BRPI0617297A2

BRPI0617297A2 - composiÇÕes e mÉtodos para tratamento de hipersecreÇço das vias aÉreas

Info

Publication number: BRPI0617297A2
Application number: BRPI0617297-0A
Authority: BR
Inventors: Michael J Holtzman
Original assignee: Univ Washington
Priority date: 2005-10-11
Filing date: 2006-10-10
Publication date: 2011-07-26
Also published as: WO2007047235A2; AU2006304044A1; CA2624940A1; EP1933624A4; US20070082865A1; CN101282650A; WO2007047235A3; JP2009511586A; EP1933624A2

Abstract

<B>COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA TRATAMENTO DE HIPERSECREÇçO DAS VIAS ÁEREAS<D>A presente invenção refere-se geralmente ao campo de tratamento de doenças pulmonares. Mais especificamente, a invenção refere-se ao tratamento de hipersecreção das vias aéreas através da administração de um inibidor do caminho de sinalização receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR) em combinação com um inibidor do caminho de sinalização interleucina-13 (IL-13), bem como composições dos mesmos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÕESE MÉTODOS PARA TRATAMENTO DE HIPERSECREÇÃO DAS VIASÁEREAS".

Esta invenção foi feita com suporte do governo sob P01 HL29594concedida por NHLBI. O governo tem certos direitos na invenção.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção geralmente refere-se a composições e mé-todos para o tratamento de doenças das vias aéreas.

ANTECEDENTES

Hipersecreção das vias aéreas é uma característica de doençasdas vias aéreas, incluindo doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), fi-brose cística e asma. Em um indivíduo que sofre de hipersecreção, mucoacumula-se nas vias aéreas e poderá causar obstrução das vias aéreas.Glândulas submucosas das vias aéreas e células caliciformes que revestemo muco segregado do epitélio das vias aéreas, um adesivo, gel viscoelásticocomposto de água, carboidratos, proteínas e lipídeos. Em um indivíduo sadi-o, muco é uma defesa primária contra partículas estranhas inaladas e agen-tes infecciosos. Muco captura essas partículas e agentes e facilita sua depu-ração enquanto também impedindo tecidos de secar-se completamente. Vi-as aéreas pequenas que contêm muitas células caliciformes, bem como viasaéreas periféricas e que não podem ser limpas por meio de tosse são parti-cularmente vulneráveis a acumulação de muco e obstrução gradual por mu-co. Um número substancial de indivíduos sofre de hipersecreção das viasaéreas, quando se associa a várias doenças das vias aéreas, incluindoCOPD, fibrose cística e asma, bem como infecções respiratórias, incluindobronquite viral e bronquiolite. Nos Estados Unidos, aproximadamente 14,2milhões de pessoas têm sido diagnosticados com COPD. Fibrose cística afe-ta 30.000 americanos e asma afeta 17 milhões americanos.

Tratamentos convencionais para indivíduos que sofrem de hi-persecreção das vias aéreas incluem uso de corticosteróides sistêmicos ouinalados, anticolinérgicos, terapia antibiótica, broncodilatadores (por exem-plo, metilxantinas), simpatomiméticos com fortes propriedades estimuladorasde p2-adrenérgicos, transferência DE aerossol de agentes "mucolíticos" (porexemplo, água, solução salina hipertônica), e administração oral de expecto-rantes (por exemplo, guaifenesina). Com relação especificamente à fibrosecística, uma abordagem mais recente foi administrar DNAse para reduzir aviscosidade do muco ou escarro rico em DNA, de tal modo que o muco sejamais fácil de limpar as vias aéreas (Shak e outros, Proc. Natl. Acad.,87:9188-9192, 1990; Hubbard e outros, N. Engl. J. Med., 326:812, 1991). Àparte de medicação, terapia física torácica que consiste em percussão, vi-bração e drenagem são também usadas para limpar muco das vias aéreas.Como um último recurso, transplante do pulmão poderá ser uma opção paraaqueles com doença pulmonar grave. Muitos dos medicamentos acima des-critos apresentam sérios efeitos colaterais. Por exemplo, corticosteróidesinalados podem causar aftas (uma infecção da boca causada por levedo),tosse, ou rouquidão e corticosteróides apresentam efeitos colaterais maisgraves, tais como desenvolvimento sexual retardado, alterações no ciclomenstrual, ganho de peso, e aumento de açúcar no sangue (diabetes). Osefeitos colaterais de metilxantinas incluem náusea severa, tremores, contra-ção muscular, ataques e pulsação irregular.

