leu Gly Lys Asp Ser Pro Ser Asn Lys Leu Leu Tyr Ala
1790 1795 1800
Lys Asp Ile Pro Asn Tyr Lys Ser Trp Val Glu Arg Tyr Tyr Ala
1805 1810 1815
Asp Ile Ala Lys Met Pro Ala Ile Ser Asp Gln Asp Met Ser Ala
1820 1825 1830
Tyr Leu Ala Glu Gln Ser Arg Leu His Leu Ser Gln Phe Asn Ser
1835 1840 1845
Met Ser Ala Leu His Glu Ile Tyr Ser Tyr Ile Thr Lys Tyr Lys
1850 1855 1860
Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Glu Lys Asp Glu Gln Ala Arg Arg
1865 1870 1875
Gln Arg Leu Arg Ser Lys Leu Glu Gln Val Val Asp Thr Met Ala
1880 1885 1890
Leu Ser Ser
1895
<210> 7
<211> 9071
<212> DNA
<213> 智人
<400> 7
atgccgctgc caccgcggag cctgcaggtg ctcctgctgc tgctgctgtt gctgctgctg 60
ctgccgggca tgtgggctga ggcaggcttg cccagggcag gcgggggttc acagcccccc 120
ttccgcacct tctcggccag cgactggggc ctcacccacc tagtggtgca tgagcagaca 180
ggcgaggtgt atgtgggcgc agtgaaccgc atctataagc tgtcggggaa cctgacactg 240
ctgcgggccc acgtcacggg ccctgtggag gacaacgaga agtgctaccc gccgcccagc 300
gtgcagtcct gcccccacgg cctgggcagt actgacaacg tcaacaagct gctgctgctg 360
gactatgccg ctaaccgcct gctggcctgt ggcagcgcct cccagggcat ctgccagttc 420
ctgcgtctgg acgatctctt caaactgggt gagccacacc accgtaagga gcactacctg 480
tccagcgtgc aggaggcagg cagcatggcg ggcgtgctca ttgccgggcc accgggccag 540
ggccaggcca agctcttcgt gggcacaccc atcgatggca agtccgagta cttccccaca 600
ctgtccagcc gtcggctcat ggccaacgag gaggatgccg acatgttcgg cttcgtgtac 660
caggatgagt ttgtgtcatc acagctcaag atcccttcgg acacgctgtc caagttcccg 720
gcctttgaca tctactatgt gtacagcttc cgcagcgagc agtttgtcta ctacctcacg 780
ctgcagctag acacacagct gacctcgcct gatgccgccg gcgagcactt cttcacgtcc 840
aagatcgtgc ggctctgtgt ggacgacccc aaattctact cgtacgttga gttccccatt 900
ggctgcgagc aggcgggtgt ggagtaccgc ctggtgcagg atgcctacct gagccggccc 960
ggccgtgccc tggcccacca gctgggcctg gctgaggacg aggacgtgct gttcactgtg 1020
ttcgcccagg gccagaagaa ccgcgtgaag ccaccaaagg agtcagcact gtgcctgttc 1080
acgctcaggg ccatcaagga gaagattaag gagcgcatcc agtcctgcta ccgtggtgag 1140
ggcaagctct ccctgccgtg gctgctcaac aaggagctgg gctgcatcaa ctcgcccctg 1200
cagatcgatg acgacttctg cgggcaggac ttcaaccagc ccctgggggg cacagtcacc 1260
attgagggga cgcccctgtt cgtggacaag gatgatggcc tgaccgccgt ggctgcctat 1320
gactatcggg gccgcactgt ggtattcgcc ggcacgcgaa gtggccgcat ccgcaagatc 1380
ctggtggacc tctcaaaccc cggtggccgg cctgccctgg cctacgagag cgtcgtggcc 1440
caggagggca gccccatcct gcgagacctc gtcctcagcc ccaaccacca gtacctctac 1500
gccatgaccg agaagcaggt gacgcgggtg cctgtggaga gctgtgtgca gtacacgtcc 1560
