CN107002087B - 检测假性过敏药物反应和鉴别阻断剂以预防不良反应的基于mrgprx2/mrgprb2表达细胞的试验 - Google Patents

Abstract

本发明关于用于检测诱发假性过敏型反应的化合物的细胞和方法，以及减轻假性过敏型反应严重性的方法。

Description

检测假性过敏药物反应和鉴别阻断剂以预防不良反应的基于 MRGPRX2/MRGPRB2表达细胞的试验

相关申请

基于35U.S.C.§119(e)，本申请主张2014年8月1日提交的美国临时专利申请US62/032,350的权益，该临时专利申请通过引用而以其整体并入本文。

技术领域

本发明关于用于检测诱发假性过敏型反应的化合物的细胞和方法，以及减轻假性过敏型反应严重性的方法。

背景技术

多数食品药品监督管理局(FDA)许可的药物与假性过敏型反应有关，这些反应是药物副作用的一部分。在本文中揭示的本发明之前，对测定何种药物有可能造成假性过敏型反应的细胞株和方法存在需求。此外，在本文中揭示的本发明之前，对减轻假性过敏型反应严重性的方法和发现阻断这些响应的拮抗剂的筛选存在需求。

发明内容

本发明基于，至少部分基于，包含表达mas相关G蛋白偶联受体成员X2(MrgprX2)或MrgprB2的重组核酸的分离细胞。例如该重组核酸表达MrgprX2。或者，该重组核酸表达MrgprB2。一些例子中，该细胞进一步包含表达GTP结合蛋白α15(Gα15)的重组核酸。其它例子中，该表达MrgprX2的重组核酸包含一个或多个突变。例如，该一个或多个突变产生不能活化信号转导通道的MrgprX2蛋白。或者，该表达MrgprB2的重组核酸包含一个或多个突变。例如，该一个或多个突变产生不能活化信号转导通道的MrgprB2蛋白。一些例子中，这一细胞进一步包含表达GTP结合蛋白α15(Gα15)的重组核酸。

优选地，该分离细胞包含人类胚胎肾293(HEK 293)细胞。

也提供减轻由给药化合物至该对象诱发的对象体内假性过敏型反应严重性的方法，该方法包含给药该化合物至该对象；给药MrgprB2或MrgprX2拮抗剂至该对象，从而减轻该对象体内假性过敏型反应的严重性。

例如，本文揭示的方法将假性过敏型反应的严重性降低至少1％，如，至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％。

该对象优选需要此治疗的哺乳动物，如已经诊断具有假性过敏反应或其倾向的对象。该哺乳动物是任何哺乳动物，如人、灵长类、小鼠、大鼠、狗、猫、马、以及家畜及驯养的食用动物如牛、绵羊、猪、鸡、和山羊。优选的具体实施例中，该哺乳动物是人。

该抑制剂或拮抗剂可包括但不限于核酸、肽、抗体、或结合至其具体靶标或该靶标天然配体并调节生物活性的小分子。

一方面，该拮抗剂包含抗体或其片段、结合蛋白、多肽、或其组合。本文所揭示的是抗MrgprX2抗体。适当的抗MrgprX2抗体包括SAB2900154-50UG(

St.Louis,Missouri)、PA5-32930(Thermo Scientific,Waltham,MA)、TA317038(Origene,Rockville,MD)、和038585(United States Biological,Boston,MA)，其各自通过引用而并入本文。但是，技术人员可轻易鉴别用于本文中揭示方法中的额外的抗MrgprX2(或抗MrgprB2)抗体。一些例子中，本文中揭示的抗MrgprX2(或抗MrgprB2)抗体以0.1μg/ml至500mg/ml的浓度给药。

一些例子中，该拮抗剂包含小分子。小分子是质量小于2000道尔顿的化合物。该小分子的分子质量优先小于1000道尔顿，更优选小于600道尔顿，如该化合物小于500道尔顿、小于400道尔顿、小于300道尔顿、小于200道尔顿、或小于100道尔顿。

小分子是有机的或无机的。例示性有机小分子包括，但不限于，脂肪烃、醇、醛、酮、有机酸、酯、单糖和二糖、芳香烃、氨基酸、和脂质。例示性无机小分子包含微量元素、离子、自由基、和代谢物。或者，小分子可合成性设计为由片段、或小部分、或更长氨基酸链组成，以结合酶袋。典型地，小分子小于一千道尔顿。

一些例子中，该拮抗剂包含核酸分子。例如，核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)抑制MrgprX2或MrgprB2多肽的表达，从而抑制MrgprX2或MrgprB2的活性。一些例子中，该核酸包含小干扰RNA(siRNA)、RNA干扰(RNAi)、信使RNA(mRNA)、小发夹RNA或短发夹RNA(shRNA)、双链核糖核酸(dsRNA)、反义RNA或微RNA、或其任意部位。因此，适当的MrgprX2拮抗剂包括MrgprX2siRNA和MrgprX2shRNA，其各自可从例如Origene、Rockville、MD或生命科技公司(Life Technologies,Grand Island,NY)购买，且通过引用而并入本文。同样，适当的MrgprB2拮抗剂包括MrgprB2siRNA和MrgprB2shRNA，其各自可从例如Origene、Rockville、MD或生命科技公司(Life Technologies,Grand Island,NY)购买，且通过引用而并入本文。但是，技术人员可轻易鉴别抑制/拮抗MrgprX2或MrgprB2的其它核酸。

该拮抗剂在给药该化合物至该对象之前、同时或之后给药。

可采用多种给药途径。例如，该拮抗剂可外用给药、口服给药、经吸入给药或经注射给药。

该拮抗剂的有效量为从0.001mg/kg至250mg/kg体重，如，0.001mg/kg、0.05mg/kg0.01mg/kg、0.05mg/kg、1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg、75mg/kg、100mg/kg、125mg/kg、150mg/kg、175mg/kg、200mg/kg、225mg/kg、或250mg/kg体重。最后，主治医生或兽医决定适宜的量和剂量方案。

一些例子中，该拮抗剂每天至少给药一次、每周至少给药一次、或每月至少给药一次。该拮抗剂给药持续时间为一天、一周、一个月、两个月、三个月、六个月、9个月、或一年。一些例子中，该拮抗剂每天给药，如每24小时给药。或者，该拮抗剂持续给药或每天给药若干次，如每1小时、每2小时、每3小时、每4小时、每5小时、每6小时、每7小时、每8小时、每9小时、每10小时、每11小时、或每12小时给药一次。

通过将MrgprB2或MrgprX2拮抗剂给药至对象而实施治疗该对象体内假性过敏型反应的方法，从而治疗该对象体内的假性过敏型反应。

通过下述实施确定化合物是否诱发假性过敏型反应的方法：令本文中揭示的分离细胞与备选化合物接触，测定MrgprX2或MrgprB2的活化，其中，MrgprX2或MrgprB2的活化确定了该备选化合物诱发了假性过敏型反应。

例如，通过鉴别细胞内钙相对于该化合物缺失下细胞内钙水平的增加而检测MrgprX2或MrgprB2的活化。一些例子中，细胞内钙的水平增加了至少1％，如，至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％。使用本文中揭示的方法或技术人员可获得的方法测定细胞内钙的浓度。

例示性备选化合物包括亮丙瑞林、戈舍瑞林、组氨瑞林、曲普瑞林、西曲瑞克、加尼瑞克、地加瑞克(degarelix)、奥曲肽、兰瑞肽(lanreotide)、帕瑞肽(pasireotide)、舍莫瑞林(sermorelin)、替莫瑞林(tesamorelin)、艾替班特(icatibant)、醋酸格拉替雷(glatiramer acetate)、特立帕肽、普兰林肽、争光霉素、艾塞那肽(exenatide)、胰高血糖素、利拉鲁肽、恩夫韦地(enfuvirtide)、和粘杆菌素(colistimethate)。

其它例示性备选化合物包括琥珀酰胆碱、筒箭毒碱、阿曲库铵、美维库铵、和罗库溴铵。

筛选出一个备选的MrgprX2拮抗剂，证实其抵消或抑制、降低、或压制MrgprX2多肽的生物学活性。还提供识别MrgprX2或MrgprB2拮抗剂的方法，该方法包含令本文中揭示的分离细胞与诱发假性过敏型反应的化合物接触，令本文中揭示的分离细胞与备选拮抗剂接触，检测MrgprX2或MrgprB2的活化，其中，MrgprX2或MrgprB2的活化相对于该备选拮抗剂缺失下MrgprX2或MrgprB2活化的降低确定了该备选化合物为拮抗剂。

还提供识别MrgprX2或MrgprB2激动剂的方法，该方法包含：令本文中揭示的分离细胞与诱发假性过敏型反应的化合物接触，令本文中揭示的分离细胞与备选激动剂接触，检测MrgprX2或MrgprB2的活化，其中，MrgprX2或MrgprB2的活化相对于该备选激动剂缺失下MrgprX2或MrgprB2活化的增加确定了该备选化合物是激动剂。

定义

除非定义排除，本文中使用的全部科技术语具有本发明所属领域技术人员所一般理解的意义。下述参考文献向技术人员提供本发明中使用多数术语的通常定义：《剑桥科技词典》(The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988))；《遗传性词汇(第五版)》(The Glossary of Genetics,5th Ed.,R.Rieger et al.(eds.),Springer Verlag(1991))；和《哈珀柯林斯生物学词典》(Hale&Marham的,The HarperCollins Dictionary of Biology(1991))。本文中，除非明确排除，下述术语具有其下方所述的意义。

本文中揭示的抗体及其片段包括，但不限于，多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、dAb(域抗体)、单链单体、Fab、Fab’和F(ab’)2片段、Fv、scFvs。抗体片段具有其各自抗体的免疫学活性。一些具体实施例中，抗体的片段含有1500个或更少、1250个或更少、1000个或更少、900个或更少、800个或更少、700个或更少、600个或更少、500个或更少、400个或更少、300个或更少、200个或更少氨基酸。例如，蛋白质或肽抑制剂含有1500个或更少、1250个或更少、1000个或更少、900个或更少、800个或更少、700个或更少、600个或更少、500个或更少、400个或更少、300个或更少、200个或更少、100个或更少、80个或更少、70个或更少、60个或更少、50个或更少、40个或更少、30个或更少、25个或更少、20个或更少、10个或更少氨基酸。例如，本发明的核酸抑制剂含有400个或更少、300个或更少、200个或更少、150个或更少、100个或更少、90个或更少、80个或更少、70个或更少、60个或更少、50个或更少、40个或更少、35个或更少、30个或更少、28个或更少、26个或更少、24个或更少、22个或更少、20个或更少、18个或更少、16个或更少、14个或更少、12个或更少、10个或更少核苷酸。

本文中使用的术语“抗体”(Ab)包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(如，双特异性抗体)、及抗体片段，只要它们展现所希望的生物学活性即可。本文中，术语“免疫球蛋白”(Ig)与“抗体”互换使用。

“分离抗体”是已经从其天然环境成分中分离及/或回收的抗体。其天然环境的杂质成分是将会感染该抗体诊断或治疗用途的材料，且可包括酶、技术、和其它类似蛋白质或非类似蛋白质的溶质。一个优选的具体实施例中，该抗体经纯化：(1)至大于95重量％的抗体，通过劳里法(Lowry method)测得，且最优选大于99重量％；(2)至足以获得至少15个N端残基或内部氨基酸序列的程度，通过使用旋转杯测序仪获得；或(3)至同质性，通过SDS-PAGE在减压或非减压条件下使用考马斯亮蓝或优选使用印染色而获得。由于该抗体天然环境中的至少一种成分不存在，分离抗体包括重组细胞内的原位抗体。但通常情况下，分离抗体将通过至少一个纯化步骤进行制备。

基本的四链抗体单元是由两个完全相同的轻(L)链和两个完全相同的重(H)链构成的异四聚体糖蛋白。IgM抗体由5个该基本的异四聚体单元以及另外的称为J链的多肽一起构成，并因此含有10个抗原结合位点，而所分泌的IgA抗体可聚合以形成包含2至5个该疾病4链单元和J链的多价集合体。在IgG的例子中，该4链单元通常为约150,000道尔顿。每一L链通过一个共价二硫键链接至一个H链，而该两个H链通过一个或多个二硫键彼此链接，二硫键的多寡取决于该H链的同种型。每一H链和L链也具有规则间隔的链间二硫桥。每一H链在N端具有可变域(V_H)，对于α链和γ链，其各自在可变域(V_H)后连有三个恒定域(C_H)，而μ同种型和ε同种型中为四个C_H域。每一L链在N端具有可变域(VL)，其另一端跟随有恒定域(C_L)。V_L与V_H对准，而CL与重链的第一个恒定域(C_H1)对准。据信，特定的氨基酸残基形成该轻链与重链可变域之间的干扰。V_H与V_L一起的配对形成单抗原结合位点。对于不同种类的抗体的结构和性质，参见如《基础和临床免疫学(第八版)》(Basic and Clinical Immunology,8thedition,Daniel P.Stites,Abba I.Terr and Tristram G.Parslow(eds.),Appleton&Lange,Norwalk,Conn.,1994)中的第6章第71页。

基于其恒定域(C_L)的氨基酸序列，来自任何脊椎动物种的L链可归为明显截然不同的两种类型中的一种，称为κ和λ。依据其重链(C_H)的恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白可归为不同的类别或同种型。存在5个类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM，分别具有指定为α、δ、ε、γ、和μ的重链。基于C_H序列和功能的相对微小差异，γ类和α类进一步分为多个子类，如人类表达下述子类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、和IgA2。

术语“可变”指代下述事实：抗体中V域的某些碎片的序列差异极大。V域介导抗原结合，并定义特定抗体对于其特定抗原的特异性。但是，横跨该可变域中110个氨基酸跨度，可变性为不均匀分布。反之，V区域由通过极度可变的称为“高变区”的较短区域分隔的称为骨架区(FR)的相对不变的伸张组成，该骨架区包含15至30个氨基酸，而每一高变区的长度为9至12个氨基酸。原始重链和轻链的可变区各自包含四个FR，极大地采用β-折叠构型，通过三个高变区连接，形成圈状连接，且在一些例子中，形成该β-折叠结构的一部分。每一链中的高变区通过FR保持为极其靠近，且该些高变区形成另一链，促成抗体中抗原结合位点的形成(见，Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。恒定域并不直接牵涉入抗体至抗原的结合，但展现多种效应子功能，如抗体依赖性细胞内细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。

当用于本文中时，术语“高变区”指抗体中可响应抗原结合的氨基酸残基。该高变区通常包含来自“互补性决定区”或“CDR”的氨基酸残基(如，当根据Kabat编号系统编号时，V_L中的大约残基24至34(L1)、50至56(L2)和89至97(L3)，V_H中的大约残基31至35(H1)、50至65(H2)和95至102(H3)；Kabat等，《免疫性靶标蛋白质的序列(第五版)》(Sequences ofProteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991))；及/或来自“高变圈”的那些残基(如，当根据Chothia编号系统编号时，V_L中的残基24至34(L1)、50至56(L2)和89至97(L3)，V_H中的26至32(H1)、52至56(H2)和95至101(H3)；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；及/或来自“高变圈”/CDR的那些残基(如，当根据IMGT编号系统编号时，V_L中的残基27至38(L1)、56至65(L2)和105至120(L3)，V_H中的27至-38(H1)、56至65(H2)和105至120(H3)；Lefranc,M.P.et al.Nucl.Acids Res.27:209-212(1999)，Ruiz,M.e al.Nucl.AcidsRes.28:219-221(2000))。视需要，该抗体在下述位置的一处或多处具有对称性插入内容：当根据AHo编号时，V_L中的28、36(L1)、63、74至75(L2)和123(L3)，VH中的28、36(H1)、63、74至75(H2)和123(H3)；Honneger,A.and Plunkthun,A.J.Mol.Biol.309:657-670(2001))。

