JPWO2006118328A1 - 脱顆粒抑制剤 - Google Patents

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和宏 大儀
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Abstract

本発明は、（ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩および（ｂ）該蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンドを用いることを特徴とする、肥満細胞の脱顆粒抑制剤のスクリーニング方法／スクリーニング用キット、該スクリーニングによって得られる肥満細胞の脱顆粒抑制剤などを提供する。

Description

本発明は、ＴＧＲ１２または肥満細胞と、ＴＧＲ１２のリガンドとを用いる脱顆粒抑制剤などのスクリーニング方法およびスクリーニング用キット、該スクリーニング方法またはキットによって得られうる脱顆粒抑制剤などに関する。
肥満細胞は、抗体に感作された後、抗原刺激を受けると脱顆粒を起こし、ヒスタミン、ロイコトリエン、セロトニンなどのケミカルメディエーターを放出し、Ｉ型アレルギー反応に深く関与している。肥満細胞は抗原刺激後、種々のサイトカインを分泌し、Ｔ細胞や好酸球の機能に影響を与え、免疫調節細胞としても重要である。肥満細胞は末梢神経終末に近接して存在しており、サブスタンスＰ（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ）、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）などの神経性因子の影響を直接的に受けて、脱顆粒反応を引き起こすと考えられている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８４巻、２９７５−２９７９頁、１９８７年；Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｒｅｓ．、２８５巻、３４１−３４６頁、１９９３年）。さらに、近年、ストレスや神経性因子とアレルギー性疾患の発症および増悪には深い相関関係があると考えられている。例えば、ストレスをかけたマウスの皮膚において神経細胞の移入が起こり、肥満細胞の脱顆粒を引き起こすことが報告されている（Ｂｒａｉｎ Ｂｅｈａｖ．Ｉｍｍｕｎ．、１９巻。２５２−２６２頁、２００５年）。アトピー性皮膚炎患者において、局所ならびに血中におけるサブスタンスＰおよび神経成長因子（ＮＧＦ）量と、その病態の重症度に深い相関関係があることが報告されている（Ｂｒ．ｈ Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、１４７巻、７１−７９頁、２００２年）。アトピー性皮膚炎患者において、病変部位における肥満細胞数が増大していることも知られている（Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｒｅｓ．、２８９巻、２５６−２６０頁、１９９７年）。サブスタンスＰは、神経細胞だけでなく肥満細胞においても産生、放出されるので、オートクライン的にも作用すると考えられる（Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｒｅｓ．、２９２巻、４１８−４２１頁、２０００年）。肥満細胞はアレルギー性疾患に限らず、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、間質性膀胱炎などの病態に深く関与していると考えられており、神経性因子がこれらの疾患の発症および増悪に関与していると考えられる（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１２６巻、６９３−７０２頁、２００４年；Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｏｒｌ．、４０巻、１２９−１４０頁、２００５年；Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２７９巻、Ｇ１２９８−Ｇ１３０６頁、２０００年；Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２８３巻、Ｆ６１６−Ｆ６２９頁、２００２年）。
Ｇ−タンパク質共役型受容体であるヒトＴＧＲ１２（配列番号：１）は、ＭＲＧＸ２、ＧＰＣＲｘ１１、ＧＰＣＲ４４などの別名が知られている。ＭＲＧＸ２は、コルチスタチン（ｃｏｒｔｉｓｔａｔｉｎ）、ソマトスタチン、ＢＡＭ（ｂｏｖｉｎｅ ａｄｒｅｎａｌ ｍｅｄｕｌｌａｐｅｐｔｉｄｅ）１３−２２、αメラニン細胞刺激ホルモン（αＭＳＨ）、ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ ＦＦ、ダイノルフィンＡ（ｄｙｎｏｒｐｈｉｎ Ａ）およびサブスタンスＰによって活性化されること、ＭＲＧＸ２のアゴニストまたはアンタゴニストが、睡眠障害、疼痛、脳梗塞、記憶障害、糖尿病、癌、肥満症、心疾患、鬱病、性機能障害、尿路・膀胱疾患、感染症治療、消化器疾患などの治療薬となりうることなどが報告されている（ＷＯ ０３／０７３１０７号公報）。ＧＰＣＲｘ１１にａｎｇｉｏｐｅｐｔｉｎが特異的に反応したことが報告されている（ＷＯ ０１／９８３３０号公報）。さらに、ＭＲＧＸ２に、ＰＡＭＰ−１２（ｐｒｏａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ２０ ｐｅｐｔｉｄｅの９−２０位）がアゴニスト作用を示したこと、ＭＲＧＸ２が後根神経節（ＤＲＧ）のＣ繊維に特異的に発現していることが報告されている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、３３０巻、１１４６−１１５２頁、２００５年）。また、ＭＲＧＸ２が、ヒト臍帯血由来肥満細胞において発現していること、ＩｇＥによって発現が変動することが報告されている（ＷＯ ２００５／０２８６６７号公報）ものの、肥満細胞におけるＭＲＧＸ２の発現量の定量的な値およびヒト肥満細胞株であるＬＡＤ２における発現に関する報告はない。
ヒト肥満細胞がサブスタンスＰに反応し、脱顆粒促進作用（Ｂｌｏｏｄ、９７巻、２０４５−２０５２頁、２００１年）、エイコサノイド産生作用（Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２４巻、１５０−１５６頁、２００１年）およびＩＬ−４、ＩＬ−８やＴＮＦαなどのサイトカイン産生作用（Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、１３１巻、３４８−３５３頁、１９９４年；Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１７巻、４８−５１頁、１９９４年；Ｅｘｐ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、１０巻、３１２−３２０頁、２００１年）を有することが知られているが、これらは受容体を介さない非特異的反応（Ｍ．Ｍｏｕｓｌｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ ｌｅｔｔ、２５９巻（２）、２６０−２６２頁、１９９０年１月；Ｒ．Ｓａｂａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２８３巻、Ｆ６１６−Ｆ６２９、２００２年５月；Ａ．Ｈ．Ｙ．Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４１４巻、２９５−３０３頁、２００１年；Ｄ．Ｌｏｒｅｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２巻、５７７−５９１頁、１９９８年１１月）、あるいはサブスタンスＰ高親和性受容体、ＮＫ−１受容体を介しているもの（Ｓ．Ｇｕｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６３巻、９２−１０１頁、２００５年４月）と考えられてきた。
ラット腹腔肥満細胞またはヒト皮膚肥満細胞が、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）に反応し、脱顆粒促進作用（Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｒｅｓ．、４７巻、４８８−４９２頁、１９９８年；Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８６５巻、１４１−１４６頁、１９９８年）を、マウスにおいて皮膚炎惹起作用（Ｒｅｇｌｕｌ．Ｐｅｐｔ．、８２巻、６５−６９頁、１９９９年）を示すことが知られているが、肥満細胞におけるＰＡＣＡＰ受容体の発現量に関する報告はない。
ヒト皮膚肥満細胞が、血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）に反応し、脱顆粒促進作用（Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、９５巻、１２１−１３０頁、１９８８年）を示すことが知られているが、肥満細胞におけるＶＩＰ受容体の発現量に関する報告はない。
優れた肥満細胞の脱顆粒抑制剤、さらには優れた免疫疾患、呼吸器疾患、泌尿器疾患または循環器疾患の予防・治療剤の開発が望まれていた。
本発明者たちは上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＴＧＲ１２発現ＣＨＯ細胞株に対して、サブスタンスＰ、コルチスタチン−１７、ＰＡＭＰ−１２、ＰＡＣＡＰ−２７、ＰＡＣＡＰ−３８および血管作動性腸管ペプチドが細胞内カルシウム上昇作用を示すこと、ヒトＴＧＲ１２がヒト肥満細胞において非常に多く発現しており、サブスタンスＰに反応する高親和性受容体ＮＫ１受容体、サブスタンスＰに反応する低親和性受容体ＮＫ２受容体ならびにＮＫ３受容体、およびＰＡＣＡＰに反応するＶＩＰ１受容体、ＶＩＰ２受容体ならびにＰＡＣＡＰ受容体が、ヒト肥満細胞にほとんど発現していないこと、ヒトの肥満細胞株であるＬＡＤ２をサブスタンスＰ、コルチスタチン−１７、ＰＡＭＰ−１２、ＰＡＣＡＰ−２７、ＰＡＣＡＰ−３８およびＶＩＰで刺激することにより脱顆粒反応が促進すること、またＬＡＤ２におけるサブスタンスＰ依存的脱顆粒反応がＮＫ１受容体アンタゴニストで阻害されないことを見出し、これらのことからヒト肥満細胞のサブスタンスＰを含む神経ペプチド依存的脱顆粒にはＴＧＲ１２が関与していることを見出した。これらの知見に基づいて、本発明者らは、ＴＧＲ１２アンタゴニストが肥満細胞の脱顆粒抑制剤となり、肥満細胞の脱顆粒抑制剤の簡便なスクリーニング法を提供することを見出し、鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
本発明は、
〔１〕 （ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩および（ｂ）該蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンドを用いることを特徴とする、肥満細胞の脱顆粒抑制剤のスクリーニング方法、
〔２〕 リガンドが、サブスタンスＰ、コルチスタチン、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ；ＰＡＣＡＰ）、血管作動性腸管ペプチド（ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ；ＶＩＰ）またはｐｒｏａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ２０ ｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＡＭＰ）である上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔２ａ〕 リガンドが、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドである上記〔２〕記載のスクリーニング方法、
〔３〕 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を介した細胞刺激活性を測定し、指標とする上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔４〕 （ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩および（ｂ）該蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンドを用いことを特徴とする、ヒト肥満細胞における脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドによる脱顆粒を抑制する作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
〔５〕 （ｉ）（ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、（ｂ）該蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンドとを、試験化合物の非存在下接触させ、前記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する前記リガンドの結合量を測定する工程、
（ｉｉ）（ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、（ｂ）該蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンドとを、試験化合物の存在下接触させ、前記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する前記リガンドの結合量を測定する工程、および
（ｉｉｉ）工程（ｉ）と工程（ｉｉ）との間で、前記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する前記リガンドの結合量を比較し、工程（ｉ）における結合量よりも工程（ｉｉ）における結合量の方が低い場合に、前記試験化合物を肥満細胞の脱顆粒抑制剤として選択する工程を含む上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔６〕 工程（ｉｉ）における結合量が工程（ｉ）における結合量の５０％以下の場合に、前記試験化合物を肥満細胞の脱顆粒抑制剤として選択する、上記〔５〕記載のスクリーニング方法、
〔７〕 （ｉ）（ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、（ｂ）該蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンドとを、試験化合物の非存在下接触させ、前記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する前記リガンドの結合量を測定する工程、
（ｉｉ）（ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、（ｂ）該蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンドとを、試験化合物の存在下接触させ、前記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する前記リガンドの結合量を測定する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉ）と工程（ｉｉ）との間で、前記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する前記リガンドの結合量を比較し、工程（ｉ）における結合量よりも工程（ｉｉ）における結合量の方が低い場合の試験化合物を選択する工程、および
（ｉｖ）前記（ｉｉｉ）で得られた試験化合物を肥満細胞に接触させ、脱顆粒を抑制する試験化合物を選択する工程を含む上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔７ａ〕 リガンドが、サブスタンスＰ、コルチスタチン、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ；ＰＡＣＡＰ）、血管作動性腸管ペプチド（ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ；ＶＩＰ）またはｐｒｏａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ２０ ｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＡＭＰ）である上記〔４〕〜〔７〕のいずれか記載のスクリーニング方法、
〔７ｂ〕 リガンドが、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドである上記〔７ａ〕記載のスクリーニング方法、
〔８〕 肥満細胞の脱顆粒抑制剤が、免疫疾患、泌尿器疾患、消化器疾患または呼吸器疾患の予防・治療剤である上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔９〕 （ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩および（ｂ）該蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンドを含有することを特徴とする、肥満細胞の脱顆粒抑制剤のスクリーニング用キット、
〔１０〕 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対するアンタゴニストを含有してなる肥満細胞の脱顆粒抑制剤、
〔１１〕 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる肥満細胞の脱顆粒抑制剤、
〔１２〕 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる免疫疾患、泌尿器疾患、消化器疾患または呼吸器疾患の診断薬、
〔１３〕 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩のアゴニストに対する抗体を含有してなる肥満細胞の脱顆粒抑制剤、
〔１４〕 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる免疫疾患、泌尿器疾患、消化器疾患または呼吸器疾患の診断薬、
〔１５〕 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的なまたは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、または（ｉｉ）該蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含有してなる肥満細胞の脱顆粒抑制剤、
〔１６〕 肥満細胞の脱顆粒抑制剤が、免疫疾患、泌尿器疾患、消化器疾患または呼吸器疾患の予防・治療剤である上記〔１０〕、〔１１〕、〔１３〕または〔１５〕記載の抑制剤、
〔１７〕 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性または該蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンドの活性を阻害することを特徴とする肥満細胞の脱顆粒抑制方法、
〔１８〕 肥満細胞および配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンドを用いることを特徴とする、肥満細胞の脱顆粒抑制剤のスクリーニング方法、
〔１９〕 （ｉ）肥満細胞と、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンドとを、試験化合物の非存在下接触させ、前記肥満細胞に対する前記リガンドの結合量を測定する工程、
（ｉｉ）肥満細胞と、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンドとを、試験化合物の存在下接触させ、前記肥満細胞に対する前記リガンドの結合量を測定する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉ）における結合量よりも工程（ｉｉ）における結合量の方が低い場合の試験化合物を選択する工程、および
（ｉｖ）前記（ｉｉｉ）で得られた試験化合物を肥満細胞に接触させ、脱顆粒を抑制する試験化合物を選択する工程を含む上記〔１８〕記載のスクリーニング方法、
〔２０〕 肥満細胞および配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンドを含有することを特徴とする、肥満細胞の脱顆粒抑制剤のスクリーニング用キット、
〔２１〕 哺乳動物に対して、（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対するアンタゴニスト、（ｉｉ）該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、または（ｉｉｉ）該蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的なまたは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチドの有効量を投与することを特徴とする肥満細胞の脱顆粒抑制方法、
〔２２〕 肥満細胞の脱顆粒抑制剤を製造するための、（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対するアンタゴニスト、（ｉｉ）該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、または（ｉｉｉ）該蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的なまたは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチドの使用などを提供する。
さらには、
〔２３〕 （ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩および（ｂ）脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ；ＰＡＣＡＰ）を用いことを特徴とする、前記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドとの間の結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
〔２４〕 （ｉ）（ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、（ｂ）脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドとを、試験化合物の非存在下接触させ、前記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドの結合量を測定する工程、
（ｉｉ）（ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、（ｂ）脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドとを、試験化合物の存在下接触させ、前記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドの結合量を測定する工程、および
（ｉｉｉ）工程（ｉ）と工程（ｉｉ）との間で、前記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドの結合量を比較し、工程（ｉ）における結合量から工程（ｉｉ）における結合量が変化している場合に、前記試験化合物を選択する工程を含む上記〔２３〕記載のスクリーニング方法、
〔２５〕 前記脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドが、ＰＡＣＡＰ−２７またはＰＡＣＡＰ−３８である上記〔２３〕または〔２４〕記載のスクリーニング方法、
〔２６〕 （ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩および（ｂ）脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドを含有することを特徴とする、前記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドとの間の結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット
〔２７〕 （ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩および（ｂ）該蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンドを用いることを特徴とする、エイコサノイド（例、ロイコトリエン、プロスタグランジン）産生抑制剤、サイトカイン産生抑制剤、肥満細胞増殖抑制剤または肥満細胞活性化抑制剤（例、ＭＡＰＫ活性化抑制剤なども含む）のスクリーニング方法、
〔２８〕 リガンドが、サブスタンスＰ、コルチスタチン、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド、血管作動性腸管ペプチドまたはｐｒｏａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ２０ ｐｅｐｔｉｄｅである上記〔２７〕記載のスクリーニング方法、
〔２９〕 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を介した細胞刺激活性を測定し、指標とする上記〔２７〕記載のスクリーニング方法、
〔３０〕 抑制剤が、免疫疾患、泌尿器疾患、消化器疾患または呼吸器疾患の予防・治療剤である上記〔２７〕記載のスクリーニング方法、
〔３１〕 （ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩および（ｂ）該蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンドを含有することを特徴とする、エイコサノイド（例、ロイコトリエン、プロスタグランジン）産生抑制剤、サイトカイン産生抑制剤、肥満細胞増殖抑制剤または肥満細胞活性化抑制剤（例、ＭＡＰＫ活性化抑制剤なども含む）のスクリーニング用キット、
〔３２〕 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対するアンタゴニストを含有してなるエイコサノイド（例、ロイコトリエン、プロスタグランジン）産生抑制剤、サイトカイン産生抑制剤、肥満細胞増殖抑制剤または肥満細胞活性化抑制剤（例、ＭＡＰＫ活性化抑制剤なども含む）、
〔３３〕 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなるエイコサノイド（例、ロイコトリエン、プロスタグランジン）産生抑制剤、サイトカイン産生抑制剤、肥満細胞増殖抑制剤または肥満細胞活性化抑制剤（例、ＭＡＰＫ活性化抑制剤なども含む）、
〔３４〕 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩のアゴニストに対する抗体を含有してなるエイコサノイド（例、ロイコトリエン、プロスタグランジン）産生抑制剤、サイトカイン産生抑制剤、肥満細胞増殖抑制剤または肥満細胞活性化抑制剤（例、ＭＡＰＫ活性化抑制剤なども含む）、
〔３５〕 （ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的なまたは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、または（ｉｉ）該蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含有してなるエイコサノイド（例、ロイコトリエン、プロスタグランジン）産生抑制剤、サイトカイン産生抑制剤、肥満細胞増殖抑制剤または肥満細胞活性化抑制剤（例、ＭＡＰＫ活性化抑制剤なども含む）、
〔３６〕 抑制剤が、免疫疾患、泌尿器疾患、消化器疾患または呼吸器疾患の予防・治療剤である上記〔３２〕、〔３３〕、〔３４〕または〔３５〕記載の抑制剤、
〔３７〕 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性または該蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンドの活性を阻害することを特徴とするエイコサノイド（例、ロイコトリエン、プロスタグランジン）産生抑制方法、サイトカイン産生抑制方法、肥満細胞増殖抑制方法または肥満細胞活性化抑制方法、
〔３８〕 肥満細胞および配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンドを用いることを特徴とする、エイコサノイド（例、ロイコトリエン、プロスタグランジン）産生抑制剤、サイトカイン産生抑制剤、肥満細胞増殖抑制剤または肥満細胞活性化抑制剤（例、ＭＡＰＫ活性化抑制剤なども含む）のスクリーニング方法、
〔３９〕 肥満細胞および配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンドを含有することを特徴とする、エイコサノイド（例、ロイコトリエン、プロスタグランジン）産生抑制剤、サイトカイン産生抑制剤、肥満細胞増殖抑制剤または肥満細胞活性化抑制剤（例、ＭＡＰＫ活性化抑制剤なども含む）のスクリーニング用キット、
〔４０〕 哺乳動物に対して、（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対するアンタゴニスト、（ｉｉ）該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、または（ｉｉｉ）該蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的なまたは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチドの有効量を投与することを特徴とするエイコサノイド（例、ロイコトリエン、プロスタグランジン）産生抑制方法、サイトカイン産生抑制方法、肥満細胞増殖抑制方法または肥満細胞活性化抑制方法、
〔４１〕 エイコサノイド（例、ロイコトリエン、プロスタグランジン）産生抑制剤、サイトカイン産生抑制剤、肥満細胞増殖抑制剤または肥満細胞活性化抑制剤（例、ＭＡＰＫ活性化抑制剤なども含む）を製造するための、（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対するアンタゴニスト、（ｉｉ）該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、または（ｉｉｉ）該蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的なまたは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチドの使用などを提供する。
以下、「配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分ペプチドもしくはその塩」を「本発明の受容体」と略記する場合がある。さらに、「本発明の受容体と特異的に結合する能力を有するリガンド」を「本発明のリガンド」と略記する場合がある。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、網膜細胞、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、網膜、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など、または血球系の細胞もしくはその培養細胞（例、ＭＥＬ、Ｍ１、ＣＴＬＬ−２、ＨＴ−２、ＷＥＨＩ−３、ＨＬ−６０、ＪＯＳＫ−１、Ｋ５６２、ＭＬ−１、ＭＯＬＴ−３、ＭＯＬＴ−４、ＭＯＬＴ−１０、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＴＡＬＬ−１、Ｊｕｒｋａｔ、ＣＣＲＴ−ＨＳＢ−２、ＫＥ−３７、ＳＫＷ−３、ＨＵＴ−７８、ＨＵＴ−１０２、Ｈ９、Ｕ９３７、ＴＨＰ−１、ＨＥＬ、ＪＫ−１、ＣＭＫ、Ｋ０−８１２、ＭＥＧ−０１、ＬＡＤ１、ＬＡＤ２など）に由来する蛋白質であってもよく、合成蛋白質であってもよい。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用、細胞刺激活性などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。したがって、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用、細胞刺激活性などの活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度や蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用、細胞刺激活性などの活性の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができる。