tgtgagctgt gtctggggtc acgggacccc cactgtggct ggtgtgtcct gcacagcatc 1620
tgctcgcggc gggacgcctg tgagcgagca gacgagcccc agcgctttgc tgcggacctg 1680
ctgcagtgtg tgcagctgac tgtgcagccc cgcaatgtgt ctgtcaccat gtcccaggtc 1740
ccacttgtgc tgcaggcctg gaacgtgcct gacctctcag ctggcgtcaa ctgctccttc 1800
gaggacttca cggaatctga gagcgtcctg gaggatggcc ggatccactg ccgctcaccc 1860
tccgcccggg aggtggcgcc catcacgcgg ggccagggag accagcgggt ggtgaaactc 1920
tacctaaagt ccaaggagac agggaagaag tttgcgtctg tggacttcgt cttctacaac 1980
tgcagcgtcc accagtcctg cctgtcctgt gtcaacggct cctttccctg ccactggtgc 2040
aaataccgcc acgtgtgcac acacaacgtg gctgactgcg ccttcctgga gggccgtgtc 2100
aacgtgtctg aggactgccc acagatcctg ccctccacgc agatctacgt gccagtggga 2160
gtggtaaaac ccatcaccct ggccgcacgg aacctgccac agccacagtc aggccagcgt 2220
ggatatgagt gcctcttcca catcccgggc agcccggccc gtgtcaccgc cctgcgcttc 2280
aacagctcca gcctgcagtg ccagaattcc tcgtactcct acgaggggaa cgatgtcagc 2340
gacctgccag tgaacctgtc agtcgtgtgg aacggcaact ttgtcattga caacccacag 2400
aacatccagg cgcacctcta caagtgcccg gccctgcgcg agagctgcgg cctctgcctc 2460
aaggccgacc cgcgcttcga gtgcggatgg tgcgtggccg agcgccgctg ctccctgcga 2520
caccactgcg ctgccgacac acctgcatcg tggatgcacg cgcgtcacgg cagcagtcgc 2580
tgcaccgacc ccaagatcct caagctgtcc cccgagacgg gcccgaggca gggcggcacg 2640
cggctcacta tcacaggcga gaacctgggc ctgcgattcg aagacgtgcg tctgggcgtg 2700
cgcgtgggca aggtgctgtg cagccctgtg gagagcgagt acatcagtgc ggagcagatc 2760
gtctgtgaga tcggggacgc cagctccgtg cgtgcccatg acgccctggt ggaggtgtgt 2820
gtgcgggact gctcaccaca ctaccgcgcc ctgtcaccca agcgcttcac cttcgtgaca 2880
ccaaccttct accgtgtgag cccctcccgt gggcctctgt cagggggcac ctggattggc 2940
atcgagggaa gccacctgaa cgcaggcagt gatgtggctg tgtcggtcgg tggccggccc 3000
tgctccttct cctggaggaa ctcccgtgag atccggtgcc tgacaccccc cgggcagagc 3060
cctggcagcg ctcccatcat catcaacatc aaccgcgccc agctcaccaa ccctgaggtg 3120
aagtacaact acaccgagga ccccaccatc ctgaggatcg accccgagtg gagcatcaac 3180
agcggtggga ccctcctgac ggtcacaggc accaacctgg ccactgtccg tgaaccccga 3240
atccgggcca agtatggagg cattgagagg gagaacggct gcctggtgta caatgacacc 3300
accatggtat gccgcgcccc gtctgtggcc aaccctgtgc gcagcccacc agagctgggg 3360
gagcggccgg atgagctggg cttcgtcatg gacaacgtgc gctccctgct tgtgctcaac 3420
tccacctcct tcctctacta ccctgacccc gtactggagc cactcagccc cactggcctg 3480
ctggagctga agcccagctc cccactcatc ctcaagggcc ggaacctctt gccacctgca 3540
cccggcaact cccgactcaa ctacacggtg ctcatcggct ccacaccctg taccctcacc 3600