本文中使用的术语“单克隆抗体”指从大体上同质抗体的群落中获得抗体，即，除了可能少量存在的天然可能出现的突变之外，该群落包含的独立抗体完全相同。单克隆抗体为高度特异性，指向单一的抗原性位点。此外，与包括指向不同决定因素(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂对比，每一单克隆抗体均指向该抗原上的单一决定因素。除了它们的特异性之外，该单克隆抗体的优势在于，它们可合成为不被其它抗体污染。修饰语“单克隆”不解释为需要通过任何特定方法生产抗体。例如，可用于本发明的单克隆抗体可通过Kohler等人于Nature,256:495(1975)中首次揭示的杂种细胞方法制备，或可使用重组DNA方法在细胞、真核动物或植物细胞中作成(见，如，US 4,816,567)。例如，“单克隆抗体”也可使用Clackson等人在Nature,352:624-628(1991)中和Marks等人在J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)中揭示的方法从噬菌体抗体库中分离。

单克隆抗体包括“嵌合”抗体以及此类抗体的片段，在该嵌合抗体中，重链及/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或子类的抗体中的相应序列完全相同或同源，而该链的剩余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或子类的抗体中的相应序列完全相同或同源，只要他们展现所希望的生物学活性即可(见，US 4,816,567；以及Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。也提供源自人类抗体的可变域抗原结合序列。据此，本文中最感兴趣的嵌合抗体包括具有一个或多个人类抗原结合序列(如，CDRs)且含有一个或多个源自非人类抗体的序列如FR或C区域序列的抗体。此外，本文中最感兴趣的嵌合抗体包括那些包含一个抗体类别或资料的人类可变域抗原结合序列和源自另一抗体类别或子类的另一序列如FR或C区域序列的抗体。本文中最感兴趣的嵌合抗体也包括那些含有与本文揭示者相关的或源自不同物种如非人灵长类(如，旧大陆猴、猿等)的可变域抗原结合序列的抗体。嵌合抗体也包括灵长源化(primatized)抗体和人源化抗体。

此外，嵌合抗体可包含在接受者抗体或供体抗体中未发现的残基。做出这些修饰以进一步精细化抗体性能。进一步详细而言，见，Jones et al.,Nature321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature 332:323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。

“人源化抗体”通常认为是人类抗体，其具有一个或多个从非人类来源引入该人类抗体中的氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基往往指代为“导入”残基，其典型取自“导入”可变域。传统上，人源化遵循Winter及其合作者的方法(Jones et al.,Nature,321:522-525(1986)；Reichmann et al.,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen et al.,Science,239:1534-1536(1988))通过以导入高变区序列取代人类抗体的相应序列而实施。据此，该“人源化”抗体是嵌合抗体(US 4,816,567)，其中，实质上小于完整的人类可变域已经由来自非人类物种的相应序列所取代。

“人类抗体”是仅含有人类天然产生的抗体中存在的序列的抗体。但是，本文中，人类抗体可包含天然出现的人类抗体中未发现的残基或修饰，包括本文中揭示的那些修饰和变体序列。典型作成这些以进一步精细化或提升抗体性能。

“全(intact)”抗体是包含抗原结合位点以及C_L和至少重链恒定域C_H1、C_H2及C_H3的抗体。该恒定域可以是天然序列恒定域(如，人类天然序列恒定域)或其氨基酸序列变体。优选地，该全抗体具有一种或多种效应子功能。

“抗体片段”包含全抗体的一部分，优选该全抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体；线性抗体(见，US 5,641,870；Zapata etal.,Protein Eng.8(10):1057-1062[1995])；单链抗体分子；及从抗体片段形成的多特异性抗体。

短语抗体的“功能性片段或类似物”是具有与全长度抗体一样的定性生物学活性的化合物。例如，抗IgE抗体的功能性片段或类似物能结合至IgE免疫球蛋白，结合方式为防止该分子具有结合至高亲和性受体Fc_εRI的能力或实质上减轻该能力。

抗体的木瓜蛋白酶消解产生两个完全相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，以及残留的“Fc”片段，消解反应容易结晶的能力。该Fab片段由整体L链和H链的可变区域(V_H)以及一条重链的第一恒定域(C_H1)一起组成。每一Fab片段关于抗原结合为单价，即，其具有单一抗原结合位点。抗体的胃蛋白酶处理导致单一的大F(ab')2片段，这大致与两个二硫键链接的Fab片段一致，具有二价抗原结合活性且仍能交联抗原。Fab'片段与Fab片段的差异在于，前者在C_H1域的碳端具有额外的少数残基，包括一个或多个来自抗体铰接区域的半胱氨酸。本文中，Fab'-SH为Fab'的指定，其中，该恒定域的半胱氨酸残基承载自由巯基。F(ab')2抗体片段最初被生产为Fab'片段的一部分，其具有界于其间的铰接半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。

“Fc”片段包含通过二硫键保持在一起的两个H链的碳端部位。通过该Fc区内的序列测定抗体的效应子功能，该区也是通过在某些类型的细胞中发现的Fc受体(FcR)识别的部分。

“Fv”是含有完全抗原识别位点和结合位点的最小的抗体片段。这一片段由一条重链和一条轻链可变区域以紧密、非共价联合的二聚体所组成。从这两个域的折叠发散出六个高变圈(从H链和L链各形成三个圈)，其有助于用于抗原结合的氨基酸残基并赋予该抗体以抗原结合特异性。但是，甚至单一可变域(或Fv的一半仅包含三个对于抗原为特异性的CDR)即具有识别并接合抗原的能力，但其亲和性低于该整体结合位点。

“单链Fv”也缩写为“sFv”或“scFv”，是包含连接为单个多肽链的V_H抗体域和V_L抗体域的抗体片段。优选地，该sFv多肽进一步包含界于V_H域与V_L域之间的多肽链接基，令该sFv能形成所希望的抗原结合结构。对于sFv的综述，参见Pluckthun在《单克隆抗体药物学》(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994))；下文的Borrebaeck 1995。

术语“双体”指小抗体片段，通过使用短链接基(约5至10个残基)在V_H域与V_L域之间构造sFv片段(见先前段落)而制备，因此实现V域的链间而非链内配对，获得二价片段，即具有两个抗原接合位点的片段。双特异性双体是两个“交叉”sFv片段的异二聚体，其中，两个抗体的V_H域和V_L域存在于不同的多肽链上。双体更完全地揭示于例如EP 404,097、WO 93/11161、和Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中。

本文中，“使内化”的抗体是在结合至哺乳动物细胞上的抗原(如，细胞表面多肽或受体)时通过(即，进入)该细胞而取得。当然，该内化抗体将包括抗体片段、人类或嵌合抗体、及抗体共轭体。对于某些治疗性应用，预期体内的内化。经内化的抗体分子的数目将足以或适于杀死细胞或抑制其生长，尤其是被感染的细胞。依据该抗体或抗体共轭体的潜能，一些例子中，将单个抗体分子摄取入该细胞内足以杀死该抗体所结合的靶标细胞。例如，某些毒素具有高杀伤潜能，故共轭至该抗体的一个分子的该毒素足以杀死被感染的该细胞。

本文中，若抗体与抗原以可检测的水平反应，则称该抗体为“免疫特异性”、“对抗原为特异性”或“特异性结合至抗原”，该反应的水平优选为亲和常数K_a大于或等于约10⁴M^-1，或大于或等于约10⁵M^-1，大于或等于约10⁶M^-1，大于或等于约10⁷M¹，或大于或等于10⁸M^-1。抗体对于其共轭抗原的亲和性一般也表达为解离常数K_D，且在某些具体实施例中，若HuM2e抗体特异性结合的KD为小于或等于10^-4M，小于或等于约10^-5M，小于或等于约10^-6M，小于或等于10^-7M，或小于或等于10^-8M，则该抗体结合至M2e。可使用传统技术，例如，Scatchard(Ann.N.Y.Acad.Sci.USA 51:660(1949))等人揭示的那些，轻易测得抗体的亲和性。

通常，可使用免疫检测方法测定并评估抗体至抗原、细胞或其组织的结合性质，该方法包括，例如，基于免疫荧光的试验，如免疫组化(IHC)及/或荧光活化细胞分选(FACS)。

具有所指定抗体的“生物学特征”的抗体，是具有将该抗体与其它抗体区分开来的一个或多个生物学特征的抗体。例如，某些具体实施例中，具有所指定抗体的生物学特征的抗体将结合通过所指定抗体结合的相同表位，及/或具有与所指定抗体相同的效应子功能。

术语“拮抗剂抗体”以其最广义使用，且包括部分地或完全地阻断、抑制、或中和其特异性结合的表位、多肽或细胞的生物学活性的抗体。鉴别拮抗剂抗体的方法可包含令可特异性结合备选拮抗剂抗体的多肽或细胞与该备选拮抗剂抗体接触，并测量一般与该多肽或细胞相关的一种或多种生物学活性的可检测的改变。

抗体“效应子功能”指那些归因于抗体的Fc区域(天然序列Fc区域或氨基酸变体Fc区域)并随着抗体同种型而变的生物学活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合剂补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(如，B细胞受体)的下调；和B细胞活化。

术语“抗原结合位点”或“结合部位”指免疫球蛋白分子中参与抗原结合的部分。该抗原结合位点是通过重(“H”)链和轻(“L”)链的N端可变(“V”)区的氨基酸残基形成的。重链和轻链的V区域内的三种高分歧伸张指代为“高变区”，且插置于多个作为“骨架区”或“FR”而为人所知的保守侧翼伸张之间。因此，术语“FR”指代氨基酸序列，其可于免疫球蛋白的高变区之间或邻近该高变区处自然地发现。一个抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间内相对于彼此而配制，以形成抗原结合表面。该抗原结合表面与所结合抗原的三维表面互补，且该重链和轻链各自的三个高变区指代为“互补性决定区”或“CDR”。

本文中，术语“表位”包括任何能特异性结合至免疫球蛋白、scFv、或T细胞受体的蛋白质决定因素。表位决定因素由分子的化学活性表面基团如氨基酸或糖侧链组成，且具有特异性的三维结构特征以及特异性的电荷特征。例如，可托起抗体对抗多肽的N端或C端肽、蛋白质的线性或非线性肽序列、以及包含第一抗原和第二抗原的氨基酸的表位。本文中，术语“免疫学结合”剂“免疫学结合性质”指，出现于免疫球蛋白分子与该免疫球蛋白特异性的抗原之间的非共价相互反应的类型。可使用该相互反应的解离常数(K_d)来表达免疫学结合相互反应的强度或亲和性，其中，较小的K_d表示较大的亲和性。可使用该领域已知的方法将所选择的多肽的免疫学结合性质定量。一个此方法令测量抗原结合位点/抗原络合物形成和解离的速率称为必需，其中，那些速率取决于该络合物成员的浓度、该相互反应的亲和性、及在两个方向中同样影响速率的几何参数。因此，可通过计算浓度和实际联合和解离速率来测定“运行速率常数”(K_on)和“终止速率常数”(K_off)两者(Nature 361:186-87(1993))。K_off/K_on的比令删除与亲和性不相关的全部参数成为可能，且能等于解离常数K_d(Davies et al.(1990)Annual Rev Biochem 59:439-473)。当平衡结合常数(Kd)为≤1μM，优选≤100nM，更优选≤10nM，更优选≤1nM，且最优选≤100pM至约1pM时，本发明的抗体称为特异性结合至本文所揭示的抗原或表位(如，CTLA、PD1、PDL1、或其它免疫抑制性蛋白及/或肿瘤抗原)，解离常数通过试验如放射性配体结合试验或该领域技术人员已知的类似试验测得。

本发明也包含多肽和核酸片段，只要它们分别展现所希望的全长度多肽和核酸的生物学活性(即，拮抗MrgprX2或MrgprB2)即可。采用几乎任何长度的核酸片段。例如，总长度为约10,000、约5000、约3000、约2,000、约1,000、约500、约200、约100、约50对碱基对(包括全部中间长度)的例示性多核苷酸碎片包括于本发明的多种实作中。同样，采用几乎任何长度的多肽片段。例如，总长度为约10,000、约5,000、约3,000、约2,000、约1,000、约5,000、约1,000、约500、约200、约100、或约50个氨基酸(包括全部中间长度)的例示性多肽碎片包括于本发明的多种实作中。

多核苷酸、多肽、或其它剂经纯化及/或分离。具体而言，本文中，“经分离的”或“经纯化的”核酸分子、多核苷酸、多肽、或蛋白质，实质上不含其它细胞内材料、或当通过重组技术生产时的培养基、或当化学合成时的化学前体或其它化学品。经纯化的化合物的至少60重量(wt)％(干重)为感兴趣的化合物。优选地，该制剂的至少75wt％，更优选至少90wt％，且最优选至少99wt％为感兴趣的化合物。例如，以重量计，经纯化的化合物的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、98％、99％、或100％(w/w)为所希望的化合物。通过任何适宜的标准方法测量纯度，如柱色谱、薄层色谱、或高效液相色谱(HPLC)分析。经纯化或经分离的多核苷酸(核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA))不含其天然出现状态中位于其侧翼的基因或序列。经纯化的或经分离的多肽不含其天然出现状态中位于其侧翼的氨基酸或序列。经纯化的也定义其对于给药至人类对象为安全的无菌程度，如缺少感染剂或毒性剂。

同样，“实质上纯”意指已经从其天然伴随组分分隔的核苷酸或多肽。典型地，以重量计，当核苷酸和多肽的至少60％、70％、80％、90％、95％、甚或99％不含它们天然关联的蛋白质和天然有机分子时，它们是实质上纯的。

“分离的核酸”意指核酸，其不含在该核酸来源的有机体的天然基因组中处于其侧翼的基因。该术语覆盖，例如：(a)DNA，是天然基因组DNA分子的一部分，但两侧未附带核酸序列，而在该DNA天然出现的有机体基因组内该核酸序列与该分子的一部分侧面相接；(b)以一定方式并入载体或并入原核生物或真核细胞基因组DNA的核酸，因此所得分子并不与任何天然载体或基因组DNA相同；(c)独立的分子如cDNA、基因组片段、通过聚合酶链反应(PCR)生产的片段、或限制性片段；以及(d)重组核苷酸序列，其实杂交基因的一部分，即编码融合蛋白的基因。根据本发明的分离的核酸分子进一步包括合成生产的分子、以及任何已经化学改性及/或具有经改性的骨架核酸。例如，分离的核酸是纯化的cDNA或RNA多核苷酸。分离的核酸分子也包括信使核糖核酸(mRNA)分子。

“备选化合物”意指化学品，为天然存在或人造。备选化合物可包括，例如，肽、多肽、合成性有机分子、天然有机分子、核酸分子、肽核酸分子、及其成分和衍生物。

术语“药物组合物”意指任何组合物，其含有至少一种治疗剂或生物活性剂，且适用于给药至患者。任何这些配方可通过该领域已知且被接受的方法制备。见，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy,20th edition,(ed.A.R.Gennaro),Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,2000。

“促分泌素”意指造成另一物质被分泌的物质。

“G蛋白偶联受体(GPCR)”意指蛋白质受体，其在细胞外感测分子并在细胞内活化信号转导通道以及最后的细胞响应。GPCR称为七跨膜受体，盖因它们七次穿行通过细胞膜。

“拮抗剂”意指结合至受体并活化该受体以产生生物学响应的化学品。鉴于拮抗剂造成作用，“拮抗剂”阻断该拮抗剂的作用，反之，激动剂造成与拮抗剂相反的作用。本文中，术语“拮抗剂”和“抑制剂”可互换使用，指代任何抵消或抑制、降低、或压制其靶标分子的生物学活性的分子。适当的MrgprX2或MrgprB2拮抗剂包括可溶性受体、肽抑制剂、小分子抑制剂、配体融合体、和抗体。