O esquema de controle dos caminhos dependentes de EGFR e IL-13 induzíveis por vírus de hospedeiro epitelial e remodelagem é mostrado,por exemplo, na figura 28. Ativação de EGFR com dimerização de receptor efosforilação de receptor tirosina quinase leva a ativação de três caminhos:(1) recrutamento de Ral seguido por ativação de c-Src que leva a ativaçãode Statl e Stat3; (2) recrutamento de Shc/Grb2 seguido por ativação de Sos,Ras, e c-Raf que leva a ativação de MEK1/2 de ERK1/2; e (3) recrutamentode Gabl seguido por ativação de PI3K que leva a geração de fosfatidilinosi-tol-3,4,5-fosfato (ΡΙ-3,4,5-Ρ3), ativação de PDK1/2 e em seguida Akt queinativa fatores proapoptóticos (por exemplo, Bad). Sinalização de IL-13 étambém capaz de ativar ERK1/2 e PI3K, bem como Stat6 que cada um con-tribui para supra-regulação de genes (CLCA e MUC) que promovem transdi-ferenciação de células ciliadas para caliciformes. Sinalização de IL-13 ativacascata dependente de IRS1/2 para ERK1/2 e Stat6 que cada um contribuipara supra-regulação de genes (CLCA e MUC) que promovem transdiferen-ciação de célula ciliada para caliciforme. Sob condições fisiológicas, essasvias aéreas poderão (em conjunto com ativação de Statl dependente deIFN) levar à proteção de infecção viral, mas se há ativação persistente emum fundamento genético suscetível, os mesmos caminhos poderão levar ahiperplasia de células ciliadas e metaplasia de células caliciformes. Uso racio-nal de inibidores específicos, por exemplo, bloqueadores de receptor EGFR eIL-13, poderão totalmente recuperar arquitetura epitelial normal.Ativação do sistema de receptor de fator de crescimento epidér-mico (EGFR) por seus Iigantes tem mostrado conduzir a síntese de mucinaem células epiteliais das vias aéreas, bem como a metaplasia de células ca-liciformes em ratos (Takeyama e outros, Proc. Natl. Acad. Sci., 96:3081-3086, 1999). Além disso, é mostrado que expressão de EGFR é esparsa nasvias aéreas de indivíduos sadios, mas o receptor é expresso em indivíduosasmáticos (Burgel e Nadei, Thorax, 59:992-996, 2004). Um fator ou caminhoque estimula expressão de EGFR no epitélio das vias aéreas é o caminho defator-α de necrose tumoral (TNF-α) (Takeyama e outros, Proc. Natl. Acad.Sci., 96:3081-3086, 1999). Nadei e outros, Patente U.S. No. 6.270.747, des-creve o tratamento de hipersecreção por meio de administração de um anta-gonista de EGFR.O caminho de sinalização interleucina-13 (IL-13) associa-se àremodelagem e hipersecreção das vias aéreas. Um receptor isca para IL-13(slL-13Ra2-Fc) verificou-se inibir formação de células caliciformes induzidapor alérgeno em camundongos (Wills-Karn e outros, Science, 282:2258-2261). IL-13 mostrou diretamente conduzir expressão gênica de mucina emcélulas epiteliais das vias aéreas cultivadas sob condições fisiológicas e inwVo(Laoukili e outros, J. Clin. Invest. 108:1817-1824, 2001; Kondo, e outros,Am. J. Respir. Cell Moi Biol. 27:536-541, 2002). Tem sido também relatadoque IL-13 estimula a liberação de TGFa, a qual se liga e ativa EGFR, a partirdas membranas de células epiteliais respiratória humana, (Booth e outros,Am. J. Respir. Cell Moi Bioi, 25: 739-743, 2001). Instilação intratecária deIL-13 nos pulmões de ratos causa metaplasia de células caliciformes e au-menta produção de mucina via um mecanismo complexo de acordo com IL-13 que induz a produção de IL-8, levando a recrutamento neutrófilo (Shim eoutros, Am. J. Physiol. Lung Cell Moi Physiol., 280: L134-L140, 2001).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Entre os vários aspectos da presente invenção é a provisão deum tratamento aperfeiçoado para hipersecreção das vias aéreas. A patogê-nese de hipersecreção das vias aéreas envolve os caminhos de sinalizaçãode EFGR e IL-13, ambos dos quais desempenham um papel na formação decélula caliciforme. Desse modo, por meio de inibição tanto dos caminhos desinalização EGFR quanto de IL-13, o epitélio das vias aéreas pode abordarmais totalmente sua arquitetura original.

Resumidamente, portanto, a presente invenção refere-se a umprocesso de tratamento de hipersecreção das vias aéreas em um indivíduo,processo este que compreende administrar um inibidor do caminho de sina-lização de EGFR e um inibidor do caminho de sinalização de IL-13.

A invenção também se refere a uma composição para o trata-mento de hipersecreção das vias aéreas que compreende um inibidor docaminho de sinalização do EGFR e um inibidor do caminho de sinalizaçãode IL-13 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Outros objetivos e características serão em parte visíveis e emparte mostrados daqui por diante.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

As figuras 1A, 1B, 1C, 1D, 1E e 1F são fotomicrografias repre-sentativas de seções das vias aéreas de camundongos C57BL/6J obtidasem 21 dias após inoculação com SeV ou uma quantidade equivalente deSeV inativado por UV (SeV-UV) e em seguida imunocorada em relação aEGFR e fosfo-EGFR (p-EGFR), bem como competição por 50 vezes exces-so de antígeno. Barra = 20 μηη. Metodologia é adicionalmente descrita noExemplo 1.