gtgtcggaga cgcaactgct gtgcgaggcg cccaacctca ctgggcagca caaggtcacg 3660
gtgcgggcag gtggcttcga gttctcgcca gggacactgc aggtgtactc ggacagcctg 3720
ctgacgctgc ctgccattgt gggcattggc ggaggcgggg gtctcctgct gctggtcatc 3780
gtggctgtgc tcatcgccta caagcgcaag tcacgagatg ctgaccgcac actcaagcgg 3840
ctgcagctcc agatggacaa cctggagtcc cgcgtggccc tcgaatgcaa ggaagccttt 3900
gcagagctgc agacagacat ccacgagctg accaatgacc tggacggtgc cggcatcccc 3960
ttccttgact accggacata tgccatgcgg gtgctctttc ctgggatcga ggaccaccct 4020
gtgctcaagg agatggaggt gcaggccaat gtggagaagt cgctgacact gttcgggcag 4080
ctgctgacca agaagcactt cctgctgacc ttcatccgca cgctggaggc acagcgcagc 4140
ttctccatgc gcgaccgcgg gaatgtggcc tcgctcatca tgacggccct gcagggcgag 4200
atggaatacg ccacaggcgt gctcaagcag ctgctttccg acctcatcga gaagaacctg 4260
gagagcaaga accaccccaa gctgctactg cgccggactg agtcggtggc agagaagatg 4320
ctaactaact ggttcacctt cctcttgtat aagttcctca aggagtgcgc tggggagccg 4380
ctgttcatgc tgtactgcgc catcaagcag cagatggaga agggccccat tgacgccatc 4440
acgggtgagg cacgctactc cctgagtgag gacaagctca tccggcagca gattgactac 4500
aagacactga ccctgaactg tgtgaaccct gagaatgaga atgcacctga ggtgccggtg 4560
aaggggctgg actgtgacac ggtcacccag gccaaggaga agctgctgga cgctgcctac 4620
aagggcgtgc cctactccca gcggcccaag gccgcggaca tggacctgga gtggcgccag 4680
ggccgcatgg cgcgcatcat cctgcaggac gaggacgtca ccaccaagat tgacaacgat 4740
tggaagaggc tgaacacact ggctcactac caggtgacag acgggtcctc ggtggcactg 4800
gtgcccaagc agacgtccgc ctacaacatc tccaactcct ccaccttcac caagtccctc 4860
agcagatacg agagcatgct gcgcacggcc agcagccccg acagcctgcg ctcgcgcacg 4920
cccatgatca cgcccgacct ggagagcggc accaagctgt ggcacctggt gaagaaccac 4980
gaccacctgg accagcgtga gggtgaccgc ggcagcaaga tggtctcgga gatctacttg 5040
acacggctac tggccaccaa gggcacactg cagaagtttg tggacgacct gtttgagacc 5100
atcttcagca cggcacaccg gggctcagcc ctgccgctgg ccatcaagta catgttcgac 5160
ttcctggatg agcaggccga caagcaccag atccacgatg ctgacgtgcg ccacacctgg 5220
aagagcaact gcctgcccct gcgcttctgg gtgaacgtga tcaagaaccc acagtttgtg 5280
ttcgacattc acaagaacag catcacggac gcctgcttgt cggtggtggc ccagaccttc 5340
atggactcct gctccacctc tgagcacaag ctgggcaagg actcaccctc caacaagctg 5400
ctctacgcca aggacatccc caactacaag agctgggtgg agaggtacta tgcagacatc 5460
gccaagatgc cagccatcag cgaccaggac atgagtgcgt atctggctga gcagtcccgc 5520
ctgcacctga gccagttcaa cagcatgagc gccttgcacg agatctactc ctacatcacc 5580
aagtacaagg atgagatcct ggcagccctg gagaaggatg agcaggcgcg gcggcagcgg 5640