また、本発明の蛋白質としては、（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、または（ｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども用いられる。
本発明の受容体の部分ペプチド（以下、本発明の部分ペプチドと称する場合がある）としては、後述の医薬等のスクリーニング方法に用いることのできる部分ペプチドであれば、いかなるものであってもよく、例えば、本発明の蛋白質分子のうち、細胞膜の外に露出している部位であって、実質的に同質のリガンド結合活性などを有するものなどが用いられる。
具体的には、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するレセプター蛋白質の部分ペプチドとしては、疎水性プロット解析において細胞外領域（親水性（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）部位）であると分析された部分を含むペプチドである。また、疎水性（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでもよい。
本発明の部分ペプチドのアミノ酸の数は、本発明の蛋白質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。
ここで、「実質的に同質の活性」とは、上記と同意義を示す。「実質的に同質の活性」の測定は上記と同様に行なうことができる。
また、本発明の部分ペプチドは、（ｉ）上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失し、（ｉｉ）上記アミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加し、または（ｉｉｉ）上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
具体例としては、配列番号：１で表される配列の第１〜２７番目、第５１〜６９番目、第９３〜１０２番目、第１２６〜１４４番目、第１６８〜１８５番目、第２０９〜２２３番目、第２４７〜２５９番目および第２８３〜３３０番目のアミノ酸配列を含む部分ペプチドなどが用いられる。
本発明の受容体および本発明の部分ペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。Ｃ末端はカルボキシ（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキルもしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキルなどのＣ７−１４アラルキルのほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチルなどが用いられる。
本発明の受容体および本発明の部分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシ（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシがアミド化またはエステル化されているものも、本発明の受容体および本発明の部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明の受容体および本発明の部分ペプチドには、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル、アセチルなどのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシルなど）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル、アセチルなどのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシルなど）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
本発明の受容体または本発明の部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
本発明のリガンドとしては、本発明の受容体と特異的に結合するものであれば、何れの物であってもよい。例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合の解離定数が１０μＭ以下、好ましくは２μＭ以下、さらに好ましくは１μＭ以下、特に好ましくは２００ｎＭ以下、最も好ましくは１００ｎＭ以下である物などが挙げられる。
本発明のリガンドとしては、例えば、サブスタンスＰ、ＰＡＣＡＰ（例、ＰＡＣＡＰ−２７、ＰＡＣＡＰ−３８など）、ＶＩＰ、コルチスタチン（例、コルチスタチン−１４、コルチスタチン−１７など））、ＰＡＭＰ（例、ＰＡＭＰ−１２、ＰＡＭＰ−２０など）、ソマトスタチン（例、ソマトスタチン３−１４、ソマトスタチン３−１０、ソマトスタチン−１４、ソマトスタチン−２８、ソマトスタチン７−１４、Ｄ−Ｔｒｐ−ソマトスタチン、シクロソマトスタチン、ソマトスタチン２−９など）、ＢＡＭ（例、ＢＡＭ１３−２２、ＢＡＭ−２２など）、αメラニン細胞刺激ホルモン（例、ＨＳ０２４−αＭＳＨ（３−１１）ａｍｉｄｅなど）、ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ ＦＦ、ダイノルフィンＡ、オキシトシン（例、（Ｓｅｒ４，Ｉｌｅ８）−オキシトシンなど）、バソプレッシン（例、［Ａｒｇ８］−バソプレッシンなど）、ａｎｇｉｏｐｅｐｔｉｎなどが用いられる。好ましくは、サブスタンスＰ、ＰＡＣＡＰ（例、ＰＡＣＡＰ−２７、ＰＡＣＡＰ−３８など）、ＶＩＰ、コルチスタチン（例、コルチスタチン−１７など）、ＰＡＭＰ（例、ＰＡＭＰ−１２、ＰＡＭＰ−２０など）などが用いられる。
標識したリガンドも、本発明のリガンドに含まれる。
標識物質としては、放射性同位元素（例、〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、〔３２Ｐ〕、〔３３Ｐ〕、〔３５Ｓ〕など）、蛍光物質（例、フルオレセインなど）、発光物質（例、ルミノールなど）、酵素（例、ペルオキシダーゼなど）、ランタニド元素などがあげられる。中でも、放射性同位元素が好ましい。さらに〔１２５Ｉ〕が好ましい。
標識したリガンドとして好ましくは、放射性同位元素〔１２５Ｉ〕などで標識された［Ｔｙｒ８］−サブスタンスＰ、［Ｔｙｒ０］−コルチスタチン−１４、ＰＡＭＰ、ソマトスタチン、ＢＡＭ、αメラニン細胞刺激ホルモン、ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ ＦＦ、ダイノルフィンＡ、オキシトシン、バソプレッシンなどが挙げられる。
リガンドの塩も、本発明のリガンドに含まれる。塩としては、例えば金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。金属塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩などのアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ′−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
このうち、薬学的に許容し得る塩が好ましい。例えば、化合物内に酸性官能基を有する場合にはアルカリ金属塩（例、ナトリウム塩，カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（例、カルシウム塩，マグネシウム塩，バリウム塩など）などの無機塩、アンモニウム塩など、また、化合物内に塩基性官能基を有する場合には、例えば臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸など無機酸との塩、または酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などの有機酸との塩が挙げられる。
本発明の受容体および本発明の部分ペプチドは、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から自体公知のポリペプチドの精製方法によって製造することもできるし、後述するポリペプチドをコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。例えば、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、５６巻、１２−２１頁、１９９９年、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１４４６巻、５７−７０頁、１９９９年などに記載の方法またはこれに準じた方法により、製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
本発明の受容体または部分ペプチドもしくはそれらの塩の合成には、通常、市販のポリペプチド合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２′，４′−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２′，４′−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などをあげることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするポリペプチドの配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からポリペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のポリペプチド、受容体、部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、ポリペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ′−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ′−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ポリペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はポリペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ぺンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ１−６）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
本発明の受容体または部分ペプチドを得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（ポリペプチド）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたポリペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したポリペプチドとを製造し、この両ポリペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ポリペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ポリペプチドを得ることができる。この粗ポリペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の受容体またはその部分ペプチドのアミド体を得ることができる。
本発明の受容体または部分ペプチドもしくはそれらの塩のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、受容体またはその部分ペプチトのアミド体と同様にして、所望の受容体またはその部分ペプチドのエステル体を得ることができる。
本発明の受容体または部分ペプチドは、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは受容体の部分ペプチドについては、受容体を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明受容体または部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（ｉ）〜（ｖ）に記載された方法があげられる。
（ｉ）Ｍ．ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド・シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６６年）
（ｉｉ）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ・ペプチド（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６５年）
（ｉｉｉ）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株） （１９７５年）
（ｉｖ）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座 １、 タンパク質の化学ＩＶ、 ２０５、（１９７７年）
（ｖ）矢島治明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶などを組み合わせて本発明の受容体または部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる受容体または部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
本発明の受容体または部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、前述した本発明の受容体または部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。このうちＤＮＡが好ましく、該ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりｔｏｔａｌ ＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
本発明の受容体をコードするＤＮＡとしては、例えば配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する受容体をコードするＤＮＡなどであれば何れのものでもよい。
配列番号：２で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２で表される塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有する受容体をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、本発明の受容体の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。具体的には、配列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号：２で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する受容体をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２で表される塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
本発明の受容体または部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）は、自体公知の方法で標識化されていてもよい。標識物質としては、放射性同位元素、蛍光物質（例、フルオレセインなど）、発光物質、酵素、ビオチン、ランタニド元素などがあげられる。
本発明の受容体または部分ペプチドを完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明の受容体または部分ペプチドの部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いて自体公知のＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明の受容体または部分ペプチドの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
ＤＮＡの塩基配列の変換は、公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化された受容体をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明の受容体または部分ペプチドの発現ベクターは、例えば、（ａ）本発明の受容体または部分ペプチドをコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ｂ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウィルス，ワクシニアウィルス，バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＩＶ・ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどがあげられる。
これらのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウィルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等があげられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明の受容体のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明の受容体または部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０巻，１６０（１９６８）〕，ＪＭ１０３〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９巻，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２０巻，５１７（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１巻，４５９（１９６９）〕，Ｃ６００〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９巻，４４０（１９５４）〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔Ｇｅｎｅ，２４巻，２５５（１９８３）〕，２０７−２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７（１９８４）〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＫＭ７１などが用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、ウィルスがＡｃＮＰＶの場合は、ヨトウガの幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウィルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｎ 細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｉｎ Ｖｉｖｏ，１３，２１３−２１７，（１９７７））などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、Ｎａｔｕｒｅ，３１５巻，５９２（１９８５）〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７（ＣＯＳ７），Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９巻，２１１０（１９７２）やＧｅｎｅ，１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８巻，１１１（１９７９）などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５巻，１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８ 新細胞工学実験プロトコール ２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、受容体または部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがあげられる。また、酵母エキス、ビタミン類、成長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４３１−４３３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ１９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｂｏｓｔｉａｎ，Ｋ．Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７巻，４５０５（１９８０）］や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｂｉｔｔｅｒ，Ｇ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１巻，５３３０（１９８４）〕があげられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ′ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ，Ｔ．Ｃ．Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２巻，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８巻，３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ １９９巻，５１９（１９６７）〕，１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３巻，１（１９５０）〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外などに本発明の受容体または部分ペプチドを生成せしめることができる。
上記培養物から本発明の受容体または部分ペプチドを分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
本発明の受容体または部分ペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりポリペプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にポリペプチドが分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる受容体または部分ペプチドの精製は、自体公知の分離・精製法を適宜組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
かくして得られる受容体または部分ペプチドが遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生する受容体または部分ペプチドを、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
本発明の受容体と特異的に結合する能力を有するリガンドは、市販されている場合には市販品をそのまま用いることもでき、自体公知の方法またはこれらに準じた方法に従って抽出または製造することもできる。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体（以下、単に本発明の抗体と称する場合がある）は、本発明の受容体に対する抗体を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。本発明の受容体に対する抗体としては、受容体のシグナル伝達を不活性化する抗体、受容体のシグナル伝達を活性化する抗体などが挙げられる。
本発明の受容体に対する抗体は、本発明の受容体を抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明の受容体は、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリがあげられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化ポリペプチドと抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６、４９５（１９７５）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどがあげられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄腫細胞があげられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、ポリペプチド（蛋白質）抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したポリペプチドを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などがあげられる。
モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（ポリペプチド抗原）自体、あるいはそれとキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行い、該免疫動物から本発明の受容体に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）としては、該ポリヌクレオチドに相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有し、該ポリヌクレオチドの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのポリヌクレオチド（アンチセンスポリヌクレオチド）であってもよい。
具体的には、本発明の受容体をコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）（以下、これらのＤＮＡを本発明のＤＮＡと略記する場合がある）に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスＤＮＡ（以下、これらのＤＮＡをアンチセンスＤＮＡと略記する場合がある）が挙げられ、本発明のＤＮＡに相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスＤＮＡであってもよい。
本発明のＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などがあげられる。特に、本発明のＤＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、本発明の受容体のＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスＤＮＡが好適である。これらのアンチセンスＤＮＡは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
具体的には、配列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に相補的な、もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチドなどが挙げられる。好ましくは例えば、配列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に相補な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチドなどが挙げられる。
アンチセンスポリヌクレオチドは通常、１０〜４０個程度、好ましくは１５〜３０個程度の塩基から構成される。
ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスＤＮＡを構成する各ヌクレオチドのりん酸残基（ホスフェート）は、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾りん酸残基に置換されていてもよい。これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
本発明に従えば、本発明の受容体遺伝子の複製または発現を阻害することのできるアンチセンスポリヌクレオチド（核酸）を、クローン化した、あるいはアミノ酸が決定された蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。かかるポリヌクレオチド（核酸）は、本発明の受容体遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成または機能を阻害することができるか、あるいは本発明の受容体関連ＲＮＡとの相互作用を介して本発明の受容体遺伝子の発現を調節・制御することができる。本発明の受容体関連ＲＮＡの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、および本発明の受容体関連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内および生体外で本発明の受容体遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列または核酸とペプチド（蛋白質）との間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核酸）の配列またはその相補体から誘導される指令にあるペプチド（蛋白質）のアミノ酸を通常指している。蛋白質遺伝子の５′端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、蛋白質翻訳終止コドン、蛋白質コード領域、ＯＲＦ翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域，３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、蛋白質遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係は、対象物とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、「アンチセンス」であるということができる。アンチセンスポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販の蛋白質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えば蛋白質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレート化合物（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチド（核酸）は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンスヌクレオチドは次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンスヌクレオチドをより安定なものにする、アンチセンスヌクレオチドの細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンスヌクレオチドの毒性をより小さなものにする。