As figuras 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 2H e 21 são fotomicrogra-fias representativas de seções das vias aéreas obtidas de camundongos em21 dias após inoculação com SeV e em seguida submetidas à coloração i-munofluorescente de EGFR, β-tubulina, CCSP e MUC5AC isolados e emcombinação. Ligação de anti-EGFR Ab primária foi detectada por anti-CY3Ab (fluorescência vermelha), enquanto outros foram detectados por anti-FITC Ab (fluorescência verde). Barra = 20 μιη. Metodologia é adicionalmentedescrita no Exemplo 1.

As figuras 3A, 3B, 3C e 3D são fotomicrografias representativasde seções das vias aéreas obtidas em 21 dias após inoculação com SeV ouSeV-UV e em seguida submetidas a coloração de hematoxilina/eosina, colo-ração imunofluorescente para β-tubulina-IV (fluorescência verde) e CCSP(fluorescência vermelha), e imunocoloração de MUC5AC. Imunocoloraçãocom IgG não-imune forneceu nenhum sinal acima de fundamento (dadosnão mostrados). Barra = 20 μηι. Metodologia é adicionalmente descrita no

Exemplo 2.

As figuras 4A e 4B são gráficos em barra mostrando dadosquantitativos correspondentes a condições na figura 3, bem como pós-ino-culação de 12 dias de SeV sem tratamento e mais tratamento de SeV comEKB-569 em 12 dias após inoculação de 10-21 dias. Valores representam amédia ± SEM, e uma diferença significativa de controle de SeV-UV é indica-da por (*). Metodologia é adicionalmente descrita no Exemplo 2.

As figuras 5A, 5B e 5C são fotomicrografias representativas deseções das vias aéreas obtidas de camundongos C57BL/6J e Balb/cJ emdias indicados após inoculação com SeV e em seguida submetidas à imuno-coloração de BrdU (figura 5A), fósforo-EGFR (figura 5B) e MUC5AC (figura5C). Barra = 20 μιη. Metodologia é adicionalmente descrita nos Exemplos 2e 3.

A figura 6 é um gráfico em barra mostrando dados quantitativoscorrespondentes de condições na figura 5A. Valores representam a média ±SEM, e uma diferença significativa de 0 dia é indicada por (*). Metodologia éadicionalmente descrita nos Exemplos 2 e 3.

Figura 7 é um gráfico em barra mostrando morfometria quantita-tiva correspondente de seções das vias aéreas que foram obtidas de ca-mundongos Balb/cJ em 21 dias após-inoculação com SeV ou SeV-UV e emseguida submetidas à imunocoloração de β-tubulina, CCSP e MUC5AC. Va-lores representam a média ± SEM, e uma diferença significativa de controlede SeV-UV é indicada por (*). Barra = 20 μηι. Metodologia é adicionalmentedescrita nos Exemplos 2 e 3.

Figuras 8A, 8B e 8C são fotomicrografias representativas de cul-turas de células epiteliais das vias aéreas (mTEC) colocadas sob condiçõesinterfaciais ar-líquido de 10 dias seguidos por imunocoloração de EGFR (topo)ou dupla imunofluorescência seguida por microscopia confocal de β-tubulina ecada EGFR ou p-EGFR. Metodologia é adicionalmente descrita no Exemplo 2.

A figura 9 é uma imagem de uma análise Western blot de cultu-ras de mTEC que foram colocadas em meio básico por 1 dia, e em seguidatratadas com EGF (1 ou 10 ng/ml) por 10 minutos com ou sem inibidor con-comitante. Cada inibidor foi adicionado sob concentrações máximas eficazespara a câmara inferior por 6 horas e a câmara superior por 2,5 horas antes de adição de EGF a ambas as câmaras. Para cada condição, Iisatos celula-res com anti-EGFR, p-EGFR, fosfo-Akt (p-Akt), ou fosfo-ERK1/2 (p-ERK1/2)Ab e detecção por quimiluminescência acentuada. Metodologia é adicional-mente descrita no Exemplo 2.

As figuras 10A, 10B, 10C e 10D são fotomicrografias representa-tivas de culturas de mTEC que foram tratadas com veículo ou PD153035(0,3 μΜ) por 7 dias a 37°C e em seguida submetidas à coloração imunofluo-rescente para β-tubulina e Hoechst 33432. Barra = 20 μιτι. Metodologia éadicionalmente descrita no Exemplo 2.