ctgcggagca agctggagca ggtggtggac acgatggccc tgagcagctg agccccagct 5700
gtgatcatcc agcatgatgc agcgtgagga cagctgagca gggaccggga cagccctcac 5760
cgcatgcgtg tggagtgtcc ggtggtgctc gggccgccgc agtgcagcga ctgcccggcc 5820
ctccctcccc tgcctcaccc ggtcgggtcc cggctcttcc tgtgtggagg tgatggtacc 5880
tgccacacca cagctgcgca cacagctgct tgctcagggg ccgggacagc actgggtgct 5940
caggctggcc aaggaccttc attgcctggc aagagctgcc cagtggcctt catgggagaa 6000
gggctgacct ctgaggggct gaggggtgag gccagggccc tccaggggga ggggtagcca 6060
gcttgggctg tccccttgag accaggacaa gaggctgggg gtgtcagcat tcccagcttt 6120
ccaagctgcc cccaggcggc agagtctgag ggtcccgggg cccggttggc agctggagaa 6180
agaggcaaaa agcccgtagc cgggcaagag gagctcaagt cggtctgggc ccgttgccac 6240
cgactcccac ctccagcacc catgcccgct gcaccgctgc catcctcaga ttcaccgcgt 6300
gctctgcgcg gccgaggccg gagcaccaca tccacctcgc cccagagagg ctctgctccc 6360
tcctatggag gggctgtggg ccaggctgct cagactcctg ggtggcttcc agacggaccg 6420
ggcagcccct ctccgtcctc agggctgtgc ctctgggagc cactgggcca ggggccccgg 6480
gtcgcagaga gcacgttccc gttatttatt cccctccgcg tcctacacag gctgccctgg 6540
cagctgtctt caagggtagg ctgagctccc caccctggag cccctgaggg cggcccctga 6600
gcactcctct ctctccactc tctctgtccc tgccccagcg gcttccagtg tggcatctca 6660
gcagtgtcct ggcccctcca gagcagtggg acatctgggg actgtttttg tgtttagggg 6720
aaaaaattct gctgcactct gcttgggcct tgaggtctgt ggcagggctc ctctggcccg 6780
cagtggcctg gatctatctg ggccatgagt gacgggcagt gaccagaggg actggaggcc 6840
agcggtgtcc acccttgccc tcagcaagag agaatgcatt cttaaaagaa agctgtacat 6900
gtatatatat gcatatatat atatgtggct ctagcctcag gctccagccc cagtggggta 6960
ctgtacagtt aactgaagaa gaattttaaa gacgatttga acaagaaaat gaaggcagtg 7020
ggaaagcaat gccaaatggt tgtggagaaa gtggccggag cctccctgga gtggagcagc 7080
cctgaagcct gtgccccccg acctgcgggc cgctgttttg gtttgacatg acaaggaaag 7140
gacttcctgc tgaccctgag agcctctggg gtgccgcggc accacggggc atgcatgatt 7200
gtgctagcgt ttagtctgag ttgatctttt taaaactgca agtgttgaat actagaggtt 7260
gttagaccct tttttatgtt ttttaattaa tcagtcactt gtaaaagcaa acaagcggtc 7320
catccccttt tcaaggtcac ttttttgatg gtaccgaaga tcccatggac attaagggac 7380
agctaactgt ggccagactc agccccatgt ccttggccag gcccaaggag aggactcggc 7440
cccatggggt gtgccagtct tgcagtccgc cccagctgag tagcgtgagc cagatgacgc 7500
cacagagacc cgcctcttcc ctgaacgcgg gtcggtgtgg agtcagtgac tgctgactca 7560
gggagctcct tggccccgtg ggcactgtgc cagggctggg gccttctgct gctgccacac 7620
ccagctcagg cctgggccag cccctgcccc cagcccactg agggggtggg cttactccct 7680
