ES2961366T3 - Ensayo basado en células que expresan MrgprX2/MrgprB2 para detectar reacciones seudoalérgicas y para identificar bloqueadores para prevenir las reacciones adversas - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a células y métodos para detectar compuestos que inducen una reacción de tipo pseudoalérgico y a métodos para reducir la gravedad de una reacción de tipo pseudoalérgico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Ensayo basado en células que expresan MrgprX2/MrgprB2 para detectar reacciones seudoalérgicas y para identificar bloqueadores para prevenir las reacciones adversas
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a métodos para detectar compuestos que inducen una reacción de tipo seudoalérgico.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Muchos fármacos aprobados por la Food and Drug Administration (FDA) están asociados con reacciones de tipo seudoalérgico como parte de sus perfiles de efectos secundarios. Antes de la invención descrita en el presente documento, se necesitaban líneas celulares y métodos para determinar qué fármacos son propensos a provocar una reacción de tipo seudoalérgico.
El documento WO 03/073107 A2 divulga el receptor MRGX2 acoplado a proteína G y variantes del mismo, moduladores para MRGX2 y métodos de cribado para identificar agonistas y antagonistas para MRGX2.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La invención se define en la reivindicación 1, mencionándose características opcionales en las reivindicaciones dependientes. Se divulga en el presente documento una célula aislada que comprende un ácido nucleico recombinante que expresa un miembro X2 del receptor acoplado a proteína G relacionado con mas (MrgprX2) o MrgprB2. Por ejemplo, el ácido nucleico recombinante expresa MrgprX2. Alternativamente, el ácido nucleico recombinante expresa MrgprB2. En algunos casos, la célula comprende además un ácido nucleico recombinante que expresa proteína alfa 15 de unión a GTP (Ga15). En otros casos, el ácido nucleico recombinante que expresa MrgprX2 comprende una o más mutaciones. Por ejemplo, la una o más mutaciones producen una proteína MrgprX2 incapaz de activar una ruta de transducción de señales. Alternativamente, el ácido nucleico recombinante que expresa MrgprB2 comprende una o más mutaciones. Por ejemplo, la una o más mutaciones producen una proteína MrgprB2 incapaz de activar una ruta de transducción de señales. En algunos casos, esta célula comprende además un ácido nucleico recombinante que expresa proteína alfa 15 de unión a GTP (Ga15).
Preferiblemente, la célula aislada comprende una célula renal embrionaria humana 293 (HEK 293).
Se describen en el presente documento anticuerpos anti-MrgprX2. Anticuerpos anti-MrgprX2 adecuados incluyen SAB2900154-50UG (Sigma-Aldrich®, St. Louis, Missouri), PA5-32930 (Thermo Scientific, Waltham, MA), TA317038 (Origene, Rockville, M<d>) y 038585 (United States Biological, Boston,<m>A).
Una micromolécula es un compuesto que tiene menos de 2000 daltons de masa. La masa molecular de la micromolécula es preferiblemente menor de 1000 daltons, más preferiblemente menor de 600 daltons, p. ej., el compuesto tiene menos de 500 daltons, menos de 400 daltons, menos de 300 daltons, menos de 200 daltons o menos de 100 daltons.
Las micromoléculas son orgánicas o inorgánicas. Micromoléculas orgánicas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, hidrocarburos alifáticos, alcoholes, aldehídos, cetonas, ácidos orgánicos, ésteres, mono- y disacáridos, hidrocarburos aromáticos, aminoácidos y lípidos. Micromoléculas inorgánicas ejemplares comprenden minerales vestigiales, iones, radicales libres y metabolitos. Alternativamente, las micromoléculas se pueden manipular sintéticamente para consistir en un fragmento, o pequeña porción, o una cadena de aminoácidos más larga para llenar un bolsillo de unión de una enzima. Típicamente, las micromoléculas tienen menos de un kilodalton.
Se llevan a cabo métodos para determinar si un compuesto induce una reacción de tipo seudoalérgico poniendo en contacto la célula aislada descrita en el presente documento con un posible compuesto, detectando la activación de MrgprX2 o MrgprB2, donde la activación de MrgprX2 o MrgprB2 determina que el posible compuesto induce una reacción de tipo seudoalérgico.
Por ejemplo, la activación de MrgprX2 o MrgprB2 se detecta identificando un incremento en el calcio intracelular con relación al nivel de calcio intracelular en ausencia del compuesto. En algunos casos, el nivel de calcio intracelular se incrementa en al menos 1%, p. ej., al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99%. La concentración de calcio intracelular se determina utilizando los métodos descritos en el presente documento o los disponibles para los expertos.
Posibles compuestos ejemplares incluyen leuprorelina, goserelina, histrelina, triptorelina, cetrorelix, ganirelix, degarelix, octreotida, lanreotida, pasireotida, sermorelina, tesamorelina, icatibant, acetato de glatiramer, teriparatida, pramlintida, bleomicina, exenatida, glucagón, liraglutida, enfuvirtida y colistimetato.
Otros posibles compuestos ejemplares incluyen succinilcolina, tubocurarina, atracurio, mivacurio y rocuronio.
Definiciones
A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el significado entendido comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Las siguientes referencias proporcionan a un experto una definición general de muchos términos usados en esta invención: The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5a Ed., R. Rieger y cols. (eds.), Springer Verlag (1991); y Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). Según se usa en el presente documento, los siguientes términos tienen los significados atribuidos a ellos posteriormente, a menos que se especifique otra cosa.
Los anticuerpos y fragmentos de los mismos descritos en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, policlonales, monoclonales, quiméricos, dAb (anticuerpo de domino), monocatenarios, fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2, Fv, scFvs. Un fragmento de un anticuerpo posee la actividad inmunológica de su anticuerpo respectivo. En algunas realizaciones, un fragmento de un anticuerpo contiene 1500 o menos, 1250 o menos, 1000 o menos, 900 o menos, 800 o menos, 700 o menos, 600 o menos, 500 o menos, 400 o menos, 300 o menos, 200 o menos aminoácidos. Por ejemplo, un inhibidor peptídico o proteínico contiene 1500 o menos, 1250 o menos, 1000 o menos, 900 o menos, 800 o menos, 700 o menos, 600 o menos, 500 o menos, 400 o menos, 300 o menos, 200 o menos, 100 o menos, 80 o menos, 70 o menos, 60 o menos, 50 o menos, 40 o menos, 30 o menos, 25 o menos, 20 o menos, 10 o menos aminoácidos. Por ejemplo, un inhibidor de ácido nucleico de la invención contiene 400 o menos, 300 o menos, 200 o menos, 150 o menos, 100 o menos, 90 o menos, 80 o menos, 70 o menos, 60 o menos, 50 o menos, 40 o menos, 35 o menos, 30 o menos, 28 o menos, 26 o menos, 24 o menos, 22 o menos, 20 o menos, 18 o menos, 16 o menos, 14 o menos, 12 o menos, 10 o menos nucleótidos.
El término "anticuerpo" (Ab) según se usa en el presente documento incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (p. ej., anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo, siempre que exhiban la actividad biológica deseada. El término "inmunoglobulina" (Ig) se usa indistintamente con "anticuerpo" en el presente documento.
Un "anticuerpo aislado" es uno que se ha separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes se su ambiente natural son materiales que interferirían con usos diagnósticos o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos o no proteínicos. En realizaciones preferidas, el anticuerpo se purifica: (1) hasta más de 95% en peso de anticuerpo según se determina por el método de Lowry, y lo más preferiblemente más de 99% en peso; (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de taza giratoria; o (3) hasta homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción con plata. Un anticuerpo aislado incluye el anticuerpoin situdentro de células recombinantes ya que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. Normalmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.
La unidad tetracatenaria básica del anticuerpo es una glucoproteína heterotetrámera compuesta por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Un anticuerpo IgM consiste en 5 de las unidades heterotetrámeras básicas junto con un polipéptido adicional denominado cadena J, y por lo tanto contiene 10 sitios de unión a antígeno, mientras que los anticuerpos de IgA secretados se pueden polimerizar para formar ensamblajes polivalentes que comprenden 2-5 de las unidades tetracatenarias básicas junto con la cadena J. En el caso de las IgG, la unidad tetracatenaria tiene generalmente aproximadamente 150.000 daltons. Cada cadena L está ligada a una cadena H por un enlace disulfuro covalente, mientras que las dos cadenas H están ligadas entre sí por uno o más enlaces disulfuro dependiendo del isotipo de la cadena H. Cada cadena H y L también tienen puentes disulfuro intracatenarios separados regularmente. Cada cadena H tiene el extremo N, un dominio variable (V<h>) seguido por tres dominios constantes (C<h>) para cada una de las cadenas a y<y>y cuatro dominios C<h>para los isotipos p y £. Cada cadena L tiene el extremo N, un dominio variable (V<l>) seguido por un dominio constante (C<l>) en su otro extremo. El V<l>está alineado con el V<h>y el C<l>está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada (C<h>1). Se cree que residuos de aminoácido particulares forman una interfase entre los dominios variables de la cadena ligera y la cadena pesada. El apareamiento de un V<h>y un V<l>juntos forma un solo sitio de unión a antígeno. Para la estructura y las propiedades de las diferentes clases de anticuerpos, véanse, p. ej., Basic and Clinical Immunology, 8a edición, Daniel P. Stites, Abba I. Terr y Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, página 71, y Capítulo 6.
La cadena L de cualquier especie de vertebrado puede ser asignada a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa (<k>) y lambda (A), basándose en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes (C<l>). Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas (C<h>), las inmunoglobulinas pueden ser asignadas a diferentes clases o isotipos. Existen cinco clases de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG y IgM, que tienen cadenas pesadas denominadas alfa (a), delta (5), épsilon (e), gamma (<y>) y mu (p), respectivamente. Las clases Y y a se dividen además en subclases en base a diferencias relativamente pequeñas en la secuencia y la función de C<h>, p. ej., los seres humanos expresan las siguientes subclases: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 y IgA2.
El término "variable" se refiere al hecho de que ciertos segmentos de los dominios V difieren extensamente en secuencia entre anticuerpos. El dominio V media en la unión a antígeno y define la especificidad de un anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida uniformemente a lo largo del tramo de 110 aminoácidos de los dominios variables. En cambio, las regiones V consisten en extensiones relativamente invariantes denominadas regiones de armazón (FR) de 15-30 aminoácidos separadas por regiones más cortas de variabilidad extrema denominadas "regiones hipervariables" cada una de las cuales tiene una longitud de 9 12 aminoácidos. Cada uno de los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras naturales comprende cuatro FR, que adoptan principalmente una configuración de lámina p, conectadas por tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de la lámina p. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad mediante las FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (véase Kabat y cols., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero exhiben diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).
El término "región hipervariable", cuando se usa en el presente documento, se refiere a los residuos de aminoácido de un anticuerpo que son responsables de la unión a antígenos. La región hipervariable comprende generalmente residuos de aminoácido de una "región determinante de la complementariedad" o "CDR" (p. ej., alrededor de aproximadamente los residuo 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el V<l>, y alrededor de aproximadamente 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el V<h>cuando se numeran según el sistema de numeración de Kabat; Kabat y cols., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)); y/o los residuos de un "bucle hipervariable" (p. ej., residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en la V<l>, y 26-32 (H1), 52-56 (H2) y 95-101 (H3) en el V<h>cuando se numeran según el sistema de numeración de Chothia; Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)); y/o los residuos de un "bucle hipervariable"/CDR (p. ej., residuos 27-38 (L1), 56-65 (L2) y 105-120 (L3) en el V<l>, y 27-38 (H1), 56-65 (H2) y 105-120 (H3) en el V<h>cuando se numeran según el sistema de numeración de IMGT; Lefranc, M.P. y cols. Nucl. Acids Res. 27:209-212 (1999), Ruiz, M. y cols. Nucl. Acids Res. 28:219-221 (2000)). Opcionalmente, el anticuerpo tiene inserciones simétricas en uno o más de los siguientes puntos 28, 36 (L1), 63, 74-75 (L2) y 123 (L3) en el V<l>, y 28, 36 (H1), 63, 74-75 (H2) y 123 (H3) en el V<h>cuando se numeran según AHo; Honneger, A. y Plunkthun, A. J. Mol. Biol. 309:657-670 (2001)).
El término "anticuerpo monoclonal" según se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones presentes en la naturaleza que puedan estar presentes en pequeñas cantidades. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos contra un único sitio antigénico. Por otra parte, en contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante sobre el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos debido a que se pueden sintetizar sin contaminación por otros anticuerpos. No se debe considerar que el modificador "monoclonal" requiera la producción del anticuerpo mediante un método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden preparar mediante la metodología de hibridomas descrita en primer lugar por Kohler y cols., Nature, 256:495 (1975), o se pueden elaborar usando métodos de ADN recombinante en células de animales eucarióticos bacterianos o plantas (véase, p. ej., la Pat. EE. UU. N° 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también se pueden aislar de bibliotecas de anticuerpos fágicos usando las técnicas descritas en Clackson y cols., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks y cols., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por ejemplo.
Los anticuerpos monoclonales incluyen anticuerpos "quiméricos" en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase particular de anticuerpo, mientras que el resto de la cadena o cadenas es idéntico u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de estos anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (véanse la Pat. EE. UU. N° 4.816.567; y Morrison y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). También se proporcionan secuencias de unión a antígeno de dominios variables derivadas de anticuerpos humanos. Según esto, anticuerpos quiméricos de principal interés en el presente documento incluyen anticuerpos que tienen una o más secuencias de unión a antígeno humanas (p. ej., CDR) y que contienen una o más secuencias derivadas de un anticuerpo no humano, p. ej., una secuencia de una región FR o C. Además, los anticuerpos quiméricos de principal interés en el presente documento incluyen los que comprenden una secuencia de unión a antígeno de un dominio variable humano de una clase o subclase de anticuerpo y otra secuencia, p. ej., una secuencia de una región FR o C, derivada de otra clase o subclase de anticuerpo. Anticuerpos quiméricos de interés en el presente documento también incluyen los que contienen secuencias de unión a antígeno de un dominio variable relacionadas con las descritas en el presente documento o derivadas de una especie diferente, tal como un primate no humano (p. ej., monos del Viejo Mundo, simios superiores, etc.). Los anticuerpos quiméricos también incluyen anticuerpos primatizados y humanizados.
Por otra parte, los anticuerpos quiméricos pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente el comportamiento del anticuerpo. Para más detalles, véanse y cols., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann y cols., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).
Se considera generalmente que un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo humano que tiene uno o más residuos de aminoácido introducidos en él desde una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácido no humanos se denominan a menudo residuos "importados", que se toman típicamente de un dominio variable "importado". La humanización se realiza tradicionalmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones y cols., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann y cols., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen y cols., Science, 239:1534-1536 (1988)), al sustituir las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano por secuencias de una región hipervariable importadas. Según esto, estos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Pat. EE. UU. N° 4.816.567) donde sustancialmente menos que un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la correspondiente secuencia procedente de una especie no humana.
Un "anticuerpo humano" es un anticuerpo que contiene solamente secuencias presentes en un anticuerpo producido naturalmente por un ser humano. Sin embargo, según se usa en el presente documento, los anticuerpos humanos pueden comprender residuos o modificaciones no encontrados en un anticuerpo humano presente en la naturaleza, incluyendo las modificaciones y secuencias variantes descritas en el presente documento. Estas se realizan típicamente para refinar o potenciar más el comportamiento del anticuerpo.
Un anticuerpo "intacto" es uno que comprende un sitio de unión a antígeno así como un C<l>y al menos dominios constantes de la cadena pesada, C<h>1, C<h>2 y C<h>3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencias naturales (p. ej., dominios constantes de secuencias naturales humanas) o una de sus variantes de la secuencia de aminoácidos. Preferiblemente, el anticuerpo intacto tiene una o más funciones efectoras.
Un "fragmento de anticuerpo" comprende una porción de un anticuerpo intacto, preferiblemente la región de unión a antígeno o variable del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab<')2>y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (véanse la Pat. EE. UU. N° 5.641.870; Zapata y cols., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); moléculas de anticuerpo monocatenario; y anticuerpos multiespecíficos formados por fragmentos de anticuerpo.
La expresión "fragmento funcional o análogo" de un anticuerpo es un compuesto que tiene una actividad biológica cualitativa en común con un anticuerpo de longitud completa. Por ejemplo, un fragmento funcional o análogo de un anticuerpo anti-IgE es uno que se puede unir a una inmunoglobulina IgE de tal manera que prevenga o reduzca sustancialmente la capacidad de esta molécula de tener la capacidad para unirse al receptor de alta afinidad, FcERI.