A figura 11 é uma série de gráficos em barra mostrando análisequantitativa de células de coloração β-tubulina (expressa como uma % decélulas de coloração Hoechst totais) com e sem tratamento com PD153035,LY294002 e PD98059 dado nas doses indicadas por 7 dias. Uma diferençasignificativa é indicada por (*). Metodologia é adicionalmente descrita no E-xemplo 2.

As figuras 12A, 12B, 12C, 12D, 12E, 12F, 12 G e 12 H são foto-micrografias representativas de culturas de mTEC que foram tratadas comveículo, PD153035 (0,3 μΜ), LY294002 (50 μτη) e PD98059 (50 μηη) por 3dias a 37°C e em seguida submetidas à coloração imunofluorescente parafragmento clivado de caspase 3 ativa (Act-C-3) ou reação de TÚNEL. Barra= 20 μm. Metodologia é adicionalmente descrita no Exemplo 3

As figuras 13A 13B são gráficos em barra mostrando análisequantitativa da figura 12 para ativar células de coloração caspase-3 (expressacomo % de células de coloração Hoechst totais) usando condições de trata-mento de figura 12, bem como PD15305 mais zVAD-fmk (100 μΜ). Valoresrepresentam a média ± SEM, e uma diferença significativa de veículo isoladoé indicada por (*). Metodologia é adicionalmente descrita no Exemplo 3.

A figura 14 é uma imagem de análise imunoblot de ativação decaspase 3 (Act-C-3) e caspase 9 (Act-C-9) em lisatos celulares de culturasde mTEC usando condições de tratamento a figura 12. Anticorpo anticaspa-se 9 reconhece precursor (C-9) e o fragmento clivado de ativação de caspa-se-9 (Act-C-9). Metodologia é adicionalmente descrita no Exemplo 3.

Figura 15 é um gráfico em barra mostrando análise citométricade fluxo de coloração JC-1 de culturas mTEC usando condições de trata-mento de figura 12. Valores representam % de células com potencial demembrana mitocondrial diminuído (ΔΨm) detectado por deslocamento deFL2 para FL1. Valores representam a média ± SEM, e uma diferença signifi-cativa de veículo isolado é indicada por (*). Metodologia é adicionalmentedescrita no Exemplo 3.

A figura 16 é fotomicrografia representativa de culturas mTECtratadas com ou sem IL-13 (100 ng/ml por 5 dias) e com ou sem PD153035subseqüente (0,3 μΜ por 3 dias) e submetidas à coloração imunofluorescen-te para MUC5AC (vermelho) e caspase 3 ativa (verde), bem como contra-coloração com corante de Hoechst (azul). Metodologia é adicionalmentedescrita no Exemplo 4.

As figuras 17A e 17B são gráficos em barra mostrando dadosquantitativos correspondentes à figura 16. Valores representam a média ±SEM para % de células caliciformes positivas a caspase 3 ativa (célulasMUC5AC+ caspase 3+ ativa/MUC5AC+) e células não-caliciformes positivas(células de coloração TUNEL totais/células de coloração Hoechst). Uma dife-rença significativa de controle de veículo é indicada por (*). Metodologia éadicionalmente descrita no Exemplo 4.

As figuras 18A, 18B, 18C e 18 D são micrógrafos de transmissãoeletrônica representativos de mTEC de cultura antes de tratamento (figura18A) e em seguida após tratamento com IL-13 (100 ng/ml por 2 dias a 37°C)(figuras 18B-18D). Células ciliadas-caliciformes prematuras são identificadascom cílios que são visíveis na superfície de células que também contêm al-guns grânulos mucosos (figura 18B); células ciliadas caliciformes tardias e-xibem maiores números de grânulos mucosos no citoplasma (figura 18C); ecélulas caliciformes maduras contêm características de grânulos mucosossem nenhum cílio (figura 18D). Metodologia é adicionalmente descrita no

Exemplo 4.

As figuras 19A, 19B e 19C são fotomicrografias representativasde seções das vias aéreas obtidas de camundongos em 21 dias após inocula-ção de SeV e submetidas à microscopia de imunofluorescência confocal paraβ-tubulina (verde) e MUC5AC (vermelho). Setas indicam coloração de célulasciliadas em relação a β-tubulina (c), coloração de células caliciformes paraMUC5AC (g), e coloração de células tanto em relação a β-tubulina quanto aMUC5AC (cg). Metodologia é adicionalmente descrita no Exemplo 4.

As figuras 20A, 20B e 20C são fotomicrografias representativasde seções das vias aéreas obtidas como na figura 19, mas imunocoradaspara p-EGFR (vermelho) e MUC5AC (verde). Setas indicam coloração decélulas ciliadas em relação a p-EGFR (c), coloração de células caliciformesem relação a MUC5AC (g) e coloração de células tanto em relação a p-EGFR quanto a MUC5AC (cg). Metodologia é adicionalmente descrita no

Exemplo 4.