こうした修飾は当該分野で数多く知られており、例えばＪ．Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｔｅｃｈ Ｊａｐａｎ，Ｖｏｌ．８，ｐｐ．２４７，１９９２；Ｖｏｌ．８，ｐｐ．３９５，１９９２；Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．ｅｄ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３などに開示がある。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３′端あるいは５′端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３′端あるいは５′端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンスヌクレオチドの阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいは本発明の受容体の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸は公知の各種の方法で細胞に適用できる。
以下に、（ｉ）本発明の受容体、（ｉｉ）本発明の受容体をコードするポリヌクレオチド（本発明のポリヌクレオチド）、（ｉｉｉ）本発明の受容体に対する抗体（本発明の抗体）、（ｉｖ）本発明の受容体のアンチセンスポリヌクレオチド（例、本発明のアンチセンスＤＮＡ）、（ｖ）本発明の受容体に特異的に結合する能力を有するリガンド（本発明のリガンド）などの用途を説明する。
〔１〕肥満細胞の脱顆粒抑制作用、エイコサノイド産生抑制作用、サイトカイン産生抑制作用、肥満細胞増殖抑制作用、肥満細胞活性化抑制作用などを有する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明のリガンドは、肥満細胞の脱顆粒促進作用、エイコサノイド（例、ロイコトリエン、プロスタグランジンなど）産生促進作用、サイトカイン（例、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１３、ＴＧＦ−βなど）産生促進作用、肥満細胞増殖促進作用、肥満細胞活性化（促進）作用などを有する。
本発明のリガンドや本発明の受容体の機能・活性（例、肥満細胞の脱顆粒促進作用、エイコサノイド産生促進作用、サイトカイン産生促進作用、肥満細胞増殖促進作用、肥満細胞活性化促進作用など）を阻害する化合物またはその塩は、例えば、肥満細胞の脱顆粒抑制剤、エイコサノイド産生抑制剤、サイトカイン産生抑制剤、肥満細胞増殖抑制剤、肥満細胞活性化抑制剤（例、ＭＡＰＫ活性化抑制剤なども含む）などとして有用であり、例えば、免疫疾患〔例、炎症性疾患（下垂体膿瘍、甲状腺炎、腹膜炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、結節性紅斑、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー（例、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、花粉症、金属アレルギーなど）、喘息、滲出性中耳炎、メニエール病、接触皮膚炎、アナフィラキシー、蕁麻疹、重症筋無力症、糸球体腎炎、シェーグレン症候群、バセドー病、インスリン抵抗性糖尿病、アトピー性皮膚炎、白血球異常など〕、泌尿器疾患（例、腎尿細管間質障害（繊維化）、間質性膀胱炎、アレルギー性膀胱炎など）、消化器疾患〔例、過敏性腸症候群、慢性肝疾患、食物アレルギー、アレルギー性腸炎、牛乳タンパク誘発性直腸炎、消化性潰瘍（例、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、吻合部潰瘍、Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ−Ｅｌｌｉｓｏｎ症候群など）、胃炎、逆流性食道炎、ＮＵＤ（Ｎｏｎ Ｕｌｃｅｒ Ｄｙｓｐｅｐｓｉａ）、胃ＭＡＬＴリンパ腫、非ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、胃酸過多、手術後ストレスによる胃酸過多および潰瘍など〕、呼吸器疾患〔例、慢性閉塞性肺疾患（例、慢性気管支炎、肺気腫）、びまん性汎細気管支炎、嚢胞性線維症、過敏性肺炎、突発性間質性肺炎、肺線維症など〕、循環器疾患（例、動脈硬化症、急性冠状動脈症候群、粥状硬化性大動脈瘤、心臓アナフィラキシー、心不全、心筋梗塞、狭心症、不整脈、深部静脈血栓症、ＰＴＣＡ後再狭窄など）、眼科疾患（例、翼状片、春期カタル、ドライアイなど）、癌（例、甲状腺乳頭癌、非小細胞性肺癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、胃癌、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、カポジ肉腫、肥満細胞種など）、脳梗塞、高脂血症、急性腎不全、糖尿病、肥満症、浮腫、肉芽種、アトピー性脊髄炎、神経線維腫、鼻粘膜過敏症、ホジキン病、子宮内膜増殖症などの予防・治療剤などとして使用できる。
肥満細胞の脱顆粒抑制剤として、好ましくは、免疫疾患、泌尿器疾患、消化器疾患、循環器疾患などの予防・治療剤が挙げられる。
エイコサノイド産生抑制剤として、好ましくは、免疫疾患などの予防・治療剤が挙げられる。
サイトカイン産生抑制剤として、好ましくは、免疫疾患などの予防・治療剤が挙げられる。
肥満細胞増殖抑制剤として、好ましくは、泌尿器疾患などの予防・治療剤が挙げられる。
肥満細胞活性化抑制剤（例、ＭＡＰＫ活性化抑制剤なども含む）として、好ましくは、消化器疾患などの予防・治療剤が挙げられる。
本発明の受容体を用い、または組換え型本発明の受容体の発現系を用いたリガンドレセプターアッセイ系を用いることにより、本発明の受容体と、本発明のリガンドとの結合性を変化させる化合物（例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など）またはその塩を効率よくスクリーニングすることができる。
該化合物またはその塩には、（ｉ）本発明の受容体を介して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ産生抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、リン脂質依存性プロテインキナーゼの活性化、マイトジェン活性化蛋白質リン酸化酵素（ＭＡＰキナーゼ）（例、ＥＲＫ１／２（ｐ４２／４４ ＭＡＰ キナーゼ）、ｐ３８ ＭＡＰＫ、ＪＮＫ／ＳＡＰＫ、ＥＲＫ５など）の活性化などを促進する活性など）を有する化合物（アゴニスト）、（ｉｉ）上記細胞刺激活性を有しない化合物（アンタゴニスト）、（ｉｉｉ）本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合力を促進する化合物、（ｉｖ）本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合力を阻害する化合物などが含まれる。
具体的には、（ｉ）本発明の受容体に、本発明のリガンドを接触させた場合と（ｉｉ）本発明の受容体に、本発明のリガンドおよび試験化合物を接触させた場合との比較を行なう。比較は、例えば、本発明の受容体に対する本発明のリガンドの結合量、細胞刺激活性などを測定して行う。
本発明のスクリーニング方法としての具体例としては、例えば、
（ａ）本発明のリガンドを本発明の受容体に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を本発明の受容体に接触させた場合における、本発明のリガンドの本発明の受容体に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（ｂ）本発明のリガンドを、本発明の受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、本発明のリガンドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、および
（ｃ）本発明の受容体が、本発明の受容体をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の受容体である上記（ｂ）記載のスクリーニング方法、
（ｄ）本発明のリガンドが、標識したリガンドである上記（ａ）〜（ｃ）のスクリーニング方法などのレセプター結合アッセイ系、
（ｅ）本発明のリガンドを本発明の受容体に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を本発明の受容体に接触させた場合における、本発明の受容体を介した細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（ｆ）本発明のリガンドを本発明の受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、本発明の受容体を介した細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、および
（ｇ）本発明の受容体が、本発明の受容体をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の受容体である上記（ｆ）のスクリーニング方法などの細胞刺激アッセイ系などが挙げられる。
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
本発明の受容体としては、ヒトや温血動物の臓器の膜画分などが好適に用いられる。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリーニングに用いられるものとしては、組換え体を用いて大量発現させた本発明の受容体などが適している。
本発明の受容体を製造するには、前述の本発明の受容体の製造方法などが用いられる。
本発明のスクリーニング方法において、本発明の受容体を含有する細胞あるいは該細胞膜画分などを用いる場合、後述の調製法に従えばよい。
本発明の受容体を含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行うことができる。
本発明の受容体を含有する細胞としては、本発明の受容体を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、前述の大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。製造方法は前述と同様である。
膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などがあげられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現した本発明の受容体と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
該本発明の受容体を含有する細胞や膜画分中の本発明の受容体の量は、１細胞当たり１０３〜１０８分子であるのが好ましく、１０５〜１０７分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
前記のレセプター結合アッセイ系や細胞刺激アッセイ系などのスクリーニング方法を実施するためには、例えば、本発明の受容体画分と、本発明のリガンド（例、標識した本発明のリガンド）などが用いられる。本発明の受容体画分としては、天然型の本発明の受容体画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型本発明の受容体画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性などを示す。標識したリガンドとしては、例えば、放射性同位元素（例、〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、〔３２Ｐ〕、〔３３Ｐ〕、〔３５Ｓ〕など）、蛍光物質（例、フルオレセインなど）、発光物質（例、ルミノールなど）、酵素（例、ペルオキシダーゼなど）またはランタニド元素などで標識されたリガンドなどを用いることができる。
具体的には、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニングを行うには、本発明の受容体を含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりレセプター標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンドと受容体との結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０ＴＭ（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによる本発明の受容体の分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０．０１〜１０ｍｌの該レセプター溶液に、一定量（５０００〜５０００００ｃｐｍ）の標識した本発明のリガンドを添加し、同時に１０−１０〜１０−７Ｍの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識の本発明のリガンドを加えた反応チューブも用意する。反応は０℃〜５０℃、望ましくは４℃〜３７℃で２０分〜２４時間、望ましくは３０分〜３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント（Ｂ０）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ０−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が例えば５０％以下になる試験化合物を本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合性を低下させる化合物として選択することができる。
さらに、表面プラズモンセンサー技術を利用することによって、本発明の受容体に結合する化合物をスクリーニングすることもできる。
具体的には、ビアコア３０００（ビアコア社）のセンサーチップ表面に、本発明の受容体を固定化後、チップ表面にリン酸緩衝液（ＰＢＳ）などに溶解した試験化合物を流したときの表面プラズモンの変化を測定することにより、本発明の受容体に結合する試験籠物を選択る。例えば、表面プラズモンの変化の測定値が５レゾナンスユニット以上与える試験化合物を本発明の受容体に結合性を有する物質として選択する。
前記の細胞刺激アッセイ系のスクリーニング方法を実施するためには、本発明の受容体を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ産生抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、リン脂質依存性プロテインキナーゼの活性化、マイトジェン活性化蛋白質リン酸化酵素（ＭＡＰキナーゼ）の活性化などを促進する活性または抑制する活性など）（例、ＥＲＫ１／２（ｐ４２／４４ ＭＡＰ キナーゼ）、ｐ３８ ＭＡＰＫ、ＪＮＫ／ＳＡＰＫ、ＥＲＫ５など）を、自体公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。具体的には、まず、本発明の受容体を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行うにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、適当な本発明の受容体を発現した細胞が必要である。本発明の受容体を発現した細胞としては、前述の本発明の受容体発現細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられる。
上記細胞刺激アッセイ系のスクリーニング方法について、さらに具体的に以下（１）〜（１３）に記載する。
（１）受容体発現細胞が受容体アゴニストによって刺激されると細胞内のＧ蛋白質が活性化されてＧＴＰが結合する。この現象は受容体発現細胞の膜画分においても観察される。通常、ＧＴＰは加水分解されてＧＤＰへと変化するが、このとき反応液中にＧＴＰγＳを添加しておくと、ＧＴＰγＳはＧＴＰと同様にＧ蛋白質に結合するが、加水分解されずにＧ蛋白質を含む細胞膜に結合した状態が維持される。標識したＧＴＰγＳを用いると細胞膜に残存した標識されたＧＴＰγＳを測定することにより、受容体アゴニストの受容体発現細胞刺激活性を測定することができる。
この反応を利用して、本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
この方法は、本発明の受容体を含む膜画分を用いて行う。本測定法において本発明の受容体膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を示す物質はアゴニストである。
具体的には、標識したＧＴＰγＳの存在下、本発明のリガンドを本発明の受容体細胞膜画分に接触させた場合と本発明のリガンドおよび試験化合物を本発明の受容体細胞膜画分に接触させた場合における、本発明の受容体細胞膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を測定し、比較することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
本方法において、本発明のリガンドによる本発明の受容体細胞膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を抑制する活性を示す試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の受容体細胞膜画分に接触させ、本発明の受容体細胞膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を測定することにより、アゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
公知の方法に従って調製した本発明の受容体を含む細胞膜画分を、膜希釈緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１μＭ ＧＤＰ、０．１％ ＢＳＡ；ｐＨ７．４）で希釈する。希釈率は、受容体の発現量により異なる。これをＦａｌｃｏｎ２０５３に０．２ｍｌずつ分注し、本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を加え、さらに終濃度２００ｐＭとなるように［３５Ｓ］ＧＴＰγＳを加える。２５℃で１時間保温した後、氷冷した洗浄用緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ ＢＳＡ，０．０５％ ＣＨＡＰＳ；ｐＨ７．４）１．５ｍｌを加えて、ガラス繊維ろ紙ＧＦ／Ｆでろ過する。６５℃、３０分保温して乾燥後、液体シンチレーションカウンターでろ紙上に残った膜画分に結合した［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの放射活性を測定する。本発明のリガンドのみを加えた実験区の放射活性を１００％、本発明のリガンドを加えなかった実験区の放射活性を０％とし、本発明のリガンドによるＧＴＰγＳ結合促進活性に対する試験化合物の影響を算出する。ＧＴＰγＳ結合促進活性が例えば５０％以下になる試験化合物をアンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
（２）本発明の受容体発現細胞は、本発明のリガンドの刺激により、細胞内ｃＡＭＰの産生が抑制される。この反応を利用して、本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる物質の存在下、本発明のリガンドを本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、該細胞の細胞内ｃＡＭＰの産生抑制活性を測定し、比較することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる物質としては、例えば、フォルスコリン、カルシトニンなどが用いられる。
本発明の受容体発現細胞内のｃＡＭＰ産生量は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウシなどを免疫して得られた抗ｃＡＭＰ抗体と〔１２５Ｉ〕標識ｃＡＭＰ（ともに市販品）を使用することによるＲＩＡ系、または抗ｃＡＭＰ抗体と標識ｃＡＭＰとを組み合わせたＥＩＡ系で測定することができる。また、抗ｃＡＭＰ抗体を、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａまたは抗ｃＡＭＰ抗体産生に用いた動物のＩｇＧなどに対する抗体などを使用して固定したシンチラントを含むビーズと〔１２５Ｉ〕標識ｃＡＭＰとを使用するＳＰＡ（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ａｓｓａｙ）法による定量、化学増幅型ルミネッセンスプロキシミティーホモジニアスアッセイ系であるＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を応用した競合法ｃＡＭＰ検出キット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）による定量も可能である。
本方法において、本発明のリガンドによる本発明の受容体発現細胞のｃＡＭＰ産生抑制活性を阻害する活性を示す試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させて、ｃＡＭＰ産生抑制活性を調べることによりアゴニスト活性を示す化合物のスクリーニングを行なうことができる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞（例、ＣＨＯ細胞などの動物細胞）を２４穴プレートに５ｘ１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種し、４８時間培養する。細胞を０．２ｍＭ ３−イソブチル−メチルキサンチン、０．０５％ ＢＳＡおよび２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むハンクスバッファー（ｐＨ７．４）で洗浄する（以下、反応用バッファーと略記する）。その後、０．５ｍｌの反応用バッファーを加えて３０分間培養器で保温する。反応用バッファーを除き、新たに０．２５ｍｌの反応用バッファーを細胞に加えた後、２０μＭの本発明のリガンドまたは２０μＭの本発明のリガンドおよび試験化合物を添加した２μＭ フォルスコリンを含む０．２５ｍｌの反応用バッファーを、細胞に加え、３７℃で２４分間反応させる。１００μｌの２０％過塩素酸を加えて反応を停止させ、その後氷上で１時間置くことにより細胞内ｃＡＭＰを抽出する。抽出液中のｃＡＭＰ量を、ｃＡＭＰ ＥＩＡキット（アマシャ厶ファルマシアバイオテク）を用いて測定する。フォルスコリンの刺激によって産生されたｃＡＭＰ量を１００％とし、２０μＭの本発明のリガンドの添加によって抑制されたｃＡＭＰ量を０％として、本発明のリガンドによるｃＡＭＰ産生抑制活性に対する試験化合物の影響を算出する。本発明のリガンドの活性を阻害して、ｃＡＭＰ産生活性が例えば５０％以上になる試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
また、本発明のリガンドの刺激により、細胞内ｃＡＭＰ量が増加する性質を示す本発明の受容体発現細胞を使用する場合、本発明のリガンドを本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、該細胞の細胞内ｃＡＭＰの産生促進活性を測定し、比較することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
本方法において、本発明のリガンドによる本発明の受容体発現細胞のｃＡＭＰ産生促進活性を阻害する活性を示す試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させてｃＡＭＰ産生促進活性を調べることによりアゴニスト活性を示す化合物のスクリーニングを行なうことができる。
ｃＡＭＰ産生促進活性は、上記のスクリーニング法においてフォルスコリンを添加せずに本発明の受容体発現細胞（例、ＣＨＯ細胞などの動物細胞）に本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を添加して産生されたｃＡＭＰを上記の方法で定量して測定する。
（３）ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを用いて、本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
ＣＲＥ（ｃＡＭＰ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）を含むＤＮＡを、ベクターのレポーター遺伝子上流に挿入し、ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを得る。ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを導入した本発明の受容体発現細胞において、ｃＡＭＰの上昇を伴う刺激は、ＣＲＥを介したレポーター遺伝子発現と、それに引き続くレポーター遺伝子の遺伝子産物（蛋白質）の産生を誘導する。つまり、レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定することにより、ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入細胞内のｃＡＭＰ量の変動を検出することができる。
具体的には、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる物質の存在下、本発明のリガンドを、ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を、ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定し、比較することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる物質としては、例えば、フォルスコリン、カルシトニンなどが用いられる。
ベクターとしては、例えば、ピッカジーン ベイシックベクター、ピッカジーン エンハンサーベクター（東洋インキ製造（株））などが用いられる。ＣＲＥを含むＤＮＡを、上記ベクターのレポーター遺伝子、例えばルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクローニングサイトに挿入し、ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクターとする。
本方法において、本発明のリガンドによるレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性抑制を回復させる試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させて、フォルスコリン刺激によって上昇した発光量の本発明のリガンドと同様な抑制を測定することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼを利用する例を用いて、このスクリーニング方法の具体例を以下に述べる。
ＣＲＥ−レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）を導入した本発明の受容体発現細胞を、２４穴プレートに５ｘ１０３ｃｅｌｌ／Ｗｅｌｌで播種し、４８時間培養する。細胞を０．２ｍＭ ３−イソブチル−メチルキサンチン、０．０５％ ＢＳＡおよび２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むハンクスバッファー（ｐＨ７．４）で洗浄する（以下、反応用バッファーと略記する）。その後０．５ｍｌの反応用バッファーを加えて３０分間培養器で保温する。反応用バッファーを除き、新たに０．２５ｍｌの反応用バッファーを細胞に加えた後、１００μＭの本発明のリガンドまたは１００μＭの本発明のリガンドおよび試験化合物を添加した２μＭ フォルスコリンを含む０．２５ｍｌの反応用バッファーを、細胞に加え、３７℃で２４分間反応させる。細胞をピッカジーン用細胞溶解剤（東洋インキ製造（株））で溶かし、溶解液に発光基質（東洋インキ製造（株））を添加する。ルシフェラーゼによる発光は、ルミノメーター、液体シンチレーションカウンターまたはトップカウンターにより測定する。本発明のリガンド単独を添加した場合と、１００μＭの本発明のリガンドおよび試験化合物を添加した場合のルシフェラーゼによる発光量を測定して、比較する。
本発明のリガンドは、フォルスコリン刺激に基づくルシフェラーゼによる発光量の増加を抑制する。該抑制を回復させる化合物をアンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
レポーター遺伝子として、例えば、アルカリフォスファターゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、β−ガラクトシダーゼなどの遺伝子を用いてもよい。これらのレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性は、公知の方法に従い、または市販の測定キットを用いて測定する。アルカリフォスファターゼ活性は、例えば和光純薬製Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ５３０を用いて、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ活性は、例えば和光純薬製ＦＡＳＴ ＣＡＴ ｃｈｒｏｌａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ Ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ ＫｉＴを用いて、β−ガラクトシダーゼ活性は、例えば和光純薬製Ａｕｒｏｒａ Ｇａｌ−ＸＥを用いて測定する。
（４）ＳＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを用いて、本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
ＳＲＥ（ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）を含むＤＮＡを、ベクターのレポーター遺伝子上流に挿入し、ＳＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを得る。ＳＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを導入した本発明の受容体発現細胞において、血清刺激によるＭＡＰキナーゼ活性化などの増殖シグナルの活性化は、ＳＲＥを介したレポーター遺伝子発現と、それに引き続くレポーター遺伝子の遺伝子産物（蛋白質）の産生を誘導する。つまり、レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定することにより、ＳＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入細胞内の増殖シグナルの活性化を検出することができる。
具体的には、本発明のリガンドを、ＳＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を、ＳＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定し、比較することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