gggcagtctt gggggccaga gctgaggcca gtccatatta cagtggctgg gctgtttttt 7740
tcagtagccc ctagcattgg ctgggattcc tgttcctggg tgcgcctcca cctcccttct 7800
gatgtttcct ggctatggtg gggtgggaac ctcagtttcc cccaaagtct tccctggatg 7860
ctggcttcag gttgaagtcc ctggttcttc cagttcctca cgggttaggt aggggctcct 7920
gcatcacctt cagaatccag ttccaacccc cactctcctt aggccttgtg ctctgctctg 7980
ccctgccagg ctgcccttgt ccatgtgagt agcatgggcg ggtggtgggg acggcagtgg 8040
tgatgaaggg ggtgcaccac aggcctcatg aagcagttcc cacatgggcg tgtggctggg 8100
gcgtggccac cacagagcac atggctgtgt ctaggcgcaa gcactttagc agtatctgtt 8160
tacatgcgca aggatcaagc cgactacctg tgctgtctac tgggacagca gtctccgagc 8220
tactccgtac ctccctctgc caggtcgtgg agttaggccc cagtccctac ttgtcactgg 8280
ttcccactgt gctcctaact gtgcagcacc tgggagctct ggcctggggc tggaggccct 8340
ggtaggagct gcagttggag gccgttctgt gcccagcagc ggtgagcggc tcccatgggc 8400
cctgtgtctg cagggagcca gggctgcggc acatgtgctg tgaaactggc acccacctgg 8460
cgtgctgctg ccgccacttg cttcctgcag cacctcctac cctgctccgt gtcctccctc 8520
tccccgcgcc tggctcagga gtgctggaaa agctcacgcc tcggcctggg agcctggcct 8580
cttgatatac ctcgagcttc ccctgtgctc cccagcccca ggaccactgg ccccttggcc 8640
tgaggggctg ggggccccac gacctgcagc gtcgagtccg ggagagagcc cggagcggcg 8700
tgccatctcg gctcggcctt gctgagagcc tccgccctgg ctttctccct gtctggattc 8760
agtggctcac gttggtgcta cacagctaga atagatatat ttagagagag agatattttt 8820
aagacaaagc ccacaattag ctgtccttta acaccgcaga accccctccc agaagaagag 8880
cgatccctcg gacggtccgg gcgggcaccc tcagccgggc tctttgcaga agcagcaccg 8940
ctgactgtgg gcccggccct cagatgtgta catatacggc tatttcctat tttactgttc 9000
ttcagattta gtacttgtaa ataaacacac acattaagga gagattaaac atttttgcta 9060
aaagctaaaa a 9071

Claims (50)

1.一种阻抑同种异体移植物排斥的方法，所述方法包括向同种异体移植物受者给予Sema3F激动剂，由此阻抑同种异体移植物的免疫排斥。
2.一种阻抑受试者中的免疫系统的方法，所述方法包括向有需要的受试者给予Sema3F激动剂。
3.一种治疗有需要的受试者中的炎性病症的方法，所述方法包括向所述受试者给予Sema3F激动剂。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述炎性病症是自身免疫性疾病。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述自身免疫性疾病选自于由以下所组成的组：1型糖尿病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、银屑病、炎性肠病、克罗恩氏病以及自身免疫性甲状腺炎。
6.如权利要求3所述的方法，其中，所述炎性病症是局部病症。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述局部炎性病症选自于由皮疹和变应性反应所组成的组。
8.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向需要对其进行治疗的受试者给予Sema3F激动剂。
9.一种减少血管生成的方法，所述方法包括向需要对其进行治疗的受试者给予Sema3F激动剂。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，所述Sema3F激动剂是Sema3F多肽或编码Sema3F多肽的核酸。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述Sema3F多肽包含序列SEQ ID NO：5。