As figuras 21 A, 21B e 21C são fotomicrografias representativasde secreções das vias aéreas obtidas como na figura 19, mas imunocoradaspara CCSP (verde) e MUC5AC (vermelho). Setas indicam coloração de célu-Las para CCSP (cc) ou CCSP e MUC5AC (ccg). Metodologia é adicionalmen-te descrita no Exemplo 4.

A figura 22 é um gráfico em barra mostrando análise quantitativade MUC5AC expressando células que também imunocoradas para CCSP ouβ-tubulina. Valores representam a média ± SEM, e uma diferença significati-va de controle de SeV-UV correspondente é indicada por (*). Metodologia éadicionalmente descrita no Exemplo 4.

As figuras 23A, 23B e 23C são gráficos em barra mostrando re-sultados de RCP de tempo real para níveis de mRNA de IL-13 no pulmão(figura 23A), mCLCA3 (figura 23B) e MUC5AC (figura 23C) corrigidos paranível de controle GAPDH em tempos indicados após inoculação de SeV.Valores representam a média ± SEM, e uma diferença significativa de con-trole de SeV-UV correspondente é indicada por (*). Metodologia é adicional-mente descrita no Exemplo 4.

A Figura 24 é um gráfico em barra mostrando análise quantitati-va de imunocoloração de β-tubulina (células ciliadas), CCSP (células Clara)e MUC5AC (células caliciformes) nas vias aéreas de camundongos infectadoscom SeV e tratados com antagonista de receptores slL-13 (slL-13Ra2-Fc) ouIgG de controle a partir dos dias 12, 14, 17 e 20 após inoculação. Barras =20 μm por (*). Metodologia é adicionalmente descrita no Exemplo 4.

As figuras 25A, 25B e 25C são fotomicrografias representativasde seções pulmonares obtidas de pacientes com COPD e imunocoradaspara β-tubulina, MUC5AC ou CCSP e observada com imunofluorescência(figura 25A) ou para β-tubulina e MUC5AC ou CCSP e MUC5AC e observa-da com microscopia de varredura confocal a laser (figura 25 B e figura 25C,respectivamente). Setas e contornos indicam células caliciformes que ex- pressam MUC5AC (g), células clara que expressam CCSP (cc), células cili-adas-caliciformes que co-expressam β-tubulina e MUC5AC (cig), ou célulascaliciformes que co-expressam CCSP (ccg).

As figuras 26A, 26B e 26C são fotomicrografias representativasde células epiteliais grandes humanas das vias aéreas (hLAECs) cultivadasde pacientes com COPD, incubadas com IL-13 (100 ng/ml) por 5 dias, e emseguida imunocoradas para γ-tubulina (vermelho) (figura 26A), MUC5AC(verde) (figura 26B) e tanto γ-tubulina quanto MUC5AC (figura 26C). Setasindicam células que imunocoram em relação à γ-tubulina e MUC5AC.

As figuras 27A, 27B, 27C e 27D são fotomicrografias representa-tivas de hLAECs cultivadas de indivíduos (não-COPD) de controle, incubadascom IL-13 por 1 dia, imunocoradas como na figura 26, e em seguida observa-das com microscopia de varredura confocal a laser em inspeções x-y (figura27 A) e eixo ζ (figuras 27B-27D). Setas indicam células que imunocoramtanto γ-tubulina quanto MUC5AC.

A figura 28 é uma esquemática que demonstra um esquema decaminhos dependentes de EGFR e IL-13 induzidos por vírus que controlam resposta de hospedeiro epitelial e remodelagem.

As figuras 29A, 29B, 29C e 29D são fotomicrografias representa-tivas de seções de biópsia endobronquial obtidas de indivíduos de controlesadios e asmáticos. Seções foram imunocoradas para EGFR e fosfo-EGFRusando os mesmos métodos como nas figura 1 e figura 2. Barra = 20 μιτι.Metodologia é adicionalmente descrita no Exemplo 2.

As figuras 30A e 30B são imagens de análise Western blot quemostram o efeito de tratamento com EKB-569 in vitro (figura 30A) e in vivo(figura 30B). figura 30A é uma imagem Western blot de Iisatos celulares decélulas epiteliais traqueobronquiais humanas (hTECs) cultivadas sob condi-ções interfaciais ar-líquido e incubadas com ou sem EGF (100 ng/ml) ou comou sem IL-13 (100 ng/ml) na ausência ou presença de EKB-569 (1 μΜ por10 minutos a 37°C) e blotted (borradas) com os anticorpos indicados. A figu-ra 30B é uma imagem western blot de Iisatos pulmonares de camundongosC57BL/6J inoculados com SeV ou SeV-UV e tratados com ou sem EKB-569em 10-21 dias pós-inoculação. Blottingioi com os anticorpos indicados. Me-todologia é adicionalmente descrita nos Exemplos 1 e 2.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Sinais imunes, se deixados não-checados, podem levar a umacaracterística de fenótipo epitelial de doença crônica das vias aéreas. Em partículas, metaplasia de células caliciformes persistentes, levando a umfenótipo de doença asma/bronquite crônica, depende de sobrevivência de-pendente de EGFR de células epiteliais ciliadas e transdiferenciação dependen-te de IL-13 de células ciliadas para células caliciformes (vide, por exemplo,Exemplos 1 e 2). Essa anormalidade pode ser corrigida por inibição direcio-nada de etapas de sinalização nos caminhos de sinalização EGFR e IL-13.Tratamento com inibidores de EGFR permite que as células ciliadas prossi-gam no sentido de morte celular programada enquanto bloqueio de IL-13impede a transição de células ciliadas para células caliciformes (vide porexemplo, Exemplos 2 e 3). Desse modo, conforme descrito neste relatório,bloqueio de caminho de sinalização tanto de EGFR quanto de IL-13 poderecuperar o epitélio das vias aéreas a sua arquitetura original (vide por e- xemplo, Exemplo 4).