ベクターとしては、例えば、ピッカジーン ベイシックベクター、ピッカジーン エンハンサーベクター（東洋インキ製造（株））などが用いられる。ＳＲＥを含むＤＮＡを、上記ベクターのレポーター遺伝子、例えばルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクローニングサイトに挿入し、ＳＲＥ−レポーター遺伝子ベクターとする。
本方法において、本発明のリガンドによるレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性化を抑制させる試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させて、本発明のリガンドと同様な発光量の上昇を測定することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼを利用する例を用いて、このスクリーニング方法の具体例を以下に述べる。
ＳＲＥ−レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）を導入した本発明の受容体発現細胞を、２４穴プレートに５ｘ１０３ｃｅｌｌ／Ｗｅｌｌで播種し、４８時間培養する。細胞を０．０５％ ＢＳＡおよび２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むハンクスバッファー（ｐＨ７．４）で洗浄する（以下、反応用バッファーと略記する）。その後０．５ｍｌの反応用バッファーを加えて３０分間培養器で保温する。反応用バッファーを除き、新たに０．２５ｍｌの反応用バッファーを細胞に加えた後、１００μＭの本発明のリガンドまたは１００μＭの本発明のリガンドおよび試験化合物を添加した０．２５ｍｌの反応用バッファーを、細胞に加え、３７℃で２４分間反応させる。細胞をピッカジーン用細胞溶解剤（東洋インキ製造（株））で溶かし、溶解液に発光基質（東洋インキ製造（株））を添加する。ルシフェラーゼによる発光は、ルミノメーター、液体シンチレーションカウンターまたはトップカウンターにより測定する。本発明のリガンド単独を添加した場合と、１００μＭの本発明のリガンドおよび試験化合物を添加した場合のルシフェラーゼによる発光量を測定して、比較する。
本発明のリガンドは、ルシフェラーゼによる発光量を増加させる。該増加を抑制させる化合物をアンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
レポーター遺伝子として、例えば、アルカリフォスファターゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、β−ガラクトシダーゼなどの遺伝子を用いてもよい。これらのレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性は、公知の方法に従い、または市販の測定キットを用いて測定する。アルカリフォスファターゼ活性は、例えば和光純薬製Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ５３０を用いて、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ活性は、例えば和光純薬製ＦＡＳＴ ＣＡＴ ｃｈｒｏｌａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ Ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ ＫｉＴを用いて、β−ガラクトシダーゼ活性は、例えば和光純薬製Ａｕｒｏｒａ Ｇａｌ−ＸＥを用いて測定する。
（５）本発明の受容体発現細胞は、本発明のリガンドの刺激により、アラキドン酸代謝物を細胞外に放出する。この反応を利用して、本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
あらかじめ、標識したアラキドン酸を、本発明の受容体発現細胞に取り込ませておくことによって、アラキドン酸代謝物放出活性を、細胞外に放出された標識されたアラキドン酸代謝物を測定することによって測定することができる。
具体的には、本発明のリガンドを、標識したアラキドン酸を含有する本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を、標識したアラキドン酸を含有する本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、アラキドン酸代謝物の放出活性を測定し、比較することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
本方法において、本発明のリガンドによるアラキドン酸代謝物放出活性を阻害する試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
また、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、本発明の受容体発現細胞のアラキドン酸代謝物放出活性を公知の方法で調べることによりアゴニスト活性を示す化合物のスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞を２４穴プレートに５ｘ１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種し、２４時間培養後、［３Ｈ］アラキドン酸を０．２５μＣｉ／ｗｅｌｌとなるよう添加し、１６時間後、細胞を０．０５％ ＢＳＡおよび２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むハンクスバッファー（ｐＨ７．４）（以下、反応用バッファーと略記する）で洗浄する。終濃度２０μＭの本発明のリガンドまたは終濃度２０μＭの本発明のリガンドおよび試験化合物を含む反応用バッファー５００μｌを、各ｗｅｌｌに添加する。３７℃で６０分間インキュベートした後、反応液４００μｌをシンチレーターに加え、反応液中に遊離した［３Ｈ］アラキドン酸代謝物の量をシンチレーションカウンターにより測定する。
反応用バッファー５００μｌのみを添加した場合（本発明のリガンド非添加・試験化合物非添加）の遊離［３Ｈ］アラキドン酸代謝物の量を０％、２０μＭの本発明のリガンドを含む反応用バッファーを添加した場合（試験化合物非添加）の遊離［３Ｈ］アラキドン酸代謝物の量を１００％として、試験化合物を添加した場合の遊離［３Ｈ］アラキドン酸代謝物の量を算出する。
アラキドン酸代謝物放出活性が、例えば５０％以下になる試験化合物をアンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
（６）本発明の受容体発現細胞は、本発明のリガンドの刺激により、細胞内のＣａ濃度が上昇する。この反応を利用して、本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、本発明のリガンドを、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、細胞内カルシウム濃度上昇活性を測定し、比較することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。測定は公知の方法に従って行う。
本方法において、本発明のリガンドによる細胞内カルシウム濃度のト昇を抑制する試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
一方、試験化合物のみの添加による蛍光強度の上昇を測定することによってアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞を、滅菌した顕微鏡用カバーグラス上に播き、２日後、培養液を、４ｍＭ Ｆｕｒａ−２ ＡＭ（同仁化学研究所）を縣濁したＨＢＳＳに置換し、室温で２時間３０分おく。ＨＢＳＳで洗浄した後、キュベットにカバーグラスをセットし、本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を添加し、励起波長３４０ｎｍおよび３８０ｎｍでの、５０５ｎｍの蛍光強度の比の上昇を蛍光測定器で測定し、比較する。
また、ＦＬＩＰＲ（モレキュラーデバイス社製）を使って行ってもよい。本発明の受容体発現細胞縣濁液にＦｌｕｏ−３ ＡＭ（同仁化学研究所製）を添加し、細胞に取り込ませた後、上清を遠心により数度洗浄後、９６穴プレートに細胞を播く。ＦＬＩＰＲ装置にセットし、Ｆｕｒａ−２の場合と同様に、本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を添加し、蛍光強度の比の上昇を蛍光測定器で測定し、比較する。
さらに、本発明の受容体発現細胞に、細胞内Ｃａイオンの上昇によって発光するような蛋白質の遺伝子（例、ａｅｑｕｏｒｉｎなど）を共発現させておき、細胞内Ｃａイオン濃度の上昇によって、該遺伝子蛋白質（例、ａｅｑｕｏｒｉｎなど）がＣａ結合型となり発光することを利用して、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることもできる。
細胞内Ｃａイオンの上昇によって発光するような蛋白質の遺伝子を共発現させた本発明の受容体発現細胞を、９６穴プレートに播き、上記と同様に、本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を添加し、蛍光強度の比の上昇を蛍光測定器で測定し、比較する。
本発明のリガンドによる蛍光強度の上昇を、抑制する試験化合物をアンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
（７）受容体を発現する細胞に、受容体アゴニストを添加すると、細胞内イノシトール三リン酸濃度は上昇する。本発明のリガンドの、本発明の受容体発現細胞における細胞内イノシトール三リン酸産生活性を利用することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、標識したイノシトールの存在下、本発明のリガンドを、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、イノシトール三リン酸産生活性を測定し、比較することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。測定は公知の方法に従って行う。
本方法において、イノシトール三リン酸産生活性を抑制する試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、イノシトール三リン酸産生上昇を測定することによってアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞を２４穴プレートに播き、１日間培養する。その後、ｍｙｏ−［２−３Ｈ］ｉｎｏｓｉｔｏｌ（２．５μＣｉ／ｗｅｌｌ）を添加した培地で１日間培養し、細胞を放射活性を有するイノシトールを無添加の培地でよく洗浄する。本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を添加後、１０％過塩素酸を加え、反応を止める。１．５Ｍ水酸化カリウ厶および６０ｍＭ ＨＥＰＥＳ溶液で中和し、０．５ｍｌのＡＧ１ｘ８樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を詰めたカラムに通し、５ｍＭ四ホウ酸ナトリウム（Ｎａ２Ｂ４Ｏ７）および６０ｍＭギ酸アンモニウムで洗浄した後、１Ｍギ酸アンモニウムおよび０．１Ｍギ酸で溶出した放射活性を、液体シンチレーションカウンターで測定する。本発明のリガンドを添加しない場合の放射活性を０％、本発明のリガンドを添加した場合の放射活性を１００％とし、試験化合物の、本発明のリガンドと本発明の受容体の結合に対する影響を算出する。
イノシトール三リン酸産生活性が、例えば５０％以下になる試験化合物をアンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
（８）ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを用いて、本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
ＴＲＥ（ＴＰＡ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）を含むＤＮＡを、ベクターのレポーター遺伝子上流に挿入し、ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを得る。ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを導入した本発明の受容体発現細胞において、細胞内カルシウム濃度の上昇を伴う刺激は、ＴＲＥを介したレポーター遺伝子発現と、それに引き続くレポーター遺伝子の遺伝子産物（蛋白質）の産生を誘導する。つまり、レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定することにより、ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入細胞内のカルシウム量の変動を検出することができる。
具体的には、本発明のリガンドを、ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を、ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定し、比較することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
ベクターとしては、例えば、ピッカジーン ベイシックベクター、ピッカジーン エンハンサーベクター（東洋インキ製造（株））などが用いられる。ＴＲＥを含むＤＮＡを、上記ベクターのレポーター遺伝子、例えばルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクローニングサイトに挿入し、ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクターとする。
本方法において、本発明のリガンドによるレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を抑制する試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
一方、試験化合物のみをＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入本発明の受容体発現細胞に接触させ、本発明のリガンドと同様な発光量の増加を測定することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼを利用する例を用いて、このスクリーニング方法の具体例を以下に述べる。
ＴＲＥ−レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）を導入した本発明の受容体発現細胞を、２４穴プレートに５ｘ１０３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種し、４８時間培養する。細胞を０．０５％ ＢＳＡおよび２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むハンクスバッファー（ｐＨ７．４）で洗浄した後、１００μＭの本発明のリガンドまたは１００μＭの本発明のリガンドおよび試験化合物を添加し、３７℃で６０分間反応させる。細胞をピッカジーン用細胞溶解剤（東洋インキ製造（株））で溶かし、溶解液に発光基質（東洋インキ製造（株））を添加する。ルシフェラーゼによる発光は、ルミノメーター、液体シンチレーションカウンターまたはトップカウンターにより測定する。本発明のリガンドを添加した場合と、１００μＭの本発明のリガンドおよび試験化合物を添加した場合のルシフエラーゼによる発光量を測定して、比較する。
本発明のリガンドによる細胞内カルシウムの上昇によって、ルシフェラーゼによる発光量が増加する。この増加を抑制する化合物をアンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
レポーター遺伝子として、例えば、アルカリフォスファターゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、β−ガラクトシダーゼなどの遺伝子を用いてもよい。これらのレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性は、公知の方法に従い、または市販の測定キットを用いて測定する。アルカリフォスファターゼ活性は、例えば和光純薬製Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ ５３０を用いて、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ活性は、例えば和光純薬製ＦＡＳＴ ＣＡＴ ｃｈｒｏｌａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ Ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ ＫｉＴを用いて、β−ガラクトシダーゼ活性は、例えば和光純薬製Ａｕｒｏｒａ Ｇａｌ−ＸＥを用いて測定する。
（９）本発明の受容体発現細胞は、本発明のリガンドの刺激により、ＭＡＰキナーゼが活性化され、増殖する。この反応を利用して、本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、本発明のリガンドを、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、細胞増殖を測定し、比較することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
本発明の受容体発現細胞の増殖は、例えば、ＭＡＰキナーゼ活性、チミジン取り込み活性、ＡＴＰ量、細胞数などを測定すればよい。
具体例としては、ＭＡＰキナーゼ活性については、本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に添加した後、細胞溶解液から抗ＭＡＰキナーゼ抗体を用いた免疫沈降によりＭＡＰキナーゼ分画を得た後、公知の方法、例えば和光純薬製ＭＡＰ Ｋｉｎａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔおよびγ−［３２Ｐ］−ＡＴＰを使用してＭＡＰキナーゼ活性を測定し、比較する。
チミジン取り込み活性については、本発明の受容体発現細胞を２４穴プレートに播種し、培養し、本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を添加した後、放射活性により標識したチミジン（例、［ｍｅｔｈｙｌ−３Ｈ］−チミジンなど）を加え、その後、細胞を溶解し、細胞内に取り込まれたチミジンの放射活性を、液体シンチレーションカウンターで計数することにより、チミジン取り込み活性を測定し、比較する。
ＡＴＰ量の測定については、本発明の受容体発現細胞を９６穴プレートに播種し、培養し、本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を添加した後、例えばＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞内のＡＴＰ量を測定し、比較する。
細胞数の測定については、本発明の受容体発現細胞を２４穴プレートに播種し、培養し、本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を添加した後、ＭＴＴ（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）を添加する。細胞内に取り込まれてＭＴＴが変化したＭＴＴホルマザンを、塩酸にて酸性としたイソプロパノール水溶液で細胞を溶解した後、５７０ｎｍの吸収によって測定し、比較する。
本方法において、本発明の受容体発現細胞の増殖を抑制する試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、本発明のリガンドと同様な細胞増殖活性を測定することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
チミジン取り込み活性を利用するスクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞を２４穴プレートに５０００個／ウェル播き、１日間培養する。次に血清を含まない培地で２日間培養し、細胞を飢餓状態にする。本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を、細胞に添加して２４時間培養した後、［ｍｅｔｈｙｌ−３Ｈ］−チミジンをウェル当たり０．０１５ＭＢｑ添加し、６時間培養する。細胞をＰＢＳで洗った後、メタノールを添加して１０分間放置する。次に５％トリクロロ酢酸を添加して１５分間放置後、固定された細胞を蒸留水で４回洗う。０．３Ｎ水酸化ナトリウム溶液で細胞を溶解し、溶解液中の放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定する。
本発明のリガンドを添加した場合の放射活性の増加を抑制する試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
（１０）本発明の受容体発現細胞は、本発明のリガンドの刺激により、カリウムチャネルが活性化し、細胞内にあるＫイオンが、細胞外に流出する。この反応を利用して、本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
Ｋイオンと同族元素であるＲｂイオン（ルビジウムイオン）は、Ｋイオンと区別無く、カリウムチャネルを通って細胞外に流出する。よって、本発明の受容体発現細胞に、放射活性同位体であるＲｂ（［８６Ｒｂ］）を取り込ませておいた後、本発明のリガンドの刺激によって流出する８６Ｒｂの流れ（流出活性）を測定することにより、本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定する。
具体的には、８６Ｒｂの存在下、本発明のリガンドを、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、８６Ｒｂの流出活性を測定し、比較することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
本方法において、本発明のリガンド刺激による８６Ｒｂの流出活性の上昇を抑制する試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、本発明のリガンドと同様な８６Ｒｂの流出活性の上昇を測定することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞を２４穴プレートに播き、２日間培養する。その後、１ｍＣｉ／ｍｌの８６ＲｂＣｌを含む培地中で２時間保温する。細胞を培地でよく洗浄し、外液中の８６ＲｂＣｌを完全に除く。本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を細胞に添加し、３０分後外液を回収し、γカウンターで放射活性を測定し、比較する。
本発明のリガンド刺激による８６Ｒｂの流出活性の上昇を抑制する試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
（１１）本発明の受容体発現細胞が本発明のリガンドに反応し、細胞外のｐＨが変化する。この反応を利用して、本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、本発明のリガンドを、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、細胞外のｐＨ変化を測定し、比較することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
細胞外ｐＨ変化は、例えば、Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ装置（モレキュラーデバイス社）を使用して測定する。
本方法において、本発明のリガンドによる細胞外ｐＨ変化を抑制する試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、本発明のリガンドと同様な細胞外ｐＨ変化を測定することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞をＣｙｔｏｓｅｎｓｏｒ装置用のカプセル内で終夜培養し、装置のチャンバーにセットして細胞外ｐＨが安定するまで約２時間、０．１％ ＢＳＡを含むＲＰＭＩ１６４０培地（モレキュラーデバイス社製）を灌流させる。ｐＨが安定した後、本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を含む培地を細胞上に灌流させる。灌流によって生じた培地のｐＨ変化を測定し、比較する。
本発明のリガンドによる細胞外ｐＨ変化を抑制する化合物をアンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
（１２）酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のｈａｐｌｏｉｄ α−ｍａｔｉｎｇ ｔｙｐｅ（ＭＡＴα）の性フェロモン受容体Ｓｔｅ２は、Ｇ蛋白質Ｇｐａ１と共役しており、性フェロモンα−ｍａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒに応答してＭＡＰキナーゼを活性化し、これに引き続き、Ｆａｒ１（ｃｅｌｌ−ｃｙｃｌｅ ａｒｒｅｓｔ）および転写活性化因子Ｓｔｅ１２が活性化される。Ｓｔｅ１２は、種々の蛋白質（例えば、接合に関与するＦＵＳ１）の発現を誘導する。一方、制御因子Ｓｓｔ２は上記の過程に抑制的に機能する。この系において、受容体遺伝子を導入した酵母を作製し、受容体アゴニストの刺激により酵母細胞内のシグナル伝達系を活性化し、その結果生じる増殖などを指標として用いる、受容体アゴニストと受容体との反応の測定系の試みが行なわれている（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５巻，４８７−４９４頁，１９９７年）。上記の受容体遺伝子導入酵母の系を利用して、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体例を以下に示す。
ＭＡＴα酵母のＳｔｅ２およびＧｐａ１をコードする遺伝子を除去し、代わりに、本発明の受容体遺伝子およびＧｐａ１−Ｇａｉ２融合蛋白質をコードする遺伝子を導入する。Ｆａｒ１をコードする遺伝子を除去してｃｅｌｌ−ｃｙｃｌｅ ａｒｒｅｓｔが生じないようにし、また、Ｓｓｔ２をコードする遺伝子を除去して本発明のリガンドに対する応答の感度を向上させておく。さらに、ＦＵＳ１にヒスチジン生合成遺伝子ＨＩＳ３を結合したＦＵＳ１−ＨＩＳ３遺伝子を導入する。この遺伝子組換え操作は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１５巻，６１８８−６１９５頁，１９９５年に記載の方法において、ソマトスタチン受容体タイプ２（ＳＳＴＲ２）遺伝子を、本発明の受容体に置き換えて実施することができる。
このように構築された形質変換酵母は、本発明のリガンドに高感度で反応し、その結果、ＭＡＰキナーゼの活性化が起き、ヒスチジン生合成酵素が合成されるようになり、ヒスチジン欠乏培地で生育可能になる。
従って、上記の本発明の受容体発現酵母（Ｓｔｅ２遺伝子およびＧｐａ１遺伝子が除去され、本発明の受容体遺伝子およびＧｐａ１−Ｇａｉ２融合蛋白質コード遺伝子が導入され、Ｆａｒ遺伝子およびＳｓｔ２遺伝子が除去され、ＦＵＳ１−ＨＩＳ３遺伝子が導入されたＭＡＴα酵母）を、ヒスチジン欠乏培地で培養し、本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を接触させ、該酵母の生育を測定し、比較することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
本方法において、該酵母の生育を抑制する試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
一方、試験化合物のみを上記の本発明の受容体発現酵母に接触させ、本発明のリガンドと同様な酵母の生育を測定することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
上記の本発明の受容体発現酵母を完全合成培地の液体培地で終夜培養し、その後、ヒスチジンを除去した溶解寒天培地に、２ｘ１０４ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度になるように加える。ついで、９ｘ９ｃｍの角形シャーレに播く。寒天が固化した後、本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物をしみこませた滅菌濾紙を寒天表面におき、３０℃で３日間培養する。試験化合物の影響は、濾紙の周囲の酵母の生育を、本発明のリガンドのみをしみこませた滅菌濾紙を用いた場合と比較する。また、あらかじめ、ヒスチジンを除去した寒天培地に本発明のリガンドを添加しておき、滅菌濾紙に試験化合物のみをしみこませて酵母を培養し、シャーレ全面での酵母の生育が濾紙の周囲で影響を受けることを観察してもよい。
酵母の生育を抑制する化合物をアンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
（１３）本発明の受容体遺伝子ＲＮＡをアフリカツメガエル卵母細胞に注入し、本発明のリガンドによって刺激すると細胞カルシウ厶濃度が上昇して、Ｃａｌｃｉｕｍ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｃｕｒｒｅｎｔが生じる。これは、膜電位の変化としてとらえることができる（Ｋイオン濃度勾配に変化がある場合も同様）。本発明のリガンドによって生じる本発明の受容体導入アフリカツメガエル卵母細胞における上記反応を利用して、本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、本発明のリガンドを、本発明の受容体遺伝子ＲＮＡ導入アフリカツメガエル卵母細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を、本発明の受容体遺伝子ＲＮＡ導入アフリカツメガエル卵母細胞に接触させた場合における、細胞膜電位の変化を測定し、比較することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
本方法において、細胞膜電位変化を抑制する試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の受容体遺伝子ＲＮＡ導入アフリカツメガエル卵母細胞に接触させ、本発明のリガンドと同様な細胞膜電位変化を測定することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
氷冷して動けなくなった雌のアフリカツメガエルから取り出した、卵母細胞塊を、ＭＢＳ液（８８ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＫＣｌ，０．４１ｍＭ ＣａＣｌ２，０．３３ｍＭ Ｃａ（ＮＯ３）２，０．８２ｍＭ ＭｇＳＯ４，２．４ｍＭ ＮａＨＣＯ３，１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ；ｐＨ７．４）に溶かしたコラーゲナーゼ（０．５ｍｇ／ｍｌ）で卵塊がほぐれるまで１９℃、１〜６時間、１５０ｒｐｍで処理する。外液をＭＢＳ液に置換することで３度洗浄し、マイクロマニピュレーターで本発明の受容体遺伝子ｐｏｌｙ Ａ付加ｃＲＮＡ（５０ｎｇ／５０ｎｌ）を卵母細胞にマイクロインジェクションする。
本発明の受容体遺伝子ｍＲＮＡは、組織や細胞から調製してもよく、プラスミドからｉｎ ｖｉｔｒｏで転写してもよい。本発明の受容体遺伝子ｍＲＮＡをＭＢＳ液中で２０℃で３日培養し、これをＲｉｎｇｅｒ液を流しているｖｏｌｔａｇｅ ｃｌａｍｐ装置のくぼみに置き、電位固定用ガラス微小電極および電位測定用ガラス微小電極を細胞内に刺入し、（−）極は細胞外に置く。電位が安定したら、本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を含むＲｉｎｇｅｒ液を流して電位変化を記録する。試験化合物の影響は、本発明の受容体遺伝子ＲＮＡ導入アフリカツメガエル卵母細胞の細胞膜電位変化を、本発明のリガンドのみ含むＲｉｎｇｅｒ液を流した場合と比較することによって測定することができる。