“野生型”或“WT”意指物种作为其在自然界出现的典型形式的表型。或者，该野生型概念化为位于一个基因座的标准、“正常”等位基因的产物，与非标准、“突变”等位基因所生产的形成对照。

术语“假性过敏”指代以其类似真实过敏存在但肇因不同而命名的情况。它可能是由于组胺新陈代谢的改变。“假性过敏”意指抗体IgE依赖性类过敏反应。换句话说，假性过敏并不需要IgE来诱发类过敏反应。

本文中，术语“给药”指代转移、输送、引入、或运输MrgprB2或MrgprX2拮抗剂至例如需要减轻假性过敏型反应严重的对象的任何模式。此类模式包括，但不限于，经口给药、外用给药、静脉给药、腹膜内盖因、肌肉给药、皮内给药、鼻腔给药、和皮下给药。

“MrgprB2或MrgprX2拮抗剂”意指能阻断、防止、减少、和改变MrgprB2或MrgprX2活化信号转导通道的能力的任何小分子、化学化合物、抗体、核酸分子、或多肽、或其片段。

“改变”意指多肽如MrgprB2或MrgprX2活性中的变化(增加或降低)，通过该领域已知的标准方法如本文中揭示的那些检测。本文中，改变包括在基因或多肽的表达水平或活性变化10％或更大，优选多肽活性变化25％，更优选变化40％，且最优选变化50％或更大。

本文中，“改变”也包括基因或多肽的表达水平或活性变化2倍或更大，例如，5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、500倍、1000倍或更大。

“缓解”意指降低、压制、削弱、消除、阻止、或稳定疾病如，举例而言，假性过敏型反应的发展或进展。

“扩大”意指增加分子副本的数目。一个实施例中，使用聚合酶链反应(PCR)来扩大核酸。

“结合”意指具有对于分子的理化亲和性。通过本发明的任何方法测量结合，如，药物/化合物与表达于细胞上的受体的结合。

本公开中，“包含(comprises或comprising)”、“含有”、“具有”等可具有它们在美国专利法中揭示的意义，且可意指“包括(includes或including)”等；术语“主要由…组成(consisting essentially of或consists essentially)”同样具有美国专利法中揭示的意义，且这些术语是开放的，允许超过其所列举者的存在，只要其所列举者的基本或新颖特征并未被超过其所列举者的存在所改变即可，但不包括先前技术的具体实施例。

“检测”指代或直接或间接地鉴别待检测的信号转导通道的MrgprB2或MrgprX2活化的存在、不存在、或量。

“有效量”意指相对于未治疗患者缓解疾病症状所需的量。用以实践本发明的用于治疗性处理的活性化合物的有效量，依据给药方式、对象的年龄、体重和总体健康状况而变。最后，主治医生或兽医将决定适宜的量和计量方案。该量指代为“有效”量。

本文中使用的术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”指代将剂或配方给药至临床上有症状的受苦于有害状态、病症、或疾病的个体，以有效减轻症状的严重性及/或频率、消除该症状及/或其深层原因、及/或促进损害的改善或矫正。

本文提供的范围理解为该范围内全部数值的简写。例如，1至50的范围理解为包括来自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50所组成组的任何数字、数字组合、或子范围，以及前述整数之间的中间小数如，举例而言，1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、和1.9。关于子范围，具体预期从该范围断电延伸的“嵌套子范围”。例如，1至50的范围的嵌套子范围可包含一个方向上的1至10、1至20、1至30、和1至40，或另一方向上的50至40、50至30、50至20、和50至10。

“重组”意指通过基因重组的实验室方法(如，分子克隆)将来自多个来源的基因材料带至一起，创建生物有机体内尚未发现的序列，由是形成的核酸分子。

“异种启动子”是一种启动子，它与实际上可操作性链接基因或核酸的启动子不同。术语“可操作性链接”指代核酸表达控制序列(如启动子、信号序列、或转录因子结合位点的阵列)与第二核酸序列之间的功能性链接，其中，该表达控制序列影响该核酸相对于该第二序列的转录及/或转译。本文中，“异种多核苷酸”或“异种基因”发源于与特定宿主细胞无关来源，或者，若来自相同来源，则从其起源形式改性。

“减轻”意指至少10％、25％、50％、75％、或100％的负改变。

“参考”意指标准或对照条件。

除非具体指明或从语境中明显可见，本文中，术语“一”、“该”理解为单数或复数。除非具体指明或从语境中明显可见，本文中，术语“或”理解为包括。

除非具体指明或从语境中明显可见，本文中，术语“约”理解为该领域正常公差的范围内，例如，平均数的2标准偏差内。约可理解为所指明数值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、或0.01％内。除非从语境中明显排除，本文中提供的全部数字范围均由术语“约”修饰。

从下述优选具体实施例的说明书和权利要求书可明确获知本发明的其它特征和优点。除非定义排除，本文中使用的全部科技术语具有与其所属领域技术人员一般理解的相同的意义。尽管可使用与本文中揭示的那些类似或等价的方法来实践或测试本发明，适当的方法和材料揭示于下文中。本文中引用的全部外国专利公开案和专利申请案通过引用而并入本文。本文中引用的由保藏号表明的基因银行(Genbank)和NCBI提交书通过引用而并入本文。本文中引用的其它全部已出版的参考文献、文档、手稿和科技文献通过引用而并入本文。存在冲突时，以本说明书包括定义为准。此外，该材料、方法和实施例仅做例示性说明而非限制用。

附图说明

图1A是鼠和人Mrgpr基因组轨迹的图解，例示性说明鼠体内的扩充基因家族，以及，基于类似的表达模式和激动剂特异性而鉴别的该基因家族的人类直系同源。该鼠Mrgpr基因(显示为名称位于其上方的垂直棒)丛生于染色体7上。鼠MrgprA3(A3)和MrgprC11(C11)是人MrgprX1(X1)的直系同源，特异性表达于背根神经节(DRG)神经元中，且起瘙痒受体介导氯喹(CQ)和BAM8-22(BAM)诱发的瘙痒的功能。人MrgprX2(X2)的直系同源，鼠MrgprB2(B2)的表达和激动剂特异性揭示如下。图1B显示严格的逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)筛选的结果，该筛选鉴别MrgprB2转录本(箭头)在鼠腹膜肥大细胞中的表达。该Mrgpr基因名字标注在凝胶图片的上方。当将逆转录酶从cDNA合成反应中省略(阴性对照)时，未见谱带。图1C显示细胞内钙浓度[Ca²⁺]i的例示性踪迹，通过放射性Fura-2成像从仅以驱动MrgprB2或MrgprX2表达的质粒转染片刻并曝露于20μM PAMP(9-20)的浴应用的HEK293细胞测得(由上方黑线标注持续性)。每一踪迹为来自独特细胞的响应。图1D是显示来自BAC转基因鼠组织的代表性共聚焦图像的一系列照片。表达MrgprB2开放解读码组中eGFP-Cre的BAC鼠与Rosa26-loxP-STOP-loxP-tdTomato受体鼠交配。因此，通过Cre的表达模式测定tdTomato的表达，而Cre的表达处于MrgprB2启动子的控制下。将tdTomato(红)表达与作为肥大细胞标记物的亲和素染色(绿)比较。两种标记物之间几乎100％重叠表明，MrgprB2特异性地包含于肥大细胞中。检查三只鼠除心脏外的所有组织，而检查两只鼠的心脏。亲和素阳性同时tdTomato也呈阳性的肥大细胞的百分比：无毛的皮肤，97.5％；多毛的皮肤，90.1％；气管，97.2％；心脏，87.1％。tdTomato阳性同时亲和素也呈阳性的细胞的百分比：无毛的皮肤，99.2％；多毛的皮肤，100％；气管，98.3％；心脏，99％。每一组织中计数的细胞总数超过300，但心脏中计数的细胞总数超过100。因为腔室附近的肥大细胞密度比该组织其它地方高得多，因此检查腔室附近的心脏肥大细胞；观察到亲和素阳性同时tdTomato呈阴性的细胞以非常低的数目包埋在肌肉组织中，但其身份不明。比例尺为20μm。

图2A(左)是显示鼠腹膜肥大细胞的代表性热图的一系列照片，显示[Ca²⁺]i的改变，通过Fluo-4成像测得，由抗IgE(5μg/ml)或化合物48/80(10μg/ml)的浴应用诱发。图2A(中)显示代表性成像踪迹。每一颜色的先表示独立的细胞。“抗IgE”图中的黑线是各基因型的平均踪迹。注意：WT组与MUT组的[Ca²⁺]i踪迹相似。图2A(右)显示响应细胞的百分比的定量。如果该[Ca²⁺]i上升至少50％并持续至少10秒，则将细胞鉴定为响应，该现象明显区分了来自随机闪烁事件的配体诱发的响应。这些和全部其它实验的分组数据表达为平均数±平均数标准误差。使用单尾未配对学生t测试来测定统计学比较的显着性，且当p<0.05时认为差异显着。**，p<0.01(对于各基因型，n＝3；每一条件下计数的细胞超过150个)。抗IgE响应的差异并不显着。比例尺为10μm。图2B是显示组胺释放入上清液中的柱状图，该上清液来自在37℃曝露于48/80(30μg/ml)内30分钟的WT和MrgprB2^MUT鼠的气管和腹部皮肤。将释放入上清液中的组胺的量定量并表达为ng/mg组织(湿重)。**，p<0.01(对于气管，n＝5；对于皮肤，n＝8)。图2C是一系列图。图2C(上)显示代表性踪迹，其显示从WT和MrgprB2^MUT鼠(先前令其对卵白蛋白(ova)敏感)分离出的气管响应48/80(30μg/ml)或ova(10μg/ml；即，抗IgE依赖性)的收缩。图2C(下)显示测定为响应在实验结束时加入的10μM卡米可林(carbamycholine)的最大总收缩的平均数据。对于48/80WT，n＝5；对于，48/80MrgprB2MUT，n＝3。图2D是一系列照片和一张柱状图，左图显示足底注射48/80(上，箭头，10μg/ml，5μl于盐水中)或盐水(下)后进行伊文思蓝外渗15分钟的代表性图像。图2D(上)显示15分钟后渗析入足中的伊文思蓝的定量以及足厚度的增加。*，p<0.02(n＝5/WT，n＝6/MrgprB2^MUT)。注射盐水后的差异并不显着。图2E是显示WT和MrgprB2^MUT肥大细胞对MrgprX2配体和基础促分泌素的响应能力的定量，使用Fluo-4成像测得。物质的浓度(以μM计)：PAMP(9-20)，20；皮质抑素(cortistatin)-14(cort.)，20；物质P(sub P)，200；胰激肽，200；黄蜂毒素(mastoparan(masto.)，黄蜂毒(wasp venom)的一种组分)，20；胡蜂毒素(vespidmastoparan)，20。n＝3/基因型；>150计数细胞/促分泌素。数据表示为平均数±平均数标准误差(SEM)。使用双尾未配对学生t测试来测定统计学比较的显着性，且当p<0.05时认为差异显着。*，p<0.05。除非注明，否则**，p<0.01。

图3A是显示MrgprB2介导肽能治疗性药物的肥大细胞响应能力和副作用的柱状图。图3A显示来自用药后的WT和MrgprB2^MUT腹膜肥大细胞的响应细胞的百分比，使用Fluo-4成像测得。药物浓度(以μg/ml计)：艾替班特，50；西曲瑞克，20；亮丙瑞林，100；奥曲肽，10；舍莫瑞林，60；胰岛素，80。n＝3/基因型；>150计数细胞/物质，但对于胰岛素，计数细胞>100。胰岛素响应能力间的差异并不显着。图3B(左)显示足底注射48/80(上，箭头，10μg/ml，5μl于盐水中)或盐水(下)后进行伊文思蓝外渗15分钟的代表性图像。图3B(右)显示15分钟后渗析入足中的伊文思蓝的定量以及足厚度的增加。**，p<0.01(对于每一基因型，n＝6)。注射盐水后的差异并不显着。图3C是一系列散点图，显示从使用所指定物质孵化的WT(红色菱形)和MrgprB2^MUT(黑色方块)鼠释放的组胺总量。对于任何剂量的抗IgE抗体，均未发现WT与MrgprB2^MUT细胞之间的显着差异。重复实验>3次。数据表示为平均数±SEM。双尾未配对学生t测试：*，p<0.05。**，p<0.01。

图4A是一系列化合物48/80和环化变体的结构，而有报导称环化变体更强。四氢异喹啉(THIQ)结构组元以蓝色高亮。图4B是全NMBD类别的代表性成员的一系列结构。THIQ结构组元以蓝色高亮。注意，仅琥珀酰胆碱缺乏大体积的疏水基。图4C是显示小分子治疗性药物的MrgprB2介导肥大细胞响应能力和副作用的柱状图。图4C显示来自施加多种NMBD后的WT和MrgprB2^MUT腹膜肥大细胞的响应细胞的百分比，使用Fluo-4成像测得。药物的浓度(以μg/ml计)：阿曲库铵，50；美维库铵，20；筒箭毒碱，30；罗库溴铵，500。n＝3鼠/基因型；>150计数细胞/物质。图4D描述环丙沙星(ciprofloxacin)的结构，且全部氟喹诺酮类共有的结构组元以蓝色高亮。注意，氮邻近该喹诺酮结构组元。图4E是显示来自施加氟喹诺酮后的WT和MrgprB2^MUT腹膜肥大细胞的响应细胞的百分比的柱状图，使用Fluo-4成像测得。药物的浓度(以μg/ml计)：环丙沙星，200；左氧氟沙星，500；莫西沙星，160；氧氟沙星，400。n＝3鼠/基因型；>150计数细胞/物质。图4F是显示在时间0静脉注射环丙沙星(1.5mg于125μl盐水中)后的体温变化的折线图。n＝4鼠/基因型。数据表示为平均数±SEM。双尾未配对学生t测试：*，p<0.05。**，p<0.01。

图5A是印迹的照片，显示在天然条件下，MrgprX1直系同源并未以相关水平表达在肥大细胞内。图5A显示用于表达MrgprX1直系同源的MrgprA3和MrgprC11的腹膜肥大细胞的低严格度RT-PCR筛选结果。箭头指出了预期的谱带尺寸。图5B是柱状图，显示响应MrgprX1和MrgprC11激动剂，源自牛肾上腺髓质的肽片段8至22(BAM8-22，500nM)的腹膜肥大细胞的百分比。通过测量细胞内钙的上升来试验活性，使用Fluo-4染料成像。差异并不显着(p＝0.39)。各组数据表达为平均数±平均数标准误差。使用双尾未配对学生t测试来测定统计学比较的显着性。图5C是经质粒瞬时转染的HEK293细胞对于MrgprX2配体和MrgprX1配体氯喹(CQ)的响应的总结表，其中，该质粒驱动与MrgprB2最相关的MrgprX2、MrgprB2和其它鼠Mrgpr(即，MrgprB1、B10、及B11)的表达。阳性响应和阴性响应分别标注为“√”和“×”。如果至少半数的被转染细胞显示[Ca²⁺]i增加50％，则认为响应是阳性。以MrgprB1、B10、及B11转染的细胞不响应任何所列药物。