Um aspecto da presente invenção, portanto, é o tratamento, pro-filático ou terapêutico, de hiperplasia epitelial e metaplasia através de dire-cionamento dos caminhos de sinalização de EGFR e IL_13. Um outro aspec-to da invenção é composições que direcionam os caminhos de sinalizaçãode EGFR e IL-13, úteis no tratamento de hiperplasia epitelial e metaplasiadescrito neste relatório. Esse tratamento pode ser usado, por exemplo, comoum tratamento profilático para proteger, em todo ou em parte, contra asmae/ou bronquite crônica. As composições e tratamentos podem ser tambémusados, por exemplo, terapeuticamente para melhorar arquitetura epitelialalterada na regulação de asma, bronquite, bronquiolite, e/ou distúrbios infla-matórios e infecciosos correlatos caracterizados por um padrão similar deativação de EGFR, expressão de IL-13, e metaplasia de células caliciformes.As composições e tratamentos podem ser similarmente usados para trataruma doença ou condição das vias aéreas caracterizada por hipersecreçãode muco.

Estados de doença indicativos de uma necessidade de terapiacom inibidores de sinalização de EGFR e IL-13 e estados de doença recepti-vos a tratamento com inibidores de sinalização de EGFR e IL-13 incluem,por exemplo, doença pulmonar obstrutiva crônica, doenças hipersecretóriasnasais (por exemplo, alergias nasais), doenças inflmatórias (por exemplo,asma, bronquiectasia e fibrose pulmonar), e doenças pulmonares obstrutivascrônicas (por exemplo, bronquite crônica), bem como doenças genéticas,incluindo fibrose cística, espessamento do muco de fibrose não-cística fami-liar de trato respiratório, síndrome de Kartagener, deficiência de alfa-1-antitripsina e infecções superiores ou inferiores das vias aéreas (por exem-plo, bronquiolite viral ou rinite) que provocam ou causam condições hiperse-cretórias.

Uma determinação da necessidade de tratamento tipicamenteserá avaliada por uma história e exame físico consistente com superprodu-ção de muco (por exemplo, tosse produtiva de muco), estudos radiográficosou outros de imagem das vias aéreas que indicam doenças ou condições com superprodução de muco, ou testes da função pulmonar que indicamevidência de obstrução das vias aéreas e/ou hiper-reatividade.

Em um aspecto da invenção, o método compreende redução donível de sinalização de EGFR e IL-13 em tecido epitelial administrando uminibidor de sinalização de EGFR e um inibidor de sinalização de IL-13. A quantidade administrada é pelo menos essa suficiente para impedir aumentoem células ciliadas e também impedir transdiferenciação de células ciliadaspara células caliciformes. Em um estudo exemplar, tratamento em 12, 14, 17e 20 dias pós-infecção viral com um receptor isca que bloqueia IL-13 foi efi-caz em prevenir metaplasia de células caliciformes induzida por vírus en-quanto diariamente tratamento de 10-21 pós-infecção com inibidores seleti-vos de sinalização de EGFR causou uma perda dependente de dose de cé-lulas ciliadas fora de proporção à diminuição conseqüente em células epiteli-ais totais (vide, por exemplo, Exemplo 4). Esses resultados demonstram quetratamento com inibidores de sinalização de EGFR e IL-13 pode corrigir ar-quitetura epitelial na regulação de doença inflamatória caracterizada por ati-vação de EGFR, expressão de IL-13 e metaplasia de células caliciformes.INIBIDORES DE SINALIZAÇÃO

Inibidores do caminho de sinalização de EGFR ou IL-3 podemdirecionar, diretamente ou indiretamente, qualquer fator ou componente en- volvido na cascata biológica que resulta em promover aumento em célulasciliadas e metaplasia de células caliciformes, respectivamente.