細胞膜電位変化を抑制する化合物をアンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
上記の系において、電位の変化量を増大させると、測定しやすくなるため、各種のＧ蛋白質遺伝子のｐｏｌｙ Ａ付加ＲＮＡを導入してもよい。また、カルシウム存在下で発光を生じるような蛋白質（例、ａｅｑｕｏｒｉｎなど）の遺伝子のｐｏｌｙ Ａ付加ＲＮＡを共インジェクションすることにより、膜電位変化ではなく発光量を測定することもできる。
さらに、哺乳動物由来の肥満細胞を使用したスクリーニング方法について、以下に述べる。
哺乳動物（好ましくはヒト、チンパンジー、サルなど）由来の肥満細胞（肥満細胞株も含む）、好ましくは皮膚、膀胱、胃、小腸、肺などの由来の肥満細胞を用いて以下の方法などにより、例えば肥満細胞の脱顆粒抑制作用、エイコサノイド産生抑制作用、サイトカイン産生抑制作用、肥満細胞増殖抑制作用、肥満細胞活性化抑制作用などを有する化合物をスクリーニングすることができる。
（１）試験化合物の存在下および非存在下、本発明のリガンドを肥満細胞に接触させ、細胞からＲＮＡを調製し、サイトカイン（例、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１３、ＴＧＦ−βなど）ＲＮＡ量を（例、ＲＴ−ＰＣＲ、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌ−ｔｉｍｅ−ＰＣＲなどにより）測定し、比較することにより、サイトカイン産生抑制剤（サイトカイン産生抑制作用を有する化合物など）をスクリーニングする。
（２）試験化合物の存在下および非存在下、本発明のリガンドを肥満細胞に接触させ、培養上清中のサイトカイン（例、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１３、ＴＧＦ−βなど）タンパク質量を（例、ＥＩＡ、ＲＩＡなどにより）測定し、比較することにより、サイトカイン（例、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１３、ＴＧＦ−βなど）産生抑制剤（サイトカイン産生抑制作用を有する化合物など）をスクリーニングする。
（３）試験化合物の存在下および非存在下、本発明のリガンドを肥満細胞に接触させ、サイトカイン（例、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１３、ＴＧＦ−βなど）産生細胞数を（例、ＥＬＩＳＰＯＴ法により）測定し、比較することにより、サイトカイン産生抑制剤（サイトカイン産生抑制作用を有する化合物など）をスクリーニングする。
（４）試験化合物の存在下および非存在下、本発明の受容体をコードするポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡベクター（例、ｓｉＲＮＡベクター、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド発現ベクターなど）を多数作製し、ｓｉＲＮＡライブラリーを作製後、肥満細胞にトランスフェクションし、本発明のリガンドと接触させ、細胞におけるサイトカイン（例、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１３、ＴＧＦ−βなど）の発現量（例、サイトカインＲＮＡ量、サイトカインタンパク質量など）を測定し、発現量の低下を誘導するｓｉＲＮＡの塩基配列を調べることにより、サイトカイン産生抑制剤（サイトカイン産生抑制作用を有する化合物など）をスクリーニングする。リガンドと接触させる際、例えば肥満細胞を能動または受動感作した場合は、抗ＩｇＥ抗体、抗体特異的抗原などを、その他の場合は、ＮＧＦ、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ）、サイトカイン、レクチンなどを用いて共刺激してもよい。
（５）試験化合物の存在下および非存在下、本発明のリガンドを、放射標識したアラキドン酸を取り込ませた肥満細胞に接触させ、培養上清中の放射活性を測定し、比較することにより、エイコサノイド産生抑制作用（エイコサノイド産生抑制作用を有する化合物など）のある化合物をスクリーニングする。
（６ａ）試験化合物の存在下および非存在下、本発明のリガンドを肥満細胞に接触させ、培養上清中の顆粒含有物（例、ヒスタミン、セロトニン、β−ヘキソサミニダーゼ、β−グルクロニダーゼ、トリプターゼ、キマーゼ、カルボキシペプチダーゼなど）量を測定し、比較することにより、脱顆粒抑制作用（脱顆粒抑制作用を有する化合物など）のある化合物をスクリーニングする。顆粒含有物の量は、公知の方法、例えばＥＩＡ、ＲＩＡ、ＨＰＬＣ、酵素活性測定等で定量できる。あるいは、肥満細胞を視覚化し（例、ビデオ装置など）、脱顆粒した細胞を数えてもよい。
（６ｂ）試験化合物の存在下および非存在下、本発明のリガンドを、放射標識した顆粒含有物を取り込ませた肥満細胞に接触させ、培養上清中の放射活性を測定し、比較することにより、脱顆粒抑制剤（脱顆粒抑制作用を有する化合物など）をスクリーニングする。
（６ｃ）試験化合物の存在下および非存在下、本発明のリガンドを肥満細胞に接触させ、アネキシンＶの肥満細胞への結合量を測定（例、ＦＡＣＳなど）し、比較することにより、脱顆粒抑制剤（脱顆粒抑制作用を有する化合物など）をスクリーニングする。
（７）試験化合物の存在下および非存在下、本発明のリガンドを肥満細胞に接触させ、細胞溶解液をポリアクリルアミドゲルで分離し、フィルターに転写後、ＭＡＰキナーゼ特異的な抗体および化学発光試薬を用いてイメージアナライザー等で検出し、発光の強度を比較することにより、肥満細胞活性化抑制剤（例、ＭＡＰＫ活性化抑制剤なども含む、肥満細胞活性化抑制作用を有する化合物）をスクリーニングする。
（８）試験化合物の存在下および非存在下、本発明のリガンドを肥満細胞（例、２４穴プレートに播種後培養された肥満細胞）に接触させ、放射性同位元素で標識されたチミジン（例、［ｍｅｔｈｙｌ−３Ｈ］−チミジンなど）を添加後、細胞を溶解し、細胞内に取り込まれたチミジンの放射活性を、液体シンチレーションカウンターで計数することにより、チミジン取り込み活性を測定し、比較することにより、肥満細胞増殖抑制剤（肥満細胞増殖抑制作用を有する化合物など）をスクリーニングする。
（９）試験化合物の存在下および非存在下、本発明のリガンドを肥満細胞（例、２４穴プレートに播種後培養された肥満細胞）に接触させ、ＭＴＴ（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）を添加後、細胞内に取り込まれてＭＴＴが変化したＭＴＴホルマザンを、塩酸にて酸性としたイソプロパノール水溶液で細胞を溶解した後、５７０ｎｍの吸収によって測定して比較することにより、肥満細胞増殖抑制剤（肥満細胞増殖抑制作用を有する化合物）をスクリーニングする。
本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キットは、本発明の受容体または本発明の受容体を含有する細胞もしくは細胞の膜画分、および本発明のリガンドを含有する。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
１．スクリーニング用試薬
（ｉ）測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Ｈａｎｋｓ′Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ギブコ社製）に、０．０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径０．４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、または用時調製しても良い。
（ｉｉ）本発明の受容体標品
本発明の受容体を発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０５個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ２、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。
（ｉｉｉ）標識リガンド
〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、〔３２Ｐ〕、〔３３Ｐ〕、〔３５Ｓ〕などの放射性同位元素で標識した本発明のリガンドを適当な溶媒または緩衝液に溶解したものを、４℃または−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。
（ｉｖ）リガンド標準液
本発明のリガンドを０．１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で保存する。
２．測定法
（ｉ）１２穴組織培養用プレートにて培養した本発明の受容体を発現させた細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
（ｉｉ）１０−３〜１０−１０Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた後、標識した本発明のリガンドを５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物の代わりに１０−３Ｍの本発明のリガンドを５μｌ加えておく。
（ｉｉｉ）反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。細胞に結合した標識された本発明のリガンドを０．２Ｎ ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
（ｉｖ）液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、Ｐｅｒｃｅｎｔ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｂｉｎｄｉｎｇ（ＰＭＢ）を次式で求める。
ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ０−ＮＳＢ）］×１００
ＰＭＢ：Ｐｅｒｃｅｎｔ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｂｉｎｄｉｎｇ
Ｂ ：検体を加えた時の値
ＮＳＢ：Ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂｉｎｄｉｎｇ（非特異的結合量）
Ｂ０ ：最大結合量
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩は、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合を変化させる化合物あるいは本発明の受容体の活性を促進または阻害する化合物であり、具体的には、（ｉ）本発明の受容体を介して細胞刺激活性を有する化合物またはその塩（本発明の受容体アゴニスト）、（ｉｉ）該刺激活性を有しない化合物（本発明の受容体アンタゴニスト）、（ｉｉｉ）本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合力を促進する化合物、（ｉｖ）本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合力を阻害する化合物などである。該化合物としては、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
該化合物の塩としては、前記した本発明の受容体の塩と同様のものが用いられる。
上記本発明の受容体アゴニストであるか、またはアンタゴニストであるかの評価方法は、例えば、以下のｉ）またはｉｉ）に従えばよい。
ｉ）前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のスクリーニング方法で示されるバインディング・アッセイを行い、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる（特に、結合を阻害する）化合物を得た後、該化合物が上記した本発明の受容体を介する細胞刺激活性を有しているか否かを測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩は本発明の受容体アゴニスト（アゴニスト）であり、該活性を有しない化合物またはその塩は本発明の受容体アンタゴニスト（アンタゴニスト）である。
ｉｉ）（ａ）試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞に接触させ、本発明の受容体を介した細胞刺激活性を測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩は本発明の受容体アゴニストである。
（ｂ）本発明のリガンドを本発明の受容体を含有する細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞に接触させた場合における、本発明の受容体を介した細胞刺激活性を測定し、比較する。本発明の受容体を活性化する化合物による細胞刺激活性を減少させ得る化合物またはその塩は本発明の受容体アンタゴニストである。
本発明の受容体アンタゴニストは、本発明の受容体または本発明のリガンドが有する生理活性（例、肥満細胞の脱顆粒促進作用、エイコサノイド産生促進作用、サイトカイン産生促進作用、肥満細胞増殖促進作用、肥満細胞活性化作用など）を抑制することができるので、低毒性で安全な優れた肥満細胞の脱顆粒抑制剤、エイコサノイド産生抑制剤、サイトカイン産生抑制剤、肥満細胞増殖抑制剤、肥満細胞活性化抑制作用剤などとして、例えば、免疫疾患〔例、炎症性疾患（下垂体膿瘍、甲状腺炎、腹膜炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、結節性紅斑、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー（例、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、花粉症、金属アレルギーなど）、喘息、滲出性中耳炎、メニエール病、接触皮膚炎、アナフィラキシー、蕁麻疹、重症筋無力症、糸球体腎炎、シェーグレン症候群、バセドー病、インスリン抵抗性糖尿病、アトピー性皮膚炎、白血球異常など〕、泌尿器疾患（例、腎尿細管間質障害（繊維化）、間質性膀胱炎、アレルギー性膀胱炎など）、消化器疾患〔例、過敏性腸症候群、慢性肝疾患、食物アレルギー、アレルギー性腸炎、牛乳タンパク誘発性直腸炎、消化性潰瘍（例、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、吻合部潰瘍、Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ−Ｅｌｌｉｓｏｎ症候群など）、胃炎、逆流性食道炎、ＮＵＤ（Ｎｏｎ Ｕｌｃｅｒ Ｄｙｓｐｅｐｓｉａ）、胃ＭＡＬＴリンパ腫、非ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、胃酸過多、手術後ストレスによる胃酸過多および潰瘍など〕、呼吸器疾患〔例、慢性閉塞性肺疾患（例、慢性気管支炎、肺気腫）、びまん性汎細気管支炎、嚢胞性線維症、過敏性肺炎、突発性間質性肺炎、肺線維症など〕、循環器疾患（例、動脈硬化症、急性冠状動脈症候群、粥状硬化性大動脈瘤、心臓アナフィラキシー、心不全、心筋梗塞、狭心症、不整脈、深部静脈血栓症、ＰＴＣＡ後再狭窄など）、眼科疾患（例、翼状片、春期カタル、ドライアイなど）、癌（例、甲状腺乳頭癌、非小細胞性肺癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、胃癌、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、カポジ肉腫、肥満細胞種など）、脳梗塞、高脂血症、急性腎不全、糖尿病、肥満症、浮腫、肉芽種、アトピー性脊髄炎、神経線維腫、鼻粘膜過敏症、ホジキン病、子宮内膜増殖症などの予防・治療剤などとして使用できる。
本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合力を阻害する化合物は、本発明の受容体アンタゴニストと同様に用いられる。
本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合力を促進する化合物は、本発明の受容体アゴニストと同様に用いられる。
また、本発明は、本発明の受容体をコードする本発明のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする本発明の受容体の遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法なども提供する。
具体的には、（ｉ）本発明の受容体を産生する能力を有する細胞を培養した場合と（ｉｉ）本発明の受容体を産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物を培養した場合との比較を行い、本発明の受容体の遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする。
上記スクリーニング方法においては、例えば、（ｉ）と（ｉｉ）の場合における、本発明の受容体の遺伝子の発現量（具体的には、本発明の受容体量または本発明の受容体をコードするｍＲＮＡ量など）を測定して、比較する。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
上記のスクリーニング方法を実施するには、本発明ポリペプチドまたは本発明の受容体を産生する能力を有する細胞をスクリーニングに適したバッファーに浮遊して調製する。バッファーには、ｐＨ約４〜１０（望ましくは、ｐＨ約６〜８）のリン酸バッファー、ほう酸バッファーなどの、本発明の受容体の活性を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。
本発明の受容体を産生する能力を有する細胞としては、例えば、前述した本発明の受容体をコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換された宿主（形質転換体）などが用いられる。宿主としては、例えば、ＣＨＯ細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養することによって、本発明の受容体を細胞膜上に発現させた形質転換体などが好ましく用いられる。
本発明の受容体の蛋白質量の測定は、公知の方法、例えば、本発明の抗体を用いて、細胞抽出液中などに存在する前記ポリペプチドまたは受容体を、ウェスタン解析、ＥＬＩＳＡ法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
本発明の受容体の遺伝子の発現量は、公知の方法、例えば、ノーザンブロッティングやＲｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ解析システム（ＡＢＩ社製、ＴａｑＭａｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）などの方法あるいはそれに準じる方法にしたがって測定することができる。
例えば、上記（ｉｉ）の場合における本発明の受容体の遺伝子の発現を、上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上促進する試験化合物を本発明の受容体の遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩として選択することができる。
例えば、上記（ｉｉ）の場合における本発明の受容体の遺伝子の発現を、上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害する試験化合物を本発明の受容体の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。
本発明の受容体の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩は、本発明の受容体アンタゴニストと同様に用いられる。
本発明の受容体の遺伝子の発現を促進（発現量を増加）する化合物またはその塩は、本発明の受容体アゴニストと同様に用いられる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、例えば、ペプチド、蛋白、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物であり、本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合性を変化させる化合物、本発明の受容体の活性または機能を促進または阻害する化合物、本発明の受容体の遺伝子の発現を促進または阻害（発現量を増加または減少）する化合物などである。
該化合物の塩としては、前記した本発明の受容体の塩と同様のものが用いられる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を上記の医薬（予防・治療剤など）として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。
該化合物またはその塩は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、該化合物またはその塩を、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はある。
例えば、間質性膀胱炎患者（体重６０ｋｇ当たり）に、一日につきアンタゴニストを約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ経口投与する。非経口的に投与する場合、例えば、アンタゴニストを注射剤の形で間質性膀胱炎患者（６０ｋｇ当たり）に投与する場合、一日につきアンタゴニストを約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
〔２〕本発明の受容体の定量
本発明の受容体に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）は、本発明の受容体を特異的に認識することができるので、被検液中の本発明の受容体の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化された本発明の受容体とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明の受容体の割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明の受容体の定量法、および
（ｉｉ）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明の受容体の定量法を提供する。
上記（ｉｉ）の定量法においては、一方の抗体が本発明の受容体のＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明の受容体のＣ端部に反応する抗体であることが望ましい。
また、本発明の受容体に対するモノクローナル抗体を用いて本発明の受容体の定量を行うことができるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ａｂ′）２、Ｆａｂ′、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明の受容体の定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、ポリペプチド量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常ポリペプチドあるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の受容体量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明の受容体の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、本発明の受容体の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明の受容体のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原（Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明の受容体の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」 Ｖｏｌ．７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ａ））、同書Ｖｏｌ．７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｂ））、同書Ｖｏｌ．７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｃ））、同書Ｖｏｌ．８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、同書Ｖｏｌ．９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ））、同書Ｖｏｌ．１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、本発明の受容体を感度良く定量することができる。
さらには、本発明の抗体を用いて本発明の受容体の濃度を定量することによって、本発明の受容体の濃度の増加が検出された場合、例えば、肥満細胞の脱顆粒促進作用、エイコサノイド産生促進作用、サイトカイン産生促進作用、肥満細胞増殖促進作用、肥満細胞活性化作用などが亢進し、免疫疾患〔例、炎症性疾患（下垂体膿瘍、甲状腺炎、腹膜炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、結節性紅斑、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー（例、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、花粉症、金属アレルギーなど）、喘息、滲出性中耳炎、メニエール病、接触皮膚炎、アナフィラキシー、蕁麻疹、重症筋無力症、糸球体腎炎、シェーグレン症候群、バセドー病、インスリン抵抗性糖尿病、アトピー性皮膚炎、白血球異常など〕、泌尿器疾患（例、腎尿細管間質障害（繊維化）、間質性膀胱炎、アレルギー性膀胱炎など）、消化器疾患〔例、過敏性腸症候群、慢性肝疾患、食物アレルギー、アレルギー性腸炎、牛乳タンパク誘発性直腸炎、消化性潰瘍（例、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、吻合部潰瘍、Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ−Ｅｌｌｉｓｏｎ症候群など）、胃炎、逆流性食道炎、ＮＵＤ（Ｎｏｎ Ｕｌｃｅｒ Ｄｙｓｐｅｐｓｉａ）、胃ＭＡＬＴリンパ腫、非ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、胃酸過多、手術後ストレスによる胃酸過多および潰瘍など〕、呼吸器疾患〔例、慢性閉塞性肺疾患（例、慢性気管支炎、肺気腫）、びまん性汎細気管支炎、嚢胞性線維症、過敏性肺炎、突発性間質性肺炎、肺線維症など〕、循環器疾患（例、動脈硬化症、急性冠状動脈症候群、粥状硬化性大動脈瘤、心臓アナフィラキシー、心不全、心筋梗塞、狭心症、不整脈、深部静脈血栓症、ＰＴＣＡ後再狭窄など）、眼科疾患（例、翼状片、春期カタル、ドライアイなど）、癌（例、甲状腺乳頭癌、非小細胞性肺癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、胃癌、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、カポジ肉腫、肥満細胞種など）、脳梗塞、高脂血症、急性腎不全、糖尿病、肥満症、浮腫、肉芽種、アトピー性脊髄炎、神経線維腫、鼻粘膜過敏症、ホジキン病、子宮内膜増殖症などに将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明の受容体を検出するために使用することができる。また、本発明の受容体を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明の受容体の検出、被検細胞内における本発明の受容体の挙動の分析などのために使用することができる。
〔３〕遺伝子診断薬
本発明のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）は、例えば、プローブとして使用することにより、ヒトや温血動物（例えば、ラットマウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、など）における本発明の受容体をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断薬として有用である。
本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，第５巻，８７４〜８７９頁，１９８９年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，第８６巻，２７６６〜２７７０頁，１９８９年）などにより実施することができる。
例えば、本発明の受容体の遺伝子の発現過多が検出された場合は、例えば、肥満細胞の脱顆粒抑制作用、エイコサノイド産生抑制作用、サイトカイン産生抑制作用、肥満細胞増殖抑制作用、肥満細胞活性化抑制作用が亢進し、免疫疾患〔例、炎症性疾患（下垂体膿瘍、甲状腺炎、腹膜炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、結節性紅斑、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー（例、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、花粉症、金属アレルギーなど）、喘息、滲出性中耳炎、メニエール病、接触皮膚炎、アナフィラキシー、蕁麻疹、重症筋無力症、糸球体腎炎、シェーグレン症候群、バセドー病、インスリン抵抗性糖尿病、アトピー性皮膚炎、白血球異常など〕、泌尿器疾患（例、腎尿細管間質障害（繊維化）、間質性膀胱炎、アレルギー性膀胱炎など）、消化器疾患〔例、過敏性腸症候群、慢性肝疾患、食物アレルギー、アレルギー性腸炎、牛乳タンパク誘発性直腸炎、消化性潰瘍（例、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、吻合部潰瘍、Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ−Ｅｌｌｉｓｏｎ症候群など）、胃炎、逆流性食道炎、ＮＵＤ（Ｎｏｎ Ｕｌｃｅｒ Ｄｙｓｐｅｐｓｉａ）、胃ＭＡＬＴリンパ腫、非ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、胃酸過多、手術後ストレスによる胃酸過多および潰瘍など〕、呼吸器疾患〔例、慢性閉塞性肺疾患（例、慢性気管支炎、肺気腫）、びまん性汎細気管支炎、嚢胞性線維症、過敏性肺炎、突発性間質性肺炎、肺線維症など〕、循環器疾患（例、動脈硬化症、急性冠状動脈症候群、粥状硬化性大動脈瘤、心臓アナフィラキシー、心不全、心筋梗塞、狹心症、不整脈、深部静脈血栓症、ＰＴＣＡ後再狭窄など）、眼科疾患（例、翼状片、春期カタル、ドライアイなど）、癌（例、甲状腺乳頭癌、非小細胞性肺癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、胃癌、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、カポジ肉腫、肥満細胞種など）、脳梗塞、高脂血症、急性腎不全、糖尿病、肥満症、浮腫、肉芽種、アトピー性脊髄炎、神経線維腫、鼻粘膜過敏症、ホジキン病、子宮内膜増殖症などに将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
〔４〕アンチセンスポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）を含有する医薬