La digestión de anticuerpos con papaína produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, denominados fragmentos "Fab", y un fragmento "Fc" residual, una denominación que refleja la capacidad para cristalizarse fácilmente. El fragmento Fab consiste en una cadena L entera junto con el dominio de la región variable de la cadena H (V<h>), y el primer dominio constante de una cadena pesada (C<h>1). Cada fragmento Fab es monovalente con respecto a la unión a antígeno, es decir, tiene un único sitio de unión a antígeno. El tratamiento con pepsina de un anticuerpo da un solo fragmento grande F(ab<')2>que corresponde más o menos a dos fragmentos Fab ligados con disulfuro que tienen actividad de unión a antígeno divalente y todavía es capaz de reticularse a antígeno. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por tener unos pocos residuos adicionales en el extremo carboxi del dominio C<h>1 incluyendo una o más cisteínas procedentes de la región de bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la denominación en el presente documento para Fab', en el que el residuo o los residuos de cisteína de los dominios constantes soportan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab<')2>se producían originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas de bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.
El fragmento "Fc" comprende las porciones carboxiterminales de ambas cadenas H mantenidas juntas por disulfuros. Las funciones efectoras de los anticuerpos se determinan mediante secuencias en la región Fc, región que también es la parte reconocida por receptores de Fc (FcR) encontrados en ciertos tipos de células.
"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio completo de reconocimiento y unión a antígeno. Este fragmento consiste en un dímero de un dominio variable de una cadena pesada y una ligera en una estrecha asociación no covalente. A partir del doblamiento de estos dos dominios surgen seis bucles hipervariables (tres bucles de cada cadena H y L) que aportan los residuos de aminoácido para la unión al antígeno y confieren al anticuerpo especificidad de unión al antígeno. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse a un antígeno, aunque con una menor afinidad que el sitio de unión completo.
"Fv monocatenario", también abreviado como "sFv" o "scFv" son fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios de anticuerpo V<h>y V<l>conectados a una única cadena polipeptídica. Preferiblemente, el polipéptido sFv comprende además un conector polipeptídico entre los dominios V<h>y V<l>que permite que el sFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una revisión de sFv, véanse Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, posteriormente.
El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo preparados al construir fragmentos sFv (véase el párrafo precedente) con conectores cortos (aproximadamente 5-10 residuos) entre los dominios V<h>y V<l>de modo que se alcance un apareamiento intercatenario pero no intracatenario de los dominios V, dando como resultado un fragmento bivalente, es decir, un fragmento que tiene dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos biespecíficos son heterodímeros de dos fragmentos sFv "transversales" en los que los dominios V<h>y V<l>de los dos anticuerpos están presentes sobre diferentes cadenas polipeptídicas. Los diacuerpos se describen más a fondo, por ejemplo, en los documentos EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).
Según se usa en el presente documento, un anticuerpo que se "internaliza" es uno que es recogido por (es decir, entra en) la célula tras la unión a un antígeno sobre una célula de mamífero (p. ej., un polipéptido o receptor de la superficie celular). Este anticuerpo internalizante incluirá por supuesto fragmentos de anticuerpo, anticuerpo humano o quimérico y conjugados de anticuerpo. Para ciertas aplicaciones terapéuticas, se contempla la internalizaciónin vivo.El número de moléculas de anticuerpo internalizadas será suficiente o adecuado para destruir una célula o inhibir su crecimiento, especialmente una célula infectada. Dependiendo de la potencia del anticuerpo o el conjugado de anticuerpo, en algunos casos, la captación de una sola molécula de anticuerpo en la célula es suficiente para destruir la célula diana a la que se une el anticuerpo. Por ejemplo, ciertas toxinas son muy potentes en la destrucción, de modo que la internalización de una molécula de la toxina conjugada al anticuerpo es suficiente para destruir la célula infectada.
Según se usa en el presente documento, se dice que un anticuerpo es "inmunoespecífico", "específico para" o se "une específicamente a" un antígeno si reacciona a un nivel detectable con el antígeno, preferiblemente con una constante de afinidad, K<a>, de más de o igual a 10<4>M<-1>, o mayor de o igual a aproximadamente 10<5>M<-1>, mayor que o igual a aproximadamente 10<6>M<-1>, mayor que o igual a aproximadamente 10<7>M<-1>, o mayor que o igual a 10<8>M<-1>. La afinidad de un anticuerpo para su antígeno cognado también se expresa comúnmente como una constante de disociación K<d>, y en ciertas realizaciones, el anticuerpo HuM2e se une específicamente a M2e si se une con una K<d>de menos de o igual a 10<-4>M, menos de o igual a aproximadamente 10<-5>M, menos de o igual a aproximadamente 10<-6>M, menos de o igual a 10<-7>M, o menos de o igual a 10<-8>M. Las afinidades de los anticuerpos se pueden determinar fácilmente usando técnicas convencionales, por ejemplo, las descritas por Scatchard y cols. (Ann. N.Y. Acad. Sci. USA 51:660 (1949)).
Las propiedades de unión de un anticuerpo a sus antígenos, células o tejidos generalmente se puede determinar y evaluar usando métodos de inmunodetección incluyendo, por ejemplo, ensayos basados en inmunofluorescencia, tales como inmunohistoquímica (IHC) y/o clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).
Un anticuerpo que tiene una "característica biológica" de un anticuerpo designado es uno que posee una o más de las características biológicas de este anticuerpo que lo distinguen de otros anticuerpos. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un anticuerpo con una característica biológica de un anticuerpo designado se unirá al mismo epítopo al que se une el anticuerpo designado y/o tendrá una función efectora común al anticuerpo designado.
El término "anticuerpo antagonista" se usa en el sentido más amplio, e incluye un anticuerpo que bloquea, inhibe o neutraliza parcialmente o totalmente una actividad biológica de un epítopo, polipéptido o célula a los que se une específicamente. Métodos para identificar anticuerpos antagonistas pueden comprender poner en contacto un polipéptido o una célula unidos específicamente a un posible anticuerpo antagonista con el posible anticuerpo antagonista y medir un cambio detectable en una o más actividades biológicas normalmente asociadas con el polipéptido o la célula.
"Funciones efectoras" del anticuerpo se refiere a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc (una región Fc de secuencia natural o una región Fc variante de la secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo, y varían con el isotipo de anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento; unión a receptores de Fc; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación a la baja de receptores de la superficie celular (p. ej., receptor de células B); y activación de células B.
El término "sitio de unión a antígeno" o "porción de unión" se refiere a la parte de la molécula de inmunoglobulina que participa en la unión al antígeno. El sitio de unión a antígeno está formado por residuos de aminoácido de las regiones variables ("V") N-terminales de las cadenas pesada ("H") y ligera ("L"). Tres extensiones muy divergentes dentro de las regiones V de las cadenas pesada y ligera, denominadas "regiones hipervariables”, están interpuestas entre extensiones de flanqueo más conservadas conocidas como "regiones de armazón" o "FR". Así, el término "FR" se refiere a secuencias de aminoácidos que se encuentran naturalmente entre, y adyacentes a, regiones hipervariables en inmunoglobulinas. En una molécula de anticuerpo, las tres regiones hipervariables de una cadena ligera y las tres regiones hipervariables de una cadena pesada están dispuestas unas con relación a las otras en el espacio tridimensional para formar una superficie de unión a antígeno. La superficie de unión a antígeno es complementaria a la superficie tridimensional de un antígeno unido, y las tres regiones hipervariables de cada una de las cadenas pesadas y ligeras se denominan "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR".
Según se usa en el presente documento, el término "epítopo" incluye cualquier determinante proteínico capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina, un scFv o un receptor de células T. Los determinantes epitópicos consisten en agrupamientos superficiales químicamente activos de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y tienen características estructurales tridimensionales, así como características de carga específicas. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos contra péptidos N-terminales o C-terminales de un polipéptido, secuencias peptídicas lineales y no lineales de una proteína, así como epítopos que comprenden aminoácidos de un primer antígeno y los de un segundo antígeno. Según se usan en el presente documento, los términos "unión inmunológica" y "propiedades de unión inmunológica" se refieren a las interacciones no covalentes del tipo que se produce entre una molécula de inmunoglobulina y un antígeno para el que la inmunoglobulina es específica. La resistencia o afinidad de las interacciones de unión inmunológica se pueden expresar en cuanto a la constante de disociación (K<d>) de la interacción, donde una K<d>menor representa una mayor afinidad. Las propiedades de unión inmunológica de polipéptidos seleccionados se pueden cuantificar usando métodos bien conocidos en la técnica. Uno de estos métodos implica medir las velocidades de formación y disociación de complejos de sitio de unión a antígeno/antígeno, donde esas velocidades dependen de las concentraciones de los integrantes del complejo, la afinidad de la interacción y parámetros geométricos que influyen igualmente en la velocidad en ambas direcciones. Así, tanto la "constante de velocidad de asociación" (K<on>) como la "constante de velocidad de disociación" (K<off>) se pueden determinar mediante el cálculo de las concentraciones y las velocidades reales de asociación y disociación. (Nature 361:186-87 (1993)). La relación de K<off>/K<on>permite el cálculo de todos los parámetros no relacionados con la afinidad, y es igual a la constante de disociación K<d>. Davies y cols. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473). Se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno o epítopo descrito en el presente documento (p. ej., una CTLA, PD1, PDL1, u otra proteína inhibidora inmunitaria y/o antígeno tumoral) cuando la constante de unión en equilibrio (K<d>) es < 1 pM, preferiblemente < 100 nM, más preferiblemente < 10 nM, más preferiblemente < 1 nM y lo más preferiblemente < 100 pM a aproximadamente 1 pM, según se mide por ensayos tales como ensayos de unión a radioligandos o ensayos similares conocidos por los expertos en la técnica.
La divulgación también comprende fragmentos de polipéptidos y ácidos nucleicos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada de los polipéptidos y el ácido nucleico de longitud completa, respectivamente. Se emplea un fragmento de ácido nucleico casi de cualquier longitud. Por ejemplo, se incluyen segmentos de polinucleótidos ilustrativos con longitudes totales de aproximadamente 10.000, aproximadamente 5000, aproximadamente 3000, aproximadamente 2.000, aproximadamente 1.000, aproximadamente 500, aproximadamente 200, aproximadamente 100, aproximadamente 50 pares de bases de longitud (incluyendo todas las longitudes intermedias) en muchas ejecuciones de esta invención. De forma similar, se emplea un fragmento de polipéptido de casi cualquier longitud. Por ejemplo, se incluyen segmentos de polipéptido ilustrativos con longitudes totales de aproximadamente 10.000, aproximadamente 5.000, aproximadamente 3.000, aproximadamente 2.000, aproximadamente 1.000, aproximadamente 5.000, aproximadamente 1.000, aproximadamente 500, aproximadamente 200, aproximadamente 100 o aproximadamente 50 aminoácidos de longitud (incluyendo todas las longitudes intermedias) en muchas ejecuciones de esta invención.
Los polinucleótidos, los polipéptidos u otros agentes están purificados y/o aislados. Específicamente, según se usa en el presente documento, una molécula de ácido nucleico, un polinucleótido, un polipéptido o una proteína "aislado" o "purificado" está sustancialmente libre de otro material celular o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes, o precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. Los compuestos purificados son al menos 60% en peso (peso seco) el compuesto de interés. Preferiblemente, la preparación es al menos 75%, más preferiblemente al menos 90% y lo más preferiblemente al menos 99% en peso el compuesto de interés. Por ejemplo, un compuesto purificado es uno que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 98%, 99% o 100% (p/p) del compuesto deseado en peso. La pureza se mide mediante cualquier método estándar apropiado, por ejemplo, mediante análisis por cromatografía en columna, cromatografía en capa fina o cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC). Un polinucleótido (ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN)) purificado o aislado está libre de genes o secuencias que lo flanquean en su estado presente en la naturaleza. Un polipéptido purificado o aislado está libre de los aminoácidos o las secuencias que lo flanquean en su estado presente en la naturaleza. Purificado también define un grado de esterilidad que es seguro para la administración a un sujeto humano, p. ej., que carece de agentes infecciosos o tóxicos.
De forma similar, por "sustancialmente puro" se entiende un nucleótido o polipéptido que se ha separado de los componentes que lo acompañan naturalmente. Típicamente, los nucleótidos y polipéptidos son sustancialmente puros cuando están al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o incluso 99%, en peso, libres de las proteínas y las moléculas orgánicas presentes en la naturaleza con las que están asociados naturalmente.
Por "ácido nucleico aislado" se entiende un ácido nucleico que está libre de los genes que lo flanquean en el genoma presente en la naturaleza del organismo del que se deriva el ácido nucleico. El término cubre, por ejemplo: (a) un ADN que es parte de una molécula de ADN genómico presente en la naturaleza, pero no está flanqueado por ninguna de las dos secuencias de ácido nucleico que flanquean esa parte de la molécula en el genoma del organismo en el que está presente en la naturaleza; (b) un ácido nucleico incorporado en un vector o en el ADN genómico de un procariota o eucariota de una manera tal que la molécula resultante no sea idéntica a ningún vector o ADN genómico presente en la naturaleza; (c) una molécula separada tal como un ADN complementario (ADNc) sintético, un fragmento genómico, un fragmento producido por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o un fragmento de restricción; y (d) una secuencia nucleotídica recombinante que es parte de un gen híbrido, es decir, un gen que codifica una proteína de fusión. Moléculas de ácido nucleico aisladas incluyen además moléculas producidas sintéticamente, así como ácidos nucleicos que se han alterado químicamente y/o que tienen esqueletos modificados. Por ejemplo, el ácido nucleico aislado es un polinucleótido de ADNc o ARN purificado. Las moléculas de ácido nucleico aisladas también incluyen moléculas de ácido ribonucleico mensajero (ARNm).
Por un "posible compuesto" se entiende un producto químico, ya esté presente en la naturaleza o se derive artificialmente. Posibles compuestos pueden incluir, por ejemplo, péptidos, polipéptidos, moléculas orgánicas sintéticas, moléculas orgánicas presentes en la naturaleza, moléculas de ácido nucleico, moléculas de ácido nucleico peptídico, y sus componentes y derivados.
El término "composición farmacéutica" significa cualquier composición que contenga al menos un agente terapéuticamente o biológicamente activo y sea adecuada para la administración al paciente. Cualquiera de estas formulaciones se puede preparar mediante métodos bien conocidos y aceptados de la técnica. Véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a edición, (ed. A. R. Gennaro), Mack Publishing Co., Easton, Pa., 2000.
Por "secretagogo" se entiende una sustancia que hace que se secrete otra sustancia.
Por "receptores acoplados a proteína G (GPCR)" se entiende un receptor proteínico que detecta moléculas fuera de una célula y activa, dentro de la célula, rutas de transducción de señales y, finalmente, respuestas celulares. Los GPCR se denominan receptores heptatransmembranarios debido a que pasan siete veces a través de la membrana celular.
Por "agonista" se entiende un producto químico que se une a un receptor y activa el receptor para producir una respuesta biológica. Mientras que un agonista provoca una acción, un "antagonista" bloquea la acción del agonista y un agonista inverso provoca una acción opuesta a la del agonista. Según se usa en el presente documento, los términos "antagonista" e "inhibidor" se usan indistintamente para referirse a cualquier molécula que contrarreste o inhiba, disminuya o suprima la actividad biológica de su molécula diana. Antagonistas de MrgprX2 o MrgprB2 adecuados incluyen receptores solubles, inhibidores peptídicos, inhibidores micromoleculares, fusiones de ligandos, y anticuerpos.
Por "silvestre" o "WT" se entiende el fenotipo de la forma típica de una especie según se presenta en la naturaleza. Alternativamente, lo silvestre está conceptualizado como un producto del alelo "normal" estándar en un locus, en contraste con lo producido por un alelo "mutante" no estándar.
El término "seudoalérgico" se refiere a una condición denominada por su presentación similar a una alergia verdadera, aunque debida a causas diferentes. Se puede deber a alteraciones en el metabolismo de la histamina. "Seudoalérgico" significa una reacción de tipo alérgico independiente de anticuerpos de IgE. En otras palabras, la seudoalergia no requiere IgE para inducir una reacción de tipo alérgico.
El término "administrar", según se usa en el presente documento, se refiere a cualquier modo de transferencia, aporte, introducción o transporte de un antagonista de MrgprB2 o MrgprX2, por ejemplo, a un sujeto que necesite reducir la gravedad de una reacción de tipo seudoalérgico. Estos modos incluyen, pero no se limitan a, administración oral, tópica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intradérmica, intranasal y subcutánea.
Por "antagonista de MrgprB2 o MrgprX2" se entiende cualquier micromolécula, compuesto químico, anticuerpo, molécula de ácido nucleico, o polipéptido, o sus fragmentos, que sean capaces de bloquear, prevenir, reducir y alterar la capacidad de MrgprB2 o MrgprX2 para activar una ruta de transducción de señales.
Por "alteración" se entiende un cambio (incremento o disminución) en la actividad de un polipéptido, p. ej., MrgprB2 o MrgprX2, según se detecta mediante métodos estándar conocidos en la técnica tales como los descritos en el presente documento. Según se usa en el presente documento, una alteración incluye un cambio de 10% o más en los niveles de expresión o la actividad de un gen o polipéptido, preferiblemente un cambio de 25%, más preferiblemente un cambio de 40% y lo más preferiblemente un cambio de 50% o más en la actividad de un polipéptido.