图6A是一系列折线图，显示诱发假性过敏反应的基础促分泌素和药物活化在HEK293细胞内表达的鼠MrgprB2和人MrgprX2。图6A显示例示性踪迹，其显示来自表达MrgprB2和Gα15的HEK293细胞内的[Ca²⁺]i变化，通过Fluo-4成像测得。图6B显示例示性踪迹，其显示来自表达MrgprX2和Gα15的HEK293细胞内的[Ca²⁺]i变化，通过Fluo-4成像测得。除环丙沙星外的物质在30至90秒时间段内灌注，环丙沙星在30至60秒之间的时间段内灌注以最小化与溶解环丙沙星的低pH溶液的接触。使用胰岛素作为阴性对照。图6C是基础促分泌素和与假性过敏反应相关的药物活化表达MrgprB2和MrgprX2的HEK293细胞的EC50的表。从重复三次的剂量响应研究测得EC50。数据表达为平均数±SEM。

图7是显示多系BAC转基因鼠证实肥大细胞特异性MrgprB2表达的一系列显微照片。图7显示来自两个其它BAC转基因鼠系的代表性共聚焦图像。表达MrgprB2开放解读码组内的eGFP-Cre的BAC鼠与tdTomato受体鼠交配，并将tdTomato(红)表达与肥大细胞标记物亲和素染色(绿)比较。比例尺为20μm。

图8A至图8B显示，粘膜肥大细胞或外周白血球内不表达MrgprB2。图8A显示来自使用抗MCPT1(β-糜蛋白酶)抗体染色以标记粘膜肥大细胞的MrgprB2-tdTomato鼠的胃部切片的代表性图像。白色箭头表明阳性细胞。没有细胞被双重标记(计数296个Mcpt1标记的细胞和275个tdTomato阳性细胞，n＝3鼠)。比例尺为40μm。图8B显示来自使用双重标记的MrgprB2-tdTomato鼠的外周白血球的细胞离心涂片制剂的代表性图像，该双重标记为用于表达MrgprB2的细胞的tdTomato染色(红；左图)和Hoechst 33342细胞核染色(蓝；右图)。没有外周白血球表达MrgprB2(n＝3鼠；所检查的细胞>4000个)。比例尺为40μm。

图9A、图9B、图9C、和图9D显示MrgprB2^MUT鼠经功能性基因剔除。图9A是MrgprB2基因座内和附近的基因组区域的例示性说明。注意，包括长点缀元素(LINE)、短点缀元素(SINE)、和长串联重复(LTR)的代表性序列在MrgprB2基因的3’侧立即开始，且额外存在于5’侧的2.5kb范围内。2014年3月份，使用邻近MrgprB2的3’端的500个碱基作为查询关键词进行BLASTN检索，在鼠基因组中找到了超过269,000条结果。图9B是WT和MUT基因组序列的比较，其显示突变体中四对碱基对消除的位置。数字对应MrgprB2开放解读码组。图9C是从突变系构建18个月后出生的小鼠采样的WT和MUT cDNA的定序结果。突变体中碱基误配以红色高亮。图9D是MrgprB2^MUT开放解读码组的氨基酸转译，其揭示该消除创建了在第一跨膜区域后很快的移码突变和密码子(*)的提前结束。Mut：移码消除的位点。TM1：跨膜区域1。

图10A至图10B是一系列显微照片和柱状图，显示气管和皮肤组织的肥大细胞数目和组胺含量在野生型和MrgprB2^MUT动物之间并无差异。图10A(上)显示WT和MrgprB2^MUT鼠内的亲和素染色的代表性图片。比例尺为40μm。图10A(下)显示各种组织中肥大细胞数的定量。使用双尾未配对学生t测试(对于各基因型，n＝3；对于各基因型的多毛皮肤和无毛皮肤，分别计数超过3000μm²和1000μm²内的细胞；计数超过10,000的腹膜细胞)，差异并不显着。图10B显示，气管组胺平均含量分别为5.9±0.9和5.5±1.6ng/mg(对于各基因型，n＝5)；皮肤组胺平均含量分别为30.8±3.2和30.2±4.0ng/mg(对于各基因型，n＝8)。差异不显着。各组数据表达为平均数±平均数标准误差。使用双尾未配对学生t测试来测定统计学比较的显着性。

图11A、图11B、和图11C分别是一系列显微照片、折线图和柱状图，其显示内皮素透过ETA GPCR1在MrgprB2^MUT和野生型肥大细胞中诱发的可比较的活化。图11A显示鼠腹膜肥大细胞的代表性热图像，显示有内皮素(1μM)的浴应用诱发的[Ca²⁺]i的变化，通过Fluo-4成像测得。比例尺为10μm。图11B显示WT(红线)和MrgprB2^MUT(黑线)的平均[Ca²⁺]i成像轨迹。WT组与MUT组之间的[Ca²⁺]i轨迹类似。轨迹是图2A所示者的平均。图11C显示响应细胞的百分比的定量。各组数据表达为平均数±平均数标准误差。使用双尾未配对学生t测试来测定统计学比较(对于各基因组，n＝3；各基因组均计数超过180个细胞)的显着性。内皮素诱发的响应没有显着差异。

图12A和图12B显示，IgE介导的发炎在野生型和MrgprB2^MUT鼠之间并无差异。图12A显示，足底注射抗IgE抗体(右，箭头，100μg/ml，7μl于盐水中)或盐水(左)后15分钟，伊文思蓝外溢的代表性图像。图12B显示在15分钟后渗析入足的伊文思蓝的定量(对于WT，n＝6；对于MrgprB2^MUT，n＝7)。在注射抗IgE抗体(p＝0.49)和盐水(p＝0.23)后的差异不显着。各组数据表达为平均数±平均数标准误差。使用双尾未配对学生t测试来测定统计学比较的显着性。

图13A、图13B、图13C、图13D、和图13E显示，MrgprB2^MUT肥大细胞对基础促分泌素和多种治疗性药物无响应。图13A显示实施例踪迹，显示来自WT和MrgprB2^MUT腹膜肥大细胞的由图2E的基础促分泌素诱发的[Ca²⁺]i变，通过Fluo-4成像测得。每一踪迹是来自一个独特的细胞的响应。图13B显示，应用艾替班特(50μg/ml)的过程中，来自WT(上)和MrgprB2^MUT(下)培养的腹膜肥大细胞的代表性Fluo-4图像(左)和荧光示踪(右)。图9C显示实例踪迹，显示来自WT和MrgprB2^MUT腹膜肥大细胞的由所选择的FDA许可的阳离子肽能药物诱发的[Ca²⁺]i变化，通过Fluo-4成像测得。每一踪迹为一个独特的细胞的响应。图13D是一系列显微照片和折线图，显示应用阿曲库铵(50μg/ml)的过程中，来自WT(上)和MrgprB2^MUT(下)培养的腹膜肥大细胞的代表性Fluo-4图像(左)和荧光示踪(右)。图13E是一系列显微照片和折线图，显示应用环丙沙星(200μg/ml)的过程中，来自WT(上)和MrgprB2^MUT(下)培养的腹膜肥大细胞的代表性Fluo-4图像(左)和荧光示踪(右)。

图14A和图14B是一系列柱状图，显示人肥大细胞被基础促分泌素和与假性过敏反应相关的药物以MrgprX2依赖性方式活化。图14A中，人LAD2肥大细胞经不同浓度的化合物48/80、黄蜂毒素、艾替班特、阿曲库铵和环丙沙星治疗。响应这些物质的肥大细胞的活化以β-氨基己糖苷酶、TNF、PGD2和组胺的释放为特征。此外，与经治疗的细胞(4.1±0.3％释放)相比，使用0.1μg/ml链霉亲和素刺激以生物素共轭的人IgE敏化的LAD2细胞，造成fβ-氨基己糖苷酶(71.3±1.8％释放)的强烈释放。各组数据表达为平均数±平均数标准误差。图14B显示，人MrgprX2的削减显着降低了由基础促分泌素和与假性过敏反应的药物诱发而非IgE诱发的肥大细胞活化。首先使用MrgprX2siRNA或对照siRNA转染人LAD2肥大细胞。转染两天后，使用化合物48/80(0.1μg/ml)、黄蜂毒素(5μg/ml)、艾替班特(10μg/ml)、阿曲库铵(25μg/ml)、和环丙沙星(75μg/ml)处理该细胞。响应这些物质的肥大细胞的活化以下述为特征：经MrgprX2siRNA处理的细胞中的β-氨基己糖苷酶的释放比对照组中的释放显着减少。IgE介导的肥大细胞脱粒不受MrgprX2siRNA削减的影响。各组数据表达为平均数±平均数标准误差。使用双尾未配对学生t测试来测定统计学比较的显着性，且当*p<0.05；**p<0.01；***p<0.005(实验重复三次)时认为差异显着。

图15是FDA许可的50个氨基酸以下的全部治疗性药物的表。电荷通过ChemAxon计算。西曲瑞克、加尼瑞克、和奥曲肽的ISR数据来自下列参考文献：Verschraegen,C.F.etal.Gynecologic oncology 90,552-559(2003)；Fluker,M.et al.Fertility andsterility 75,38-45(2001)；以及Tuvia,S.et al.The Journal of clinicalendocrinology and metabolism 97,2362-2369,(2012)，这些参考文献通过引用并入本文。全部其它信息由FDA提供。

图16是列举FDA许可的全部类别的神经肌肉阻断药物(NMBD)及代表性成员的图表。

具体实施方式

本发明提出测定化合物是否诱发假性过敏型反应的细胞和方法，以及减轻对象体内假性过敏型反应严重性的方法。本发明基于，至少部分地基于下述发现：G蛋白偶联受体，即鼠体内的MrgprB2和人体内的MrgprX2，排他性表达于一种名为肥大细胞的免疫细胞中，这一现象与对于外来物质的假性过敏反应紧密相联。本发明确定，这一单一受体被FDA许可的至少13种不同的与过敏型反应相关的药物活化，而这一活化是这些药物副作用的一部分。

在本文中揭示的本发明之前，MrgprX2/MrgprB2在假性过敏药物反应中的角色完全未知。本文中揭示了使用基于表达MrgprX2/MrgprB2的细胞的试验来筛选诱发假性过敏药物反应的药物，以及用来筛选阻断这些反应的MrgprX2拮抗剂。为了进行试验工作，本发明人将表达MrgprX2/MrgprB2的细胞内的GTP结合蛋白α15(Gα15)加入基于受体的信号，以增加细胞内钙，令该细胞株与高通量筛选装置相容。在本发明之前，MrgprX2/MrgprB2在假过敏药物反应中的角色未知。据此，MrgprX2/Gα15细胞未被报导着实不令人惊讶。而Gα15在其它分离细胞中的表达已被报导，其仅用于当受体不诱发细胞内钙的上升时。MrgprX2诱发该上升，这表明分离细胞中包括Gαl5并非是必需的。但是，发明人发现，MrgprX2正常地响应一些激动剂而非其它，从而诱发了此上升，做出了该试验工作必需的共表达。

本发明的分离细胞表达人G蛋白偶联受体(GPCR)MrgprX2或鼠GPCR MrgprB2，同时表达GTP结合蛋白Gα15，这令受体活化在基于钙的试验中容易可视化。这些细胞株能用来进行对FDA许可的药物和研发用于MrgprX2激动剂和拮抗剂活性的药物的筛选。这是所希望的，因为MrgprX2的脱靶活化诱发了体内的过敏型副作用，可导致显着的不良事件。

在基于细胞的药物筛选试验中使用这些细胞，阳性结果(即，通过例如钙释放而测量的细胞株的活化)将指明，该药物将会正常地活化肥大细胞并潜在地造成患者体内的过敏型反应。研发中的药物的筛选将会预测其副作用概况；目前使用中的药物的筛选将会鉴别这些药物的副作用的肇因；拮抗剂的筛选将对导致新的治疗性药物，该药物可与诱发过敏型反应的药物同时提供，因此阻断肥大细胞的活化而不感染它们的预期用途。

如下文所详述的，在缺乏MrgprB2的鼠体内没有野生型鼠响应这些药物的局部和全身性过敏性响应，MrgprB2是人MrgprX2的鼠直系同源。这一完全意料之外的发现表明，MrgprX2是一种引人注意的药物靶标，因为拮抗剂可与非常宽范围的药物合用而阻断它们的过敏型副作用。

本文中揭示用来筛选FDA许可药物和活化或拮抗这一受体的临床试用化合物的细胞株。这些将可用来确定药物是否会诱发过敏型响应，以及用于筛选中以研发阻断这些响应的拮抗剂。

本文中揭示了表明基础促分泌素通过单一受体MrgprB2在体内外活化鼠肥大细胞的结果，该单一受体MrgprB2是人G蛋白偶联受体(GPCR)MrgprX2的鼠直系同源。在不具MrgprB2的突变鼠体内未见促分泌素诱发的组胺释放、炎症、以及气道收缩。再者，如下文中详述，FDA许可的大多数类别的与过敏型注射位点反应相关的肽能药物也活化MrgprB2和MrgprX2，而突变鼠体内不存在该注射位点炎症。本文中揭示的结果表明，MrgprB2和MrgprX2是众多与全身性假性过敏反应或过敏性反应相关的小分子药物的靶标；药物诱发的这些过敏性反应的症状在基因剔除鼠体内得以显着减轻。本文中也揭示，对若干个这些帮助预测其它化合物副作用的分子中共有的化学结构组元的鉴别。下文详述对用来研究基础促分泌素对肥大细胞活化的鼠模型的介绍，以及对MrgprX2作为治疗性靶标以减轻药物诱发的副作用子集的鉴别。

肥大细胞

肥大细胞是过敏反应中的主要效应子，且可通过分泌组胺及多种炎性和免疫调节性物质而在疾病中扮演重要角色(Metcalfe,et al.,1997Physiological reviews 77,1033-1079；Galli et al.,2005Nature immunology 6,135-142)。尽管传统上认为它们被IgE抗体活化，肥大细胞的独有性质为它们对于统称为基础促分泌素的阳离子性物质范围的抗体依赖性响应能力，该基础促分泌素包括炎性肽和与过敏型反应相关的药物(Metcalfe,et al.,1997Physiological reviews 77,1033-1079；Lagunoff et al.,1983Annual review of pharmacology and toxicology 23,331-351)。这些物质在病理学中扮演的角色已经引起了长达数十年的对于它们的受体的研究。

肥大细胞(mast cell，也写作mastocyte或labrocyte)源自髓细胞样干细胞。它是免疫系统的一部分，且含有多种富含组胺和肝素的颗粒。尽管肥大细胞在过敏和过敏性反应中的角色最有名，肥大细胞也扮演重要的保护性角色，它们密切牵涉入伤口愈合包括血管生成中并防御病原体。肥大细胞在外观上和功能上与嗜碱粒细胞非常相似，嗜碱粒细胞是另一种类型的白血球。这些细胞的区别下压，肥大细胞是组织如肌肉组织中的组成部分，而嗜碱粒细胞在血液中被发现。两种细胞全是含有组胺和肝素的粒细胞，其中，肝素是一种抗凝剂。两种细胞在结合至免疫球蛋白E时均释放组胺。

肥大细胞存在于典型环绕血管和神经的大多数组织中，且尤其显着接近外界与内环境之间的边界如皮肤、肺粘膜、和消化道，以及口、结膜、和鼻。

肥大细胞在炎性进程中扮演关键角色。当被活化时，肥大细胞迅速将其特征性颗粒和多种激素介质释放入小间隙中。可通过直接伤害(如，物理或化学伤害(如阿片类、醇类、和某些抗体如多粘菌素))、免疫球蛋白E(IgE)受体的交联、或补体蛋白来刺激肥大细胞，以进行脱粒。

肥大细胞表达IgE的Fc区域的高亲和性受体(FcεRI)，该受体是该抗体的丰度最小的成员。这一受体的亲和性如此之高，以至于IgE分子的亲和性大体上不可逆。结果，肥大细胞为浆细胞(免疫系统的生产抗体的细胞)所产生的IgE所包覆。