本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）に相補的に結合し、該ポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）の発現を抑制することができるアンチセンスポリヌクレオチド（例、アンチセンスＤＮＡ）は、例えば、肥満細胞の脱顆粒抑制剤、エイコサノイド産生抑制剤、サイトカイン産生抑制剤、肥満細胞増殖抑制剤、肥満細胞活性化抑制剤（例、ＭＡＰＫ活性化抑制剤なども含む）などとして、例えば、免疫疾患〔例、炎症性疾患（下垂体膿瘍、甲状腺炎、腹膜炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、結節性紅斑、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー（例、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、花粉症、金属アレルギーなど）、喘息、滲出性中耳炎、メニエール病、接触皮膚炎、アナフィラキシー、蕁麻疹、重症筋無力症、糸球体腎炎、シェーグレン症候群、バセドー病、インスリン抵抗性糖尿病、アトピー性皮膚炎、白血球異常など〕、泌尿器疾患（例、腎尿細管間質障害（繊維化）、間質性膀胱炎、アレルギー性膀胱炎など）、消化器疾患〔例、過敏性腸症候群、慢性肝疾患、食物アレルギー、アレルギー性腸炎、牛乳タンパク誘発性直腸炎、消化性潰瘍（例、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、吻合部潰瘍、Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ−Ｅｌｌｉｓｏｎ症候群など）、胃炎、逆流性食道炎、ＮＵＤ（Ｎｏｎ Ｕｌｃｅｒ Ｄｙｓｐｅｐｓｉａ）、胃ＭＡＬＴリンパ腫、非ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、胃酸過多、手術後ストレスによる胃酸過多および潰瘍など〕、呼吸器疾患〔例、慢性閉塞性肺疾患（例、慢性気管支炎、肺気腫）、びまん性汎細気管支炎、嚢胞性線維症、過敏性肺炎、突発性間質性肺炎、肺線維症など〕、循環器疾患（例、動脈硬化症、急性冠状動脈症候群、粥状硬化性大動脈瘤、心臓アナフィラキシー、心不全、心筋梗塞、狭心症、不整脈、深部静脈血栓症、ＰＴＣＡ後再狭窄など）、眼科疾患（例、翼状片、春期カタル、ドライアイなど）、癌（例、甲状腺乳頭癌、非小細胞性肺癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、胃癌、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、カポジ肉腫、肥満細胞種など）、脳梗塞、高脂血症、急性腎不全、糖尿病、肥満症、浮腫、肉芽種、アトピー性脊髄炎、神経線維腫、鼻粘膜過敏症、ホジキン病、子宮内膜増殖症などの予防・治療剤などの低毒性で安全な医薬として有用である。
例えば、上記アンチセンスＤＮＡを用いる場合、該アンチセンスＤＮＡを単独あるいはレトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノウィルスアソシエーテッドウィルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。該アンチセンスＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
さらに、該アンチセンスＤＮＡは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、本発明の受容体をコードするＲＮＡの一部を含有する二重鎖ＲＮＡ〔本発明の受容体に対するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ（ｓｈｏｒｔ）ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌ（ｓｈｏｒｔ）ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）、本発明の受容体をコードするＲＮＡの一部を含有するリボザイムなども、本発明のポリヌクレオチドの発現を抑制することができ、生体内における本発明の受容体または本発明のポリヌクレオチドの機能を抑制することができるので、例えば、肥満細胞の脱顆粒抑制剤、エイコサノイド産生抑制剤、サイトカイン産生抑制剤、肥満細胞増殖抑制剤、肥満細胞活性化抑制剤（例、ＭＡＰＫ活性化抑制剤なども含む）などとして、例えば、免疫疾患〔例、炎症性疾患（下垂体膿瘍、甲状腺炎、腹膜炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、結節性紅斑、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー（例、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、花粉症、金属アレルギーなど）、喘息、滲出性中耳炎、メニエール病、接触皮膚炎、アナフィラキシー、蕁麻疹、重症筋無力症、糸球体腎炎、シェーグレン症候群、バセドー病、インスリン抵抗性糖尿病、アトピー性皮膚炎、白血球異常など〕、泌尿器疾患（例、腎尿細管間質障害（繊維化）、間質性膀胱炎、アレルギー性膀胱炎など）、消化器疾患〔例、過敏性腸症候群、慢性肝疾患、食物アレルギー、アレルギー性腸炎、牛乳タンパク誘発性直腸炎、消化性潰瘍（例、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、吻合部潰瘍、Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ−Ｅｌｌｉｓｏｎ症候群など）、胃炎、逆流性食道炎、ＮＵＤ（Ｎｏｎ Ｕｌｃｅｒ Ｄｙｓｐｅｐｓｉａ）、胃ＭＡＬＴリンパ腫、非ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、胃酸過多、手術後ストレスによる胃酸過多および潰瘍など〕、呼吸器疾患〔例、慢性閉塞性肺疾患（例、慢性気管支炎、肺気腫）、びまん性汎細気管支炎、嚢胞性線維症、過敏性肺炎、突発性間質性肺炎、肺線維症など〕、循環器疾患（例、動脈硬化症、急性冠状動脈症候群、粥状硬化性大動脈瘤、心臓アナフィラキシー、心不全、心筋梗塞、狭心症、不整脈、深部静脈血栓症、ＰＴＣＡ後再狭窄など）、眼科疾患（例、翼状片、春期カタル、ドライアイなど）、癌（例、甲状腺乳頭癌、非小細胞性肺癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、胃癌、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、カポジ肉腫、肥満細胞種など）、脳梗塞、高脂血症、急性腎不全、糖尿病、肥満症、浮腫、肉芽種、アトピー性脊髄炎、神経線維腫、鼻粘膜過敏症、ホジキン病、子宮内膜増殖症などの予防・治療剤などの低毒性で安全な医薬として有用である。
二重鎖ＲＮＡは、公知の方法（例、Ｎａｔｕｒｅ，４１１巻，４９４頁，２００１年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
リボザイムは、公知の方法（例、ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７巻，２２１頁，２００１年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。例えば、本発明の受容体をコードするＲＮＡの一部に公知のリボザイムを連結することによって製造することができる。本発明の本発明の受容体をコードするＲＮＡの一部としては、公知のリボザイムによって切断され得る本発明のＲＮＡ上の切断部位に近接した部分（ＲＮＡ断片）が挙げられる。
上記の二重鎖ＲＮＡまたはリボザイムを上記予防・治療剤として使用する場合、アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、投与することができる。
〔５〕本発明の抗体を含有する医薬
本発明の受容体の抗体（例、本発明の受容体を中和する作用を有する抗体、シグナル伝達を不活性化する抗体など）は、例えば、肥満細胞の脱顆粒抑制剤、エイコサノイド産生抑制剤、サイトカイン産生抑制剤、肥満細胞増殖抑制剤、肥満細胞活性化抑制剤（例、ＭＡＰＫ活性化抑制剤なども含む）などとして、例えば、免疫疾患〔例、炎症性疾患（下垂体膿瘍、甲状腺炎、腹膜炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、結節性紅斑、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー（例、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、花粉症、金属アレルギーなど）、喘息、滲出性中耳炎、メニエール病、接触皮膚炎、アナフィラキシー、蕁麻疹、重症筋無力症、糸球体腎炎、シェーグレン症候群、バセドー病、インスリン抵抗性糖尿病、アトピー性皮膚炎、白血球異常など〕、泌尿器疾患（例、腎尿細管間質障害（繊維化）、間質性膀胱炎、アレルギー性膀胱炎など）、消化器疾患〔例、過敏性腸症候群、慢性肝疾患、食物アレルギー、アレルギー性腸炎、牛乳タンパク誘発性直腸炎、消化性潰瘍（例、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、吻合部潰瘍、Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ−Ｅｌｌｉｓｏｎ症候群など）、胃炎、逆流性食道炎、ＮＵＤ（Ｎｏｎ Ｕｌｃｅｒ Ｄｙｓｐｅｐｓｉａ）、胃ＭＡＬＴリンパ腫、非ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、胃酸過多、手術後ストレスによる胃酸過多および潰瘍など〕、呼吸器疾患〔例、慢性閉塞性肺疾患（例、慢性気管支炎、肺気腫）、びまん性汎細気管支炎、嚢胞性線維症、過敏性肺炎、突発性間質性肺炎、肺線維症など〕、循環器疾患（例、動脈硬化症、急性冠状動脈症候群、粥状硬化性大動脈瘤、心臓アナフィラキシー、心不全、心筋梗塞、狭心症、不整脈、深部静脈血栓症、ＰＴＣＡ後再狭窄など）、眼科疾患（例、翼状片、春期カタル、ドライアイなど）、癌（例、甲状腺乳頭癌、非小細胞性肺癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、胃癌、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、カポジ肉腫、肥満細胞種など）、脳梗塞、高脂血症、急性腎不全、糖尿病、肥満症、浮腫、肉芽種、アトピー性脊髄炎、神経線維腫、鼻粘膜過敏症、ホジキン病、子宮内膜増殖症などの予防・治療剤などの低毒性で安全な医薬として有用である。
本発明の抗体を含有する上記医薬は、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトや温血動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の間質性膀胱炎患者の治療・予防のために使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
すなわち、例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、公知の方法に従って、例えば、上記抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｃａｓｔｏｒ ｏｉｌ）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記抗体が含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
〔６〕ＤＮＡ転移動物
本発明は、外来性の本発明の受容体をコードするＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
（２）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１）記載の動物、
（３）ゲッ歯動物がマウスまたはラットである上記（２）記載の動物、および
（４）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターなどを提供する。
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ転移動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを転移することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ１系統，ＢＤＦ１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明の受容体を発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発明の受容体の機能を抑制するポリペプチドを発現させるＤＮＡなどが用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハ厶スター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ転移哺乳動物を作出することができる。
本発明の受容体の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のＤＮＡ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、（ｉ）ウィルス（例、シミアンウィルス、サイトメガロウィルス、モロニー白血病ウィルス、ＪＣウィルス、乳癌ウィルス、ポリオウィルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、（ｉｉ）各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性蛋白質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存蛋白質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ポリペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎蛋白質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウィルスプロモーター、ヒトポリペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウィルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウィルスのＳＶ４０ターミネターなどが用いられる。
その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流に連結することも目的により可能である。
正常な本発明の受容体の翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なポリペプチドの翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。
導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。
本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本発明の受容体の機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明の受容体の機能亢進症や、本発明の受容体が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明の受容体の増加症状を有することから、例えば、肥満細胞の脱顆粒促進動物、エイコサノイド産生促進動物、サイトカイン産生促進動物、肥満細胞増殖促進動物、肥満細胞活性化動物〔例、ＭＡＰＫ活性化（促進）動物なども含む〕などとして、例えば、免疫疾患〔例、炎症性疾患（下垂体膿瘍、甲状腺炎、腹膜炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、結節性紅斑、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー（例、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、花粉症、金属アレルギーなど）、喘息、滲出性中耳炎、メニエール病、接触皮膚炎、アナフィラキシー、蕁麻疹、重症筋無力症、糸球体腎炎、シェーグレン症候群、バセドー病、インスリン抵抗性糖尿病、アトピー性皮膚炎、白血球異常など〕、泌尿器疾患（例、腎尿細管間質障害（繊維化）、間質性膀胱炎、アレルギー性膀胱炎など）、消化器疾患〔例、過敏性腸症候群、慢性肝疾患、食物アレルギー、アレルギー性腸炎、牛乳タンパク誘発性直腸炎、消化性潰瘍（例、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、吻合部潰瘍、Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ−Ｅｌｌｉｓｏｎ症候群など）、胃炎、逆流性食道炎、ＮＵＤ（Ｎｏｎ Ｕｌｃｅｒ Ｄｙｓｐｅｐｓｉａ）、胃ＭＡＬＴリンパ腫、非ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、胃酸過多、手術後ストレスによる胃酸過多および潰瘍など〕、呼吸器疾患〔例、慢性閉塞性肺疾患（例、慢性気管支炎、肺気腫）、びまん性汎細気管支炎、嚢胞性線維症、過敏性肺炎、突発性間質性肺炎、肺線維症など〕、循環器疾患（例、動脈硬化症、急性冠状動脈症候群、粥状硬化性大動脈瘤、心臓アナフィラキシー、心不全、心筋梗塞、狭心症、不整脈、深部静脈血栓症、ＰＴＣＡ後再狭窄など）、眼科疾患（例、翼状片、春期カタル、ドライアイなど）、癌（例、甲状腺乳頭癌、非小細胞性肺癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、胃癌、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、カポジ肉腫、肥満細胞種など）、脳梗塞、高脂血症、急性腎不全、糖尿病、肥満症、浮腫、肉芽種、アトピー性脊髄炎、神経線維腫、鼻粘膜過敏症、ホジキン病、子宮内膜増殖症などの予防・治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原科として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラクトは、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に本発明の受容体の機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明の受容体の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明の受容体の機能不活性型不応症における本発明の異常ポリペプチドまたは本発明の異常受容体による正常ポリペプチドまたは受容体の機能阻害（ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ作用）を解明するモデルとなる。
また、本発明の外来異常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明の受容体の増加症状を有することから、本発明の受容体の機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記２種類の本発明のＤＮＡ転移動物のその他の利用可能性として、例えば、
（ｉ）組織培養のための細胞源としての使用、
（ｉｉ）本発明のＤＮＡ転移動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現されたポリペプチドまたは受容体組織を分析することによる、本発明の受容体により特異的に発現あるいは活性化するポリペプチドまたは受容体との関連性についての解析、
（ｉｉｉ）ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
（ｉｖ）上記（ｉｉｉ）記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
（ｖ）本発明の変異ポリペプチドまたは受容体を単離精製およびその抗体作製
などが考えられる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明の受容体の機能不活性型不応症などを含む、本発明の受容体に関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、本発明の受容体に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明のＤＮＡ転移動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどの蛋白質分解酵素により、遊離したＤＮＡ転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、本発明の受容体産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明の受容体およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明の受容体の機能不活性型不応症を含む、本発明の受容体に関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮＡ転移動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発明の受容体が関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。
本明細書において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ ：アデニン
Ｔ ：チミン
Ｇ ：グアニン
Ｃ ：シトシン
Ｉ ：イノシン
ＲＮＡ ：リボ核酸
ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＢＨＡ ：ベンズヒドリルアミン
ｐＭＢＨＡ ：ｐ−メチルベンズヒドリルアミン
Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル
Ｂｚｌ ：ベンジル
Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル
Ｂｏｃ ：ｔ−ブチルオキシカルボニル
ＤＣＭ ：ジクロロメタン
ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＤＣＣ ：Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＴＦＡ ：トリフルオロ酢酸
ＤＩＥＡ ：ジイソプロピルエチルアミン
Ｇｌｙ又はＧ ：グリシン
Ａｌａ又はＡ ：アラニン
Ｖａｌ又はＶ ：バリン
Ｌｅｕ又はＬ ：ロイシン
Ｉｌｅ又はＩ ：イソロイシン
Ｓｅｒ又はＳ ：セリン
Ｔｈｒ又はＴ ：スレオニン
Ｃｙｓ又はＣ ：システイン
Ｍｅｔ又はＭ ：メチオニン
Ｇｌｕ又はＥ ：グルタミン酸
Ａｓｐ又はＤ ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ又はＫ ：リジン
Ａｒｇ又はＲ ：アルギニン
Ｈｉｓ又はＨ ：ヒスチジン
Ｐｈｅ又はＦ ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ又はＹ ：チロシン
Ｔｒｐ又はＷ ：トリプトファン
Ｐｒｏ又はＰ ：プロリン
Ａｓｎ又はＮ ：アスパラギン
Ｇｌｎ又はＱ ：グルタミン
ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸
Ｔｙｒ（Ｉ） ：３−ヨードチロシン
ＤＭＦ ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
Ｔｒｔ ：トリチル
Ｐｂｆ ：２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾ
フラン−５−スルホニル
Ｃｌｔ ：２−クロロトリチル
Ｂｕｔ ：ｔ−ブチル
Ｍｅｔ（Ｏ） ：メチオニンスルフォキシド
ＤＮＰ ：ジニトロフェノール
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
ヒトＴＧＲ１２のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
配列番号：１で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕
実施例におけるＰＣＲ反応で使用したＴＧＲ１２用プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：４〕
実施例におけるＰＣＲ反応で使用したＴＧＲ１２用プローブの塩基配列を示す。
〔５′末端にリポーター色素としてＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）を、３′末端にはクエンチャーとしてＴＡＭＲＡ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）を標識した〕
〔配列番号：５〕
実施例におけるＰＣＲ反応で使用したＮＫ１受容体用標準ＤＮＡ（合成オリゴＤＮＡ）の塩基配列を示す。
〔配列番号：６〕
実施例におけるＰＣＲ反応で使用したＮＫ１受容体用プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：７〕
実施例におけるＰＣＲ反応で使用したＮＫ１受容体用プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：８〕
実施例におけるＰＣＲ反応で使用したＮＫ１受容体用プローブの塩基配列を示す。〔５′末端にリポーター色素としてＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）を、３′末端にはクエンチャーとしてＴＡＭＲＡ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）を標識した〕
〔配列番号：９〕
実施例におけるＰＣＲ反応で使用したＮＫ２受容体用標準ＤＮＡ（合成オリゴＤＮＡ）の塩基配列を示す。
〔配列番号：１０〕
実施例におけるＰＣＲ反応で使用したＮＫ２受容体用プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１〕
実施例におけるＰＣＲ反応で使用したＮＫ２受容体用プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２〕
実施例におけるＰＣＲ反応で使用したＮＫ２受容体用プローブの塩基配列を示す。〔５′末端にリポーター色素としてＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）を、３′末端にはクエンチャーとしてＴＡＭＲＡ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）を標識した〕
〔配列番号：１３〕
実施例におけるＰＣＲ反応で使用したＮＫ３受容体用標準ＤＮＡ（合成オリゴＤＮＡ）の塩基配列を示す。
〔配列番号：１４〕
実施例におけるＰＣＲ反応で使用したＮＫ３受容体用プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１５〕
実施例におけるＰＣＲ反応で使用したＮＫ３受容体用プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１６〕
実施例におけるＰＣＲ反応で使用したＮＫ３受容体用プローブの塩基配列を示す。〔５′末端にリポーター色素としてＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）を、３′末端にはクエンチャーとしてＴＡＭＲＡ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）を標識した〕
〔配列番号：１７〕
実施例におけるＰＣＲ反応で使用したＴＧＲ１２用標準ＤＮＡ（二本鎖ｃＤＮＡ）の塩基配列を示す。
〔配列番号：１８〕
実施例におけるＰＣＲ反応で使用したＴＧＲ１２用プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１９〕
実施例におけるＰＣＲ反応で使用したＶＩＰ１受容体用標準ＤＮＡ（合成オリゴＤＮＡ）の塩基配列を示す。
〔配列番号：２０〕
実施例におけるＰＣＲ反応で使用したＶＩＰ１受容体用プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２１〕
実施例におけるＰＣＲ反応で使用したＶＩＰ１受容体用プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２２〕
実施例におけるＰＣＲ反応で使用したＶＩＰ１受容体用プローブの塩基配列を示す。〔５′末端にリポーター色素としてＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）を、３′末端にはクエンチャーとしてＴＡＭＲＡ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）を標識した〕
〔配列番号：２３〕
実施例におけるＰＣＲ反応で使用したＶＩＰ２受容体用標準ＤＮＡ（合成オリゴＤＮＡ）の塩基配列を示す。
〔配列番号：２４〕
実施例におけるＰＣＲ反応で使用したＶＩＰ２受容体用プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２５〕
実施例におけるＰＣＲ反応で使用したＶＩＰ２受容体用プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２６〕
実施例におけるＰＣＲ反応で使用したＶＩＰ２受容体用プローブの塩基配列を示す。〔５′末端にリポーター色素としてＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）を、３′末端にはクエンチャーとしてＴＡＭＲＡ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）を標識した〕
〔配列番号：２７〕
実施例におけるＰＣＲ反応で使用したＰＡＣＡＰ受容体用標準ＤＮＡ（合成オリゴＤＮＡ）の塩基配列を示す。
〔配列番号：２８〕
実施例におけるＰＣＲ反応で使用したＰＡＣＡＰ受容体用プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２９〕
実施例におけるＰＣＲ反応で使用したＰＡＣＡＰ受容体用プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３０〕
実施例におけるＰＣＲ反応で使用したＰＡＣＡＰ受容体用プローブの塩基配列を示す。〔５′末端にリポーター色素としてＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）を、３′末端にはクエンチャーとしてＴＡＭＲＡ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）を標識した〕
〔配列番号：３１〕
ヒトＴＧＲ１２とＧＦＰの融合タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：３２〕
ｐＡＫＫＯ−１１１Ｈベクターに組み込んだヒトＴＧＲ１２の塩基配列を示す。
〔配列番号：３３〕
実施例におけるＰＣＲ反応で使用したヒトＴＮＦ−α用プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３４〕
実施例におけるＰＣＲ反応で使用したヒトＴＮＦ−α用プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３５〕
実施例におけるＰＣＲ反応で使用したヒトＴＮＦ−α用プローブの塩基配列を示す。〔５′末端にリポーター色素としてＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）を、３′末端にはクエンチャーとしてＴＡＭＲＡ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）を標識した〕
〔配列番号：３６〕