Según se usa en el presente documento, una "alteración" también incluye un cambio de 2 veces o más en los niveles de expresión o la actividad de un gen o polipéptido, por ejemplo, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 100 veces, 500 veces, 1000 veces o más.
Por "mejorar" se entiende reducir, suprimir, atenuar, disminuir, detener o estabilizar el desarrollo o la progresión de una enfermedad tal como, por ejemplo, una reacción de tipo seudoalérgico.
Por "amplificar" se entiende incrementar el número de copias de una molécula. En un ejemplo, se usa la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar ácidos nucleicos.
Por "unión" se entiende tener una afinidad fisicoquímica por una molécula. La unión se mide mediante cualquier método, p. ej., un fármaco/compuesto con un receptor expresado sobre una célula.
En esta divulgación, "comprende”, "que comprende”, "que contiene”, "que tiene” y similares pueden tener el significado atribuido a ellos en la ley de patentes de los EE. UU. y pueden significar "incluye”, "que incluye” y similares; los términos "que consiste esencialmente en" o "consiste esencialmente" tienen asimismo el significado atribuido en la ley de patentes de EE. UU. y estos términos son abiertos, permitiendo la presencia de más de lo que se cita siempre que las características básicas o nuevas de lo que se cita no se cambien por la presencia de más de lo que se cita, pero excluye realizaciones de la técnica anterior.
"Detectar" se refiere a identificar, bien directamente o bien indirectamente, la presencia, ausencia o cantidad de activación por MrgprB2 o MrgprX2 de una ruta de transducción de señales que se va a detectar.
Por "cantidad eficaz" se entiende la cantidad requerida para mejorar los síntomas de una enfermedad con relación a un paciente no tratado.
Los términos "tratar" y "tratamiento" según se usan en el presente documento se refieren a la administración de un agente o una formulación a un individuo clínicamente sintomático aquejado de una afección, trastorno o enfermedad adversos, de modo que se efectúe una reducción en la gravedad y/o la frecuencia de los síntomas, se eliminen los síntomas y/o su causa subyacente y/o se facilite la paliación o la remediación del daño.
Se entiende que los intervalos proporcionados en el presente documento son abreviaturas de todos los valores dentro del intervalo. Por ejemplo, se entiende que un intervalo de 1 a 50 incluye cualquier número, combinación de números o subintervalo del grupo que consiste en 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50, así como todos los valores decimales intermedios entre los susodichos números enteros tales como, por ejemplo, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8 y 1,9. Con respecto a los subintervalos, se contemplan específicamente "subintervalos intercalados" que se extienden desde cualquier punto final del intervalo. Por ejemplo, un subintervalo intercalado de un intervalo ejemplar de 1 a 50 puede comprender de 1 a 10, de 1 a 20, de 1 a 30 y de 1 a 40 en una dirección, o de 50 a 40, de 50 a 30, de 50 a 20 y de 50 a 10 en la otra dirección.
Por "recombinantes" se entiende moléculas de ácido nucleico formadas por métodos de laboratorio de recombinación genética (tales como clonación molecular) para reunir material genético procedente de múltiples fuentes, creando secuencias que de otro modo no se encontrarían en organismos biológicos.
Un "promotor heterólogo" es un promotor que es diferente del promotor al que está ligado operativamente en la naturaleza un gen o secuencia de ácido nucleico. El término "ligado operativamente" se refiere a una ligazón funcional entre una secuencia de control de la expresión de un ácido nucleico (tal como un promotor, una secuencia de señalización o una serie de sitios de unión a factores de transcripción) y una segunda secuencia de ácido nucleico, donde la secuencia de control de la expresión afecta a la transcripción y/o la traducción del ácido nucleico correspondiente a la segunda secuencia. Un "polinucleótido heterólogo" o un "gen heterólogo", según se usa en el presente documento, es uno que se origina de una fuente extraña a la célula anfitriona particular, o, si parte de la misma fuente, está modificado con respecto a su forma original.
Por "reduce" se entiende una alteración negativa de al menos 10%, 25%, 50%, 75% o 100%.
Por "referencia" se entiende una condición estándar o de control.
A menos que se indique específicamente o sea obvio a partir del contexto, según se usa en el presente documento, se entiende que los términos "un(a)”, "uno” y "el/la" son singulares o plurales. A menos que se indique específicamente o sea obvio a partir del contexto, según se usa en el presente documento, se entiende que el término "o" es inclusivo.
A menos que se indique específicamente o sea obvio a partir del contexto, según se usa en el presente documento, el término "aproximadamente" se entiende dentro de un intervalo de tolerancia normal en la técnica, por ejemplo dentro de 2 desviaciones estándar de la media. Aproximadamente se puede entender dentro de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05% o 0,01% del valor indicado. A menos que esté claro lo contrario a partir del contexto, todos los valores numéricos proporcionados en el presente documento están modificados por el término "aproximadamente."
Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción de sus realizaciones preferidas, y de las reivindicaciones. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el significado que es entendido comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1A es un diagrama de los locus genómicos de Mrgpr de ratón y ser humano, que ilustra la familia de genes expandida en ratones y sus ortólogos humanos identificados basados en patrones de expresión y especificidad para el agonista similares. Los genes Mrgpr de ratón (mostrados como barras verticales con nombres en la parte superior) están agregados en el cromosoma 7. MrgprA3 (A3) y MrgprC11 (C11) de ratón son los ortólogos de MrgprX1 (X1) humano y se expresan en neuronas del ganglio de la raíz posterior (DRG), y funcionan como receptores del prurito que median en el prurito inducido por cloroquina (CQ) y BAM8-22 (BAM). La expresión y la especificidad agonística de MrgprB2 (B2) de ratón, el ortólogo de MrgprX2 (X2) humano, se describen posteriormente. La Figura 1B muestra los resultados de un cribado restrictivo por la reacción en cadena de la polimerasa por transcripción inversa (RT-PCR) que identificaba la expresión de un transcrito de MrgprB2 (flecha) en células cebadas peritoneales de ratón. Los nombres de los genes Mrgpr están indicadas en la parte superior de las fotografías del gel. No se observaba banda cuando se omitía la transcriptasa inversa de la reacción de síntesis de ADNc (Neg.). La Figura 1C muestra trazados ejemplares de concentración de calcio intracelular [Ca2+]i, según se mide por obtención de imágenes radiométricas con Fura-2, a partir de células HEK293 transfectadas transitoriamente con una expresión conducida por plásmido de MrgprB2 o MrgprX2 y expuestas a una aplicación de un baño de PAMP(9-20) 20 pM (duración indicada por una línea negra en la parte superior). Cada trazado es una respuesta procedente de una única célula. La Figura 1D es un serie de fotomicrografías que muestran imágenes confocales representativas procedentes de tejidos de ratones transgénicos BAC. Los ratones BAC que expresan eGFP-Cre en el marco de lectura abierta deMrgprB2se aparearon con ratones informadores Rosa26-loxP-STOP-loxP-tdTomato. Por lo tanto, la expresión de tdTomato se determina mediante el patrón de expresión de Cre, que está bajo el control del promotor de MrgprB2. La expresión de tdTomato (rojo) se comparó con tinción con avidina (verde), un marcador para células cebadas. Casi 100% de solapamiento entre los dos marcadores sugiere que MrgprB2 está contenido específicamente en células cebadas. Se examinaron todos los tejidos de tres ratones excepto el corazón, donde se examinaron dos ratones. Porcentajes de células cebadas positivas a avidina que también eran positivas a tdTomato: piel lampiña, 97,5%; piel hirsuta, 90,1%; tráquea, 97,2%; corazón, 87,1%. Porcentajes de células positivas a tdTomato que también eran positivas a avidina: piel lampiña, 99,2%; piel hirsuta, 100%; tráquea, 98,3%; corazón, 99%. El número total de células contadas en cada tejido estaba por encima de 300, excepto para el corazón que estaba por encima de 100. Las células cebadas cardíacas se examinaron cerca de las cavidades debido a que la densidad era muy superior que en cualquier parte del tejido; las células positivas a avidina que eran negativas para tdTomato se observaban embebidas en tejido muscular en números muy bajos, pero su identidad no estaba clara. La barra de la escala es de 20 pm.
La Figura 2A (izquierda) es una serie de fotomicrografías que muestran imágenes de matriz cromática representativas de células cebadas peritoneales de ratón que muestran cambios en [Ca2+]i, según se ensaya mediante obtención de imágenes con Fluo-4, inducidos por la aplicación de un baño de anti-IgE (5 pg/ml) o Compuesto 48/80 (10 pg/ml). La Figura 2A (medio) muestra trazados de obtención de imágenes representativos. Cada línea cromática representa una célula individual. Las líneas negras en paneles de "anti-IgE" son trazados promedio para cada genotipo. Nota: los trazados de [Ca2+]i son similares entre los paneles de WT y MUT. La Figura 2A (derecha) muestra la cuantificación del porcentaje de células reactivas. Las células se identificaban como reactivas si la [Ca2+]i ascendía en al menos 50% durante al menos 10 segundos, lo que distingue claramente una respuesta inducida por ligando de episodios de fluctuación aleatorios. Los datos de los grupos para estos y otros experimentos se expresan como media ± error estándar de la media. Se usó la prueba de la t de Student desapareada unilateral para determinar la significación en comparaciones estadísticas, y las diferencias se consideraban significativas a p < 0,05. **, p<0,01 (n=3 para cada genotipo; más de 150 células contadas para cada condición). Las respuestas anti-IgE no eran significativamente diferentes. La barra de la escala es de 10 pm. La Figura 2B es un gráfico de barras que muestra la liberación de histamina en el sobrenadante procedente de tráquea y piel abdominal de ratones WT y MrgprB2MUT después de la exposición a 48/80 (30 pg/ml) durante 30 minutos a 37°C. La cantidad de histamina liberada en el sobrenadante se cuantificó y se expresó en ng/mg de tejido (peso en húmedo). **, p<0,01 (n = 5 para la tráquea, n= 8 para la piel). La Figura 2C es una serie de gráficos. La Figura 2C (parte superior) muestra trazados representativos que muestran contracciones de tráquea aislada de ratones WT y MrgprB2MUT (previamente sensibilizados a ovoalbúmina (ova)), en respuesta a 48/80 (30 pg/ml) u ova (10 pg/ml; es decir dependiente de IgE). La Figura 2C (parte inferior) muestra los datos promedio de la contracción total máxima determinados como respuesta a carbamicolina 10 pM añadida al final del experimento. n=5 para 48/80 WT, 3 para 48/80 MrgprB2MUT. La Figura 2D es una serie de fotografías y un diagrama de barras que muestra (izquierda) imágenes representativas de extravasación de azul de Evans 15 minutos después de una inyección intraplantar de 48/80 (derecha, flecha, 10 pg/ml, 5 pl en solución salina) o solución salina (izquierda). La Figura 2D (derecha) muestra la cuantificación de la fuga de azul de Evans al pie y el incremento en el grosor del pie después de 15 minutos. *, p<0,02 (n=5/WT, n=6/MrgprB2MUT). Las diferencias después de la inyección de solución salina no eran significativas. La Figura 2E es un diagrama de barras que muestra la cuantificación de la reactividad de células cebadas de WT y MrgprB2MUT a ligandos de MrgprX2 y secretagogos básicos, ensayada usando obtención de imágenes con Fluo-4. Concentraciones de sustancias (en pM): PAMP(9-20), 20; cortistatina-14 (cort.), 20; sustancia P (sust P), 200; calidina, 200; mastoparano (masto., un componente del veneno de avispa), 20; mastoparano de véspido, 20. n=3/genotipo; >150 células contadas/secretagogo. Los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM). Se uso la prueba de la t de Student desapareada bilateral para determinar la significación en comparaciones estadísticas, y las diferencias se consideraban significativas a p<0,05. *, p < 0,05. **, p<0,01 a menos que se apunte.
La Figura 3A es un gráfico de barras que muestra que MrgprB2 media en la reactividad de células cebadas y los efectos secundarios de fármacos terapéuticos peptidérgicos. La Figura 3A muestra el porcentaje de células reactivas de células cebadas peritoneales de WT y MrgprB2MUT después de la aplicación del fármaco, ensayada usando obtención de imágenes con Fluo-4. Concentraciones de fármacos (en pg/ml): icatibant, 50; cetrorelix, 20; leuprorelina, 100; octreotida, 10; sermorelina, 60; insulina, 80. n=3/genotipo; >150 células contadas/sustancia, excepto >100 células contadas para la insulina. La diferencia entre la reactividad a insulina no era significativa. La Figura 3B (izquierda) muestra imágenes representativas de extravasación de azul de Evans 15 minutos después de la inyección intraplantar de icatibant (derecha, flecha, 10 mg/ml, 5 pl en solución salina) o solución salina (izquierda). La Figura 3B (derecha) muestra la cuantificación de la fuga de azul de Evans al pie después de 15 minutos. **, p<0,01 (n=6 para cada genotipo). La diferencia después de la inyección de solución salina no era significativa. La Figura 3C es una serie de representaciones de puntos que muestran la liberación de histamina total de ratones WT (rombos rojos) y MrgprB2MUT (cuadrados negros) después de la incubación con las sustancias nombradas. No se encontraba una diferencia significativa entre células WT y MrgprB2MUT a ninguna dosis de anticuerpo anti-IgE. Los experimentos se repitieron >3 veces. Los datos se presentan como media ± SEM. Prueba de la t de Student desapareada bilateral: *, p < 0,05. **, p<0,01.
La Figura 4A es una serie de estructuras del Compuesto 48/80 y una variante ciclada, que se indica que es más potente. El motivo de tetrahidroisoquinolina (THIQ) está destacado en azul. La Figura 4B es una serie de estructuras de miembros representativos de todas las clases de NMBD. Los motivos de THIQ están destacados en azul. Nótese que solo la succinilcolina carece de un grupo hidrófobo voluminoso. La Figura 4C es un diagrama de barras que muestra que MrgprB2 media en la reactividad de células cebadas y los efectos secundarios de fármacos terapéuticos micromoleculares. La Figura 4C muestra el porcentaje de células reactivas de células cebadas peritoneales de WT y MrgprB2MUT después de la aplicación de diversos NMBD, ensayado usando obtención de imágenes con Fluo-4. Concentraciones de fármacos (en pg/ml): atracurio, 50; mivacurio, 20; tubocurarina, 30; rocuronio, 500. n=3 ratones/genotipo; >150 células contadas/sustancia. La Figura 4D es una representación de la estructura de la ciprofloxacina, con el motivo común a todas las fluoroquinolonas destacado en azul. Nótense los nitrógenos cercanos a los motivos de quinolona. La Figura 4E es un diagrama de barras que muestra el porcentaje de células reactivas de células cebadas peritoneales de WT y MrgprB2MUT después de la aplicación de fluoroquinolona, ensayado usando obtención de imágenes con Fluo-4. Concentraciones de fármacos (en pg/ml): ciprofloxacina, 200; levofloxacina, 500; moxifloxacina, 160; ofloxacina, 400. n=3 ratones/genotipo; >150 células contadas/sustancia. La Figura 4F es un gráfico de líneas que muestra cambios en la temperatura corporal después de la inyección intravenosa de ciprofloxacina (1,5 mg en 125 pl de solución salina) en el momento 0. n=4 ratones/genotipo. Los datos se presentan como media ± SEM. Prueba de la t de Student desapareada bilateral: *, p < 0,05. **, p<0,01.
La Figura 5A es una fotografía de una transferencia que muestra que los ortólogos de MrgprX1 no se expresan a niveles importantes en células cebadas bajo condiciones naturales. La Figura 5A muestra resultados de un cribado por RT-PCR poco restrictivo en células cebadas peritoneales para la expresión de los ortólogos de MrgprX1 MrgprA3 y MrgprC11. La flecha apunta a los tamaños de banda esperados. La Figura 5B es un diagrama de barras que muestra los porcentajes de células cebadas peritoneales que responden al fragmento 8-22 de péptido derivado de médula suprarrenal bovina agonista de MrgprX1 y MrgprC11 (BAM8-22, 500 nM). La activación se ensayó midiendo los aumentos en el calcio intracelular, usando la obtención de imágenes del colorante Fluo-4. Las diferencias no son significativas (p=0,39). Los datos de los grupos se expresan como media ± error estándar de la media. Se usó la prueba de la t de Student desapareada bilateral para determinar la significación en las comparaciones estadísticas. La Figura 5C es un diagrama que resume las respuestas a ligandos de MrgprX2 y el ligando de MrgprX1 cloroquina (CQ) por células HEK293 transfectadas transitoriamente con plásmidos que conducen la expresión de MrgprX2, MrgprB2, y otros Mrgpr de ratón (es decir MrgprB1, B10 y B11) muy estrechamente relacionados con MrgprB2. Las respuestas positivas y negativas se indican como "cruces" y "vistos", respectivamente. Las respuestas se consideraban positivas si al menos la mitad de las células transfectadas mostraba un incremento de 50% en [Ca2+]i. Ninguna de las células transfectadas con MrgprB1, B 10 y B 11 respondía a ningún fármaco listado.