过敏反应中，肥大细胞维持不活化，直至过敏原结合至已经包覆在该细胞上的IgE为止。其它膜活化事件可令肥大细胞做好后续脱粒的准备或与FcεRI信号转导协同作用。通常，抗原是蛋白质或多糖。该过敏原结合至抗原结合位点，该位点位于结合至该肥大细胞表明的IgE分子的可变区。结合细胞的该Fc受体的细胞内域的集簇与经交联的IgE分子有关，且该集簇造成该肥大细胞内导致该细胞活化的反应的复序列。释放入细胞外环境内的分子包括：预先形成的介质(来自粒)(如，丝氨酸蛋白酶如类以蛋白酶、组胺(2至5pg/细胞)、血清素、蛋白聚糖、肝素(作为抗凝剂作用))、新形成的脂质介质(类花生酸)(即，凝血恶烷、前列腺素D2、白三烯C4、血小板活化因子)、及细胞因子(如，嗜酸细胞趋化因子)。

组胺扩大毛细管后微静脉，活化内皮，且增加血管渗透性。这导致局部水肿(肿胀)、发热、发红、以及将其它炎性细胞吸引至该释放位点。组胺也令神经末端去极化(导致瘙痒或疼痛)。组胺释放的侵犯皮肤表征包括“潮红和膨疹(flare and wheal)”。蚊子叮咬后立即出现的肿块和发红是这一反应的好例子，这一反应在肥大细胞挑战过敏原后几秒钟内出现。

MrgprX2

本文中，mas相关的G蛋白偶联受体成员X2(MrgprX2)是肥大细胞特异性的基础促分泌素抗体，该基础促分泌素即阳离子性两亲药物，以及内源肽或外源肽，由碱性头部和疏水性芯组成。见，McNeil B.D.,2015Nature,519:237-241，该文献通过引用并入本文。如下文详述的，MrgprX2识别并接合含有经环化的四氢异喹啉(THIQ)的小分子，如非甾体神经肌肉阻断药物(NMBD)，包括筒箭毒碱和阿曲库铵。如下文详述的，MrgprX2响应这些化合物而介导假性过敏反应，该假性过敏反应以组胺释放、炎症和气道收缩为特征。本文中，MrgprX2也担当大量其它配体的受体，该其它配体包括肽和生物碱，如皮质抑素-14、肾上腺髓质素原N端肽PAMP-12、和程度较低的PAMP-20、抗细菌蛋白LL-37、PMX-53肽、β-防御素、和扁平石松碱(complanadine)A。

例示性人MrgprX2氨基酸序列提供如下(NP_001290544.1(GI:746816153)，通过引用而并入本文(SEQ ID NO:1))：

例示性人MrgprX2核酸序列提供如下(NM_001303615.1(GI:746816152)，通过引用并入本文(SEQ ID NO:2))：

例示性鼠MrgprB2氨基酸序列提供如下(NP_780740.2(GI:229094244)，通过引用并入本文(SEQ ID NO:3))：

例示性鼠MrgprB2核酸序列提供如下(NM_175531.4(GI:229094243)，通过引用并入本文(SEQ ID NO:4))：

Gα15

GTP结合蛋白α15(Gα15)是多种跨膜信令系统的调节子或转换子。

例示性人Gα15氨基酸序列提供如下(NP_002059.3(GI:597709771)，通过引用并入本文(SEQ ID NO:5))：

例示性人Gα15核酸序列提供如下(NM_002068.3(GI:597709770)，通过引用并入本文(SEQ ID NO:6))：

例示性鼠Gα15氨基酸序列提供如下(NP_034434.1(GI:6754010)，通过引用并入本文(SEQ ID NO:7))：

例示性鼠Gα15氨基酸序列提供如下(NM_010304.3(GI:34328487)，通过引用并入本文(SEQ ID NO:8))：

HEK293细胞

人类胚胎肾293细胞，一般也指代为HEK 293、HEK-293、293细胞、或较不精确地称为HEK细胞，是最初源自在组织培养液中生长的人类胚胎肾细胞(来自流产的人类胚胎)及源自死产动物的特异性细胞株。HEK 293细胞非常容易生长且非常容易转染，并已经再细胞生物学中广泛使用多年。它们也通过生物技术工业而被用来生产治疗性蛋白质和用于基因治疗的病毒。

本文中揭示稳定表达Gα15、以及或MrgprB2或MrgprX2的HEK 293细胞。

发表下述实施例，以对该领域技术人员提供如何做出并使用本发明的试验、筛选、和治疗性方法的完全公开和说明，且该实施例并非欲以限制本发明人认为的发明范畴。

[实施例]

实施例1：材料和方法

使用下述材料和方法。

动物模型

牵涉平等对待WT和突变样本和动物的全部实验由实验人员无视实验条件而实施。

分析

各组数据表达为平均数±平均数标准误差。使用双尾未配对学生t测试来测定统计学比较的显着性，且当p<0.05时认为差异显着。使用统计功效分析来证明样本尺寸。每一组中，由于大多数成果数值关于该平均数值对称分布，因此假设数据正态分布。通过F测试测得的各组间的方差类似。通过纤连蛋白粘连的可见缺乏或通过不正常的高静止钙水平而视为被损害的肥大细胞，被排除在该分析之外。反之，成功进行该过程及/或治疗的样本或动物无一被排除在该分析之外。由于不可用于该研究，因此在动物研究中不使用随机化。

肽和药物

化合物48/80、黄蜂毒、罗库溴铵、筒箭毒碱、环丙沙星、莫西沙星和氧氟沙星来自西格玛公司(Sigma)。皮质抑素来自Tocris Biosciences。PAMP(9-20)由Genscript定制合成并纯化至≥98％。亮丙瑞林来自Genscript。物质P、胰激肽、黄蜂毒素、西曲瑞克、奥曲肽、舍莫瑞林(生长激素释放因子1-29)、艾替班特(HOE-140)来自Anaspec。阿曲库铵和美维库铵来自Santa Cruz Biotechnology。重组人胰岛素来自罗氏制药(Roche)。羊抗鼠IgE(Ab9162)来自艾碧康(Abcam)。

药物制备和存储

阿曲库铵、美维库铵、筒箭毒碱、和全部氟喹诺酮溶液在实验当天制备，因为发现前三种的效能对氧化及/或冻融效应敏感，而氟喹诺酮的溶解度当新鲜制备时最佳。普萘洛尔(Propranolol)也在实验当天制备以最小化潜能损失的可能。将除左氧氟沙星之外的全部氟喹诺酮溶解于pH被调节为3.5的CIB中。全部其它药物制备为100X至1000X等量小样，在-80℃储存，使用时在4℃融化并稀释入钙成像缓冲液或盐水中。

Mrgpr RT-PCR筛选

根据制造商的建议，使用Qiagen RNEasy Micro柱将核糖核酸(RNA)从4X 10⁴鼠腹膜肥大细胞纯化出来。使用DNAse I(New England BioLabs)将RNA处理20分钟，在另一RNEasy Micro柱上再次纯化。根据制造商的使用说明书，使用寡dT引物并将所推荐的10μl放大至60μl，使用SuperScript III试剂盒(Invitrogen)以8ng的RNA来生成第一cDNA链。阴性对照反应相同，但以水替代SuperScript III逆转录酶。使用12.5μl RedTaq ReadyMix(Sigma)、0.5μl DMSO、各0.25μl的50μM基因特异性正反向引物、10μl水、和2μl的来自cDNA或阴性对照合成反应的混合物，运行25μl的PCR反应。全部反应均使用4分钟的95℃起始步骤、30秒的具体温度(下文揭示)退火、40秒的72℃扩增、和25秒的95℃(且后三个步骤重复39次)、以及4分钟的72℃最终步骤。低严格度PCR设定为60℃退火；否则，退火温度为：62℃，用于MrgprA1、MrgprA10、MrgprB2、和MrgprB6；64℃，用于MrgprA2、MrgprA3、MrgprA4、MrgprA6、MrgprA16、MrgprA18、和MrgprB11；65℃，用于MrgprA9、MrgprA19、MrgprB1、MrgprB3、MrgprB5、和MrgprB8；66℃，用于MrgprA12和MrgprB10；63℃，用于MrgprB4；61℃，用于MrgprA14；以及，65.5℃，用于MrgprC11。

引物如下。MrgprA1(正向：atccagcaagaggaatgggg(SEQ ID NO:9)，反向：tgtgacctaggaggaagaagaag(SEQ ID NO:10))；MrgprA2(正向：cctcctacacaagccagcaa(SEQID NO:11)，反向：aagcacaagtgaaagatgatgct(SEQ ID NO:12))；MrgprA3(正向：gctacatccagcaagaggaatg(SEQ ID NO:13)，反向：gcaaaaattcctttgggtagggt(SEQ ID NO:14))；MrgprA4(正向：cctgtgtgctgtgatctggt(SEQ ID NO:15)，反向：tcacggttaatccagggcac(SEQ ID NO:16))；MrgprA6(正向：cattttcctcccccaacagt(SEQ IDNO:17)，反向：atgcctgaatgagcccacaa(SEQ ID NO:18))；MrgprA9(正向：cagtgatctacatccagcaaaagg(SEQ ID NO:19)，反向：gcgtggaagctatgatgcga(SEQ ID NO:20))；MrgprA10(正向：cagtggtccaccatctccaa(SEQ ID NO:21)，反向：acaggcaagagagtcatggtt(SEQ ID NO:22))；MrgprA12(正向：tcagggatcgggtgaagcac(SEQID NO:23)，反向：gagcatttgaaggtgttgttgga(SEQ ID NO:24))；MrgprA14(正向：ggttgcccctgtgtttcttc(SEQ ID NO:25)，反向：tattgccagtcagtaagctgag(SEQ ID NO:26))；MrgprA16(正向：gccctctggttcccattact(SEQ ID NO:27)，反向：gtttttggaccactgaggcatt(SEQ ID NO:28))；MrgprA18(正向：tgctctggttttctcctttgc(SEQID NO:29)，反向：tgaggcatgtcaagtcagtca(SEQ ID NO:30))；MrgprA19(正向：caggacccagatcacgacac(SEQ ID NO:31),tcctgggcttccgatttcac(SEQ ID NO:32))；MrgprB1(正向：attagccttcatcaggcacca(SEQ ID NO:33),ccagcccaactaaggcaatg(SEQ IDNO:34))；MrgprB2(正向：gtcacagaccagtttaacacttcc(SEQ ID NO:35),cagccatagccaggttgagaa(SEQ ID NO:36))；MrgprB3(正向：acctggctgtggctgatttt(SEQ IDNO:37)，反向：gctgaacccacagagaacca(SEQ ID NO:37))；MrgprB4(正向：tctggctggtgctgatttctt(SEQ ID NO:38)，反向：accacgaggctcaacaataga(SEQ ID NO:39))；MrgprB5(正向：ctgtggttccttctgtgtcca(SEQ ID NO:40)，反向：tttccagttccccagaccttt(SEQ ID NO:41))；MrgprB6(正向：tctgtctacatcctcaacctgg(SEQID NO:42))，反向：attatctcatgaggaaggctcaa(SEQ ID NO:43))；MrgprB8(正向：agagaatgcaaagcatgcga(SEQ ID NO:44)，反向：gaggaagtttgccccagaca(SEQ ID NO:45))；MrgprB10(正向：cactggtcacattgccaacc(SEQ ID NO:46，反向：ggggatggaatcaatgtccaaga(SEQ ID NO:47)；MrgprB11(正向：accttcttgctatttttccctcca(SEQ ID NO:48)，反向：aggatgagactggacccaca(SEQ ID NO:49))；MrgprC11(正向：cagcacaagtcagctcctcaa(SEQID NO:50)，反向：atgcccatgagaaaggacagaacc(SEQ ID NO:51))。

表达构建

使用标准技术克隆Mrgpr基因并插入pcDNA3.1哺乳动物表达质粒。全部的鼠基因在其N端具有Kozak序列，也编码通过氨基酸链接基DIIL从该基因分隔开的C端FLAG标签。

cDNA构建

如RT-PCR筛选中所揭示的制备第一cDNA链，并使用Q5热启动高保真预混液(HotStart High Fidelity Master Mix)(New England Biolabs)实施扩增。将至少五种各自从野生型和突变鼠制备的不同克隆物定序，以证实突变种中消除的存在和任何从其它野生型或突变种的突变的不存在。

HEK 293细胞中钙成像

在初始筛选中，使用包括C端FLAG标签的基因构建瞬时转染HEK293细胞(未进行支原体测试但迅速分开)，并在转染后6小时，置100μg/ml聚D-赖氨酸涂覆的玻璃盖板上。24小时后，于37℃，令细胞装载钙指示物Fura-2或Fluo-4(分子探针公司(Molecular Probes))的AM酯和0.02％Pluronic F-127(MolecularProbes)，装载时间为45分钟。装载Fura-2的细胞在340nm和380nm激发过程中成像，而装载Fluo-4的细胞在488nm激发过程中成像。后来的实验使用稳定表达受体的细胞株以及混杂G蛋白Gα15的瞬时或稳定表达。细胞在钙成像缓冲液(CIB；NaCl 125mM，KCl 3mM，CaCl₂ 2.5mM，MgCl₂ 0.6mM，HEPES 10mM，葡萄糖20mM，NaHCO₃ 1.2mM，蔗糖20mM，使用NaOH带至pH 7.4)中成像。除非具体排除，将药物灌注入腔室中，灌注时间为45至60秒，并以5秒的间隔在进行另外60至90秒的响应监控。

EC₅₀测定

稳定表达Gα15、以及MrgprB2或MrgprX2的HEK293细胞以4X 10⁴细胞每孔置于96孔板中，并孵化过夜。第二天，移除培养基并使用来自FLIPR Calcium 5试验试剂盒(分子器件公司(Molecular Devices))的成像溶液替换，根据制造商的建议在汉克平衡盐溶液(Hank’s Balanced Salt Solution,HBSS)中使用20mMHEPES(pH 7.4)稀释。细胞在37℃孵化60分钟，在室温下恢复15分钟后，在Flexstation 3(Molecular Devices)中成像。根据制造商的说明对孔成像120秒，且在成像开始后，以增加的3X浓度加入50μl测试物质，加入时间为30秒。通过从最大信号减去最小信号而测定响应。以两孔的平行实验来测试物质，将信号平均，对于每一次试验，通过归一至该试验中该物质的峰值响应而测定EC₅₀。将全部药物溶解于HBSS+HEPES溶液中，且由于溶解度问题的免责条款如下：将醋酸西曲瑞克溶解于含有2.5mM CaCl₂和0.6mM MgCl₂的盐水中；且将除氧氟沙星外的氟喹诺酮溶解于相同的溶液中，但使用HCl将pH调节至3.5；氧氟沙星需要100μg/ml的乳酸才能完全溶解。肽有时在冻融循环后损失效能，因此大多数肽直接从冻干原料制备。

腹膜肥大细胞纯化和成像

通过吸入CO₂牺牲2至5个月大的成年雄性和雌性鼠。使用总计12ml的冰冷的肥大细胞解离介质(MCDM；具有3％胎牛血清和10mM HEPES的HBSS，pH 7.2)进行两次连续的腹膜灌洗，合并灌洗液，细胞以200g旋转沉降。来自每一鼠的小样再次悬浮于2ml的MCDM中，在4ml的等张70％珀可悬浮液(Percoll suspension)(2.8ml Percoll、320μl 10X HBSS、40μl1M HEPES、830μl MCDM)上分层，在4℃以500g旋转沉降20分钟。回收该小样中的肥大细胞。纯度为>95％，通过亲和素染色并通过形态学测定。肥大细胞以5X 10⁵至1X 10⁶细胞/ml再次悬浮于具有10％胎牛血清和25ng/ml重组鼠干细胞因子(Sigma)的DMEM中，并置于涂覆有30μg/ml纤连蛋白(Sigma)的玻璃盖板上。对于计数，替代该放置，将所悬浮的肥大细胞以1/10稀释，并通过在CytoSpin(Thermo Scientific)上于4℃以1000rpm旋转5分钟而固定在载玻片上。