実施例におけるＰＣＲ反応で使用したヒトＴＮＦ−α用標準ＤＮＡ（合成オリゴＤＮＡ）の塩基配列を示す。
〔配列番号：３７〕
実施例におけるＰＣＲ反応で使用したヒトＣＣＬ−５用プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３８〕
実施例におけるＰＣＲ反応で使用したヒトＣＣＬ−５用プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３９〕
実施例におけるＰＣＲ反応で使用したヒトＣＣＬ−５用プローブの塩基配列を示す。〔５′末端にリポーター色素としてＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）を、３′末端にはクエンチャーとしてＴＡＭＲＡ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）を標識した〕
〔配列番号：４０〕
実施例におけるＰＣＲ反応で使用したヒトＣＣＬ−５用標準ＤＮＡ（合成オリゴＤＮＡ）の塩基配列を示す。
〔配列番号：４１〕
実施例におけるＰＣＲ反応で使用したヒトＣＣＬ−２用プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：４２〕
実施例におけるＰＣＲ反応で使用したヒトＣＣＬ−２用プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：４３〕
実施例におけるＰＣＲ反応で使用したヒトＣＣＬ−２用プローブの塩基配列を示す。〔５’末端にリポーター色素としてＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）を、３′末端にはクエンチャーとしてＴＡＭＲＡ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）を標識した〕
〔配列番号：４４〕
実施例におけるＰＣＲ反応で使用したヒトＣＣＬ−２用標準ＤＮＡ（合成オリゴＤＮＡ）の塩基配列を示す。
〔配列番号：４５〕
ヒトＴＧＲ１２とＧＦＰの融合タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
［実施例１］
生理活性ペプチドによるＴＧＲ１２依存的な細胞内カルシウム上昇作用
ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞（以下、ＣＨＯ）は、１０％ウシ胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地（インビトロジェン社）を用いて培養した。ＣＨＯに、ＴＧＲ１２をコードする塩基配列の終始コドンを除いた後に、ＧＦＰ（和光純薬）をコードする塩基配列を繋いだ塩基配列〔以下、ＴＧＲ１２−ＧＦＰ（配列番号：３１に表される塩基配列を有するＤＮＡ）と略する〕を組み込んだ動物細胞発現用ベクタープラスミドｐＡＫＫＯ−１１１Ｈ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２１９巻、２５１−２５９頁、１９９４年記載のｐＡＫＫＯ１．１１Ｈと同一のベクタープラスミド）を安定的に発現させることにより、ＴＧＲ１２−ＧＦＰ発現ＣＨＯ細胞株（以下、ＣＨＯ−ＴＧＲ１２）を樹立した。ＣＨＯ−ＴＧＲ１２は、１０％ウシ胎児透析血清を含む核酸不含α−ＭＥＭ培地（インビトロジェン社）を用いて培養した。
ＣＨＯ−ＴＧＲ１２を３０，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度となるよう９６穴プレートに播いて一晩培養後、培地を捨て４μＭのＦｌｕｏ３−ＡＭ（同仁化学）を含むアッセイバッファー〔Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（インビトロジェン社），２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（同仁化学）、２．５ｍＭ Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ（シグマ社）〕を１ウェルあたり１００μＬ添加し、１時間、３７℃で静置した。０．０５％のＣＨＡＰＳを含むアッセイバッファーで、下記に示す生理活性ペプチド（ペプチド研究所）またはカルシウムイオノフォアＡ２３１８７（和光純薬）を希釈した。アッセイバッファーで細胞を洗浄後、ＦＬＩＰＲ（モレキュラーデバイス社）を用いて、細胞内カルシウム変動に伴う蛍光の測定を行った。サンプルは、アッセイ開始１０秒後に５０μＬを５０μＬ／秒の速度で添加した。蛍光の測定は、最初の６０秒間は１秒毎、次の１２０秒間は６秒間毎に行い、３分間の間で最も高い蛍光強度をその刺激条件における最大活性とし、３ウェルの平均で求めた。ＥＣ５０値の算出はＧｒａｐｈｐａｄ ＰＲＩＳＭ ４（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を用いて行った。
その結果、アッセイバッファー添加におけるカルシウム上昇作用の最大活性は３６３、１μＭのＡ２３１８７による刺激におけるカルシウム上昇作用の最大活性は２７３７９であった。
サブスタンスＰ刺激によるカルシウム上昇作用の最大活性は、０．３ｎＭにおいては１９４、３ｎＭにおいては５０、３０ｎＭにおいては２０６、３００ｎＭにおいては１５６１０、３０００ｎＭにおいては２３８４２であった。
コルチスタチン−１７刺激によるカルシウム上昇作用の最大活性は、０．３ｎＭにおいては６７、３ｎＭにおいては５４、３０ｎＭにおいては９４、３００ｎＭにおいては１７９１４、３０００ｎＭにおいては２３６４７であった。
ＰＡＭＰ−１２刺激によるによるカルシウム上昇作用の最大活性は、０．３ｎＭにおいては２５５、３ｎＭにおいては１６１７、３０ｎＭにおいては２２２９１、３００ｎＭにおいては２４０８８、３０００ｎＭにおいては２３７４３であった。
ＰＡＣＡＰ−２７刺激によるによるカルシウム上昇作用の最大活性は、０．３ｎＭにおいては４８、３ｎＭにおいては５８、３０ｎＭにおいては９３９、３００ｎＭにおいては２３０３０、３０００ｎＭにおいては２３７２８であった。
ＰＡＣＡＰ−３８刺激によるによるカルシウム上昇作用の最大活性は、０．３ｎＭにおいては２８７、３ｎＭにおいては４１０、３０ｎＭにおいては１９５、３００ｎＭにおいては２３０４３、３０００ｎＭにおいては２３３１５であった。
ＶＩＰ刺激によるによるカルシウム上昇作用の最大活性は、０．３ｎＭにおいては５６、３ｎＭにおいては６０、３０ｎＭにおいては１６、３００ｎＭにおいては１１１５３、３０００ｎＭにおいては２４００７であった。
また、ＣＨＯ−ＴＧＲ１２に対するカルシウム上昇作用のＥＣ５０値は、サブスタンスＰにおいて約２３７ｎＭ、コルチスタチン−１７において約２１８ｎＭ、ＰＡＭＰ−１２において約９８ｎＭ、ＰＡＣＡＰ−２７において約９３ｎＭ、ＰＡＣＡＰ−３８において約１６１ｎＭ、ＶＩＰにおいて約３０５ｎＭであった。
これらの結果より、サブスタンスＰ、コルチスタチン−１７およびＰＡＭＰ−１２が、ＴＧＲ１２のリガンドであることが示された。また、ＰＡＣＡＰ−２７、ＰＡＣＡＰ−３８およびＶＩＰが、ＴＧＲ１２のリガンドであることが分かった。
［実施例２］
（１）ヒト肥満細胞株ＬＡＤ２でのＴＧＲ１２、ＮＫ受容体、ＶＩＰ受容体およびＰＡＣＡＰ受容体遺伝子の発現量の定量
米国Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈから購入したヒト肥満細胞株ＬＡＤ２を、１００ｎｇ／ｍＬのｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ（免疫生物研究所）を含むＳｔｅｍＰｒｏ−３４培地（インビトロジェン社）を用いて培養した。ＬＡＤ２からＲＮｅａｓｙおよびＤＮａｓｅ Ｉ ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡ画分を調製した。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ １μｇを鋳型に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（インビトロジェン社）を用いて、添付のマニュアルにしたがってランダムプライマーを用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを作製した。得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡ ２５ｎｇ相当の逆転写産物または後述の標準ＤＮＡ、１ ｘ Ｕｎｉｖｅｒｓｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）、後述のプライマー各２００ｎＭ、およびＴａｑＭａｎプローブ２００ｎＭを含む反応混合液２５μＬについてＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（アプライドバイオシステムズ社）を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、５０℃・２分、９５℃・１０分で処理後、９５℃・１５秒、６０℃・６０秒のサイクルを４０回繰り返すことにより行なった。発現量はＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ ＳＤＳソフトウェアによって算出した。リポーターの蛍光強度が設定された値に達した瞬間のサイクル数を縦軸にとり、また標準ＤＮＡの初期濃度の対数値を横軸にとって標準曲線を作成した。標準曲線より各逆転写産物の初期濃度を算出し、各部位のヒトＴＧＲ１２、ＮＫ１受容体、ＮＫ２受容体、ＮＫ３受容体、ＶＩＰ１受容体、ＶＩＰ２受容体およびＰＡＣＡＰ受容体遺伝子の発現量を求めた。
その結果、ＬＡＤ２において、ＴＧＲ１２（配列番号：１７で表される塩基配列を有するＴＧＲ１２用標準ＤＮＡ、配列番号：１８で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号：３で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号：４で表される塩基配列を有するＴａｑＭａｎプローブを使用）の発現量は、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ２５ｎｇあたり６８７４７４コピーであった。
ＬＡＤ２において、ＮＫ１受容体（配列番号：５で表される塩基配列を有するＮＫ１受容体用標準ＤＮＡ、配列番号：６で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号：７で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号：８で表される塩基配列を有するＴａｑＭａｎプローブを使用）のｔｏｔａｌ ＲＮＡ ２５ｎｇあたりの発現量は５０コピーであった。
ＬＡＤ２において、ＮＫ２受容体（配列番号：９で表される塩基配列を有するＮＫ２受容体標準ＤＮＡ、配列番号：１０で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号：１１で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号：１２で表される塩基配列を有するＴａｑＭａｎプローブを使用）のｔｏｔａｌ ＲＮＡ ２５ｎｇあたりの発現量は１コピーであった。
ＬＡＤ２において、ＮＫ３受容体（配列番号：１３で表される塩基配列を有するＮＫ３受容体標準ＤＮＡ、配列番号：１４で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号：１５で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号：１６で表される塩基配列を有するＴａｑＭａｎプローブを使用した）のｔｏｔａｌ ＲＮＡ ２５ｎｇあたりの発現量は１コピーであった。
ＬＡＤ２において、ＶＩＰ１受容体（配列番号：１９で表される塩基配列を有する受容体用標準ＤＮＡ、配列番号：２０で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号：２１で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号：２２で表される塩基配列を有するＴａｑＭａｎプローブを使用）のｔｏｔａｌ ＲＮＡ ２５ｎｇあたりの発現量は２１９コピー、ＶＩＰ２受容体（配列番号：２３で表される塩基配列を有する受容体標準ＤＮＡ、配列番号：２４で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号：２５で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号：２６で表される塩基配列を有するＴａｑＭａｎプローブを使用）のｔｏｔａｌ ＲＮＡ ２５ｎｇあたりの発現量は１７９コピーであった。
ＬＡＤ２において、ＰＡＣＡＰ受容体（配列番号：２７で表される塩基配列を有する受容体標準ＤＮＡ、配列番号：２８で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号：２９で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号：３０で表される塩基配列を有するＴａｑＭａｎプローブを使用した）のｔｏｔａｌ ＲＮＡ ２５ｎｇあたりの発現量は１８コピーであった。
これにより、ＬＡＤ２において、ＴＧＲ１２が高発現していることが分かった。また、ＬＡＤ２において、ＮＫ１、ＮＫ２、ＮＫ３、ＶＩＰ１、ＶＩＰ２およびＰＡＣＡＰ受容体が低発現であることが分かった。
［実施例３］
ＴＧＲ１２リガンド依存的なヒト肥満細胞の脱顆粒促進
ヒト肥満細胞株ＬＡＤ２は、１００ｎｇ／ｍＬのｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ（免疫生物研究所）を含むＳｔｅｍＰｒｏ−３４培地（インビトロジェン社）を用いて培養した。ＬＡＤ２をタイロード緩衝液（１２６ｍＭ ＮａＣｌ，４．０ｍＭ ＫＣｌ，０．６９ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４，５．６ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ，１ｍＭ ＣａＣｌ２，１ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．１％ ＢＳＡ）で洗浄し、９６穴プレートに１ウェルあたり１５０μＬずつ、２００００個のＬＡＤ２を分注し、３７℃で５分間インキュベートした。次いで、５０μＬの各種濃度のＴＧＲ１２リガンド（ペプチド研究所）を含むタイロード緩衝液を加えて、さらに３７℃で２０分間インキュベートし、脱顆粒を誘導した。脱顆粒アッセイ上清中のβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ活性を以下のように測定することにより、脱顆粒の程度を測定した。上清を９６穴プレートに分注し、上清の５倍量の０．１Ｍ Ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ４．５）／１ｍＭ ４−ｍｅｔｈｙｌ ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ−２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（和光純薬）を添加して、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、反応液の０．１倍量の０．２Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ／ＮａＣＯ３（ｐＨ１０．７）を添加することにより反応を停止させ、Ｆｕｓｉｏｎ−α（パーキンエルマー社）で測定を行った。β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ活性は、また、ＬＡＤ２を４回凍結融解し、遠心分離を行った後の上清中における活性をＬＡＤ２中の全β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ活性とし、脱顆粒の程度は全β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ活性に対するＬＡＤ２上清中のβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ活性の割合で示した。
その結果、自発的脱顆粒は約１．５％であった。
サブスタンスＰ刺激による脱顆粒は、１０ｎＭにおいては１．８％、３０ｎＭにおいては８．７％、１００ｎＭにおいては３９．２％、３００ｎＭにおいては５８．１％、１μＭにおいては６６．８％、３μＭにおいては７１．０％であった。
コルチスタチン−１７刺激による脱顆粒は、１０ｎＭにおいては１．６％、３０ｎＭにおいては２．８％、１００ｎＭにおいては２６．５％、３００ｎＭにおいては５２．８％、１μＭにおいては６２．２％、３μＭにおいては５８．９％であった。
ＰＡＭＰ−１２刺激による脱顆粒は、３ｎＭにおいては６．３％、１０ｎＭにおいては３０．７％、３０ｎＭにおいては５２．１％、１００ｎＭにおいては６５．２％、３００ｎＭにおいては６７．７％、１μＭにおいては６９．３％であった。
ＰＡＣＡＰ−２７刺激による脱顆粒は、１０ｎＭにおいては２．６％、３０ｎＭにおいては１９．６％、１００ｎＭにおいては５９．４％、３００ｎＭにおいては７１．１％、１μＭにおいては７５．１％、３μＭにおいては６９．１％であった。
ＰＡＣＡＰ−３８刺激による脱顆粒は、１０ｎＭにおいては７．４％、３０ｎＭにおいては２４．８％、１００ｎＭにおいては４９．４％、３００ｎＭにおいては６５．８％、１μＭにおいては６８．９％、３μＭにおいては６３．３％であった。
ＰＡＣＡＰ−３８刺激による脱顆粒は、１０ｎＭにおいては７．４％、３０ｎＭにおいては２４．８％、１００ｎＭにおいては４９．４％、３００ｎＭにおいては６５．８％、１μＭにおいては６８．９％、３μＭにおいては６３．３％であった。
ＶＩＰ刺激による脱顆粒は、１０ｎＭにおいては１．５％、３０ｎＭにおいては４．０％、１００ｎＭにおいては３６．７％、３００ｎＭにおいては６３．９％、１μＭにおいては７１．７％、３μＭにおいては７６．１％であった。
ＬＡＤ２に対する脱顆粒反応のＥＣ５０値は、サブスタンスＰにおいて約９１ｎＭ、コルチスタチン−１７において約１２２ｎＭ、ＰＡＭＰ−１２において約１３ｎＭ、ＰＡＣＡＰ−２７において約５１ｎＭ、ＰＡＣＡＰ−３８において約５１ｎＭ、ＶＩＰにおいて約１０５ｎＭであった。
これより、サブスタンスＰ、コルチスタチン−１７、ＰＡＭＰ−１２、ＰＡＣＡＰ−２７、ＰＡＣＡＰ−３８およびＶＩＰ依存的に、ヒト肥満細胞株ＬＡＤ２の脱顆粒が誘導されることが分かった。
［実施例４］
サブスタンスＰ依存的なヒト肥満細胞の脱顆粒促進に対するＮＫ１受容体アンタゴニストの作用
ヒト肥満細胞株ＬＡＤ２は、１００ｎｇ／ｍＬのｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ（免疫生物研究所）を含むＳｔｅｍＰｒｏ−３４培地（インビトロジェン社）を用いて培養した。ＬＡＤ２をタイロード緩衝液（１２６ｍＭ ＮａＣｌ，４．０ｍＭ ＫＣｌ，０．６９ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４，５．６ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ，１ｍＭ ＣａＣｌ２，１ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．１％ ＢＳＡ）で洗浄し、９６穴プレートに１ウェルあたり１００μＬずつ、２００００個のＬＡＤ２を分注し、３７℃で５分間インキュベートした。次いで、５０μＬの各種濃度のＮＫ１アンタゴニストＧＲ−８２３３４（シグマ社）またはＬ−７０３６０６（シグマ社）を含むタイロード緩衝液を加えて、３７℃で５分間インキュベートした。次いで、５０μＬのサブスタンスＰ溶液（終濃度０．３μＭ；ペプチド研究所）またはカルシウムイオノフォアＡ２３１８７溶液（終濃度０．３μＭ；和光純薬）を含むタイロード緩衝液を加えて、さらに３７℃で２０分間インキュベートし、脱顆粒を誘導した。脱顆粒アッセイ上清中のβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ活性を以下のように測定することにより、脱顆粒の程度を測定した。上清を９６穴プレートに分注し、上清の５倍量の０．１Ｍ Ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ４．５）／１ｍＭ ４−ｍｅｔｈｙｌ ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ−２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（和光純薬）を添加して、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、反応液の０．１倍量の０．２Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ／ＮａＣＯ３（ｐＨ１０．７）を添加することにより反応を停止させ、Ｆｕｓｉｏｎ−α（パーキンエルマー社）で測定を行った。ＬＡＤ２を４回凍結融解し、遠心分離を行った後の上清中における活性を、ＬＡＤ２中の全β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ活性とした。ＮＫ１受容体アンタゴニストによる阻害活性は、ＮＫ１受容体アンタゴニスト非添加におけるβ−Ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ活性に対する、各種濃度のＮＫ１アンタゴニスト添加時におけるβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ活性の割合（％）で示した。
その結果、サブスタンスＰ刺激における、ＮＫ１受容体ペプチド性アンタゴニストＧＲ−８２３３４（シグマ社）添加による脱顆粒は、ＧＲ−８２３３４が１００ｎＭにおいて１０１．２％、３００ｎＭにおいて１０５．７％、１μＭにおいて１０２．７％、３μＭにおいて９９．６％、１０μＭにおいて９５．８％、３０μＭにおいて９９．５％であった。
Ａ２３１８７刺激における、ＧＲ−８２３３４添加による脱顆粒は、ＧＲ−８２３３４が１００ｎＭにおいて１０１．１％、３００ｎＭにおいて１０２．０％、１μＭにおいて１０２．０％、３μＭにおいて１０２．８％、１０μＭにおいて１０３．２％、３０μＭにおいて１０２．４％であった。
サブスタンスＰ刺激における、ＮＫ１受容体低分子性アンタゴニストＬ−７０３６０６（シグマ社）添加による脱顆粒は、Ｌ−７０３６０６が１００ｎＭにおいて１０１．１％、３００ｎＭにおいて９７．９％、１μＭにおいて９８．８％、３μＭにおいて１００．０％、１０μＭにおいて３９．４％、３０μＭにおいて３．２％であった。
Ａ２３１８７刺激における、Ｌ−７０３６０６添加による脱顆粒は、Ｌ−７０３６０６が１００ｎＭにおいて９８．４％、３００ｎＭにおいて９７．２％、１μＭにおいて９７．４％、３μＭにおいて９１．５％、１０μＭにおいて３７．１％、３０μＭにおいて２．４％であった。
これより、ＮＫ１受容体ペプチド性アンタゴニストＧＲ−８２３３４は、サブスタンスＰおよびＡ２３１８７刺激による脱顆粒を、０．１Ｍから３０μＭの濃度範囲で抑制しないことが分かった。また、ＮＫ１受容体低分子性アンタゴニストＬ−７０３６０６は、サブスタンスＰおよびＡ２３１８７刺激による脱顆粒を、０．１Ｍから３μＭの濃度範囲で抑制せず、１０μＭから３０μＭの濃度範囲ではＴＧＲ１２およびＮＫ１受容体非特異的に抑制することが分かった。
サブスタンスＰ受容体として知られているＮＫ１受容体のアンタゴニストが、サブスタンスＰによるＴＧＲ１２依存的な脱顆粒反応を阻害しなかったことより、ＮＫ１受容体アンタゴニストではなく、ＴＧＲ１２のアンタゴニストが、サブスタンスＰによる脱顆粒反応の抑制剤になりうると考える。
［実施例５］
サブスタンスＰのヒトＴＧＲ１２発現ＣＨＯ細胞に対するＭＡＰＫ活性化作用
ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞（以下、ＣＨＯ）は、１０％ウシ胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地（インビトロジェン社）を用いて培養した。ＣＨＯに、ヒトＴＧＲ１２の開始コドンから終始コドンを含む塩基配列（配列番号：３２に表される塩基配列を有するＤＮＡ）を組み込んだ動物細胞発現用ベクタープラスミドｐＡＫＫＯ−１１１Ｈ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２１９巻、２５１−２５９頁、１９９４年記載のｐＡＫＫＯ１．１１Ｈと同一のベクタープラスミド）を安定的に発現させることにより、ヒトＴＧＲ１２発現ＣＨＯ細胞株（以下、ＣＨＯ−ＴＧＲ１２）を樹立した。ＣＨＯ−ＴＧＲ１２は、１０％ウシ胎児透析血清を含む核酸不含α−ＭＥＭ培地（インビトロジェン社）を用いて培養した。
細胞の調製は以下のように行った。ＣＨＯ−ＴＧＲ１２を０．０５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ）で剥がし、培地（ＭＥＭ−α（ＧＩＢＣＯ），１０％ ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）ペニシリン／ストレプトマイシン（ＢＩＯＷＨＩＴＴＡＫＥＲ））で懸濁して遠心分離後、沈殿した細胞を培地で２ ｘ １０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに懸濁して１ｍＬずつ１２ｗｅｌｌの細胞培養用ディッシュに播いた。一晩ＣＯ２インキュベーター内で培養後、培地をアスピレーションしＰＢＳで洗浄後、無血清培地（ＭＥＭ−α（ＧＩＢＣＯ），ペニシリン／ストレプトマイシン（ＢＩＯＷＨＩＴＴＡＫＥＲ））を１ｍＬ添加し、ＣＯ２インキュベーター内で培養した。百日咳毒素（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｔｏｘｉｎ；以下、ＰＴＸ）は最終濃度が０．１μｇ／ｍＬになるようにアッセイの４時間前に添加した。
細胞の活性化は以下のように行った。培地をアスピレーションしＰＢＳで洗浄後、アッセイバッファー（ＨＢＳＳ（ＧＩＢＣＯ），１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（同仁化学研究所））を７５０μＬ添加し、１５分間３７℃でプレインキュベーションした。サブスタンスＰ溶液およびポジティブコントロールであるＡＴＰ溶液を２５０μＬ添加し、３７℃でインキュベーションした後、急冷により反応を停止させた。アッセイバッファーをアスピレーションしＰＢＳで洗浄後、１×ＬＤＳサンプルバッファー／ＤＴＴを細胞に添加して回収し、３０秒間超音波処理後、７０℃で１０分間加熱し急冷させた。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングによる検出は以下のように行った。１０％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて分離後、Ｉｍｍｕｎｅ−Ｂｌｏｔ ＰＶＤＦ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）に転写させた。メンブレンをＢｌｏｃｋ Ａｃｅ（大日本製薬）でブロッキングし、一次抗体（Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰ Ｋｉｎａｓｅ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｈｒ２０４）Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＣＳＴ）またはｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰ Ｋｉｎａｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＣＳＴ））を用いて室温において１時間インキュベーションした後、二次抗体（Ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（ＣＳＴ））を用いて室温において１時間インキュベーションした。抗体反応後のメンブレンを、ＥＣＬ ＰＬＵＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で化学発光させ、ＬＡＳ１０００（ＦＵＪＩ ＦＩＬＭ）を用いて検出および画像解析を行った。
その結果、ＣＨＯ−ＴＧＲ１２を、サブスタンスＰで刺激すると、ＥＲＫ１／２（ｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰ Ｋｉｎａｓｅ）のリン酸化が認められた。ＣＨＯ−ＴＧＲ１２のサブスタンスＰによるＥＲＫ１／２（ｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰ Ｋｉｎａｓｅ）のリン酸化は、刺激後１０分前後で最大反応を示し、刺激後３０分においてもリン酸化は認められた。また、ＣＨＯ−ＴＧＲ１２のサブスタンスＰによるＥＲＫ１／２（ｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰ Ｋｉｎａｓｅ）のリン酸化はＰＴＸを前処理することにより減弱したが、ＡＴＰによるＥＲＫ１／２（ｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰ Ｋｉｎａｓｅ）のリン酸化はＰＴＸの前処理による減弱は認められなかった
［実施例６］
ＴＧＲ１２リガンドによるヒト肥満細胞のＴＮＦ−α、ＣＣＬ−２、ＣＣＬ−５の発現亢進作用
ヒト肥満細胞株ＬＡＤ２は、１００ｎｇ／ｍＬのｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ（免疫生物研究所）を含むＳｔｅｍＰｒｏ−３４培地（インビトロジェン社）を用いて培養した。サブスタンスＰ刺激時における発現量の計時変化を解析した実験において、ＬＡＤ２を３００×ｇで５分間遠心分離後、沈殿した細胞を計数し、培地で６．６７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに懸濁して７５０μＬずつ２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播いて、３７℃のＣＯ２インキュベーターで３０分間静置した。次いで、２５０μＬの最終濃度１μＭのサブスタンスＰ（ペプチド研究所）を含む培地あるいは培地のみを加えて、さらに３７℃のＣＯ２インキュベーターで０．５、２、８、２４時間インキュベートした。アッセイはそれぞれの反応条件についてｎ＝３で行った。０．５、２、８、２４時間後に、プレートを氷冷してＬＡＤ２の活性化を停止させ、３００×ｇで５分間遠心分離を行い、沈殿した細胞からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて、添付のプロトコールに従ってｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。また、種々のＴＧＲ１２リガンド刺激時における発現量を解析した実験において、ＬＡＤ２を３００×ｇで５分間遠心分離後、沈殿した細胞を計数し、培地で１．３３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに懸濁して７５０μＬずつ２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播いて、３７℃のＣＯ２インキュベーターで３０分間静置した。次いで、２５０μＬの最終濃度１μＭのコルチスタチン−１７、ＰＡＭＰ−１２、ＰＡＣＡＰ−２７、ＶＩＰ（ペプチド研究所）を含む培地あるいは培地のみを加えて、さらに３７℃のＣＯ２インキュベーターで２時間インキュベートした。アッセイはそれぞれの反応条件についてｎ＝３で行った。２時間後に、プレートを氷冷してＬＡＤ２の活性化を停止させ、３００×ｇで５分間遠心分離を行い、沈殿した細胞からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて、添付のプロトコールに従ってｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。上記のように得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡを、Ｅｔｈａｃｈｉｎｍａｔｅを用いて、添付のプロトコールに従って濃縮し、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏに溶解した。次に、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ １μｇ分を用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（インビトロジェン社）により、以下の方法で逆転写反応を行い、一本鎖ｃＤＮＡを作成した。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ溶液にＲａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ（インビトロジェン社）０．１μｇ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ（インビトロジェン社）１μＬを加え、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏを加えて全量を１２μＬとした後，７０℃で１０分間インキュベーションし、１分間氷冷した。５×Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅに添付）４μＬ、０．１Ｍ ＤＴＴ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅに添付）２μＬ、ＲＮａｓｅＯＵＴ（インビトロジェン社）１μＬおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ １μＬを加えて、４２℃で５０分間インキュベーション後、７０℃で１５分間インキュベーションし、５分間氷冷した。このようにして得られたｃＤＮＡを、Ｅｔｈａｃｈｉｎｍａｔｅを用いて、添付のプロトコールに従って精製し、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ Ｂｕｆｆｅｒ（フルカ社）に溶解した。