Inibidores de sinalização de EGFR incluem inibidores que dire-cionam EGF, EGFR, Iigantes de EGFR (por exemplo, anfiregulina, HB-BGFe TGF-α), estimuladores de expressão EGFR, componentes de EGFR (porexemplo, hev-1 e hev-2), e componentes de sinalização a jusante de EGFR.Por exemplo, um inibidor de sinalização de EGFR pode direcionar ativaçãode EGFR (por exemplo, dimerização de receptor ou fosforilação de receptortirosina quinase) ou podem direcionar um ou mais dos caminhos manifesta-dos por ativação: (i) Recrutamento de Ral, ativação de c-Src e ativação sub-seqüente de Statl e Stat3; (ii) recrutamento de ShC/Grb3, ativação de Sos,Ras e c-Raf, e ativação subseqüente de MEK1/2 de ERK 1/2; ou (iii) recru-tamento de Gabl, ativação de PI3K, geração subseqüente de fosfatidilinosi-tol-3,4,5-fosfato (PI-3,4,5-P3), ativação de PDK1/2 e em seguida Akt queinativa fatores pró-apoptóticos (vide, por exemplo, figuras 8, 9, 10 e 11).

Como um outro exemplo, um inibidor de TNF-α (um estimuladorde expressão de EGFR no epitélio das vias aéreas) poderá ser usado para inibir o caminho de sinalização de EGFR. Similarmente, o inibidor pode dire-cionar os componentes a jusante de TNF-α e obter inibição de sinalizaçãode EGFR. EGFR pode ser ativado através de mecanismos dependentes deIigante e independentes de ligante, resultando em autofosforilação ou trans-fosforilação, respectivamente. Ativadores de sinalização de EGFR indepen-dentes de Iigantes incluem estresse oxidativo (vide, por exemplo, Takeyamae outros, Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 280:L165-L172, 2001), es-tresse ultravioleta e osmótico, estimulação de receptor acoplado à proteínaG por meio de endotelina-1, ácido lisofosfatídico e trombina, receptor de ace-tilcolina muscarínico m1 e hormônio do crescimento humano.

Inibidores de sinalização de IL-13 incluem, por exemplo, inibido-res que direcionam componentes de sinalização de IL-4Ra, IL-13Ra1, Iigan-tes de IL-4Roc, Iigantes de IL-13Ra1, e IL-13 a jusante (vide, por exemplo,figura 4). Como um exemplo, sinalização de IL-13 pode ser inibida por dire-cionamento do receptor IL-4/IL-13. Alternativamente, um fator ou caminhoque estimula expressão do receptor IL-4/IL-13 (por exemplo, IL-13) é umalvo para um inibidor do caminho de sinalização de IL-13. Outros ativadoresdo caminho de IL-13 incluem IL-4 e IL-9. Como um outro exemplo, um inibi-dor de sinalização de IL-13 pode direcionar (i) recrutamento de IRS1/2, ati-vação de Grb2/Sos, ativação de Ras/c-Raf e ativação subseqüente deERK1/2 e PI3K e/ou (ii) a ativação de Stat6, das quais cada uma contribuipara supra-regulação (upregulation) de genes (por exemplo, CLCA e MUC)que promovem transdiferenciação de células ciliadas para células calicifor-mes (vide, por exemplo, figura 4s). Também, um inibidor de sinalização deIL-13 pode direcionar recrutamento de IRS1/2, ativação de PI3K, geraçãosubseqüente de fosfatidilinositol-3,4,5-fosfato (PI-3,4,5-P3), ativação dePDK1/2 e em seguida Akt que inativa fatores pró-apoptóticos (vide, por e-xemplo, figuras 8, 9, 10 e 11).

Agonistas de EGFR e IL-13 podem ser também usados para ini-bir os respectivos caminhos de sinalização. Agonistas de EGFR e IL-13 sãomoléculas que imitam interação com receptores envolvidos no caminho desinalização de EGFR e IL-13, respectivamente. Esses poderão ser análogosou fragmentos de moléculas de sinal, ou imunopeptídeos contra epitopos desítio de ligação a Iigante dos receptores, ou imunopeptídeos antiidiotípicoscontra imunopeptídeos particulares que se ligam a porções de interação areceptores. Antagonistas poderão tomar a forma de proteínas que competemligação a receptores mas falta a capacidade de ativar o receptor ou molécu-Ias de ligação (por exemplo, imunopeptídeos). Um exemplo de agonistas desinalização anti-IL-13 inclui a proteína de fusão oc2 Fc receptor IL-13 recom-binante solúvel, slL-13Roc2-Fc, que age como um receptor isca para especi-ficamente bloquear ação de IL-13 (vide, por exemplo, Exemplo 4).

Inibidores de sinalização de EGFR e IL-13 geralmente incluemimunopeptídeos, moléculas pequenas que agem como antagonistas compe-titivos ou irreversíveis, oligonucleotídeos anti-sentido, e pequenos RNAs in-terferentes.