La Figura 6A es una serie de gráficos de líneas que muestran que los secretagogos básicos y los fármacos que inducen reacciones seudoalérgicas activan MrgprB2 de ratón y MrgprX2 de ser humano expresados en células HEK293. La Figura 6A muestra trazados ejemplares que muestran cambios en [Ca2+]i, según se mide por obtención de imágenes con Fluo-4, a partir de células HEK293 que expresan MrgprB2 y Ga15. La Figura 6B muestra trazados ejemplares que muestran cambios en [Ca2+]i, según se mide por obtención de imágenes con Fluo-4, a partir de células HEK293 que expresan MrgprX2 y Ga15. Las sustancias se perfundieron desde el período de 30 a 90 segundos, excepto para la ciprofloxacina, que se perfundía entre los períodos de 30 y 60 segundos para minimizar la exposición a las soluciones de pH bajo en las que estaba disuelta. Se usó insulina como un control negativo. La Figura 6C es una tabla de EC50 de secretagogos básicos y fármacos asociados con reacciones seudoalérgicas para activar células HEK293 que expresan MrgprB2 y MrgprX2. Las EC50 se determinaron a partir de estudios de respuesta a la dosis que se repitieron tres veces. Los datos se expresan como media ± SEM.
La Figura 7 es una serie de fotomicrografías que muestran que múltiples líneas de ratones transgénicos BAC confirman la expresión de MrgprB2 específica de células cebadas. La Figura 7 muestra imágenes confocales representativas de otras dos líneas de ratones transgénicos BAC. Los ratones BAC que expresaban eGFP-Cre en el marco de lectura abierto de MrgprB2 se aparearon con ratones indicadores tdTomato y la expresión de tdTomato (rojo) se comparó con tinción con avidina (verde), un marcador para células cebadas. La barra de la escala es de 20 gm.
La Figura 8A-Figura 8B muestran que MrgprB2 no se expresa en células cebadas mucosas o glóbulos blancos periféricos. La Figura 8A muestra imágenes representativas de una sección de estómago de un ratón MrgprB2-tdTomato teñida con un anticuerpo anti-MCPT 1 (p-quimasa) para marcar células cebadas mucosas. Las flechas blancas indican células positivas. Ninguna de las células se marcó doblemente (296 células marcadas con Mcpt1 y 275 células contadas positivas a tdTomato, n=3 ratones). La barra de la escala es de 40 gm. La Figura 8B muestra imágenes representativas de una preparación en Cytospin de glóbulos blancos periféricos procedentes de un ratón MrgprB2-tdTomato doblemente marcado con tdTomato para células que expresan MrgprB2 (rojo; imagen de la izquierda) y tinción nuclear con Hoechst 33342 (azul; imagen de la derecha). Ningún glóbulo blanco periférico expresaba MrgprB2 (n=3 ratones; >4000 células examinadas). La barra de la escala es de 40 gm.
La Figura 9A, la Figura 9B, la Figura 9C y la Figura 9D muestran que los ratones MrgprB2MUT están funcionalmente inactivados. La Figura 9A es una ilustración de la región genómica en y alrededor del locus MrgprB2. Nótese que las secuencias repetitivas, incluyendo elementos intercalados largos (LINE), elementos intercalados cortos (SINE) y repeticiones en tándem largas (LTR), empiezan inmediatamente después del lado 3' del gen MrgprB2, y además están presentes dentro de las 2,5 kb del lado 5'. Una búsqueda por BLASTN en marzo de 2014 usando las 500 bases adyacentes al extremo 3' de MrgprB2 como un interrogante presentaba más de 269.000 aciertos en el genoma de ratón. La Figura 9B es una comparación de las secuencias genómicas WT y MUT que muestra la localización de la eliminación de cuatro pares de bases en el mutante. Los números corresponden al marco de lectura abierto de MrgprB2. La Figura 9C es un resultado de secuenciación de ADNc de WT y MUT muestreado de ratones nacidos 18 meses después de que se estableciera la línea mutante. Las bases ausentes en el mutante se destacan en rojo. La Figura 9D es una traducción de aminoácidos del marco de lectura abierto de MrgprB2MUT que revela que la eliminación crea una mutación por cambio de marco y un codón de terminación temprano (*) poco después de la primera región transmembranaria. Mut - sitio de la eliminación por cambio del marco. TM1 - región transmembranaria 1.
La Figura 10A-Figura 10B es una serie de fotomicrografías y diagramas de barras que muestran que los números de células cebadas y el contenido de histamina de tejido traqueal y cutáneo no eran diferentes entre animales silvestres y MrgprB2MUT. La Figura 10A (parte superior) muestra fotografías representativas de tinción con avidina en ratones WT y MrgprB2MUT. La barra de la escala es de 40 gm. La Figura 10A (parte inferior) muestra la cuantificación de los números de células cebadas en diversos tejidos. Las diferencias no son significativas, usando una prueba de la t de Student desapareada bilateral (n=3 ratones para cada genotipo; más de 3000 gm2 y 1000 gm2 contados para cada genotipo para piel hirsuta y lampiña, respectivamente; más de 10.000 células peritoneales contadas). La Figura 10B muestra que el contenido de histamina traqueal era como promedio 5,9 ± 0,9 y 5,5 ± 1,6 ng/mg (n=5 para cada genotipo), respectivamente; el contenido de histamina cutánea era como promedio 30,8 ± 3,2 y 30,2 ± 4,0 ng/mg (n=8 para cada genotipo), respectivamente. Las diferencias no eran significativas. Los datos de los grupos se expresan como media ± error estándar de la media. Se usó la prueba de la t de Student desapareada bilateral para determinar la significación en comparaciones estadísticas.
La Figura 11A, la Figura 11B y la Figura 11C son una serie de fotomicrografías, un gráfico lineal y un diagrama de barras, respectivamente, que muestran que la endotelina actúa a través de la activación comparable inducida por ETA GPCR1 en células cebadas MrgprB2MUT y silvestres. La Figura 11A muestra imágenes de matriz cromática de células cebadas peritoneales de ratón que muestran cambios en [Ca2+]i, según se ensaya mediante obtención de imágenes con Fluo-4, inducidos por la aplicación de un baño de endotelina (1 gM). La barra de la escala es de 10 gm. La Figura 11B muestra promedios de trazados de obtención de imágenes de [Ca2+]i para WT (línea roja) y MrgprB2MUT (línea negra). Los trazados de [Ca2+]i son similares entre los grupos WT y MUT. Los trazados se promediaron según se describe para la Figura 2A. La Figura 11 C muestra la cuantificación del porcentaje de células sensibles. Los datos de los grupos se expresan como media ± error estándar de la media. Se usó la prueba de la t de Student desapareada bilateral para determinar la significación en comparaciones estadísticas (n=3 para cada genotipo; más de 180 células contadas para cada genotipo). Las respuestas inducidas por endotelina no eran significativamente diferentes.
La Figura 12A y la Figura 12B muestran que la inflamación mediada por IgE no es diferente entre ratones silvestres y MrgprB2MUT. La Figura 12A muestra imágenes representativas de extravasación de azul de Evans 15 minutos después de la inyección intraplantar de anticuerpo anti-IgE (derecha, flecha, 100 gg/ml, 7 gl en solución salina) o solución salina (izquierda). La Figura 12B muestra la cuantificación de la fuga de azul de Evans al pie después de 15 minutos (n=6 para WT, n=7 para MrgprB2MUT). Las diferencias después de la inyección de antígeno anti-IgE (p=0,49) y solución salina (p=0,23) no son significativas. Los datos de los grupos se expresan como media ± error estándar de la media. Se usó la prueba de la t de Student desapareada bilateral para determinar la significación en comparaciones estadísticas.
La Figura 13A, la Figura 13B, la Figura 13C, la Figura 13D y la Figura 13E muestran que las células cebadas MrgprB2MUT son arreactivas a secretagogos básicos y diversos fármacos terapéuticos. La Figura 13A muestra trazados ejemplares que muestran cambios en [Ca2+]i, según se mide por obtención de imágenes de Fluo-4, de células cebadas peritoneales de WT y MrgprB2MUT inducidos por los secretagogos básicos de la Figura 2E. Cada trazado es una respuesta de una única célula. La Figura 13B muestra imágenes de Fluo-4 representativas (izquierda) y trazados de fluorescencia (derecha) procedentes de células cebadas peritoneales cultivadas WT (parte superior) y MrgprB2MUT (parte inferior) durante la aplicación de icatibant (50 gg/ml). La Figura 9C muestra trazados ejemplares que muestran cambios en [Ca2+]i, según se mide por obtención de imágenes de Fluo-4, de células cebadas peritoneales WT y MrgprB2MUT, inducidos por fármacos peptidérgicos catiónicos aprobados por la FDA seleccionados. Cada trazado es una respuesta procedentes de una única célula. La Figura 13D es una serie de fotomicrografías y un gráfico lineal que muestra imágenes de Fluo-4 representativas (izquierda) y trazados de fluorescencia (derecha) procedentes de células cebadas peritoneales cultivadas WT (parte superior) y MrgprB2MUT (parte inferior) durante la aplicación de atracurio (50 gg/ml). La Figura 13E es una serie de fotomicrografías y un gráfico lineal que muestran imágenes de Fluo-4 representativas (izquierda) y trazados de fluorescencia (derecha) procedentes de células cebadas peritoneales cultivadas W<t>(parte superior) y MrgprB2MUT (parte inferior) durante la aplicación de ciprofloxacina (200 gg/ml).
La Figura 14A y la Figura 14B son una serie de diagramas de barras que muestran que las células cebadas humanas son activadas por secretagogos básicos y fármacos asociados con reacciones seudoalérgicas de un modo dependiente de MrgprX2. Figura 14A células cebadas LAD2 humanas tratadas con diferentes concentraciones de compuesto 48/80, mastoparano, icatibant, atracurio y ciprofloxacina. La activación de células cebadas en respuesta a estas sustancias de caracterizaba por la liberación de p-hexosaminidasa, TNF, PGD2 e histamina. Además, la estimulación con 0,1 gg/ml de estreptavidina de células LAD2 sensibilizadas con IgE humana conjugadas a biotina provocaba una gran liberación de p-hexosaminidasa (71,3±1,8% de liberación), en comparación con células no tratadas (4,1±0,3% de liberación). Los datos de los grupos se expresan como media ± error estándar de la media. La Figura 14B muestra que la atenuación de MrgprX2 humano reducía significativamente la activación de células cebadas provocada por secretagogos básicos y fármacos asociados con reacciones seudoalérgicas, pero no por IgE. Los células cebadas LAD2 humanas se transfectaron en primer lugar con ARNsi de MrgprX2 o ARNsi de control. Dos días después de la transfección, las células se trataron con compuesto 48/80 (0,1 gg/ml), mastoparano (5 gg/ml), icatibant (10 gg/ml), atracurio (25 gg/ml) y ciprofloxacina (75 gg/ml). La activación de células cebadas en respuesta a estas sustancias caracterizada por la liberación de p-hexosaminidasa se reducía significativamente en células tratadas con ARNsi de MrgprX2, en comparación con la liberación en el grupo de control. La desgranulación de células cebadas mediada por IgE no se veía afectada por la atenuación de ARNsi de MrgprX2. Los datos de los grupos se expresan como media ± error estándar de la media. Se usó la prueba de la t de Student desapareada bilateral para determinar la significación en comparaciones estadísticas, y las diferencias se consideraban significativas a * p < 0,05; ** p<0,01; *** p< 0,005 (los experimentos se repitieron tres veces).
La Figura 15 es una tabla de todos los fármacos terapéuticos aprobados por la FDA por debajo de 50 aminoácidos. Las cargas se calcularon mediante ChemAxon. Los datos de ISR para cetrorelix, ganirelix y octreotida provienen de las siguientes referencias: Verschraegen, C. F. y cols. Gynecologic oncology 90, 552 559 (2003); Fluker, M. y cols. Fertility and sterility 75, 38-45 (2001); y Tuvia, S. y cols. The Journal of clinical endocrinology and metabolism 97, 2362-2369, (2012). Todo el resto de la información era suministrado por la FDA.
La Figura 16 es un cuadro que lista todas las clases de fármacos de bloqueo neuromuscular (NMBD) aprobados por la FDA, y miembros representativos.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención presenta un método para determinar si un compuesto induce una reacción de tipo seudoalérgico según la reivindicación 1. La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de un receptor acoplado a proteína G, es decir, MrgprB2 en ratones y MrgprX2 en seres humanos, expresado exclusivamente en un tipo de célula inmunitaria llamado la célula cebada, que está estrechamente relacionado con reacciones de tipo alérgico a sustancias extrañas. Los inventores determinaron que este receptor individual es activado por al menos 13 fármacos aprobados por la FDA diferentes asociados con reacciones de tipo alérgico como parte de sus perfiles de efectos secundarios.
Antes de la invención descrita en el presente documento, el papel de MrgprX2/MrgprB2 en reacciones seudoalérgicas a fármacos era completamente desconocido. Se describe en el presente documento el uso de ensayos basados en células que expresan MrgprX2/MrgprB2 para cribar fármacos que inducen reacciones seudoalérgicas a fármacos. A fin de realizar el trabajo de ensayo, los inventores añadieron la proteína alfa 15 de unión a GTP (Ga15) en células que expresan MrgprX2/MrgprB2 para convertir señales basadas en receptor en incrementos en el calcio intracelular, compatibilizando las líneas celulares con dispositivos de cribado de alto rendimiento. El papel de MrgprX2/MrgprB2 en las reacciones seudoalérgicas a fármacos era desconocido antes de la presente invención. Según esto, no es sorprendente que no se hayan presentado células MrgprX2/Ga15. Aunque se ha presentado la expresión de Ga15 en otras líneas celulares aisladas, solo se utiliza cuando el receptor no induce un aumento en el calcio intracelular. MrgprX2 induce este aumento, lo que sugeriría que es innecesario incluir Ga15 en una célula aislada. Sin embargo, los inventores encontraron que MrgprX2 normalmente induce este aumento en respuesta a algunos agonistas pero no a otros, haciendo la coexpresión esencial para que funcione el ensayo.
Las células aisladas descritas en el presente documento expresan el receptor acoplado a proteína G (GPCR) humano MrgprX2 o el GPCR de ratón MrgprB2, junto con la expresión de la proteína de unión a GTP Ga15, lo que permite una fácil visualización de la activación del receptor en un ensayo de cribado basado en calcio. Estas líneas celulares permiten el cribado de fármacos aprobados por la FDA y fármacos en desarrollo para una actividad agonista y antagonista de MrgprX2. Esto es deseable debido a que la activación de MrgprX2 colateral induce efectos secundarios de tipo alérgico en el cuerpo y puede dar como resultado episodios adversos significativos.
Usando estas células en un ensayo basado en células para cribados de fármacos, un resultado positivo (es decir, la activación de la línea celular según se mide, p. ej., por la liberación de calcio) indicaría que el fármaco activaría normalmente células cebadas y provocaría potencialmente una reacción de tipo alérgico en un paciente. Los cribados de fármacos en desarrollo predecirían su perfil de efectos secundarios; los cribados de fármacos actualmente en uso identificarían una causa de los efectos adversos de estos fármacos; los cribados de antagonistas conducirían a nuevos fármacos terapéuticos que se pueden proporcionar al mismo tiempo que fármacos que inducen reacciones de tipo alérgico, bloqueando así la activación de células cebadas mientras que no interfieren con sus usos pretendidos.
Según se describe con detalle posteriormente, las respuestas de tipo alérgico locales y sistémicas en ratones silvestres en respuesta a estos fármacos se suprimen en ratones que carecen de MrgprB2, el ortólogo de ratón de MrgprX2 humano. Este hallazgo altamente inesperado demuestra que MrgprX2 es una diana farmacológica atractiva, puesto que un antagonista se puede coaplicar con una gama muy amplia de fármacos para bloquear sus efectos secundarios de tipo alérgico.
Se describen en el presente documento líneas celulares que se usan para cribar fármacos aprobados por la FDA y compuestos de investigación que activan o antagonizan este receptor. Estas serán útiles para determinar si un fármaco inducirá respuestas alérgicas y en cribados para desarrollar antagonistas que bloqueen estas respuestas.