12.如权利要求10所述的方法，其中，所述Sema3F多肽可结合Sema3F受体。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中，所述Sema3F多肽可结合选自于由A1结构域、A2结构域、B1结构域和B2结构域所组成的组中的NRP-2的结构域。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中，所述Sema3F激动剂是弗林蛋白酶样抑制剂。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中，静脉内给予所述Sema3F激动剂。
16.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中，肌内、皮下或真皮内给予所述Sema3F激动剂。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，将所述Sema3F激动剂局部给予至炎症部位。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，所述方法进一步包括给予额外的抗炎剂。
19.如权利要求18所述的方法，其中，所述额外的抗炎剂选自于由以下所组成的组：类固醇；钙调磷酸酶抑制剂；mTOR抑制剂或其类似物；以及抗增殖剂。
20.一种增加有需要的受试者中的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者给予Sema3F抑制剂或NRP-2抑制剂或丛蛋白A1抑制剂中的一种或多种。
21.如权利要求20所述的方法，其中，所述Sema3F抑制剂是抗Sema3F抗体试剂。
22.如权利要求20所述的方法，其中，所述NRP-2抑制剂是抗NRP-2抗体试剂。
23.如权利要求20所述的方法，其中，所述Sema3F抑制剂是可溶性NRP-2受体。
24.如权利要求23所述的方法，其中，所述Sema3F抑制剂是所述NRP-2受体的可溶性片段，所述NRP-2受体包含选自于由A1结构域、A2结构域、B1结构域或B2结构域所组成的组中的至少一种结构域。
25.如权利要求20所述的方法，其中，所述Sema3F抑制剂是弗林蛋白酶样多肽或编码弗林蛋白酶样多肽的核酸。
26.Sema3F激动剂在同种异体移植物受者中用于阻抑同种异体移植物排斥的用途。
27.Sema3F激动剂的用途，所述用途包括向需要免疫系统阻抑的受试者给予Sema3F激动剂。
28.Sema3F激动剂在有需要的受试者中用于治疗炎性病症的用途。
29.如权利要求28所述的用途，其中，所述炎性病症是自身免疫性疾病。
30.如权利要求29所述的用途，其中，所述自身免疫性疾病选自于由以下所组成的组：1型糖尿病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、银屑病、炎性肠病、克罗恩氏病以及自身免疫性甲状腺炎。
31.如权利要求28所述的用途，其中，所述炎性病症是局部病症。
32.如权利要求31所述的用途，其中，所述局部炎性病症选自于由皮疹和变应性反应所组成的组。
33.Sema3F激动剂用于治疗癌症的用途。
34.Sema3F激动剂用于在有需要的受试者中阻抑血管生成的用途。
35.如权利要求26-34中任一项所述的用途，其中，所述Sema3F激动剂是Sema3F多肽或编码Sema3F多肽的核酸。
36.如权利要求26-35中任一项所述的用途，其中，所述Sema3F多肽包含序列SEQ IDNO：5。
37.如权利要求35所述的用途，其中，所述Sema3F多肽可结合Sema3F受体。
38.如权利要求35-37中任一项所述的用途，其中，所述Sema3F多肽可结合选自于由A1结构域、A2结构域、B1结构域和B2结构域所组成的组中的NRP-2的结构域。
39.如权利要求26-38中任一项所述的用途，其中，所述Sema3F激动剂是弗林蛋白酶样抑制剂。
40.如权利要求26-39中任一项所述的用途，其中，静脉内给予所述Sema3F激动剂。
41.如权利要求26-39中任一项所述的用途，其中，肌内、皮下或真皮内给予所述Sema3F激动剂。
42.如权利要求26-41中任一项所述的用途，其中，将所述Sema3F激动剂局部给予至炎症部位。
43.如权利要求26-42中任一项所述的用途，所述用途进一步包括给予额外的抗炎剂。
44.如权利要求43所述的用途，其中，所述额外的抗炎剂选自于由以下所组成的组：类固醇；钙调磷酸酶抑制剂；mTOR抑制剂或其类似物；以及抗增殖剂。
45.Sema3F抑制剂或NRP-2抑制剂或丛蛋白A1抑制剂中的一种或多种用于在有需要的受试者中促进免疫应答的用途。
46.如权利要求45所述的用途，其中，所述Sema3F抑制剂是抗Sema3F抗体试剂。
47.如权利要求45所述的用途，其中，所述NRP-2抑制剂是抗NRP-2抗体试剂。
48.如权利要求45所述的用途，其中，所述Sema3F抑制剂是可溶性NRP-2受体。
49.如权利要求46所述的用途，其中，所述Sema3F抑制剂是所述NRP-2受体的可溶性片段，所述NRP-2受体包含选自于由A1结构域、A2结构域、B1结构域或B2结构域所组成的组中的至少一种结构域。
50.如权利要求45所述的用途，其中，所述Sema3F抑制剂是弗林蛋白酶样多肽或编码弗林蛋白酶样多肽的核酸。
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