以下のＴａｑＭａｎ ＰＣＲにおいて、ヒトＴＮＦ−α定量用のプライマーとして、ｈＴＮＦａｌｐｈａ−ｔＦ（配列番号：３３）およびｈＴＮＦａｌｐｈａ−ｔＲ（配列番号：３４）を、プローブとしてｈＴＮＦａｌｐｈａ−ｔＰ（配列番号：３５）を、スタンダードとしてｈＴＮＦａｌｐｈａ−ｓｔａｎｄａｒｄ（配列番号：３６）を用いた。ヒトＣＣＬ−５定量用のプライマーとして、ｈＣＣＬ５−ｔＦ（配列番号：３７）およびｈＣＣＬ５−ｔＲ（配列番号：３８）を、プローブとしてｈＣＣＬ５−ｔＰ（配列番号：３９）を、スタンダードとしてｈＣＣＬ５ ｓｔａｎｄａｒｄ（配列番号：４０）を用いた。ヒトＣＣＬ−２定量用のプライマーとして、ｈＣＣＬ２−ｔＦ（配列番号：４１）およびｈＣＣＬ２−ｔＲ（配列番号：４２）を、プローブとしてｈＣＣＬ２−ｔＰ（配列番号：４３）を、スタンダードとしてｈＣＣＬ２ ｓｔａｎｄａｒｄ（配列番号：４４）を用いた。
ＴａｑＭａｎ ＰＣＲは、それぞれのサンプルについてｎ＝２で行い、１２．５ｎｇ ｔｏｔａｌ ＲＮＡを鋳型に用いて１５μｌの液量で行った。反応液の組成は、プライマー ９００ｎＭ、プローブ ２５０ｎＭ、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）１／２ｖｏｌｕｍｅとした。反応および解析はＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴ Ｓｅｑｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社）により行った。反応サイクルは、５０℃で２分間保温し、次に９５℃で１０分間保温した後，９５℃・１５秒間６０℃・１分間のサイクルを４０回行った。遺伝子発現量は、検量線のＣｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｃｏｅｆｆ値が０．９９５以上になるように解析を行ない算出した。
発現解析の結果を以下に示す。発現量の値は標準ＤＮＡを元に算出したｍＲＮＡのコピー数として、ｎ＝３の平均値で示した。
サブスタンスＰ刺激時における発現量の計時変化を解析した実験結果を以下に示す。無刺激時において、ＬＡＤ２のＴＮＦ−αの発現量は１０１１８コピーであった。サブスタンスＰ刺激時における、ＬＡＤ２のＴＮＦ−αの発現量は、刺激後０．５時間において５６０６５コピー、刺激後２時間において１３４６２９３コピー、刺激後８時間において５４３１３コピー、刺激後２４時間において４３３２コピーであった。一方、培地のみ添加時における、ＬＡＤ２のＴＮＦ−αの発現量は、刺激後０．５時間において９６６８コピー、刺激後２時間において６６８９コピー、刺激後８時間において６０３５コピー、刺激後２４時間において４８８６コピーであった。また、無刺激時において、ＬＡＤ２のＣＣＬ−５の発現量は１５７２１コピーであった。サブスタンスＰ刺激時における、ＬＡＤ２のＣＣＬ−５の発現量は、刺激後０．５時間において３８１０７コピー、刺激後２時間において８８８７２コピー、刺激後８時間において６９９２１コピー、刺激後２４時間において５３６０５コピーであった。一方、培地のみ添加時における、ＬＡＤ２のＣＣＬ−５の発現量は、刺激後０．５時間において１４５８５コピー、刺激後２時間において１５６２５コピー、刺激後８時間において１２５３８コピー、刺激後２４時間において１５００３コピーであった。
種々のＴＧＲ１２リガンド刺激時における発現量を解析した実験結果を以下に示す。無刺激時において、ＬＡＤ２のＴＮＦ−αの発現量は１７３１コピーであった。刺激２時間後のＬＡＤ２のＴＮＦ−αの発現量は、培地のみ添加時において１３３１コピー、サブスタンスＰ刺激時において１７３４６２コピー、コルチスタチン−１７刺激時において１６３５５１コピー、ＰＡＭＰ−１２刺激時において８９１８コピー、ＰＡＣＡＰ−２７刺激時において２１９５９７コピー、ＶＩＰ刺激時において１７６６３０コピーであった。また、無刺激時において、ＬＡＤ２のＣＣＬ−５の発現量は３０３４１コピーであった。刺激２時間後のＬＡＤ２のＣＣＬ−５の発現量は、培地のみ添加時において２３５０１コピー、サブスタンスＰ刺激時において４７１１７コピー、コルチスタチン−１７刺激時において４７３２２コピー、ＰＡＭＰ−１２刺激時において３４５６６コピー、ＰＡＣＡＰ−２７刺激時において４８２４２コピー、ＶＩＰ刺激時において４５０１５コピーであった。また、無刺激時において、ＬＡＤ２のＣＣＬ−２の発現量は６４３２２４コピーであった。刺激２時間後のＬＡＤ２のＣＣＬ−２の発現量は、培地のみ添加時において４０４１１２コピー、サブスタンスＰ刺激時において２６９４８３７コピー、コルチスタチン−１７刺激時において２９４４６２２コピー、ＰＡＭＰ−１２刺激時において１１４３２４８コピー、ＰＡＣＡＰ−２７刺激時において３８０９８７３コピー、ＶＩＰ刺激時において３６３０２８６コピーであった。
［実施例７］
ＴＧＲ１２リガンドによるＴＧＲ１２に対する競合結合試験
競合結合試験に用いた［１２５Ｉ］標識ラットコルチスタチン１４（Ｔｙｒ０）（以下、［１２５Ｉ］−ｒＣＳＴ１４（Ｙ０））は、以下のように調製した。ｒＣＳＴ１４（Ｙ０）（フナコシ社）３ｎｍｏｌ／６μＬ、１０μｇ／ｍＬ ｌａｃｔｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ｉｎ ０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７，４））６μＬ、０．００１％ Ｈ２Ｏ２ ６μＬ、３７ＭＢｑ ＮａＩ ６μＬ（ｃｏｌｄ ｒｕｎでは１５ｍｇ／１００ｍＬ ＮａＩ ６μＬを用いた）を混合後、室温で２０分間反応し、ＨＰＬＣでモノヨード体を分取したところ、２４ｍｉｎ．前後の画分（ｃｏｌｄ ｒｕｎにおけるＭＳ解析でｒＣＳＴ１４（Ｙ０）のモノヨード体と同じ分子量を持つことが確認されている）に放射活性が回収された。分画にはＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭを使用し、Ａ液として１０％ ＭｅＣＮ／０．１％ ＴＦＡ、Ｂ液として６０％ ＭｅＣＮ／０．１％ ＴＦＡを用いて、ｇｒａｄｉｅｎｔは０−２５（２ｍｉｎ．），２５−２７．５（３ｍｉｎ．），２７．５−３５（６０ｍｉｎ．）と設定し、流速は１ｍＬ／ｍｉｎ．とした。
ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞（以下、ＣＨＯ）は、１０％ウシ胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地（インビトロジェン社）を用いて培養した。ＣＨＯに、ＴＧＲ１２の塩基配列の終始コドンを除いた後にＧＦＰ（和光純薬）の塩基配列を繋いだ塩基配列（以下、ＴＧＲ１２−ＧＦＰ（配列番号：４５に表される塩基配列を有するＤＮＡ））を組み込んだ動物細胞発現用ベクタープラスミドｐＡＫＫＯ−１１１Ｈ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２１９巻、２５１−２５９頁、１９９４年記載のｐＡＫＫＯ１．１１Ｈと同一のベクタープラスミド）を安定的に発現させることにょり、ＴＧＲ１２−ＧＦＰ発現ＣＨＯ細胞株（以下、ＣＨＯ−ＴＧＲ１２ＧＦＰ）を樹立した。ＣＨＯ−ＴＧＲ１２ＧＦＰは、１０％ウシ胎児透析血清を含む核酸不含α−ＭＥＭ培地（インビトロジェン社）を用いて培養した。
ＣＨＯ−ＴＧＲ１２ＧＦＰを用いた結合試験は以下のように行った。種々の生理活性ペプチドは、ペプチド研究所から購入した。ＣＨＯ−ＴＧＲ１２ＧＦＰを２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度で播種して一晩培養後、氷冷したアッセイバッファー（ＭＥＭ−α，２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４），０．０５％ ＢＳＡ）で３回洗浄し、２５０μＬのアッセイバッファーを添加した後、２５０μＬのアッセイバッファーに懸濁した［１２５Ｉ］−ｒＣＳＴ１４（Ｙ０）／生理活性ペプチド溶液を添加（［１２５Ｉ］−ｒＣＳＴ１４（Ｙ０）の最終濃度は２００ｐＭ）し、４℃で２時間静置した。５００μＬのアッセイバッファーで３回洗浄後、２５０μＬの０．５Ｎ ＮａＯＨで細胞を溶解して回収し、放射活性の測定を行った。
これにより、非特異的結合活性を１０μＭのラットコルチスタチン１４の活性として見積もり、Ｈｉｌｌプロット解析からそれぞれのペプチドのＩＣ５０値を解析した結果、サブスタンスＰでは２８８６ｎＭ，ヒトコルチスタチン１７では４７ｎＭ，ヒトＰＡＭＰ１２では１８ｎＭ，ヒトＰＡＣＡＰ２７では２６４ｎＭ，ヒトＰＡＣＡＰ３８では４７ｎＭ，ヒトＶＩＰでは２０３９ｎＭであった
［実施例８］
ＴＧＲ１２リガンドによるヒトＴＧＲ１２発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞における細胞内カルシウム上昇作用と脱顆粒促進作用
ＲＢＬ−２Ｈ３（以下、ＲＢＬ２Ｈ３）は、１０％ウシ胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地（インビトロジェン社）を用いて培養した。ＲＢＬ−２Ｈ３に、ヒトＴＧＲ１２の開始コドンから終始コドンを含む塩基配列（配列番号：３２に表される塩基配列を有するＤＮＡ）を組み込んだ動物細胞発現用ベクタープラスミドｐｃＤＮＡ３．１を安定的に発現させることにより、ヒトＴＧＲ１２発現ＲＢＬ−２Ｈ３細胞株（以下、ＲＢＬ２Ｈ３−ＴＧＲ１２）を樹立した。ＲＢＬ２Ｈ３−ＴＧＲ１２は、１０％ウシ胎児血清と２００μｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎを含むα−ＭＥＭ培地（インビトロジェン社）を用いて培養した。
細胞内カルシウム上昇活性は以下のように測定した。ＲＢＬ２Ｈ３およびＲＢＬ２Ｈ３−ＴＧＲ１２を４０，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度となるよう９６穴プレートに播いて一晩培養後、培地を捨て４μＭのＦｌｕｏ３−ＡＭ（同仁化学）を含むアッセイバッファー〔Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（インビトロジェン社），２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（同仁化学）、２．５ｍＭ Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ（シグマ社）〕を１ウェルあたり１００μＬ添加し、１時間、３７℃で静置した。０．０５％のＣＨＡＰＳを含むアッセイバッファーで、種々のＴＧＲ１２（ペプチド研究所）またはカルシウムイオノフォアＡ２３１８７（和光純薬）を希釈した。アッセイバッファーで細胞を洗浄後、ＦＬＩＰＲ（モレキュラーデバイス社）を用いて、細胞内カルシウム変動に伴う蛍光の測定を行った。サンプルは、アッセイ開始１０秒後に５０μＬを５０μＬ／秒の速度で添加した。蛍光の測定は、最初の６０秒間は１秒毎、次の１２０秒間は６秒間毎に行い、３分間の間で最も高い蛍光強度をその刺激条件における最大活性とし、３ウェルの平均で求めた。ＥＣ５０値の算出はＧｒａｐｈｐａｄ ＰＲＩＳＭ ４（Ｇｒａｏｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を用いて行った。
脱顆粒促進作用は以下のように測定した。ＲＢＬ２Ｈ３およびＲＢＬ２Ｈ３−ＴＧＲ１２を４０，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度となるよう９６穴プレートに播いて一晩培養後、培地を捨ててタイロード緩衝液（１２６ｍＭ ＮａＣｌ，４．０ｍＭ ＫＣｌ，０．６９ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４，５．６ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ，１ｍＭ ＣａＣｌ２，１ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．１％ ＢＳＡ）で洗浄後、９６穴プレートに１ウェルあたり１５０μＬずつタイロード緩衝液添加し、３７℃で５分間インキュベートした。次いで、５０μＬの各種濃度のサブスタンスＰ（ペプチド研究所）を含むタイロード緩衝液を加えて、さらに３７℃で２０分間インキュベートし、脱顆粒を誘導した。脱顆粒アッセイ上清中のβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ活性を以下のように測定することにより、脱顆粒の程度を測定した。上清を９６穴プレートに分注し、上清の５倍量の０．１Ｍ Ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ４．５）／１ｍＭ ４−ｍｅｔｈｙｌ ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ−２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（和光純薬）を添加して、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、反応液の０．１倍量の０．２Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ／ＮａＣＯ３（ｐＨ１０．７）を添加することにより反応を停止させ、Ｆｕｓｉｏｎ−α（パーキンエルマー社）で測定を行った。β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ活性は、また、同じくプレートに播いたＲＢＬ２Ｈ３およびＲＢＬ２Ｈ３−ＴＧＲ１２ＧＦＰをＴｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡで剥がした後、４回凍結融解し、遠心分離を行った後の上清中における活性をＬＡＤ２中の全β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ活性とし、脱顆粒の程度は全β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ活性に対するＬＡＤ２上清中のβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ活性の割合で示した。
ＲＢＬ２Ｈ３における、細胞内カルシウム上昇活性を測定した結果、アッセイバッファー添加におけるカルシウム上昇作用の最大活性は５１、１μＭのＡ２３１８７による刺激におけるカルシウム上昇作用の最大活性は２５３３８であった。サブスタンスＰ刺激によるカルシウム上昇作用の最大活性は、１ｎＭにおいては４４、１０ｎＭにおいては５１、１００ｎＭにおいては５０、１μＭにおいては９５、１０μＭにおいては４１であった。コルチスタチン１７刺激によるカルシウム上昇作用の最大活性は、１ｎＭにおいては６７、１０ｎＭにおいては７８、１００ｎＭにおいては５４、１μＭにおいては４９、１０μＭにおいては５２であった。ＰＡＭＰ１２刺激によるカルシウム上昇作用の最大活性は、１ｎＭにおいては５２、１０ｎＭにおいては５２、１００ｎＭにおいては３５、１μＭにおいては４４、１０μＭにおいては４３であった。ＰＡＣＡＰ２７刺激によるカルシウム上昇作用の最大活性は、１ｎＭにおいては４７、１０ｎＭにおいては３７、１００ｎＭにおいては６３、１μＭにおいては５９、１０μＭにおいては４５であった。
ＲＢＬ２Ｈ３−ＴＧＲ１２における、細胞内カルシウム上昇活性を測定した結果、アッセイバッファー添加におけるカルシウム上昇作用の最大活性は−２、１μＭのＡ２３１８７による刺激におけるカルシウム上昇作用の最大活性は２５６２４であった。サブスタンスＰ刺激によるカルシウム上昇作用の最大活性は、１ｎＭにおいては４、１０ｎＭにおいては１３、１００ｎＭにおいては１７０２、１μＭにおいては１０００５、１０μＭにおいては１２６４９であった。コルチスタチン１７刺激によるカルシウム上昇作用の最大活性は、１ｎＭにおいては−２、１０ｎＭにおいては３３、１００ｎＭにおいては１５７４、１μＭにおいては１１１９３、１０μＭにおいては１２７６２であった。ＰＡＭＰ１２刺激によるカルシウム上昇作用の最大活性は、１ｎＭにおいては４１、１０ｎＭにおいては２０８８、１００ｎＭにおいては１１１１０、１μＭにおいては１２０３９、１０μＭにおいては１２３３１であった。ＰＡＣＡＰ２７刺激によるカルシウム上昇作用の最大活性は、１ｎＭにおいては４０、１０ｎＭにおいては２９、１００ｎＭにおいては５３００、１μＭにおいては１１４９４、１０μＭにおいては１２６６７であった。
ＲＢＬ２Ｈ３における脱顆粒促進作用を解析した結果、自発的脱顆粒は９．４％であった。サブスタンスＰ刺激による脱顆粒は、１０ｎＭにおいては８．８％、３０ｎＭにおいては８．９％、１００ｎＭにおいては８．９％、３００ｎＭにおいては８．５％、１μＭにおいては８．４％、３μＭにおいては７．９％であった。
ＲＢＬ２Ｈ３−ＴＧＲ１２における脱顆粒促進作用を解析した結果、自発的脱顆粒は１０．５％であった。サブスタンスＰ刺激による脱顆粒は、１０ｎＭにおいては９．７％、３０ｎＭにおいては１０．８％、１００ｎＭにおいては１６．７％、３００ｎＭにおいては２７％、１μＭにおいては３６．３％、３μＭにおいては４２．０％であった。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分ペプチドもしくはその塩（本発明の受容体）または本発明の受容体と特異的に結合する能力を有するリガンド（本発明のリガンド）の活性・機能を阻害する化合物（例、本発明の受容体アンタゴニスト）、本発明の受容体に対する抗体、本発明の受容体に対するアンチセンスポリヌクレオチドなどは、本発明の受容体または本発明のリガンドが有する生理活性（例、肥満細胞の脱顆粒促進作用、エイコサノイド産生促進作用、サイトカイン産生促進作用、肥満細胞増殖促進作用、肥満細胞活性化作用など）を抑制することができるので、低毒性で安全な優れた肥満細胞の脱顆粒抑制剤、エイコサノイド産生抑制剤、サイトカイン産生抑制剤、肥満細胞増殖抑制剤、肥満細胞活性化抑制剤（例、ＭＡＰＫ活性化抑制剤なども含む）などとして、例えば、免疫疾患〔例、炎症性疾患（下垂体膿瘍、甲状腺炎、腹膜炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、結節性紅斑、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー（例、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、花粉症、金属アレルギーなど）、喘息、滲出性中耳炎、メニエール病、接触皮膚炎、アナフィラキシー、蕁麻疹、重症筋無力症、糸球体腎炎、シェーグレン症候群、バセドー病、インスリン抵抗性糖尿病、アトピー性皮膚炎、白血球異常など〕、泌尿器疾患（例、腎尿細管間質障害（繊維化）、間質性膀胱炎、アレルギー性膀胱炎など）、消化器疾患〔例、過敏性腸症候群、慢性肝疾患、食物アレルギー、アレルギー性腸炎、牛乳タンパク誘発性直腸炎、消化性潰瘍（例、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、吻合部潰瘍、Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ−Ｅｌｌｉｓｏｎ症候群など）、胃炎、逆流性食道炎、ＮＵＤ（Ｎｏｎ Ｕｌｃｅｒ Ｄｙｓｐｅｐｓｉａ）、胃ＭＡＬＴリンパ腫、非ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、胃酸過多、手術後ストレスによる胃酸過多および潰瘍など〕、呼吸器疾患〔例、慢性閉塞性肺疾患（例、慢性気管支炎、肺気腫）、びまん性汎細気管支炎、嚢胞性線維症、過敏性肺炎、突発性間質性肺炎、肺線維症など〕、循環器疾患（例、動脈硬化症、急性冠状動脈症候群、粥状硬化性大動脈瘤、心臓アナフィラキシー、心不全、心筋梗塞、狭心症、不整脈、深部静脈血栓症、ＰＴＣＡ後再狭窄など）、眼科疾患（例、翼状片、春期カタル、ドライアイなど）、癌（例、甲状腺乳頭癌、非小細胞性肺癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、胃癌、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、カポジ肉腫、肥満細胞種など）、脳梗塞、高脂血症、急性腎不全、糖尿病、肥満症、浮腫、肉芽種、アトピー性脊髄炎、神経線維腫、鼻粘膜過敏症、ホジキン病、子宮内膜増殖症などの予防・治療剤などとして有用である。
また、本発明の受容体または肥満細胞と本発明のリガンドとを用いるスクリーニング方法またはスクリーニング用キットにより、例えば、肥満細胞の脱顆粒抑制作用、エイコサノイド産生抑制作用、サイトカイン産生抑制作用、肥満細胞増殖抑制作用、肥満細胞活性化抑制作用などを有する化合物またはその塩が効率よく取得できる。
［配列表］
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Claims (22)

  1. （ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩および（ｂ）該蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンドを用いることを特徴とする、肥満細胞の脱顆粒抑制剤のスクリーニング方法。
  2. リガンドが、サブスタンスＰ、コルチスタチン、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド、血管作動性腸管ペプチドまたはｐｒｏａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ２０ ｐｅｐｔｉｄｅである請求項１記載のスクリーニング方法。
  3. 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を介した細胞刺激活性を測定し、指標とする請求項１記載のスクリーニング方法。
  4. （ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩および（ｂ）該蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンドを用いことを特徴とする、ヒト肥満細胞における脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドによる脱顆粒を抑制する作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
  5. （ｉ）（ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、（ｂ）該蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンドとを、試験化合物の非存在下接触させ、前記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する前記リガンドの結合量を測定する工程、
    （ｉｉ）（ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、（ｂ）該蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンドとを、試験化合物の存在下接触させ、前記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する前記リガンドの結合量を測定する工程、および
    （ｉｉｉ）工程（ｉ）と工程（ｉｉ）との間で、前記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する前記リガンドの結合量を比較し、工程（ｉ）における結合量よりも工程（ｉｉ）における結合量の方が低い場合に、前記試験化合物を肥満細胞の脱顆粒抑制剤として選択する工程を含む請求項１記載のスクリーニング方法。
  6. 工程（ｉｉ）における結合量が工程（ｉ）における結合量の５０％以下の場合に、前記試験化合物を肥満細胞の脱顆粒抑制剤として選択する、請求項５記載のスクリーニング方法。
  7. （ｉ）（ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、（ｂ）該蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンドとを、試験化合物の非存在下接触させ、前記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する前記リガンドの結合量を測定する工程、
    （ｉｉ）（ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、（ｂ）該蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンドとを、試験化合物の存在下接触させ、前記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する前記リガンドの結合量を測定する工程、
    （ｉｉｉ）工程（ｉ）と工程（ｉｉ）との間で、前記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する前記リガンドの結合量を比較し、工程（ｉ）における結合量よりも工程（ｉｉ）における結合量の方が低い場合の試験化合物を選択する工程、および
    （ｉｖ）前記（ｉｉｉ）で得られた試験化合物を肥満細胞に接触させ、脱顆粒を抑制する試験化合物を選択する工程を含む請求項１記載のスクリーニング方法。
  8. 肥満細胞の脱顆粒抑制剤が、免疫疾患、泌尿器疾患、消化器疾患または呼吸器疾患の予防・治療剤である請求項１記載のスクリーニング方法。
  9. （ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩および（ｂ）該蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンドを含有することを特徴とする、肥満細胞の脱顆粒抑制剤のスクリーニング用キット。
  10. 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対するアンタゴニストを含有してなる肥満細胞の脱顆粒抑制剤。
  11. 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる肥満細胞の脱顆粒抑制剤。
  12. 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる免疫疾患、泌尿器疾患、消化器疾患または呼吸器疾患の診断薬。
  13. 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩のアゴニストに対する抗体を含有してなる肥満細胞の脱顆粒抑制剤。
  14. 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる免疫疾患、泌尿器疾患、消化器疾患または呼吸器疾患の診断薬。
  15. （ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的なまたは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、または（ｉｉ）該蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含有してなる肥満細胞の脱顆粒抑制剤。
  16. 肥満細胞の脱顆粒抑制剤が、免疫疾患、泌尿器疾患、消化器疾患または呼吸器疾患の予防・治療剤である請求項１０、１１、１３または１５記載の抑制剤。
  17. 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性、または該蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンドの活性を阻害することを特徴とする肥満細胞の脱顆粒抑制方法。
  18. 肥満細胞および配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンドを用いることを特徴とする、肥満細胞の脱顆粒抑制剤のスクリーニング方法。
  19. （ｉ）肥満細胞と、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンドとを、試験化合物の非存在下接触させ、前記肥満細胞に対する前記リガンドの結合量を測定する工程、
    （ｉｉ）肥満細胞と、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンドとを、試験化合物の存在下接触させ、前記肥満細胞に対する前記リガンドの結合量を測定する工程、
    （ｉｉｉ）工程（ｉ）における結合量よりも工程（ｉｉ）における結合量の方が低い場合の試験化合物を選択する工程、および
    （ｉｖ）前記（ｉｉｉ）で得られた試験化合物を肥満細胞に接触させ、脱顆粒を抑制する試験化合物を選択する工程を含む請求項１８記載のスクリーニング方法。
  20. 肥満細胞および配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンドを含有することを特徴とする、肥満細胞の脱顆粒抑制剤のスクリーニング用キット。
  21. 哺乳動物に対して、（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対するアンタゴニスト、（ｉｉ）該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、（ｉｉｉ）該蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的なまたは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、または（ｉｖ）該蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの有効量を投与することを特徴とする肥満細胞の脱顆粒抑制方法。
  22. 肥満細胞の脱顆粒抑制剤を製造するための、（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対するアンタゴニスト、（ｉｉ）該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、（ｉｉｉ）該蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、または（ｉｖ）該蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの使用。
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