Se describen en el presente documento resultados que demuestran que los secretagogos básicos activan células cebadas de ratónin vitroein vivoa través de un único receptor, MrgprB2, el ortólogo del receptor acoplado a proteína G (GPCR) humano MrgprX2. La liberación de histamina inducida por secretagogos, la inflamación y la contracción de las vías respiratorias se suprimen en ratones con mutación anuladora de MrgprB2. Por otra parte, según se describe con detalle posteriormente, la mayoría de las clases de fármacos peptidérgicos aprobados por la FDA asociados con reacciones de tipo alérgico en la zona de inyección también activan MrgprB2 y MrgprX2, y que la inflamación en la zona de inyección está ausente en ratones mutantes. Los resultados descritos en el presente documento demuestran que MrgprB2 y MrgprX2 son dianas de muchos fármacos micromoleculares asociados con reacciones seudoalérgicas sistémicas, o anafilactoides; que los síntomas inducidos por fármaco de respuestas anafilactoides se reducen significativamente en ratones inactivados. También se describe en el presente documento la identificación de un motivo químico común en varias de estas moléculas, lo que ayuda a predecir efectos secundarios de otros compuestos. Se describe posteriormente con detalle la introducción de un modelo en ratones para estudiar la activación de células cebadas por secretagogos básicos y la identificación de MrgprX2 como una diana terapéutica para reducir un subgrupo de efectos adversos inducidos por fármacos.
Células cebadas
Las células cebadas son efectores primarios en reacciones alérgicas, y pueden tener papeles significativos en enfermedades al secretar histamina y diversas sustancias inflamatorias e inmunomoduladoras (Metcalfe, y cols., 1997 Physiological reviews 77, 1033-1079; Galli y cols., 2005 Nature immunology 6, 135-142). Aunque clásicamente son activados por anticuerpos de IgE, una propiedad única de las células cebadas es su sensibilidad independiente de anticuerpos a una gama de sustancias catiónicas, llamadas colectivamente secretagogos básicos, incluyendo péptidos inflamatorios y fármacos asociados con reacciones de tipo alérgico (Metcalfe, y cols., 1997 Physiological reviews 77, 1033-1079; Lagunoff y cols., 1983 Annual review of pharmacology and toxicology 23, 331-351). Los papeles para estas sustancias en la patología han motivado una búsqueda de décadas de su receptor o receptores.
Una célula cebada (también conocida como mastocito o labrocito) se deriva de la célula madre mieloide. Es una parte del sistema inmunitario y contiene muchos gránulos ricos en histamina y heparina. Aunque mejor conocidas por su papel en la alergia y la anafilaxis, las células cebadas representan asimismo un importante papel protector, estando íntimamente implicadas en la curación de heridas y la defensa contra patógenos. La célula cebada es muy similar tanto en apariencia como en función al basófilo, otro tipo de glóbulo blanco. Estas células difieren en que las células cebadas residen en tejidos, p. ej. en tejidos mucosos, mientras que los basófilos se encuentran en la sangre. Ambas células son células granuladas que contienen histamina y heparina, un anticoagulante. Ambas células también liberan histamina tras unirse a inmunoglobulina E.
Las células cebadas están presentes en la mayoría de los tejidos que rodean característicamente los vasos sanguíneos y los nervios, y son especialmente predominantes cerca de los límites entre el mundo exterior y el medio interno, tales como la piel, la mucosa de los pulmones, y el tracto digestivo, así como la boca, la conjuntiva y la nariz.
Las células cebadas representan un papel en el proceso inflamatorio. Cuando se activa, una célula cebada libera rápidamente sus gránulos característicos y diversos mediadores hormonales al intersticio. Las células cebadas se pueden estimular para desgranularse mediante un ataque directo (p. ej., físico o químico (tales como opioides, alcoholes y ciertos antibióticos tales como polimixinas), reticulación de receptores de inmunoglobulina E (IgE) o proteínas del complemento.
Las células cebadas expresan un receptor de alta afinidad (FcsRI) para la región Fc de IgE, el miembro menos abundante de los anticuerpos. Este receptor es de una afinidad tan alta que la unión de moléculas de IgE es en esencia irreversible. Como resultado, las células cebadas se revisten con IgE, que es producida por células plasmáticas (las células productoras de anticuerpos del sistema inmunitario).
En las reacciones alérgicas, las células cebadas permanecen inactivas hasta que un alérgeno se una a IgE ya revestida sobre la célula. Otros episodios de activación pueden ser bien el cebado de células cebadas para la desgranulación posterior o bien la actuación en sinergia con la transducción de señales de FcsRI. En general, los alérgenos son proteínas o polisacáridos. El alérgeno se une a sitios de unión a antígeno, que están situados sobre regiones variables de las moléculas de IgE unidas a la superficie de la célula cebada. La agregación de los dominios intracelulares de los receptores de Fc unidos a células, que están asociados con las moléculas de IgE reticuladas, provoca una secuencia compleja de reacciones dentro de la célula cebada que conduce a su activación. Las moléculas liberadas al entorno extracelular incluyen: mediadores preformados (a partir de los gránulos) (p. ej., serina proteasas, tales como triptasa, histamina (2-5 pg/célula), serotonina, proteoglucanos, heparina (activa como anticoagulante)), mediadores lipídicos recientemente formados (eicosanoides) (es decir, tromboxano, prostaglandina D2, leucotrieno C4, factor activador de plaquetas) y citocinas (p. ej., factor quimiotáctico de eosinófilos).
La histamina dilata vénulas poscapilares, activa el endotelio e incrementa la permeabilidad de los vasos sanguíneos. Esto conduce a edema local (hinchamiento), calentamiento, enrojecimiento y la atracción de otras células inflamatorias a la zona de liberación. La histamina también despolariza las terminaciones nerviosas (conduciendo a prurito o dolor). Signos cutáneos de la liberación de histamina incluyen la reacción de "eritema y pápulas". El habón y el enrojecimiento inmediatamente después de una picadura de mosquito son un buen ejemplo de esta reacción, que se produce segundos después de la estimulación de la célula cebada por un alérgeno.
MrgprX2
Según se describe en el presente documento, el miembro X2 del receptor acoplado a proteína G relacionado con mas (MrgprX2) es un receptor específico de células cebadas para secretagogos básicos, es decir, fármacos anfifílicos catiónicos, así como péptidos endo- o exógenos, que consiste en un grupo de cabeza básico y un núcleo hidrófobo. Véase McNeil B.D., 2015 Nature, 519: 237-241. Según se describe con detalle posteriormente, MrgprX2 reconoce y se une a micromoléculas que contienen una tetrahidroisoquinolina (THIQ) ciclada, tales como fármacos de bloqueo neuromuscular no esteroideos (NMBD), incluyendo tubocurarina y atracurio. Según se describe con detalle posteriormente, en respuesta a estos compuestos, MrgprX2 media en reacciones seudoalérgicas caracterizadas por liberación de histamina, inflamación y contracción de las vías respiratorias. Según se describe en el presente documento, MrgprX2 también actúa como un receptor para un número de otros ligandos, incluyendo péptidos y alcaloides, tales como cortistatina-14, péptidos N-terminales de proadrenomedulina PAMP-12 y, en menor grado, PAMP-20, proteína antibacteriana LL-37, péptido PMX-53, beta-defensinas y complanadina A.
Una secuencia ejemplar de aminoácidos de MrgprX2 humano se proporciona posteriormente (NP_001290544.1 (GI:746816153), (SEQ ID NO: 1)):
1mdpttpawgt esttvngndq allllcgket lipvflilfi alvglvgngf vlwllgfrmr
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5 301 qralqdiaev dhsegcfrqg tpemsrsslv
Una secuencia ejemplar de ácido nucleico de MrgprX2 humano se proporciona posteriormente (NM_001303615.1 (GI:746816152), (SEQ ID NO: 2)):
Una secuencia ejemplar de aminoácidos de MrgprB2 de ratón se proporciona posteriormente (NP_780740.2 (GI:229094244), (SEQ ID NO: 3)):
1 msgdfliknl stsawktnit vlngsyyídt svcvtrnqam illsiiislv gmglnaivlw
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<Una secuencia>V<ele ácido nucleico de MrgprB2 de ratón se proporciona posteriormente (NM_175531.4>(GI:229094243), ID NO: 4)):
1 agaggactct tctctttgtc acagaccagt ttaacacttc ccataagaag aatagagcaa
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Ga15
La proteína alfa 15 de unión a GTP (Ga15) es un modulador o transductor en diversos sistemas de señalización transmembranarios.
Una secuencia ejemplar de aminoácidos de Ga15 humano se proporciona posteriormente (NP_002059.3 (GL597709771), (SEQ ID NO: 5)):
1 marsltwrcc pwcltedeka aarvdqeinrilleqkkqdr gelkllllgp gesgkstfik
61 qmriihgagy seeerkgfrp lvyqnífvsmramieamerl qipfsrpesk hhaslvmsqd
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361 dsvlarylde inll
Una secuencia ejemplar de ácido nucleico de Ga15 humano se proporciona posteriormente (NM_002068.3 (GI:597709770), (SEQ ID NO: 6)):
Una secuencia ejemplar de aminoácidos de Ga15 de ratón se proporciona posteriormente (NP_034434.1 (GL6754010), (SEQ ID NO: 7)):
1 marsltwgcc pwclteeekt aaridqeinr illeqkkqer eelkllllgp gesgkstfik
61 qmriihgvgy seedrrafrl liyqnifvsm qamidamdrl qipfsrpdsk qhaslvmtqd
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181 dvlrsrmptt gineycfsvk ktklrivdvg gqrserrkwi hefenviali ylaslseydq
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Una secuencia ejemplar de aminoácidos de GalS de ratón se proporciona posteriormente (NM_010304.3 (GI:34328487), (SEQ ID NO: 8)):
1 gctggagcttccaccaccga cctgtctggc gggcagggcc aggtctgggc aagttggagg
61 gggcgggaagcagcacccag gtccccgccc tgtttccagc acccaggcct cttgaagccc
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Células HEK293
Las células renales embrionarias humanas 293, también denominadas a menudo células HEK 293, HEK-293, 293, o menos precisamente células HEK, son una línea celular específica derivada originalmente de células renales embrionarias humanas (procedentes de un aborto de embrión humano) desarrolladas en cultivo tisular y procedentes de animales nacidos muertos. Las células HEK 293 son muy fáciles de desarrollar y se transfectan muy fácilmente y se han usado ampliamente en investigación biológica celular durante muchos años. También son usadas por la industria biotecnológica para producir proteínas y virus terapéuticos para terapia génica.
Se describen en el presente documento células I-IEK293 que expresan establemente Ga15 y bien MrgprB2 o bien MrgprX2.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Materiales y métodos
Se usaron los siguientes materiales y métodos.
Modelos en animales
Todos los experimentos que implican tratamientos iguales en muestras y animales WT y mutantes fueron efectuados por experimentadores que desconocían las condiciones.
Análisis
Los datos de los grupos se expresaron como media ± error estándar de la media. Se usó la prueba de la t de Student desapareada bilateral para determinar la significación en comparaciones estadísticas, y las diferencias se consideraban significativas ap< 0,05. Se usó un análisis de poder estadístico para justificar el tamaño de la muestra. Se suponía que los datos estaban distribuidos normalmente ya que la mayoría de los valores de los resultados estaban distribuidos simétricamente alrededor del valor medio dentro de cada grupo. La varianza es similar entre grupos determinada por la prueba de la F. Las células cebadas que se consideraban dañadas, bien por falta visible de adherencia de fibronectina o bien por niveles de calcio en reposo anormalmente altos, se excluían del análisis. Por lo demás, ni muestras ni animales sometidos a procedimientos y/o tratamientos satisfactorios se excluían del análisis. No se usó aleatorización para los estudios en animales ya que no es aplicable para los estudios.
Péptidos y fármacos
El compuesto 48/80, mastoparano de véspido, rocuronio, tubocurarina, ciprofloxacina, levofloxacina, moxifloxacina y ofloxacina eran de Sigma. La cortistatina era de Tocris Biosciences. PAMP (9-20) se sintetizó como de costumbre y se purificó hasta >98% mediante Genscript. La leuprorelina era de Genscript. La sustancia P, la calidina, el mastoparano, el cetrorelix, la octreotida, la sermorelina (factor liberador de hormona del crecimiento 1-29), el icatibant (HOE-140) eran de Anaspec. El atracurio y el mivacurio eran de Santa Cruz Biotechnology. La insulina humana recombinante era de Roche. La anti-IgE de ratón caprina (Ab9162) era de Abcam.
Preparación y almacenamiento de fármacos
El atracurio, el mivacurio, la tubocurarina y todas las soluciones de fluoroquinolona se prepararon el día del experimento debido a que se encontró que las potencias de los tres primeros eran sensibles a los efectos de la oxidación y/o la congelación-descongelación, mientras que solubilidad de las fluoroquinolonas era la mejor cuando se preparaban recientemente. También se preparó propranolol recientemente el día del experimento para minimizar las posibilidades de una pérdida en la potencia. Todas las fluoroquinolonas excepto la levofloxacina se disolvieron en CIB ajustado hasta pH 3,5. Todos los otros fármacos se prepararon como partes alícuotas de 100X-1000X y se almacenaron a -80°C antes de descongelar a 4°C y diluir en tampón de obtención de imágenes de calcio o solución salina.
Cribado de Mrgpr por RT-PCR
El ácido ribonucleico (ARN) se purificó de 4 x 104 células cebadas peritoneales de ratón con una microcolumna Qiagen RNEasy, según las sugerencias del fabricante. El ARN se trató durante 20 minutos con DNAse I (New England BioLabs) y se repurificó con otra microcolumna RNEasy. Se usaron 8 ng de ARN para generar ADNc de la primera cadena usando un estuche SuperScript III (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante, usando cebadores de oligo dT y aumentando a escala la reacción de 10 pl recomendada hasta 60 pl. La reacción de control negativo era la misma excepto que la transcriptasa inversa de SuperScript III se reemplazó por agua. Se procesaron 25 pl de reacciones de PCR con 12,5 pl de RedTaq ReadyMix (Sigma), 0,5 pl de DMSO, 0,25 pl de cada uno de los cebadores directo e inverso específicos del gen 50 pM, 10 pl de agua y 2 pl de mezcla de ADNc procedente de las reacciones de síntesis de ADNc o control negativo. Todas las reacciones usaban una etapa inicial de 4 minutos a 95°C, 30 segundos de reasociación a temperaturas específicas (descritas posteriormente), 40 segundos de extensión a 72°C y 25 segundos a 95°C (con las últimas tres etapas repetidas 39 veces) y una etapa final de 4 minutos a 72°C. La PCR de baja restricción se graduó para la reasociación a 60°C; por lo demás, las temperaturas de reasociación eran: 62°C paraMrgprAI, MrgprA10, MrgprB2yMrgprB6;64°C paraMrgprA2, MrgprA3, MrgprA4, MrgprA6, MrgprA16, MrgprA18,yMrgprB11;65°C paraMrgprA9, MrgprA19, MrgprBI, MrgprB3, MrgprB5yMrgprB8;66°C paraMrgprA12yMrgprB10;63°C paraMrgprB4;61 °C paraMrgprA14;y 65,5°C paraMrgprC11.
Los cebadores eran como sigue.MrgprA1(para atccagcaagaggaatgggg (SEQ ID NO: 9), rev tgtgacctaggaggaagaagaag (SEQ ID NO: 10));MrgprA2(para cctcctacacaagccagcaa (SEQ ID NO: 11), rev aagcacaagtgaaagatgatgct (SEQ ID NO: 12));MrgprA3(para gctacatccagcaagaggaatg (SEQ ID NO: 13), rev gcaaaaattcctttgggtagggt (SEQ ID NO: 14));MrgprA4(para cctgtgtgctgtgatctggt (<s>E<q>ID NO: 15), rev tcacggttaatccagggcac (SEQ ID NO: 16));MrgprA6(para cattttcctcccccaacagt (SEQ ID NO: 17), rev atgcctgaatgagcccacaa (SEQ ID NO: 18));MrgprA9(para cagtgatctacatccagcaaaagg (SEQ ID NO: 19), rev gcgtggaagctatgatgcga (SEQ ID NO: 20));MrgprA10(para cagtggtccaccatctccaa (SEQ ID NO: 21), rev acaggcaagagagtcatggtt (SEQ ID NO: 22));MrgprA12(para tcagggatcgggtgaagcac (SEQ ID NO: 23), rev gagcatttgaaggtgttgttgga (SEQ ID NO: 24));MrgprA14(para ggttgcccctgtgtttcttc (SEQ ID NO: 25), rev tattgccagtcagtaagctgag (SEQ ID NO: 26));MrgprA16(para gccctctggttcccattact (SEQ ID NO: 27), rev gtttttggaccactgaggcatt (SEQ ID NO: 28));MrgprA18(para tgctctggttttctcctttgc (SEQ ID NO: 29), rev tgaggcatgtcaagtcagtca (SEQ ID NO: 30));MrgprA19(para caggacccagatcacgacac (SEQ ID NO: 31), tcctgggcttccgatttcac (SEQ ID NO: 32));MrgprB1(para attagccttcatcaggcacca (SEQ ID NO: 33), ccagcccaactaaggcaatg (SEQ ID NO: 34));MrgprB2(para gtcacagaccagtttaacacttcc (SEQ ID NO: 35), cagccatagccaggttgagaa (SEQ ID NO: 36));MrgprB3(para acctggctgtggctgatttt (SEQ ID NO: 37), rev gctgaacccacagagaacca (SEQ ID NO: 37));MrgprB4(para tctggctggtgctgatttctt (SEQ ID NO: 38), rev accacgaggctcaacaataga (SEQ ID NO: 39));MrgprB5(para ctgtggttccttctgtgtcca (SEQ ID NO: 40), rev tttccagttccccagaccttt (S<e>Q ID NO: 41));MrgprB6(para tctgtctacatcctcaacctgg (SEQ ID NO: 42)), rev attatctcatgaggaaggctcaa (SEQ ID NO: 43));MrgprB8(para agagaatgcaaagcatgcga (SEQ ID NO: 44), rev gaggaagtttgccccagaca (SEQ ID NO: 45));MrgprB10(para cactggtcacattgccaacc (SEQ ID NO: 46, rev ggggatggaatcaatgtccaaga (SEQ ID NO: 47);MrgprB11(para accttcttgctatttttccctcca (SEQ ID NO: 48), rev aggatgagactggacccaca (S<e>Q ID NO: 49));MrgprC11(para cagcacaagtcagctcctcaa (SEQ ID NO: 50), rev atgcccatgagaaaggacagaacc (SEQ ID NO: 51)).