对于成像，在37℃、5％CO₂中孵化2小时后，以Fluo-4和0.02％Pluronic F-127一起于室温浸泡肥大细胞30分钟，在CIB中洗涤3次，立即用于成像。细胞下浸泡2小时内使用。若[Ca²⁺]i升高至少50％且持续至少10秒，则鉴别细胞响应，其清楚地区分配体诱导的响应与随机闪烁事件。通过取小鼠中每个细胞的平均响应来计算平均踪迹，并取该等平均踪迹的平均值。

BAC转基因鼠生成

BAC克隆RP23-65I23从儿童医院奥克兰研究中心(Children's Hospital OaklandResearch Institute)购买。这一克隆含有MrgprB2基因座，约60kb的5’基因组序列和超过100kb的3’基因组序列。使用细菌的重组工程来诱发eGFP-Cre和紧邻MrgprB2启动密码子之后的polyA信号(Metcalfe,D.D.,Baram,D.&Mekori,Y.A.Mast Cells.Physiologicalreviews 77,1033-1079(1997))。该BAC使用NotI(New England Biolabs)进行线性化，并注射入来自单细胞受精原核C57Bl/6卵的原核中。将卵移植入假孕雌性体内。构建三个BAC鼠系。尽管鼠已经处于C57Bl/6背景中，在实验之前，它们是C57Bl/6背景中WT和荷tdTomato鼠的至少第四代后代。BAC鼠与从杰克逊实验室(Jackson Labs)购买的用于成像的ROSA26Tdtomato鼠交配。因为tdTomato信号一般是异种的且在杂合鼠体内弱，图1的实验使用ROSA26Tdtomato的鼠纯合子。在61℃退火下运行BAC鼠的基因型分型反应，且引物为：正向，tatatcatggccgacaagca；反向，cagaccgcgcgcctgaaga。两种引物均处于eGFP-Cre阅读框架内，但通过先前定序核实整个基因和MrgprB2基因座中的正确布置。

MrgprB2突变鼠生成

以MrgprB2为靶向的编码锌指核酸酶mRNA是从Sigma购买的。结合位点为GTTCCTGGGCATCCG(SEQ ID NO:52)和TGCACACGAATGCCTTCACTG(SEQ ID NO:53)，分别与MrgprB2开放阅读框架的碱基180至194和196至216相对应。将mRNA于具有0.25mm EDTA的1mm Tris–HCl缓冲液(pH 7.4)中稀释为2ng/ml，并注射入C57Bl/6种中单细胞受精卵的原核内。未观察到毒性的明显征兆。胚胎植入假孕雌性体内。位于结合位点侧翼的DNA从始祖鼠放大，并使用Cel-1试验试剂盒(Transgenomics)根据制造商建议进行突变筛选。通过DNA定于鉴别并证实，首次28只鼠中的3只携带小突变，未进行详细筛选。除了本研究中使用的4bp突变之外，鉴别出一只携带1bp基因缺失，另一只携带2bp基因缺失。

野生型和MrgprB2^MUT鼠基因型分型

用于野生型鼠的引物为GGTTCCTGGGCATCCGTAT(SEQ ID NO:54)和GGTTCCTGGGCATCCGTAT(SEQ ID NO:55)，该反应在62.8℃的退火温度下运行。

用于MrgprB2^MUT鼠的引物为GTTCCTGGGCATCCGCAC(SEQ ID NO:56)和CTTCCGCCTGAACCTTCGGT(SEQ ID NO:57)，该反应在64.0℃退火温度下运行。

组织的亲和素标记

使用戊巴比妥麻醉最高8月龄的成年雄性和雌性鼠，并灌注20ml 0.1M PBS(pH7.4，4℃)，之后灌注25ml固定剂(4％甲醛(vol/vol)，4℃)。从经灌注的鼠解剖获取心脏、气管和皮肤切片。组织在固定剂中在4℃进一步固定过夜。当仅需要皮肤切片作为组织样本时，通过吸入CO²令鼠窒息后，直接切割皮肤并将其置于固定剂中，省略灌注步骤。组织于20％蔗糖(wt/vol)中冷保护超过24h，并使用低温恒温器切片(20μm宽)。将载玻片上的切片在37℃干燥30min，并使用4％多聚甲醛在21至23℃固定10分钟。将载玻片在封闭溶液(10％正常山羊血清(vol/vol)、0.2％Triton X-100(vol/vol)与PBS中，pH 7.4)中于21至23℃预孵化1或2h，随后使用1/500FITC-亲和素(Sigma)或若丹明-亲和素(Vector Labs)孵化45分钟。切片使用水或PBS洗涤三次，加入一滴Fluoromount G(SouthernBiotech)，之后将盖玻片置于顶部。检查腔室附近的心脏肥大细胞，因为该处的肥大细胞密度比该组织中其它处高得多；观察到非常少量的包埋在肌肉内的亲和素阳性、tdTomato阴性的细胞，但其身份不明确。

对于腹膜肥大细胞的亲和素标记，如所揭示的将细胞置于肥大细胞纯化切片中，以4％多聚甲醛在21至23℃固定10min，以1/1000亲和素在PBS中于21至23℃孵化30分钟，以PBS洗涤后立即成像。

胃切片免疫细胞化学

使用戊巴比妥麻醉最高8月龄的成年雄性和雌性鼠，并灌注20ml 0.1M PBS(pH7.4，4℃)，之后灌注25ml固定剂(4％甲醛(vol/vol)，4℃)。移除胃部，彻底洗涤，在4％甲醛中进一步固化2小时，通过在30％蔗糖溶液中孵化48小时而将其准备切片。将组织样本安装在冷包埋接着中并冷冻，使用低温恒为其作成14μm切片，并随后固定于载玻片上。载玻片使用0.2％Triton X-100PBS溶液洗涤，在10％正常山羊血清溶液中孵化1小时，随后使用大鼠单克隆抗小鼠MCPT1(单克隆抗体RF6.1，eBiosciences)在0.2％Triton/1％正常山羊血清溶液中的1:20稀释液在4℃孵化过夜。载玻片使用0.2％Triton溶液洗涤，并于室温在Triton溶液中使用羊抗鼠IgG Alexa Fluor 488共轭的抗体(Life Technologies)的1:500稀释液孵化2小时。载玻片在PBS中洗涤，之后加上盖玻片和抗褪色溶液并进行成像。

外周白血球制备

通过使用含有PBS和30单位/ml肝素及5mM EDTA的针筒经由心脏穿刺从MrgprB2-tdTomato鼠收集血液，以相同溶液进行1:1稀释，冷却至室温，之后在15ml锥形管中于6ml的Histopaque-1119溶液上分层。试管以700g离心30分钟，在PBS与Histopaque溶液之间的界面处收集白血球。细胞以PBS洗涤，并以500g旋转沉降10分钟，重复总计三次。将细胞以600rpm在Cytospin 4(Thermo Scientific)中的涂覆有聚赖氨酸的载玻片上旋涂3至5分钟，在37℃加热块上干燥过夜，使用在PBS中稀释为0.5μg/ml的Hoechst 33342孵化2分钟，之后，使用抗褪色溶液安装盖玻片。平行实验中，也使用Hoechst 33342将细胞在悬浮液中染色，旋转沉降细胞，将再次悬浮的细胞直接在PBS/抗褪色溶液中混合，之后直接置于载玻片上，并将盖玻片装在该悬浮液上。在使用任何方法的制剂中，均未见tdTomato阳性的细胞。

组织组胺释放研究

切割从剃毛的最高6月龄雄性和雌性鼠的腹部分离的全气管或皮肤碎片(4至8mg湿重)，并清除结缔组织。在充氧的Krebs碳酸氢盐缓冲溶液(37℃)中孵化60分钟后，使用载剂或化合物48/80处理该组织30min。保存上清溶液用于组胺分析。随后，该组织于37℃水浴中以8％高氯酸处理15分钟，以获得总组胺含量。通过先前揭示的自动化荧光测定技术²测定组胺。

气管收缩

如先前揭示的进行器官收缩(Lagunoff,D.,Martin,T.W.&Read,G.Agents thatrelease histamine from mast cells.Annual review of pharmacology andtoxicology 23,331-351)。对于过敏原(卵白蛋白，OVA)响应，通过以2天的间隔注射三次，每次注射0.2mL的OVA溶液(3.75μg/mL)与Al(OH)₃的混合物，将鼠激活敏化。在首次注射2周后，在8至12周龄的雄性和雌性动物身上进行实验。将清除结缔组织和气管环的气管(整体或侧向分为两半)悬浮在两个钨制镫形物之间的10mL器官腔室中，填充加热至37℃并使用95％O₂-5％CO₂鼓泡以维持pH 7.4的Krebs。一个镫形物连接应变仪(型号FT03；GrassInstruments,Quincy,MA)，在Grass Model 7多种波动描记器(Grass Instruments,Quincy,MA)上记录张力。令制剂承受0.2g的静止张力，并使用新鲜的Krebs缓冲液以15分钟间隔在60分钟平衡期间洗涤。平衡后，令气管挑战OVA(10μg/mL)或化合物48/80。在每一实验结束时，使用碳酰胆碱(carbachol)(1μM)令全部气管最大收缩。全部结果都表达为最大收缩的百分比。

后足肿胀和外溢

通过腹膜注射50mg/kg戊巴比妥(Sigma)麻醉最高8月龄的成年雄性鼠。麻醉诱导15分钟后，向鼠静脉注射50μl的12.5mg/ml溶解在盐水中伊文思蓝(Sigma)。5分钟后，通过足底注射将5μl的测试物质(或7μl的抗IgE)给药至一足，并将盐水给药至另一足。注射后立即通过卡尺测量足厚度。15分钟后(抗IgE为30分钟后)，再次测量足厚度，并通过斩首牺牲鼠。收集足组织，在50℃干燥24小时，称重。通过在甲酰胺中于50℃孵化24小时而萃取伊文思蓝，使用分光光度计在620nm读取O.D.。对于使用酮替芬的研究，在注射戊巴比妥的同时，向小鼠腹膜注射25μl的10mg/ml酮替芬溶液。

全身性过敏性反应试验

为了最小化压力，在注射前一天，将动物运输至实施该过程的区域。将最高8月龄的成年雄性和雌性鼠(25至35克)从笼子中移除后，立即进行80μg溶解于盐水中的普萘洛尔(2mg/ml)的腹膜给药，随后放回它们的笼子中放置30分钟，再进行静脉注射。一次对一只鼠实施静脉注射。对于每次注射，将一只鼠置于运输箱中，并带入没有其它鼠的房间，以最小化注射过程中来自叫声的压力。随后将该鼠放入限制器中，在限制其行动4分钟内实施注射，这是因为，观察到更长的限制时间影响身体核心温度，而这一影响与注射无关。通过使用100％乙醇浸渍的纸巾重复擦拭而令尾静脉扩张，之后使用配有30.5计量针的0.25mlHamilton注射器(BD Biosciences)注射环丙沙星。仅当满足下列全部条件时才认为注射成功：插针后注射器内出现血液、注射后全部尾静脉可见、撤针后该鼠的注射位点轻微出血。用药签擦拭注射位点直至停止流血，将鼠放入与其饲养笼分离的笼子中，一笼一鼠，并返回其被带出的房间。对于每一实验对话期，使用至少一只野生型鼠和一只突变鼠。使用直肠温度计测量身体核心温度。

鼠腹膜肥大细胞组胺释放试验

如钙成像试验中一样纯化肥大细胞，令其在具有5％CO₂的37℃孵化器中在具有10％FBS和25ng/ml鼠干细胞因子的DMEM中恢复2小时。随后，细胞旋转沉降，再次悬浮于CIB中，计数，以300细胞/孔置于涂覆有20μg/ml纤连蛋白(Sigma)的96孔板中，每孔具有75μlCIB。令它们在37℃通风条件(即，CO₂水平未调节)下粘附基板45分钟，再进行试验。对于该试验，将细胞移至室温，加入75μl的2X浓度的测试物质(除环丙沙星外全部溶解于CIB中，环丙沙星溶解在pH 3.5的含有2.5mM CaCl₂和0.6mM MgCl₂的盐水中)。5分钟后，吸取40μl上清液，以40μl CIB稀释，在-80℃冷冻，直至测定组胺水平。抗IgE处理类似，但在加入抗IgE之后且吸取上清液之前，将细胞在37℃孵化30分钟。使用HTRF组胺试验试剂盒(CisbioAssays)根据制造商的使用说明书测定组胺含量。

人类肥大细胞培养

在以2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、50μg/ml链霉素、和100ng/ml重组人干细胞因子(Peprotech)补充的StemPro-34SFM培养基(Life Technologies)中，培养LAD2(Laboratory of Allergic Diseases 2)人肥大细胞。将该细胞悬浮液以0.1×10⁶细胞/ml的密度接种，并在37℃和5％CO₂下维持，通过流式细胞仪周期性测试CD117和FcεRI的表达。每周以新鲜培养基半替换该细胞培养基。

LAD2脱粒试验

使用0.5μg/ml生物素共轭的人IgE(Abbiotec)敏化LAD2细胞20小时。洗涤细胞，再次以每孔0.025×10⁶悬浮于Hepes缓冲液(10mM HEPES、137mM NaCl、2.7mM KCl、0.38mMNa₂HPO₄.7H₂O、5.6mM葡萄糖、1.8mM CaCl₂.H₂O、1.3mM MgSO₄.7H₂O、0.4％BSA，pH 7.4)中，随后以0.1μg/ml链霉亲和素(Life Technologies)或其它激动剂以所标注的浓度在37℃/5％CO₂下刺激30分钟。通过对硝基苯基N-乙酰基-β-D-葡糖酰胺(Sigma-Aldrich)在37℃的0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH 4.5)中水解90分钟，将释放复该上清液和细胞裂解液中的β-氨基己糖苷酶定量。将所释放的β-氨基己糖苷酶的百分比计算为总含量的百分比。所测试的激动剂为化合物48/80、黄蜂毒素、艾替班特、阿曲库铵苯磺酸盐、和盐酸环丙沙星。

EIA和ELISA

使用培养基洗涤LAD2细胞，以每孔0.25×10⁶细胞悬浮，并以化合物48/80、黄蜂毒素、艾替班特、阿曲库铵或环丙沙星以所标注浓度在37℃/5％CO₂下孵化3至24小时。收获无细胞的上清液，并通过EIA(Cayman chemical)分析所释放的PGD2，同时使用ELISA试剂盒(eBioscience)根据制造商的使用说明书定量TNF含量。PGD2的最小检出限为55pg/ml，而TNF的最小检出限为5.5pg/ml。

从LAD2细胞释放的组胺的测量

洗涤LAD2细胞，以每孔0.1×10⁶悬浮于不含BSA的Hepes缓冲液中，并以化合物48/80、黄蜂毒素、艾替班特、阿曲库铵或环丙沙星以所标注浓度在37℃/5％CO₂下孵化30分钟。制备100μg/ml的组胺(Sigma-Aldrich)原液，并在-20℃储存。使用两倍系列稀释新鲜制备4000ng/ml至7.8ng/ml的标准工作溶液。将邻苯二醛(OPT；Sigma-Aldrich)溶解于无丙酮的甲醇(10mg/ml)中并于4℃黑暗中保存。将组胺标样和无细胞的上清液(60μL)转移至平底黑色96孔微孔板上，并与12μl的1M NaOH和3μl的OPT混合。室温中放置4分钟后，加入6μl的3MHCl以停止组胺-OPT反应。使用355nm激发滤光片和460发射滤光片测量荧光强度。