Construcciones de expresión
Los genes Mrgpr se clonaron e insertaron en el plásmido de expresión de mamífero pcDNA3.1 usando técnicas estándar. Todos los genes de ratón tenían secuencia de Kozak en su extremo N y también codificaban una etiqueta FLAG C-terminal separada de los genes por el conector de aminoácidos DIIL.
Construcciones de ADNc
Se preparó ADNc de la primera cadena como se describe para los cribados por RT-PCR, y se realizó una amplificación usando the Q5 HotStart High Fidelity Master Mix (New England Biolabs). Al menos cinco clones diferentes preparados cada uno a partir de ratones silvestres y mutantes se secuenciaron para verificar la presencia de la eliminación en el mutante y la ausencia de cualquier otra mutación del tipo silvestre o el mutante.
Obtención de imágenes de calcio en células HEK293
En los cribados iniciales, las células HEK293 (no probadas con respecto a micoplasma pero que se dividen rápidamente) se transfectaron transitoriamente con construcciones génicas que incluyen una etiqueta FLAG C-terminal, y se sembraron son cubreobjetos de vidrio revestidos con 100 gg/ml de poli-D-lisina seis horas después de la transfección. 24 horas más tarde, las células se cargaron con ésteres AM de los indicadores de calcio Fura-2 o Fluo-4 (Molecular Probes) junto con 0,02% de Pluronic F-127 (Molecular Probes) durante 45 minutos a 37°C. Se obtuvieron imágenes de las células cargadas con Fura-2 durante la excitación a 340 y 380 nm, y se obtuvieron imágenes de las células cargadas con Fluo-4 durante la excitación a 488 nm. Experimentos posteriores utilizaban líneas celulares que expresan establemente receptores junto con la expresión transitoria o estable de la proteína G promiscua Ga15. Se obtuvieron imágenes de las células en tampón de obtención de imágenes de calcio (CIB; NaCl 125 mM, KCl 3 mM, CaCl<2>2,5 mM, MgCl<2>0,6 mM, HEPES 10 mM, glucosa 20 mM, NaHCO<3>1,2 mM, sacarosa 20 mM, llevado hasta pH 7,4 con NaOH). A menos que se especifique otra cosa, los fármacos se perfundieron a la cámara durante de 45 a 60 segundos y las respuestas se comprobaron a intervalos de 5 segundos durante 60-90 segundos adicionales.
Determinación de EC<sn>
Células HEK293 que expresan establemente Galfa15 y bien MrgprB2 o bien MrgprX2 se sembraron a 4x10<4>células por pocillo en placas de 96 pocillos y se incubaron durante la noche. Al día siguiente, el medio se retiró y se recolocó con solución para obtención de imágenes del estuche de ensayo FLIPR Calcium 5 (Molecular Devices), se diluyó según las sugerencias del fabricante en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) con HEPES 20 mM, pH 7,4. Las células se incubaron a 37°C durante 60 minutos y se dejó que se recuperaran durante 15 minutos a temperatura ambiente antes de obtener imágenes en una Flexstation 3 (Molecular Devices). Se obtuvieron imágenes de los pocillos según las especificaciones del fabricante durante 120 segundos, con 50 gl de sustancias de prueba a una concentración 3X añadidos 30 segundos después de que empezara la obtención de imágenes. Las respuestas se determinaron sustrayendo la señal mínima de la señal máxima. Las sustancias de probaron en pocillos duplicados, las señales se promediaron y se determinaron las EC<50>para cada experimento normalizando hasta la respuesta máxima a la sustancia en ese experimento. Todos los fármacos se disolvieron en solución de HBSS+HEPES, con las siguientes excepciones debidas a problemas de solubilidad: el acetato de cetrorelix se disolvió en solución salina que contenía CaCl<2>2,5 mM y MgCl<2>0,6 mM, y las fluoroquinolonas excepto la ofloxacina se disolvieron en la misma solución excepto que el pH se ajustó con HCl hasta 3,5; la ofloxacina requería 100 gg/ml de ácido láctico para la solubilidad total. A veces los péptidos perdían potencia después de un ciclo de congelación-descongelación, de modo que la mayoría de los péptidos se preparaban directamente a partir de solución madre liofilizada.
Purificación y obtención de imágenes de células cebadas peritoneales
Ratones macho y hembra adultos de 2-5 meses de edad se sacrificaron a través de inhalación de CO<2>. Se usó un total de 12 ml de medio de disociación de células cebadas (MCDM; HBSS con 3% de suero bovino fetal y HEPES 10 mM, pH 7,2) enfriado en hielo para realizar dos lavados peritoneales secuenciales, que se combinaron, y las células se centrifugaron a 200 g. La pella procedente de cada ratón se resuspendió en 2 ml de MCDM, se estratificó sobre 4 ml de una suspensión isotónica de Percoll al 70% (2,8 ml de Percoll, 320 gl de 10X HBSS, 40 gl de HEPES 1 M, 830 gl de MCDM) y se centrifugó durante 20 minutos, 500 g, 4°C. Las células cebadas se recuperaron en la pella. La pureza era > 95%, según se ensayaba mediante tinción con avidina y por la morfología. Las células cebadas se resuspendieron a 5 x 10<5>- 1 x 10<6>células/ml en DMEM con suero bovino fetal al 10% y 25 ng/ml de factor de células madre de ratón recombinante (Sigma), y se sembraron sobre cubreobjetos de vidrio revestidos con 30 gg/ml de fibronectina (Sigma). Para el conteo, en lugar de la siembra, las células cebadas suspendidas se diluyeron 1/10 y se fijaron a portaobjetos centrifugando a 1000 rpm durante 5 minutos a 4°C en una CytoSpin (Thermo Scientific).
Para la obtención de imágenes, después de dos horas de incubación a 37°C, CO<2>al 5%, las células cebadas se cargaron con Fluo-4 junto con Pluronic F-127 al 0,02% durante 30 minutos a temperatura ambiente, se lavaron 3 veces en CIB y se usaron inmediatamente para la obtención de imágenes. Las células se usaron dentro de las dos horas posteriores a la carga. Las células se identificaron como reactivas si la [Ca2+]i aumentaba en al menos 50% durante al menos 10 segundos, lo que claramente distingue una respuesta inducida por ligando de episodios de fluctuación aleatorios. Los trazados promedio se calcularon tomando la respuesta promedio de cada célula en un ratón, y promediándolos.
Generación de ratones transgénicos BAC
El clon BAC RP23-65I23 se adquirió del Children's Hospital Oakland Research Institute. Este clon contiene el locusMrgprB2, ~60 kb de la secuencia genómica 5' y más de 100 kb de la secuencia genómica 3'. Se usó recombinación en bacterias para introducir un eGFP-Cre y una señal de poliA inmediatamente después del codón de inicio MrgprB2 (Metcalfe, D. D., Baram, D. & Mekori, Y. A. Mast cells. Physiological reviews 77, 1033-1079 (1997)). El BAC se linealizó con NotI (New England Biolabs) y se inyectó en pronúcleos procedentes de huevos C57Bl/6 fertilizados con una sola célula. Los huevos se implantaron en hembras seudopreñadas. Se establecieron tres líneas de ratón BAC. Aunque los ratones ya estaban en un fondo de C57B1/6, se cruzaron durante al menos cuatro generaciones con ratones indicadores WT y tdTomato en el fondo de C57Bl/6 antes del uso en los experimentos. Los ratones BAC se aparearon con ratonesROSA26Tdtomatoadquiridos de Jackson Labs para estudios de obtención de imágenes. Los experimentos para la Figura 1 usaban ratones homocigóticos paraROSA26Tdtomatodebido a que la señal de tdTomato a menudo era heterogénea y débil en ratones heterocigóticos. Se efectuaron reacciones de genotipado para ratones BAC a una reasociación a 61°C, y los cebadores eran: directo, tatatcatggccgacaagca; inverso, cagaccgcgcgcctgaaga. Ambos cebadores están en el marco de lectura deeGFP-Crepero todo el gen y la colocación correcta en el locusMrgprB2se verificaba mediante secuenciación previa.
Generación de ratones mutantes MrgprB2
Se adquirieron de Sigam ARNm que codifican nucleasas del dedo de cinc que se dirigen a MrgprB2. Los sitios de unión eran GTTCCTGGGCATCCG (SEQ ID NO: 52) y TGCACACGAATGCCTTCACTG (SEQ ID NO: 53), correspondientes a las bases 180-194 y 196-216, respectivamente, del marco de lectura abierto de MrgprB2. El ARNm se diluyó hasta 2 ng/ml en tampón de Tris-HCl 1 mm, pH 7,4, con EDTA 0,25 mm, y se inyectó en los pronúcleos de huevos fertilizados con una sola célula en la cepa C57Bl/6. No se observaron signos de toxicidad excesivos. Los embriones se implantaron en hembras seudopreñadas. El ADN que flanquea los sitios de unión se amplificó a partir de ratones fundadores y se cribó con respecto a mutaciones usando el estuche de ensayo Cel-1 (Transgenomics), según las sugerencias del fabricante. 3 los primeros 28 ratones se identificaron y se confirmó mediante secuenciación de ADN que tenían pequeñas mutaciones, y no se realizó más cribado. Además de la mutación de 4 pb usada en este estudio, se identificaron un ratón que tenía una eliminación de 1 pb y otro con una eliminación de 2 pb.
Genotipado de ratones silvestres y MrgprB2MUT
Los cebadores usados para ratones silvestres eran GGTTCCTGGGCATCCGTAT (SEQ ID NO: 54) y GGTTCCTGGGCATCCGTAT (SEQ ID NO: 55), y las reacciones se efectuaron a una temperatura de reasociación de 62,8°C.
Los cebadores para ratones MrgprB2MUT eran GTTCCTGGGCATCCGCAC (SEQ ID NO: 56) y CTTCCGCCTGAACCTTCGGT (SEQ ID NO: 57), y las reacciones se efectuaron a una temperatura de reasociación de 64,0°C.
Marcaje de tejido con avidina
Ratones macho y hembra adultos de hasta 8 meses de edad se anestesiaron con pentobarbital y se perfundieron con 20 ml de PBS 0,1 M (pH 7,4, 4°C) seguido de 25 ml de fijador (formaldehído al 4% (vol/vol), 4°C). Se disecaron del tejido perfundido secciones de corazón, tráquea y piel. Los tejidos se posfijaron en fijador a 4°C durante la noche. Cuando las secciones de piel eran los únicos tejidos necesarios, se disecaban y se ponían en fijador directamente después de la asfixia de los ratones mediante inhalación de CO<2>, eliminando la etapa de perfusión. Los tejidos se crioprotegieron en sacarosa al 20% (peso/volumen) durante más de 24 h y se seccionaron (20 gm de ancho) con un crióstato. Las secciones sobre portaobjetos se secaron a 37°C durante 30 min, y se fijaron con paraformaldehído al 4% a 21-23°C durante 10 min. Los portaobjetos se preincubaron en solución de bloqueo (suero caprino normal al 10% (vol/vol), Triton X-100 al 0,2% (vol/vol) en PBS, pH 7,4) durante 1 o 2 h a 21-23°C, a continuación se incubaron con FITC-avidina (Sigma) o rodamina-avidina (Vector Labs) 1/500 durante 45 minutos. Las secciones se lavaron tres veces con agua o PBS y se añadió una gota de Fluoromount G (SouthernBiotech) antes de que se colocarán los cubreobjetos en la parte superior. Las células cebadas cardíacas se examinaron cerca de las cavidades debido a que la densidad era muy superior que en cualquier parte del tejido; las células positivas a avidina, negativas a tdTomato se observaron embebidas en tejido muscular en números muy bajo, pero su identidad no estaba clara.
Para el mareaje con avidina de células cebadas peritoneales, las células se sembraron según se describe en la sección de purificación de células cebadas, se fijaron con paraformaldehído al 4% a 21 -23°C durante 10 min, se incubaron con avidina 1/1000 en PBS durante 30 minutos a 21-23°C y se lavaron con PBS antes de la obtención de imágenes inmediata.
Inmunocitoquímica de secciones de estómago
Ratones macho y hembra adultos de hasta 8 meses de edad se anestesiaron con pentobarbital y se perfundieron con 20 ml de PBS 0,1 M (pH 7,4, 4°C) seguido de 25 ml de fijador (formaldehído al 4% (vol/vol), 4°C). Se retiraron secciones de estómago, se lavaron a fondo, se posfijaron en formaldehído al 4% durante dos horas y se prepararon para el seccionamiento mediante incubación en una solución de sacarosa al 30% durante 48 horas. Las muestras tisulares se montaron en medio de crioimbibición y se congelaron, y se elaboraron secciones de 14 gm usando un criostato y a continuación se fijaron sobre portaobjetos. Los portaobjetos se lavaron con una solución de Triton X-100 al 0,2% en PBS, se incubaron durante una hora en una solución de suero caprino normal al 10% y a continuación se incubaron durante la noche a 4°C con una dilución 1:20 de anti-(MCPT1 de ratón) monoclonal de rata (anticuerpo monoclonal RF6.1, eBiosciences) en una solución de Triton al 0,2%/suero caprino normal al 1%. Los portaobjetos se lavaron con la solución de Triton al 0,2% y se incubaron durante dos horas a temperatura ambiente en solución de Triton con una dilución 1:500 de un anticuerpo conjugado a Alexa Fluor 488 anti-(IgG de rata) caprino (Life Technologies). Los portaobjetos de lavaron en PBS antes de que se añadieran cubreobjetos con una solución antidecolorante para la obtención de imágenes.
Preparación de glóbulos blancos periféricos
Se recogió sangre de ratones MrgprB2-tdTomato a través de punciones cardíacas con una jeringa que contenía PBS con 30 unidades/ml de heparina y EDTA 5 mM, se diluyó 1:1 con la misma solución y se dejó enfriar hasta temperatura ambiente antes se estratificar sobre 6 ml de una solución de Histopaque-1119 en un tubo cónico de 15 ml. Los tubos se centrifugaron a 700 g durante 30 minutos y se recogieron glóbulos blancos en la interfase entre las soluciones de PBS e Histopaque. Las células se lavaron con PBS y se centrifugaron a 500 g durante 10 minutos un total de tres veces. Las células se centrifugaron sobre portaobjetos revestidos con polilisina en una Cytospin 4 (Thermo Scientific) a 600 rpm durante 3-5 minutos, se secaron durante a noche en un termobloque a 37°C y se incubaron durante 2 minutos con Hoechst 33342 diluido hasta 0,5 gg/ml en PBS antes de montar un cubreobjetos con una solución antidecolorante. En paralelo, también se tiñeron células en suspensión con Hoechst 33342, las células se centrifugaron y las células resuspendidas se mezclaron directamente en una solución de PBS/antidecolorante antes de poner directamente sobre portaobjetos y montar cubreobjetos sobre la suspensión. No se observaron células positivas a tdTomato en ninguna preparación usando ningún método.
Estudios de liberación de histamina tisular
Tráqueas enteras o segmentos de piel aislados de la cara abdominal de ratones macho y hembra afeitados de hasta 6 meses de edad (4-8 mg de peso en húmedo) se disecaron y se limpiaron de tejido conectivo. Después de 60 minutos en período de incubación en solución tamponadora de bicarbonato de Kreb oxigenada (37°C), el tejido se trató bien con vehículo o bien con Compuesto 48/80 durante 30 min. La solución sobrenadante se apartó para el análisis de histamina. A continuación, el tejido se sometió a ácido perclórico al 8% en un baño de agua a 37°C durante 15 minutos para obtener el contenido de histamina total. La histamina se ensayó mediante la técnica fluorométrica automatizada descrita previamente .
Contracciones traqueales
Se llevaron a cabo contracciones traqueales como se describe previamente (Lagunoff, D., Martin, T. W. & Read, G. Agents that release histamine from mast cells. Annual review of pharmacology and toxicology 23, 331-351). Para las respuestas al alérgeno (ovoalbúmina, OVA), los ratones se sensibilizaron activamente inyectando 0,2 ml de una solución de OVA (3,75 gg/ml) mezclada con Al(OH)<3>tres veces a un intervalo de 2 días. Los experimentos se efectuaron sobre animales macho y hembra de 8-12 semanas de edad empezando dos semanas antes de la primera inyección. Las tráqueas se limpiaron de tejido conectivo y anillos traqueales (enteros o divididos lateralmente por la mitad), se suspendieron entre dos estribos de volframio en cámaras para órganos de 10 ml rellenas con tampón de Krebs que estaba calentado hasta 37°C y se burbujearon con O<2>al 95%-CO<2>al 5% para mantener un pH de 7,4. Un estribo estaba conectado a un medidor de deformación (modelo FT03; Grass Instruments, Quincy, MA) y la tensión se registró en un polígrafo Grass Model 7 (Grass Instruments, Quincy, MA). Las preparaciones se estiraron hasta una tensión de reposo de 0,2 g y se lavaron con tampón de Krebs reciente a intervalos de 15 minutos durante un período de equilibrado de 60 minutos. Después del equilibrado, las tráqueas se estimularon bien con OVA (10 gg/ml) o bien con Compuesto 48/80. Al final de cada experimento, todas las tráqueas se contrajeron máximamente con carbacol (1 gM). Todos los resultados se expresan como un porcentaje de la contracción máxima.
Hinchazón y extravasación del pie delantero
Ratones macho adultos de hasta 8 meses de edad se anestesiaron con una inyección i. p. de 50 mg/kg de pentobarbital (Sigma). 15 minutos después de la inducción de la anestesia, los ratones fueron inyectados i.v. con 50 gl de 12,5 mg/ml de azul de Evans (Sigma) en solución salina. 5 minutos más tarde, se administraron 5 gl de la sustancia de prueba (o 7 gl de anti-IgE) mediante inyección intraplantar en un pie y se administró solución salina en el otro pie. El grosor del pie se midió mediante calibres inmediatamente después de la inyección. 15 minutos más tarde (30 minutos después de anti-IgE), se midió de nuevo el grosor del pie y los ratones se sacrificaron mediante decapitación. Se recogió tejido del pie, se secó durante 24 horas a 50°C y se pesó. El azul de Evans se extrajo mediante una incubación de 24 horas en formamida a 50°C, y se leyó la D. O. a 620 nm usando un espectrofotómetro. Para estudios que usaban ketotifeno, los ratones fueron inyectados i.p. con 25 gl de una solución de 10 mg/ml de ketotifeno al mismo tiempo que el pentobarbital.
Análisis anafiláctico sistémico
Para minimizar el estrés, los animales fueron transportados a la zona del procedimiento el día antes de las inyecciones. A ratones macho y hembra adultos de hasta 8 meses de edad (de 25 a 35 gramos) se les administró una inyección intraperitoneal de 80 gg de propranolol en solución salina (2 mg/ml) inmediatamente después de la extracción de sus jaulas, y a continuación se pusieron de nuevo en sus jaulas durante 30 minutos antes de las inyecciones intravenosas. Las inyecciones intravenosos se realizaron cada vez en un ratón. Para cada inyección, un ratón se puso en una caja de transporte y se llevó a una habitación sin otros ratones, para minimizar el estrés por vocalizaciones durante la inyección. A continuación, el ratón se puso en un retenedor y la inyección se realizó en los primeros 4 minutos desde la retención debido a que se observaba que tiempos de retención mayores afectaban a la temperatura corporal interna independientemente de la inyección. Las venas caudales se dilataron mediante frotamiento repetido de la cola con un pañuelo de papel empapado en etanol al 100%, seguido de una inyección de ciprofloxacina en una jeringa de Hamilton de 0,25 ml equipada con una aguja de calibre 30,5 (BD Biosciences). Se determinó que la inyección era satisfactoria solo cuando se cumplían todos los criterios: aparecía sangre en la jeringa después de la inserción de la aguja, todas las venas caudales eran visibles después de la inyección y el ratón sangraba ligeramente desde la zona de inyección después de la extracción de la aguja. La zona de inyección se taponó con una torunda de algodón hasta que la sangre dejaba de fluir, el ratón se puso en una jaula separada desde su jaula de alojamiento, un ratón por jaula, y se devolvió a la habitación de la que se sacó. Se usaron al menos un ratón silvestre y uno mutante para cada sesión experimental. La temperatura corporal interna se midió con un termómetro rectal.
Ensayo de liberación de histamina en células cebadas peritoneales de ratón
Se purificaron células cebadas como con el ensayo de obtención de imágenes de calcio y se dejó que se recuperaran durante 2 horas en DMEM con FBS al 10% y 25 ng/ml de factor de células madre de ratón en una incubadora a 37°C con CO<2>al 5%. A continuación, las células se centrifugaron, se resuspendieron en CIB, se contaron y se sembraron a 300 células/pocillo en 75 gl de CIB en placas de 96 pocillos revestidas con 20 gg/ml de fibronectina (Sigma). Se dejó que se adhirieron al sustrato durante 45 minutos a 37°C en condiciones atmosféricas (es decir los niveles de CO<2>no se ajustaron) antes del ensayo. Para los ensayos, las células se retiraron a temperatura ambiente y se añadieron 75 gl de 2X concentraciones de las sustancias probadas (todas en CIB excepto la ciprofloxacina, que estaba en solución salina con CaCl<2>2,5 mM y MgCl<2>0,6 mM, pH 3,5). Después de 5 minutos, se aspiraron 40 gl de sobrenadante, se diluyeron con 40 gl de CIB y se congelaron a -80°C hasta que se determinaban los niveles de histamina. El tratamiento con anti-IgE era similar, excepto que las células se incubaban durante 30 minutos a 37°C después de que se añadiera anti-IgE antes de la aspiración del sobrenadante. El contenido de histamina se determinó usando un estuche de ensayo de histamina HTRF (Cisbio Assays) según las instrucciones del fabricante.
Cultivo de células cebadas humanas
Se cultivaron células cebadas humanas LAD2 (Laboratory of Allergic Diseases 2) en medio StemPro-34 SFM (Life Technologies) complementado con L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina, 50 gg/ml de estreptomicina y 100 ng/ml de factor de células madre humano recombinante (Peprotech). Las suspensiones celulares se sembraron a una densidad de 0,1 x 106 células/ml y se mantuvieron a 37°C y CO<2>al 5%, y se probó periódicamente la expresión de CD117 y FcsRI mediante citometría de flujo. El medio de cultivo celular se hemiagotó cada semana con medio reciente.
Ensayo de desgranulación de LAD2
Se sensibilizaron células LAD2 durante 20 horas con 0,5 gg/ml de IgE humana conjugada a biotina (Abbiotec). Las células se lavaron, se resuspendieron en tampón de Hepes (HEPES 10 mM, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4.7H2O 0,38 mM, glucosa 5,6 mM, CaCl<2>.H<2>O 1,8 mM, MgSO4.7H2O 1.3 mM, BSA al 0,4%, pH 7,4) a 0,025 x 106 por pocillo, y a continuación se estimularon con 0,1 gg/ml de estreptavidina (Life Technologies) u otros agonistas a las concentraciones indicadas durante 30 minutos a 37°C/CO2 al 5%. La p-hexosaminidasa liberada en los sobrenadantes y en los lisados celulares se cuantificó mediante hidrólisis de p-nitrofenil-N-acetil-P-D-glucosamida (Sigma-Aldrich) en tampón de citrato sódico 0,1 M (pH 4,5) durante 90 minutos a 37°C. El porcentaje de liberación de p-hexosaminidasa se calculó como un porcentaje del contenido total. Los agonistas probados eran el Compuesto 48/80, mastoparano, icatibant, besilato de atracurio e hidrocloruro de ciprofloxacina.
EIA y ELISA
Se lavaron células LAD2 con medio, se suspendieron a 0,25 x 10<6>células por pocillo, se incubaron con Compuesto 48/80, mastoparano, icatibant, atracurio o ciprofloxacina a las concentraciones indicadas durante 3-24 horas a 37°C/CÜ<2>al 5%. Los sobrenadantes libres de células se recogieron y se analizó la liberación de PGD<2>mediante un EIA (Cayman chemical), mientras que el contenido de TNF se cuantificó usando un estuche de ELISA (eBioscience) según las instrucciones del fabricante. Los límites de detección mínimos eran 55 pg/ml para PGD<2>y 5,5 pg/ml para TNF.
Medición de la liberación de histamina a partir de células LAD2
Se lavaron células LAD2, se suspendieron en tampón de Hepes libre de BSA a 0,1 x 10<6>por pocillo, y se incubaron con Compuesto 48/80, mastoparano, icatibant, atracurio o ciprofloxacina a las concentraciones indicadas durante 30 minutos at 37°C/5% CO<2>. Se preparó una solución madre de histamina (Sigma-Aldrich) de 100 gg/ml y se almacenó a -20°C. Los estándares de trabajo de 4000 ng/ml a 7,8 ng/ml se prepararon recientemente usando dilución en serie doble. Se disolvió O-ftaladehído (OPT; Sigma-Aldrich) en metanol libre de acetona (10 mg/ml) y se mantuvo en la oscuridad a 4°C. Los estándares de histamina y los sobrenadantes libres de células (60 gl) se transfirieron a una microplaca de 96 pocillos negros de fondo plano y se mezclaron con 12 gl de NaOH 1 mM y 3 gl de OPT. Después de 4 minutos a temperatura ambiente, se añadieron 6 gl de HCl 3 M para detener la reacción de histamina-OPT. La intensidad de fluorescencia se midió usando un filtro de excitación de 355 nm y un filtro de emisión de 460.
Transfección de ARNsi de células
La expresión de MrgprX2 se reguló a la baja con ARNsi ON-TARGET plus SMARTpool contra MrgprX2 y RNAsi de control de Dharmacon. Las células LAD2 se lavaron con medio, se suspendieron a 0,5 x 10<6>células por pocillo y se transfectaron con ARNsi de MrgprX2 100 nm y ARNsi de control en medio StemPro libre de antibióticos usando Lipofectamine 3000 (Life Technologies) según las instrucciones del fabricante a 37°C/CO<2>al 5%. A las 48 horas, se confirmó la inactivación mediante PCR con transcriptasa inversa, y las células se usaron para ensayos de desgranulación.
Ejemplo 2: MrgprB2 es el ortólogo de MrgprX2 humano
La reactividad a secretagogos básicos se conserva entre mamíferos (Halpern, B. N. & Wood, D. R. The action of promethazine (phenergan) in protecting mice against death due to histamine. British journal of pharmacology and chemotherapy 5, 510-516 (1950)), y también se encuentra en aves (Taneike, T., Miyazaki, H., Oikawa, S. & Ohga, A. Compound 48/80 elicits cholinergic contraction through histamine release in the chick oesophagus. General pharmacology 19, 689-695 (1988)), indicando una antiguo papel fundamental para su mecanismo. Muchos secretagogos básicos son péptidos endógenos, a menudo ligados a la inflamación; sin embargo, activan células cebadas de tejido conectivo solo a altas concentraciones e independientemente de sus receptores canónicos, de modo que debe existir otro mecanismo de estimulación (Ferry, X., Brehin, S., Kamel, R. & Landry, Y. G protein-dependent activation of mast cell by peptides and basic secretagogues. Peptides 23, 1507-1515 (2002)). Varios candidatos que se unen a compuestos policatiónicos se han propuesto como receptores de secretagogos básicos (Ferry, X., Brehin, S., Kamel, R. & Landry, Y. G protein-dependent activation of mast cell by peptides and basic secretagogues. Peptides 23, 1507-1515 (2002); Purcell, W. M., Doyle, K. M., Westgate, C. & Atterwill, C. K. Characterisation of a functional polyamine site on rat mast cells: association with a NMDA receptor macrocomplex. Journal of neuroimmunology 65, 49-53 (1996); Tatemoto, K. y cols. Immunoglobulin E-independent activation of mast cell is mediated by Mrg receptors. Biochemical and biophysical research communications 349, 1322-1328, (2006); Sick, E., Niederhoffer, N., Takeda, K., Landry, Y. & Gies, J. P. Activation of CD47 receptors causes histamine secretion from mast cells. Cellular and molecular life sciences : CMLS 66, 1271-1282, (2009). Entre estos, MrgprX2 se ha cribado con la mayoría de los compuestos (Tatemoto, K. y cols. Immunoglobulin E-independent activation of mast cell is mediated by Mrg receptors. Biochemical and biophysical research communications 349, 1322-1328, (2006); Robas, N., Mead, E. & Fidock, M. MrgX2 is a high potency cortistatin receptor expressed in dorsal root ganglion. The Journal of biological chemistry 278, 44400-44404, (2003); Subramanian, H., Gupta, K., Guo, Q., Price, R. & Ali, H. Mas-related gene X2 (MrgX2) is a novel G protein-coupled receptor for the antimicrobial peptide LL-37 in human mast cells: resistance to receptor phosphorylation, desensitization, and internalization. The Journal of biological chemistry 286, 44739-44749, (2011); Kashem, S. W. y cols. G protein coupled receptor specificity for C3a and compound 48/80-induced degranulation in human mast cells: roles of Mas-related genes MrgX1 and MrgX2. European journal of pharmacology 668, 299-304, (2011); Subramanian, H. y cols. beta-Defensins activate human mast cells via Mas-related gene X2. Journal of immunology 191,345-352, (2013); Kamohara, M. y cois. Identification of MrgX2 as a human G-protein-coupled receptor for proadrenomedullin N-terminal peptides. Biochemical and biophysical research communications 330, 1146-1152, (2005)), y estudios de inactivación de ARNsi apoyan al menos a papel parcial de MrgprX2 en la activación por cuatro secretagogos básicos no canónicos (Subramanian, H., Gupta, K., Guo, Q., Price, R. & Ali, H. Mas-related gene X2 (MrgX2) is a novel G protein-coupled receptor for the antimicrobial peptide LL-37 in human mast cells: resistance to receptor phosphorylation, desensitization, and internalization. The Journal of biological chemistry 286, 44739-44749, (2011); Subramanian, H. y cols. beta-Defensins activate human mast cells via Mas-related gene X2. Journal of immunology 191, 345-352, (2013)). Sin embargo, no se ha empleado un estudioin vivodirecto o un modelo de inactivación para ningún candidato. La investigación de MrgprX2 en ratones es complicada debido a que la agregación génica que contiene los cuatro miembros humanos de MrgprX está notablemente extendida en ratones, consistiendo en 22 genes codificantes potenciales, muchos con identidad de secuencia comparable a MrgprX2 (FIG. 1A). Por lo tanto, un ortólogo de MrgprX2 de ratón se debe determinar mediante el patrón de expresión y la farmacología. Un cribado restrictivo por RT-PCR en células cebadas primarias de ratón descubrió una banda para un solo miembro de la familia, MrgprB2 (FIG. 1B), mientras que los ortólogos de MrgprX1 no se expresaban a niveles importantes (FIG.
5A y FIG. 5B).
Funcionalmente, las células HEK293 que expresan heterólogamente MrgprB2 (MrgprB2-HEK) respondían al antagonista de MrgprX2 PAMP (9-20)14 (FIG. 1C) y el Compuesto 48/80 (48/80), un activador de células cebadas clásico y un secretagogo básico canónico (FIG. 6A, FIG. 6B y FIG. 6C). Las célula MrgprB2-HEK también respondían a otros ligandos de MrgprX2, incluyendo el secretagogo básico sustancia P, pero no tenían respuesta al ligando de MrgprX1 cloroquina (CQ) (Liu, Q. y cols. Sensory neuron-specific GPCR Mrgprs are itch receptors mediating chloroquine-induced pruritus. Cell 139, 1353-1365, (2009)); ni los miembros de la familia estrechamente relacionados en ratones respondían a ningún compuesto (FIG. 5C, FIG 6A y FIG. 6C). Para determinar la expresión de MrgprB2, se generaron ratones transgénicosMrgprB2BAC en los que la expresión de recombinasaeGFP-Creestaba bajo el control del promotor deMrgprB2.Sorprendentemente, los patrones de expresión de Cre indican que la expresión de MrgprB2 es altamente específica para células cebadas de tejido conectivo (FIG. 1D, FIG. 7, FIG. 8A y FIG. 8B). Conjuntamente, los datos farmacológicos y de expresión indican que MrgprB2 es el ortólogo de ratón de MrgprX2.