LAD2细胞的siRNA转染

使用ON-TARGET加上对抗MrgprX2的SMARTpool siRNA和来自Dharmacon的对照siRNA下调MrgprX2的表达。使用培养基洗涤LAD2细胞，以每孔0.5×10⁶细胞悬浮，并使用Lipofectamine 3000(Life Technologies)根据制造商的使用说明书在37℃/5％CO₂下在无抗生素的StemPro培养基中以100nm MrgprX2siRNA和对照siRNA转染该细胞。在第48小时，通过逆转录酶PCR证实基因移除，并将该细胞用于脱粒试验。

实施例2：MrgprB2是人MrgprX2的直系同源

哺乳动物保留了对基础促分泌素的响应能力(Halpern,B.N.&Wood,D.R.Theaction of promethazine(phenergan)in protecting mice against death due tohistamine.British journal of pharmacology and chemotherapy 5,510-516(1950))，鸟类体内也发现了该响应能力(Taneike,T.,Miyazaki,H.,Oikawa,S.&Ohga,A.Compound48/80elicits cholinergic contraction through histamine release in the chickoesophagus.General pharmacology19,689-695(1988))，表明其机制中扮演的古老且根本的角色。多数基础促分泌素是内源性肽，一般与炎症有关；但是，它们仅在高浓度时活化结缔组织肥大细胞且不依赖于它们的典型受体，因此，必然存在另一刺激机制(Ferry,X.,Brehin,S.,Kamel,R.&Landry,Y.G protein-dependent activation of mast cell bypeptides and basic secretagogues.Peptides 23,1507-1515(2002))。若干结合聚阳离子性化合物的备选已经被提议作为基础促分泌素受体(Ferry,X.,Brehin,S.,Kamel,R.&Landry,Y.G protein-dependent activation of mast cell by peptides and basicsecretagogues.Peptides 23,1507-1515(2002)；Purcell,W.M.,Doyle,K.M.,Westgate,C.&Atterwill,C.K.Characterisation of a functional polyamine site on rat mastcells:association with a NMDA receptor macrocomplex.Journal ofneuroimmunology65,49-53(1996)；Tatemoto,K.et al.Immunoglobulin E-independentactivation of mast cell is mediated by Mrg receptors.Biochemical andbiophysical research communications 349,1322-1328,(2006)；Sick,E.,Niederhoffer,N.,Takeda,K.,Landry,Y.&Gies,J.P.Activation of CD47receptorscauses histamine secretion from mast cells.Cellular and molecular lifesciences:CMLS 66,1271-1282,(2009)。这些之中，MrgprX2已经使用大多数化合物筛选(Tatemoto,K.et al.Immunoglobulin E-independent activation of mast cell ismediated by Mrg receptors.Biochemical and biophysical research communications349,1322-1328,(2006)；Robas,N.,Mead,E.&Fidock,M.MrgX2is a high potencycortistatin receptor expressed in dorsal root ganglion.The Journal ofbiological chemistry 278,44400-44404,(2003)；Subramanian,H.,Gupta,K.,Guo,Q.,Price,R.&Ali,H.Mas-related gene X2(MrgX2)is a novel G protein-coupledreceptor for the antimicrobial peptide LL-37in human mast cells:resistance toreceptor phosphorylation,desensitization,and internalization.The Journal ofbiological chemistry286,44739-44749,(2011)；Kashem,S.W.et al.G protein coupledreceptor specificity for C3a and compound 48/80-induced degranulation inhuman mast cells:roles of Mas-related genes MrgX1and MrgX2.European journalof pharmacology 668,299-304,(2011)；Subramanian,H.et al.beta-Defensinsactivate human mast cells via Mas-related gene X2.Journal of immunology191,345-352,(2013)；Kamohara,M.et al.Identification of MrgX2as a human G-protein-coupled receptor for proadrenomedullin N-terminal peptides.Biochemical andbiophysical research communications 330,1146-1152,(2005))，且siRNA基因移除研究支持MrgprX2在通过四种非经典基础促分泌素活化中的至少部分角色(Subramanian,H.,Gupta,K.,Guo,Q.,Price,R.&Ali,H.Mas-related gene X2(MrgX2)is a novel Gprotein-coupled receptor for the antimicrobial peptide LL-37in human mastcells:resistance to receptor phosphorylation,desensitization,andinternalization.The Journal of biological chemistry 286,44739-44749,(2011)；Subramanian,H.et al.beta-Defensins activate human mast cells via Mas-relatedgene X2.Journal of immunology 191,345-352,(2013))。但是，没有对任何备选化合物采用直接体内研究或基因敲除模型。在鼠体内的MrgprX2调查研究是复杂的，盖因含有四个人MrgprX成员的基因簇在鼠体内剧烈扩展，由22个潜在编码基因组成，且多数具有与MrgprX2相当的序列一致性(图1A)。因此，鼠MrgprX2直系同源必须通过表达模式和药理学测定。鼠初代肥大细胞中的严格的RT-PCR筛选揭露了用于单一家族成员MrgprB2(图1B)的谱带，而MrgprX1直系同源未以相关水平表达(图5A和图5B)。

功能上，异源地表达MrgprB2的HEK293细胞(MrgprB2-HEK)响应MrgprX2激动剂PAMP(9-20)14(图1C)和化合物48/80(48/80)，经典肥大细胞活化剂和经典基础促分泌素(图6A、图6B、及图6C)。MrgprB2-HEK细胞也响应其它MrgprX2配体，包括该经典促分泌素物质P，但不响应MrgprX1配体氯喹(CQ)(Liu,Q.et al.Sensory neuron-specific GPCRMrgprs are itch receptors mediating chloroquine-induced pruritus.Cell 139,1353-1365,(2009))；鼠体内紧密相关的家族成员无一响应任何化合物(图5C、图6A、及图6C)。为了测定MrgprB2的表达，生成MrgprB2BAC转基因鼠，该转基因鼠体内eGFP-Cre重组酶的表达处于MrgprB2启动子的控制之下。明显地，Cre表达模式表明，MrgprB2表达对于结缔组织肥大细胞是高度特异性的(图1D、图7、图8A、及图8B)。同时，药理学和表达数据表明，MrgprB2是MrgprX2的鼠直系同源。

实施例3：MrgprB2是鼠肥大细胞基础促分泌素受体

然后，测定MrgprB2是否为鼠肥大细胞内的基础促分泌素受体。MrgprB2基因组基因座含有太多重复序列以透过同源重组而允许基因靶向(图9A)。因此，使用基于锌指核酸酶的策略来生成在MrgprB2编码区缺失4对碱基对的鼠系(MrgprB2^MUT鼠)，随即在第一跨膜域后获得框架位移突变和早期结束(图9B、图9C、及图9D)。该突变稳定且可遗传(图9C)，因此MrgprB2^MUT被认为是功能上无效。肥大细胞数目与野生型(WT)和MrgprB2^MUT鼠组织内的相当，表明MrgprB2对于肥大细胞存活或以组织为靶向不是必需的(图10A)。腹膜肥大细胞对于抗IgE抗体(图2A)和内皮素(图11A、图11B、及图11C)的响应能力也是相当的，说明MrgprB2突变并不在全局上损害IgE或GPCR介导的肥大细胞信号传导。但是，48/80诱发的肥大细胞活化(图2A)和组织组胺释放本质上在突变肥大细胞中被摧毁(图2B和图10B)。再者，48/80引发的器官收缩(图2C)和后足发炎(外溢和肿胀；图2D)在MrgprB2^MUT背景下几乎完全不存在，而抗原(图2C)和抗IgE引发的响应(图12A和图12B)与WT鼠相当。最后，四种额外的基础促分泌素，以及MrgprX2激动剂PAMP(9-20)和皮质抑素(Robas,N.,Mead,E.&Fidock,M.MrgX2is a high potency cortistatin receptor expressed in dorsal rootganglion.The Journal of biological chemistry 278,44400-44404,doi:10.1074/jbc.M302456200(2003))，强烈活化WT但不活化MrgprB2^MUT肥大细胞(图2E；图13A)。表达MrgprB2或MrgprX2的HEK293细胞(MrgprX2-HEK)也响应这些促分泌素(图6A和图6B)。合起来推断，MrgprB2是鼠肥大细胞基础促分泌素受体。活化MrgprB2的小的、基础的肽的列举很可能大于本研究中的数目；实际上，数十种此类肽已经显示活化肥大细胞(Lagunoff,D.,Martin,T.W.&Read,G.Agents that release histamine from mast cells.Annualreview of pharmacology and toxicology 23,331-351,doi:10.1146/annurev.pa.23.040183.001555(1983)；Ferry,X.,Brehin,S.,Kamel,R.&Landry,Y.Gprotein-dependent activation of mast cell by peptides and basicsecretagogues.Peptides 23,1507-1515(2002)；Mousli,M.,Hugli,T.E.,Landry,Y.&Bronner,C.Peptidergic pathway in human skin and rat peritoneal mast cellactivation.Immunopharmacology 27,1-11(1994)；Pundir,P.&Kulka,M.The role of Gprotein-coupled receptors in mast cell activation by antimicrobial peptides:is there a connection？Immunology and cell biology 88,632-640,doi:10.1038/icb.2010.27(2010))。值得注意的是，人MrgprX2对物质P的敏感度比鼠MrgprB2强得多(图6C)，暗示在肥大细胞信号传导中对于物质P的潜在特异-特异性角色。

考虑到MrgprB2活化需要微摩尔浓度的这些肽，这一信号传导时间可能出现在何处仍不明晰。但是，肥大细胞存在于类似胰腺和肾上腺等粉末大量小的阳离子性肽的器官中，可以想象邻近释放位点处的浓度达到这些水平。本文中揭示对MrgprB2具有高亲和性的内源性配体。内源性MrgprB2和MrgprX2配体的鉴别显着有助于理解肥大细胞如何与处于疾病状态中的其它类型的细胞反应。

实施例4：MrgprB2介导肥大细胞响应能力和肽能治疗药物的副作用

肥大细胞在过敏和假性过敏(即，非IgE依赖性)反应中的关键角色表明，需要进行证明MrgprX2是否为这些事件中的因子的实验。因为多数治疗性药物时阳离子性的，因此处理药物诱发的反应。药物诱发的不良反应中高达15％在实际上表现为过敏；但是，多数并未与IgE抗体滴度良好地一一关联，表明非抗体依赖性或假性过敏机制的参与(Hausmann,O.,Schnyder,B.&Pichler,W.J.Etiology and pathogenesis of adverse drugreactions.Chemical immunology and allergy97,32-46,doi:10.1159/000335614(2012))。

首先，分析肽能药物，因为大多数是经皮下或经肌肉以微摩尔浓度引入(图15)，而该浓度足以令阳离子性肽活化肥大细胞。这些药物在FDA分类标记中揭示的最常发生的过敏型响应是注射位点反应(ISR)，一种可伴随疼痛或瘙痒的可见尺寸的局部肿胀及/或潮红。在对FDA许可的肽能药物的调查中，与ISR相关的肽能药物绝大多数都是阳离子性的(图15)。全部常见的可商购类别的这些阳离子性药物的代表性成员以MrgprB2依赖的方式活化肥大细胞，而无害蛋白质胰岛素没有效果(图3A、图13B、及图13C)。除了胰岛素之外，这些肽始终活化MrgprB2-HEK细胞和MrgprX2-HEK细胞(图6A、图6B、及图6C)。选择药物艾替班特进行进一步研究，因为该药物几乎在每一患者体内均诱发ISR(Lumry,W.R.et al.Randomizedplacebo-controlled trial of the bradykinin B(2)receptor antagonist icatibantfor the treatment of acute attacks of hereditary angioedema:the FAST-3trial.Annals of allergy,asthma&immunology:official publication of theAmerican College of Allergy,Asthma,&Immunology 107,529-537,(2011))。临床浓度的艾替班特在WT鼠体内诱发类似于人ISR的广泛的外溢和肿胀，但在MrgprB2^MUT鼠体内无此效果(图3B)。预先以肥大细胞稳定剂酮替芬治疗的鼠也未显示发炎(未经酮替芬治疗：足厚度增加40.7±2.1％；经酮替芬治疗：增加3.1±0.6％；各自n＝4；p＝2.2e-6)，强烈表明，肥大细胞介导该炎症。此外，艾替班特(以及阳性对照48/80和黄蜂毒素)诱发了来自WT腹膜肥大细胞的组胺释放，而MrgprB2^MUT肥大细胞的释放大幅度低于前者(图3C)。但是，IgE介导的组胺释放未受到MrgprB2缺失的影响(图3C)。这些数据指出，药物诱发的ISR可通过以MrgprX2为靶向而减轻或使用具有较低潜在MrgprX2激动剂性质的肽而减轻。

实施例5：MrgprB2介导肥大细胞的响应能力和小分子治疗性药物的副作用

之后，探究MrgprB2介导由小分子诱发的假性过敏反应的可能性。关注点在于静脉施加药物，因为该药物一般以高剂量快速给药，因此比通过其它途径给药的药物更可能实现高血药浓度和快速的组织分布。静脉给药后假性过敏反应的症状包括皮肤发红或皮疹、血压或心率变化、以及支气管痉挛，且该症状的最严重者称为中毒反应(anaphylactoid)(Nel,L.&Eren,E.Peri-operative anaphylaxis.British journal of clinicalpharmacology 71,647-658,doi:10.1111/j.1365-2125.2011.03913.x(2011))。初始研究是基于48/80的结构。而48/80作为MrgprX2激动剂的结构-功能关系未知，含有四氢异喹啉(THIQ)结构组元的环化变体(图4A)作为肥大细胞脱粒的潜能比48/80高七倍(Read,G.W.Compound 48-80.Structure-activity relations and poly-THIQ,a new,morepotent analog.Journal of medicinal chemistry 16,1292-1295(1973))。对于FDA许可的含THIQ药物的研究起获了烟碱受体拮抗剂非甾体神经肌肉阻断药物(NMBD)的成员，包括筒箭毒碱和阿曲库铵(图4B)。NMBD通常用于外科手术中，以减少不希望的肌肉移动并允许进行气管内插管用于机械通气。有趣的是，单独使用NMBD可对手术过程中近乎60％的过敏反应产生响应(Mertes,P.M.,Alla,F.,Trechot,P.,Auroy,Y.&Jougla,E.Anaphylaxisduring anesthesia in France:an 8-year national survey.J Allergy Clin Immunol128,366-373(2011))，且除琥珀酰胆碱外全部在人体内诱发组胺的释放(Koppert,W.etal.Different patterns of mast cell activation by muscle relaxants in humanskin.Anesthesiology 95,659-667(2001))。如图16所示，除琥珀酰胆碱外的NMBD家族的全部成员均以MrgprB2依赖模式在低至临床注射浓度的0.5％的浓度下活化肥大细胞(图4C和图13D)。有趣的是，罗库溴铵并不含THIQ，但具有大体积的疏水基且该疏水基的几埃距离内具有带电的氮(图4B)，令人想到48/80。因此，使用THIQ结构组元和该48/80结构的改性实施研究，该改性包括环化的改变和该阳性或极性氮的位置的改变，将该试验限制为高注射浓度的静脉给药的药物。氟喹诺酮家族的抗生素被鉴别为具有相似的结构组元(图4D)。与NMBD相似，这些与过敏型反应相关联(Kelesidis,T.,Fleisher,J.&Tsiodras,S.Anaphylactoid reaction considered ciprofloxacin related:a case report andliterature review.Clin Ther 32,515-526(2010)；Blanca-Lopez,N.etal.Hypersensitivity reactions to fluoroquinolones:analysis of the factorsinvolved.Clin Exp Allergy 43,560-567(2013))且可活化肥大细胞(Mori,K.,Maru,C.&Takasuna,K.Characterization of histamine release induced by fluoroquinoloneantibacterial agents in-vivo and in-vitro.The Journal of pharmacy andpharmacology 52,577-584(2000)；Mori,K.,Maru,C.,Takasuna,K.&Furuhama,K.Mechanism of histamine release induced by levofloxacin,a fluoroquinoloneantibacterial agent.European journal of pharmacology394,51-55(2000))。该四个成员被批准用于静脉用途，以MrgprB2依赖方式活化MrgprB2-HEK细胞和MrgprX2-HEK细胞(图6A、图6B、及图6C)以及肥大细胞(图4E；图13C)。相应地，阿曲库铵和环丙沙星诱发WT腹膜肥大细胞中的组胺释放，且实质上减少MrgprB2^MUT肥大细胞中的该释放(图3C)。选择环丙沙星用于过敏性反应的体内测试，该过敏性反应在鼠体内最常通过体温下降来测试，该体温下降很可能是由血压改变和周边血管扩张造成的(Doyle,E.,Trosien,J.&Metz,M.Protocolsfor the induction and evaluation of systemic anaphylaxis in mice.Methods inmolecular biology 1032,133-138,doi:10.1007/978-1-62703-496-8_10(2013))。与其它实验有机体相反，啮齿动物几乎在全身性水平上对组胺毒性免疫(Halpern,B.N.&Wood,D.R.The action of promethazine(phenergan)in protecting mice against death dueto histamine.British journal of pharmacology and chemotherapy 5,510-516(1950))，但可能对肥大细胞活化剂和使用β-肾上腺素能阻断剂预治疗的分泌产物敏感(Bergman,R.K.&Munoz,J.Efficacy of beta-adrenergic blocking agents in inducinghistamine sensitivity in mice.Nature 217,1173-1174(1968)；Matsumura,Y.,Tan,E.M.&Vaughan,J.H.Hypersensitivity to histamine and systemic anaphylaxis inmice with pharmacologic beta adrenergic blockade:protection by nucleotides.JAllergy Clin Immunol 58,387-394(1976))。这些条件下，高剂量的环丙沙星诱发了体温的快速下降且恢复非常慢，而MrgprB2^MUT鼠显示小得多的下降幅度且迅速恢复(图4F)。这些结果确认，通过MrgprB2实现的肥大细胞活化是氟喹诺酮和其它药物的脱靶效应，且人体内的相应MrgprX2活化可能是使用这些药物可见的大多数假性过敏响应的基础。