Ejemplo 3: MrgprB2 es el receptor de secretagogos básicos de células cebadas de ratón
Posteriormente, se determinó si MrgprB2 es el receptor de secretagogos básicos en células cebadas de ratón. El locus genómico deMrgprB2contiene demasiada secuencia repetitiva para permitir la elección como diana de un gen a través de recombinación homóloga (FIG. 9A). Por lo tanto, se usó una estrategia basada en nucleasa del dedo de cinc para generar una línea de ratón con una eliminación de 4 pares de bases en la región codificante deMrgprB2(ratones MrgprB2MUT), dando como resultando una mutación de cambio de marco y una terminación temprana poco después del primer dominio transmembranario (FIG. 9B, FIG. 9C y FIG. 9D). La mutación era estable y heredable (FIG. 9C), de modo que MrgprB2MUT se consideraba una anulación funcional. Los números de células cebadas eran comparables en tejidos de ratones silvestres (WT) y MrgprB2MUT, indicando que MrgprB2 no es esencial para la supervivencia de células cebadas o la orientación a un tejido (FIG. 10A). La reactividad de células cebadas peritoneales a anticuerpos anti-IgE (FIG. 2A) y endotelina (FIG. 11A, FIG. 11B y FIG. 11C) también era comparable, demostrando que la mutación de MrgprB2 no dificulta globalmente la señalización de mastocitos mediada por IgE o GPCR. Sin embargo, la activación de células cebadas (FIG. 2A)y la liberación de histamina tisular inducidas por 48/80 se suprimía esencialmente en células cebadas mutantes (FIG. 2B y FIG. 10B). Por otra parte, la contracción traqueal (FIG. 2C) y la inflamación del pie delantero (extravasación e hinchazón; FIG. 2D) provocadas por 48/80 estaban casi completamente ausentes en un fondo de MrgprB2MUT, mientras que las respuestas provocadas por antígeno (FIG. 2C) y anti-IgE (FIG. 12A y FIG. 12B) eran comparables con ratones WT. Finalmente, cuatro secretagogos básicos adicionales, así como los agonistas de MrgprX2 PAMP (9-20) y cortistatina (Robas, N., Mead, E. & Fidock, M. MrgX2 is a high potency cortistatin receptor expressed in dorsal root ganglion. The Journal of biological chemistry 278, 44400 44404, doi:10.1074/jbc.M302456200 (2003)), activaban intensamente células cebadas WT pero no MrgprB2MUT (FIG.
2E; FIG. 13A). Células HEK293 que expresaban MrgprB2 o MrgprX2 (MrgprX2-HEK) también respondían a estos secretagogos (FIG. 6A y FIG. 6B). En conjunto, se concluía que MrgprB2 es el receptor de secretagogos básicos de células cebadas de ratón. Es probable que la lista de péptidos básicos pequeños que activan MrgprB2 sea mayor que el número de este estudio; en efecto, se ha observado que docenas de estos péptidos activan células cebadas (Lagunoff, D., Martin, T. W. & Read, G. Agents that release histamine from mast cells. Annual review of pharmacology and toxicology 23, 331-351, doi:10.1146/annurev.pa.23.040183.001555 (1983); Ferry, X., Brehin, S., Kamel, R. & Landry, Y. G protein-dependent activation of mast cell by peptides and basic secretagogues. Peptides 23, 1507-1515 (2002); Mousli, M., Hugli, T. E., Landry, Y. & Bronner, C. Peptidergic pathway in human skin and rat peritoneal mast cell activation. Immunopharmacology 27, 1-11 (1994); Pundir, P. & Kulka, M. The role of G protein-coupled receptors in mast cell activation by antimicrobial peptides: is there a connection? Immunology and cell biology 88, 632-640, doi:10.1038/icb.2010.27 (2010)). Notablemente, MrgprX2 humano es mucho más sensible a la sustancia P que MrgprB2 de ratón (FIG. 6C), sugiriendo un papel potencial específico de la especie de la sustancia P en la señalización de células cebadas.
Dado que se requieren concentraciones micromolares de estos péptidos para la activación de MrgprB2, no está claro dónde podría producirse este episodio de señalización. Sin embargo, las células cebadas están presentes en órganos como el páncreas y las glándulas suprarrenales que secretan grandes cantidades de péptidos catiónicos pequeños, y es concebible que las concentraciones cerca de las zonas de liberación alcancen estos niveles. Se describen en el presente documento un ligando o ligandos endógenos de alta afinidad para MrgprB2. La identificación de ligandos de MrgprB2 y MrgprX2 endógenos contribuye significativamente a entender cómo interactúan las células cebadas con otros tipos de células en estados patológicos.
Ejemplo 4: MrgprB2 media en la reactividad de células cebadas y los efectos secundarios de fármacos terapéuticos peptidérgicos
El papel crítico de las células cebadas en reacciones alérgicas y seudoalérgicas (es decir, independientes de IgE) sugería una necesidad de experimentos que demostraran si MrgprX2 es un factor en estos episodios. Se abordaron reacciones inducidas por fármacos debido a que muchos fármacos terapéuticos son catiónicos. Hasta 15% de las reacciones adversas inducidas por fármacos parecen ser de naturaleza alérgica; sin embargo, muchas no están bien relacionadas con el título de anticuerpos de IgE, indicando que participan mecanismos independientes de anticuerpos, o seudoalérgicos (Hausmann, O., Schnyder, B. & Pichler, W. J. Etiology and pathogenesis of adverse drug reactions. Chemical immunology and allergy 97, 32-46, doi:10.1159/000335614 (2012)).
En primer lugar, se analizaron fármacos peptidérgicos debido a que la mayoría se introducen subcutáneamente o intramuscularmente en concentraciones milimolares (FIG. 15), suficientemente altas para que los péptidos catiónicos activen las células cebadas. La respuesta de tipo alérgico más frecuente descrita en las etiquetas de la FDA de estos fármacos es la reacción en la zona de inyección (ISR), una hinchazón y/o eritema local de tamaño variable que puede estar acompañado por dolor o prurito. En una investigación de fármacos peptidérgicos aprobados por la FDA, la inmensa mayoría asociados con ISR son catiónicos (FIG. 15). Miembros representativos de todas las clases disponibles comercialmente comunes de estos fármacos catiónicos activaban células cebadas de un modo dependiente de MrgprB2, mientras que la proteína inocua insulina no tenía efecto (FIG. 3A, FIG. 13B y FIG. 13C). Por consiguiente, todos estos péptidos excepto la insulina activan células tanto MrgprB2-HEK como MrgprX2-HEK (FIG.
6A, FIG. 6B y FIG. 6C). El fármaco icatibant se eligió para un estudio adicional debido a que induce ISR en todos los pacientes (Lumry, W. R. y cols. Randomized placebo-controlled trial of the bradykinin B(2) receptor antagonist icatibant for the treatment of acute attacks of hereditary angioedema: the FAST-3 trial. Annals of allergy, asthma & immunology: publicación oficial de the American College of Allergy, Asthma, & Immunology 107, 529-537, (2011)). Icatibant a la concentración clínica inducía extravasación e hinchazón extendidas, de forma similar a ISR humanas, en ratones WT pero no en ratones MrgprB2MUT (FIG. 3B). Los ratones pretratados con el estabilizador de células cebadas ketotifeno tampoco mostraban inflamación (sin ketotifeno: 40,7±2,1% de incremento en el grosor del pie; con ketotifeno: 3,1±0,6% de incremento; n=4 cada uno; p=2,2e-6), indicando con fuerza que las células cebadas mediaban en la inflamación. Por otra parte, icatibant (así como los controles positivos 48/80 y mastoparano) inducían la liberación de histamina de células cebadas peritoneales WT, mientras que las células cebadas MrgprB2MUT liberaban sustancialmente menos (FIG. 3C). Sin embargo, la liberación de histamina mediada por IgE no se veía afectada por la eliminación de MrgprB2 (FIG. 3C). Estos datos anticipan que las ISR inducidas por fármaco se pueden aliviar al elegir como diana MrgprX2 o al usar péptidos con propiedades agonistas de MrgprX2 menos potentes.
Ejemplo 5: MrgprB2 media en la reactividad de células cebadas y los efectos secundarios de fármacos terapéuticos micromoleculares
Posteriormente, se exploró la posibilidad de que MrgprB2 medie en reacciones seudoalérgicas inducidas por micromoléculas. El enfoque estaba puesto en fármacos aplicados intravenosamente debido a que a menudo se administran rápidamente y en dosis elevadas, y así son más propensos a alcanzar altas concentraciones en sangre y una distribución tisular rápida que los fármacos administrados a través de otras vías. Síntomas de reacciones seudoalérgicas después de la administración intravenosa, que en las más graves se denominan anafilactoides, incluyen rubor o sarpullido cutáneos, cambios en la presión sanguínea o el ritmo cardíaco y broncoespasmos (Nel, L. & Eren, E. Peri-operative anaphylaxis. British journal of clinical pharmacology 71, 647-658, doi:10.1111/j.1365-2125.2011.03913.x (2011)). La búsqueda inicial se basaba en la estructura de 48/80. Aunque la relación estructurafunción de 48/80 como un agonista de MrgprX2 era desconocida, una variante ciclada que contiene un motivo de tetrahidroisoquinolina (THIQ) (FIG. 4A) es siete veces más potente que 48/80 como un desgranulador de células cebadas (Read, G. W. Compound 48-80. Structure-activity relations and poly-THIQ, a new, more potent analog. Journal of medicinal chemistry 16, 1292-1295 (1973)). Una búsqueda de fármacos aprobados por la FDA que contienen una THIQ recuperaba miembros de los fármacos bloqueadores neuromusculares no esteroideos (NMBD) antagonistas de receptores nicotínicos, incluyendo tubocurarina y atracurio (FIG. 4B). Los NMBD se usan habitualmente en cirugía para reducir el movimiento muscular no deseado y permitir la intubación intratraqueal para ventilación mecánica. De forma interesante, los NMBD solos son responsables de casi 60% de las reacciones alérgicas en un ámbito quirúrgico (Mertes, P. M., Alla, F., Trechot, P., Auroy, Y. & Jougla, E. Anaphylaxis during anesthesia in France: an 8-year national survey. J Allergy Clin Immunol 128, 366-373 (2011)), y todos excepto la succinilcolina inducen liberación de histamina en seres humanos (Koppert, W. y cols. Different patterns of mast cell activation by muscle relaxants in human skin. Anesthesiology 95, 659-667 (2001)). Según se muestra en la Figura 16, miembros de todas las familias de NMBD excepto la succinilcolina activaban células cebadas de un modo dependiente de MrgprB2 a concentraciones tan bajas como 0,5% de la concentración de inyección clínica (FIG. 4C y FIG. 13D). De forma interesante, el rocuronio no contiene una THIQ pero tiene un grupo hidrófobo voluminoso con un nitrógeno cargado con varios angstroms (FIG.
4B), reminiscente de 48/80. Por lo tanto, se realizó una búsqueda usando modificaciones del motivo de THIQ y la estructura de 48/80, incluyendo cambios en la ciclación y la posición del nitrógeno positivo o polar, limitando el ensayo a fármacos intravenosos a altas concentraciones de inyección. La familia fluoroquinolónica de anticuerpos se identificaba por tener un motivo similar (FIG. 4D). Como los NMBD, estos están asociados con reacciones de tipo alérgico (Kelesidis, T., Fleisher, J. & Tsiodras, S. Anaphylactoid reaction considered ciprofloxacin related: a case report and literature review. Clin Ther 32, 515-526 (2010); Blanca-López, N. y cols. Hypersensitivity reactions to fluoroquinolones: analysis of the factors involved. Clin Exp Allergy 43, 560-567 (2013)) y pueden activar células cebadas (Mori, K., Maru, C. & Takasuna, K. Characterization of histamine release induced by fluoroquinolone antibacterial agents in-vivo and in-vitro. The Journal of pharmacy and pharmacology 52, 577-584 (2000); Mori, K., Maru, C., Takasuna, K. & Furuhama, K. Mechanism of histamine release induced by levofloxacin, a fluoroquinolone antibacterial agent. European journal of pharmacology 394, 51-55 (2000)). Los cuatro miembros aprobados para uso intravenoso activaban células MrgprB2-HEK y MrgprX2-HEK (FIG. 6A, FIG. 6B y FIG. 6C) y células cebadas de un modo dependiente de MrgprB2 (FIG. 4E; FIG. 13C). De forma correspondiente, el atracurio y la ciprofloxacina inducían la liberación de histamina en células cebadas peritoneales WT y sustancialmente menos en células cebadas MrgprB2MUT (FIG. 3C). La ciprofloxacina se seleccionó para pruebas de anafilaxisin vivo,que en ratones se mide lo más a menudo mediante una caída en la temperatura corporal, probablemente debida a cambios en la presión arterial y la vasodilatación periférica (Doyle, E., Trosien, J. & Metz, M. Protocols for the induction and evaluation of systemic anaphylaxis in mice. Methods in molecular biology 1032, 133-138, doi:10.1007/978-1-62703-496-8_10 (2013)). Los roedores casi son inmunes a toxicidad por histamina a nivel sistémico, contrariamente a otros organismos experimentales (Halpern, B. N. & Wood, D. R. The action of promethazine (phenergan) in protecting mice against death due to histamine. British journal of pharmacology and chemotherapy 5, 510-516 (1950)), pero se pueden volver sensibles a activadores de células cebadas y productos secretados mediante pretratamiento con bloqueantes betaadrenérgicos (Bergman, R. K. & Muñoz, J. Efficacy of beta-adrenergic blocking agents in inducing histamine sensitivity in mice. Nature 217, 1173-1174 (1968); Matsumura, Y., Tan, E. M. & Vaughan, J. H. Hypersensitivity to histamine and systemic anaphylaxis in mice with pharmacologic beta adrenergic blockade: protection by nucleotides. J Allergy Clin Immunol 58, 387-394 (1976)). Bajo estas condiciones, una alta dosis de ciprofloxacina inducía una caída rápida en la temperatura corporal que era muy lenta de recuperar, mientras que los ratones MrgprB2MUT mostraban una caída mucho menor que se recuperaba rápidamente (FIG. 4F). Estos resultados establecen que la activación de células cebadas a través de MrgprB2 es un efecto colateral de las fluoroquinolonas y otros fármacos, y la correspondiente activación de MrgprX2 en seres humanos podría subyacer a muchas de las respuestas seudoalérgicas observadas con estos fármacos.
Ejemplo 6: Los fármacos asociados con seudoalergias activan células cebadas humanas a través de MrgprX2
Finalmente, se determinó si los fármacos asociados con seudoalergias activan células cebadas humanas a través de MrgprX2. Miembros representativos de cada clase de fármaco examinada provocaban liberación de histamina, TNF, PGD<2>y P-hexosaminidasa de células LAD2 (FIG. 14A). Se usaron 48/80 y mastoparano como controles positivos. De forma importante, las células LAD2 tratadas con ARNsi de MrgprX2 exhibían significativamente menos liberación de P-hexosaminidasa provocada por estas sustancias, en comparación con las respuestas en células tratadas con ARNsi de control, mientras que la liberación mediada por IgE era comparable (FIG. 14B). La liberación restante observada en células tratadas con ARNsi de MrgprX2 se debía probablemente a la inactivación incompleta de ARNm y/o proteína.
Según se describe con detalle anteriormente, MrgprB2 en ratones, y MrgprX2 en seres humanos, es el receptor de secretagogos básicos en células cebadas. También se describe en el presente documento la evidencia de este papel in vivo conocido por primera vez para este receptor como un mediador crítico de seudoalergias inducidas por fármacos independientes de IgE. Así, el conocimiento del papel de MrgprX2 en seudoalergias inducidas por fármacos se expande por dos razones. En primer lugar, los estudios de requisitos de unión a ligandos permiten cribados más específicos de fármacos que activan crudamente MrgprX2. En segundo lugar, el cribado de fármacos administrados oralmente descubre más ligandos de MrgprX2, puesto que efectos secundarios comunes de fármacos administrados oralmente incluyen problemas gastrointestinales y cefalea, ambos de los cuales tienen un componente de células cebadas.
REFERENCIAS
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Claims (3)

REIVINDICACIONES
1. Un método para determinar si un compuesto induce una reacción de tipo seudoalérgico, comprendiendo el método:
poner en contacto la célula aislada que comprende un ácido nucleico recombinante que expresa el miembro X2 del receptor acoplado a proteína G relacionado con mas (MrgprX2) o MrgprB2 con un posible compuesto, detectar la activación de MrgprX2 o MrgprB2, donde la activación de MrgprX2 o MrgprB2 determina que el posible compuesto induce una reacción de tipo seudoalérgico.
2. El método según la reivindicación 1, donde la activación de MrgprX2 o MrgprB2 se detecta al identificar un incremento en el calcio intracelular.
3. El método según la reivindicación 1 o 2, en el que el posible compuesto se selecciona del grupo que consiste en (i) leuprorelina, goserelina, histrelina, triptorelina, cetrorelix, ganirelix, degarelix, octreotida, lanreotida, pasireotida, sermorelina, tesamorelina, icatibant, acetato de glatiramer, teriparatida, pramlintida, bleomicina, exenatida, glucagón, liraglutida, enfuvirtida y colistimetato; o
(ii) succinilcolina, tubocurarina, atracurio, mivacurio y rocuronio.
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