实施例6：与假性过敏相关的药物通过MrgprX2活化人肥大细胞

最后，测定药物是否与通过MrgprX2活化人肥大细胞造成的假性过敏有关。每一类所检查药物的代表性成员均引发了组胺、TNF、PGD2、和β-氨基己糖苷酶从LAD2细胞的释放(图14A)。使用48/80和黄蜂毒素作为阳性对照。重要的是，与经对照siRNA处理的细胞相比，经MrgprX2siRNA处理的LAD2细胞展现了显着低于通过这些物质引发的β-氨基己糖苷酶释放，而IgE介导的释放则相当(图14B)。在经MrgprX2siRNA处理的细胞中观察到的释放很可能是由于mRNA及/或蛋白质的不完全基因移除。

如上所述，鼠体内的MrgprB2和人体内的MrgprX2，是肥大细胞内的基础促分泌素受体。本文中也揭示首次获知的这些受体的体内角色的证据，该证据表明，这些受体是非IgE依赖性药物诱发的假性过敏的关键中介物。因此，由于两个原因，对于MrgprX2在药物诱发的假性过敏中所扮演角色的认知扩展。首先，配体结合需求研究是的对于交叉活化MrgprX2的药物的更特异性筛选称为可能。其次，由于经口给药的药物的副作用一般包括胃肠道问题和头痛，而这两种症状均与肥大细胞有关，因此，筛选经口给药的药物发现了更多的MrgprX2配体。

参考文献

Bergman,R.K.&Munoz,J.Efficacy of beta-adrenergic blocking agents ininducing histamine sensitivity in mice.Nature 217,1173-1174(1968).

Blanca-Lopez,N.et al.Hypersensitivity reactions to fluoroquinolones:analysis of the factors involved.Clin Exp Allergy 43,560-567(2013).

Doyle,E.,Trosien,J.&Metz,M.Protocols for the induction and evaluationof systemic anaphylaxis in mice.Methods in molecular biology1032,133-138,(2013).

Ferry,X.,Brehin,S.,Kamel,R.&Landry,Y.G protein-dependent activationof mast cell by peptides and basic secretagogues.Peptides 23,1507-1515(2002).

Fluker,M.et al.Efficacy and safety of ganirelix acetate versusleuprolide acetate in women undergoing controlled ovarianhyperstimulation.Fertility and sterility 75,38-45(2001).

Galli,S.J.,Nakae,S.&Tsai,M.肥大细胞in the development of adaptiveimmune responses.Nature immunology 6,135-142,(2005).

Halpern,B.N.&Wood,D.R.The action of promethazine(phenergan)inprotecting mice against death due to histamine.British journal ofpharmacology and chemotherapy 5,510-516(1950).

Han,L.et al.A subpopulation of nociceptors specifically linked toitch.Nature neuroscience 16,174-182,(2013).

Harper,N.J.et al.Suspected anaphylactic reactions associated withanaesthesia.Anaesthesia 64,199-211,(2009).

Hausmann,O.,Schnyder,B.&Pichler,W.J.Etiology and pathogenesis ofadverse drug reactions.Chemical immunology and allergy 97,32-46,(2012).

Kamohara,M.et al.Identification of MrgX2as a human G-protein-coupledreceptor for proadrenomedullin N-terminal peptides.Biochemical andbiophysical research communications 330,1146-1152,(2005).

Kashem,S.W.et al.G protein coupled receptor specificity for C3a andcompound 48/80-induced degranulation in human mast cells:roles of Mas-relatedgenes MrgX1and MrgX2.European journal of pharmacology 668,299-304,(2011).

Kelesidis,T.,Fleisher,J.&Tsiodras,S.Anaphylactoid reaction consideredciprofloxacin related:a case report and literature review.Clin Ther 32,515-526(2010).

Koppert,W.et al.Different patterns of mast cell activation by musclerelaxants in human skin.Anesthesiology 95,659-667(2001).

Lagunoff,D.,Martin,T.W.&Read,G.Agents that release histamine frommast cells.Annual review of pharmacology and toxicology 23,331-351

Liu,Q.et al.Sensory neuron-specific GPCR Mrgprs are itch receptorsmediating chloroquine-induced pruritus.Cell 139,1353-1365,(2009).

Lumry,W.R.et al.Randomized placebo-controlled trial of the bradykininB(2)receptorantagonist icatibant for the treatment of acute attacks ofhereditary angioedema:the FAST-3trial.Annals of allergy,asthma&immunology:official publication of the American College of Allergy,Asthma,&Immunology107,529-537,(2011).

Matsumura,Y.,Tan,E.M.&Vaughan,J.H.Hypersensitivity to histamine andsystemic anaphylaxis in mice with pharmacologic beta adrenergic blockade:protection by nucleotides.J Allergy Clin Immunol 58,387-394(1976).

Mertes,P.M.,Alla,F.,Trechot,P.,Auroy,Y.&Jougla,E.Anaphylaxis duringanesthesia in France:an 8-year national survey.J Allergy Clin Immunol 128,366-373(2011).

Metcalfe,D.,Baram,D.&Mekori,Y.A.Mast cells.Physiological reviews 77,1033-1079(1997).

Mori,K.,Maru,C.&Takasuna,K.Characterization of histamine releaseinduced by fluoroquinolone antibacterial agents in-vivo and in-vitro.TheJournal of pharmacy and pharmacology 52,577-584(2000).

Mori,K.,Maru,C.,Takasuna,K.&Furuhama,K.Mechanism of histaminereleaseinduced by levofloxacin,a fluoroquinolone antibacterial agent.Europeanjournal of pharmacology 394,51-55(2000).

Mousli,M.,Hugli,T.E.,Landry,Y.&Bronner,C.Peptidergic pathway in humanskin and rat peritoneal mast cell activation.Immunopharmacology27,1-11(1994).

Nel,L.&Eren,E.Peri-operative anaphylaxis.British journal of clinicalpharmacology 71,647-658,(2011).

Pundir,P.&Kulka,M.The role of G protein-coupled receptors in mastcell activation by antimicrobial peptides:is there a connection？Immunologyand cell biology 88,632-640,(2010).

Purcell,W.M.,Doyle,K.M.,Westgate,C.&Atterwill,C.K.Characterisation ofa functional polyamine site on rat mast cells:association with a NMDAreceptor macrocomplex.Journal of neuroimmunology65,49-53(1996).

Read,G.W.Compound 48-80.Structure-activity relations and poly-THIQ,anew,more potent analog.Journal of medicinal chemistry 16,1292-1295(1973).

Robas,N.,Mead,E.&Fidock,M.MrgX2 is a high potency cortistatinreceptor expressed in dorsal root ganglion.The Journal of biologicalchemistry 278,44400-44404,(2003).

Sick,E.,Niederhoffer,N.,Takeda,K.,Landry,Y.&Gies,J.P.Activation ofCD47 receptors causes histamine secretion from mast cells.Cellular andmolecular life sciences:CMLS 66,1271-1282,(2009).

Siraganian,R.P.An automated continuous-flow system for the extractionand fluorometric analysis of histamine.Analytical biochemistry57,383-394(1974).

Subramanian,H.et al.beta-Defensins activate human mast cells via Mas-related gene X2.Journal of immunology 191,345-352,(2013).

Subramanian,H.,Gupta,K.,Guo,Q.,Price,R.&Ali,H.Mas-related gene X2(MrgX2)is a novel G protein-coupled receptor for the antimicrobial peptideLL-37in human mast cells:resistance to receptor phosphorylation,desensitization,and internalization.The Journal of biological chemistry286,44739-44749,(2011).

Taneike,T.,Miyazaki,H.,Oikawa,S.&Ohga,A.Compound 48/80elicitscholinergic contraction through histamine release in the chickoesophagus.General pharmacology 19,689-695(1988).

Tatemoto,K.et al.Immunoglobulin E-independent activation of mast cellis mediated by Mrg receptors.Biochemical and biophysical researchcommunications 349,1322-1328,(2006).

Tuvia,S.et al.Oral octreotide absorption in human subjects:comparablepharmacokinetics to parenteral octreotide and effective growth hormonesuppression.The Journal of clinical endocrinology and metabolism97,2362-2369,(2012).

Verschraegen,C.F.et al.Phase II study of cetrorelix,a luteinizinghormone-releasing hormoneantagonist in patients with platinum-resistantovarian cancer.Gynecologic oncology 90,552-559(2003).

Weigand,L.A.,Myers,A.C.,Meeker,S.&Undem,B.J.Mast cell-cholinergicnerve interaction in mouse airways.The Journal of physiology 587,3355-3362,(2009).

其它具体实施例

尽管本发明已经连同其详细说明书一起予以揭示，前述说明书倾向于例示性说明而非限制本发明范畴，本发明的范畴由权利要求书的范畴所界定。其它方面、优点和修饰处于权利要求书的范畴内。

本文中指代的专利和科技文献构建该领域技术人员可获得的知识。本文中引述的全部美国专利和已公开或未公开的美国专利申请案通过引用而并入本文。本文中引述的全部已公开的外国专利和专利申请案通过引用而并入本文。由本文中引述的保藏号表示的Genbank和NCBI保藏物通过引用而并入本文。本文中引述的全部其它已出版的参考文献、文档、手稿和科学文献通过引用而并入本文。

尽管已经参考本发明的优选具体实施例对本发明进行特定显示和揭示，但该领域技术人员应理解，可对本发明内容的形式和细节作出各种改变而不悖离由权利要求书所涵盖的本发明范畴。

Claims (23)

1.一种分离细胞，包含表达mas相关G蛋白偶联受体成员X2，即MrgprX2，或MrgprB2的重组核酸，以及表达GTP结合蛋白α15，即Gα15，的重组核酸。

2.如权利要求1所述的分离细胞，其中，该重组核酸表达MrgprX2。

3.如权利要求1所述的分离细胞，其中，该重组核酸表达MrgprB2。

4.如权利要求2所述的分离细胞，其中，该表达MrgprX2的重组核酸包含一个或多个突变。

5.如权利要求2所述的分离细胞，其中，该一个或多个突变产生不能活化信号转导通道的MrgprX2蛋白。

6.如权利要求3所述的分离细胞，其中，该表达MrgprB2的重组核酸包含一个或多个突变。

7.如权利要求3所述的分离细胞，其中，该一个或多个突变产生不能活化信号转导通道的MrgprB2蛋白。

8.如权利要求1所述的分离细胞，其中，该分离细胞包含人类胚胎肾293细胞，即HEK293。

9.一种MrgprB2或MrgprX2拮抗剂制备用于减轻对象体内通过给药化合物而诱发的假性过敏型反应严重性的药剂的用途。

10.如权利要求9所述的用途，其中，该拮抗剂包含抗体或其片段。

11.如权利要求9所述的用途，其中，该拮抗剂包含结合蛋白。

12.如权利要求9所述的用途，其中，该拮抗剂包含多肽。

13.如权利要求9所述的用途，其中，该拮抗剂包含小分子。

14.如权利要求9所述的用途，其中，该拮抗剂包含核酸分子。

15.如权利要求14所述的用途，其中，该核酸分子包含双链核糖核酸，即dsRNA、小发夹RNA或短发夹RNA，即shRNA、或反义RNA、或其任意部位。

16.如权利要求9所述的用途，其中，所述拮抗剂在给药该化合物之前、同时或之后给药至该对象。

17.如权利要求9所述的用途，其中，该拮抗剂是外用给药、口服给药、经吸入给药或经注射给药。

18.一种MrgprB2或MrgprX2拮抗剂制备用于治疗对象体内假性过敏型反应的药剂的用途。

19.一种确定化合物是否诱发假性过敏型反应的方法，该方法包含：

令如权利要求1所述的分离细胞与备选化合物接触，

检测MrgprX2或MrgprB2的活化，其中，MrgprX2或MrgprB2的活化决定该备选化合物诱发了假性过敏型反应。

20.如权利要求19所述的方法，其中，MrgprX2或MrgprB2的活化由鉴别细胞内钙的增加而检测。

21.如权利要求19所述的方法，其中，该备选化合物选自由亮丙瑞林、戈舍瑞林、组氨瑞林、曲普瑞林、西曲瑞克、加尼瑞克、地加瑞克、奥曲肽、兰瑞肽、帕瑞肽、舍莫瑞林、替莫瑞林、艾替班特、醋酸格拉替雷、特立帕肽、普兰林肽、博来霉素、艾塞那肽、胰高血糖素、利拉鲁肽、恩夫韦地、和粘杆菌素所组成的群组。

22.如权利要求19所述的方法，其中，该备选化合物选自由琥珀酰胆碱、筒箭毒碱、阿曲库铵、美维库铵、和罗库溴铵组成的群组。

23.一种鉴别MrgprX2或MrgprB2拮抗剂的方法，包含：

令如权利要求1所述的分离细胞与诱发假性过敏型反应的化合物接触，

令如权利要求1所述的分离细胞与备选拮抗剂接触，

检测MrgprX2或MrgprB2的活化，其中，该MrgprX2或MrgprB2的活化相对于不存在该化合物的情况下该MrgprX2或MrgprB2的活化的降低决定了该备选化合物是拮抗剂。

Images