INIBIDORES DE IMUNOPEPTÍDEOS

Inibidores de imunopeptídeos de sinalização de EGFR e IL-13incluem, por exemplo, anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais efragmentos de anticorpos. Tais anticorpos podem ser produzidos por qual-quer método apropriado, conhecido daquele versado no estado da técnica;anticorpos comercialmente produzidos poderão ser também usados.Anticorpos policlonais poderão ser prontamente gerados por a-quele versado no estado da técnica a partir de uma variedade de animais desangue quente tais como cavalos, vacas, várias aves comestíveis, coelhos,camundongos ou ratos. Resumidamente, antígeno é utilizado para imunizaro animal por meio de injeções intraperitoneal, intramuscular, intra-ocular ousubcutânea, com um adjuvante tal como adjuvante completo ou incompletode Freund. Após diversas imunizações de reforço, amostras de soro são co-letadas e testadas para reatividade ao alvo desejado. Anti-soros policlonaisparticularmente preferidos fornecerão um sinal em um desses ensaios que épelo menos três vezes maior que o de fundamento. Uma vez que o título doanimal tenha atingido um platô em termos de sua reatividade, quantidadesmaiores de anti-soros poderão ser prontamente obtidas por sangramentossemanais, ou por exsanguinação do animal.Tecnologia de anticorpo monoclonal (MAb) pode ser usada paraobter MAbs capazes de interferir com caminhos de sinalização de EGFR eIL-13. Exemplos de anticorpos que funcionariam como um antagonista deEGF inclui o anticorpo anti-EGFR monoclonal neutralizante C225 (Kawamotoe outros, (1983), Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 80: 1337-1341; Petit e outros,(1997), J. Path. 151:1523-153, produzido por ImCIone Systems, Nova Ior-que, NY) e o anticorpo anti-EGFR monoclonal EMD55900 (também chama-do Mab 425) {Merck, Darmstadt, Alemanha). Resumidamente, hibridomassão produzidos usando células do baço de camundongos imunizados comantígenos. As células do baço de cada camundongo imunizado são fundidascom células de mieloma de camundongo Sp 2/0, por exemplo, usando o mé-todo de fusão de polietileno glicol de Galfre, G. e Milstein, C., MethodsEnzymol., 73:3-46 (1981). Crescimento de hibridomas, seleção em meioHAT, clonagem e seleção de clones contra antígenos são realizados usandometodologia-padrão (Galfre, G. e Milstein, C., Methods Enzymol., 73:3-46(1981)). Clones selecionados de HAT são injetados em camundongos paraproduzir grandes quantidades de MAb em ascites conforme descritos porGalfre, G. e Milstein, C., Methods EnzymoL 73:3-46 (1981), os quais podemser purificados usando cromatografia de coluna deproteína A (BioRad, Her-cules, Califórnia). MAbs são selecionados com a base de sua (a) especifici-dade, (b) alta afinidade de ligação, (c) isotipo, e (d) estabilidade. MAbs po-dem ser selecionados ou testados para especificidade usando qualquer de uma variedade de técnicas padrões, incluindo Western Blotting (Koren, E. eoutros, Biochim, Biophys. Acta 876:91-100 (1986)) e ensaio imunoenzimáticoligado à enzima (ELISA) (Koren e outros, Biochim. Biophys. Acta 876:91-100(1986)). Esses anticorpos monoclonais usualmente ligarão com pelo menosuma Kd de aproximadamente 1 mM, mais usualmente pelo menos aproxi- madamente 300 μΜ, tipicamente pelo menos aproximadamente de 10 μΜ,mais tipicamente pelo menos, aproximadamente de 30 μΜ, preferencialmen-te pelo menos, aproximadamente de 10 μΜ, e mais preferencialmente pelomenos, aproximadamente 3 μΜ ou superior.

Poderá ser desejável produzir e usar fragmentos de anticorpos funcionais, por exemplo, fragmentos Fab, F(ab')2, Fc e Fv de cadeia única(scFv). Esses fragmentos geralmente incluirão regiões hipervariável conten-do extensões de seqüências de aminoácidos conhecidas como regiões dedeterminação de complementaridade, as quais são responsáveis pela espe-cificidade do anticorpo em relação a um sítio particular em uma molécula de antígeno. Clivagem proteolítica com papaína produz dois fragmentos de li-gação a antígeno separado chamados fragmentos Fab que contêm uma ca-deia leve intacta ligada a uma porção amino terminal da cadeia pesada con-tígua via mediante ligação dissulfeto. Clivagem proteolítica de uma moléculade IgG típica com papaína produz um fragmento F(ab')2 (Handbook of Expe- rimental lmmunology. Vol. 1: lmmunochemistry, Weir, D. M., Editor, Black-well Scientifie Publieations, Oxford (1986)). Também, métodos de DNA re-combinante permitem a produção e seleção de peptídeos de imunoglobulinarecombinante que são polipeptídeos de ligação a antígeno de cadeia únicaconhecidos como anticorpos scFv (Lowman e outros, (1991), Bioehemistry, 30, 10832-10838; Clackson e outros, (1991) Nature 352, 624-628; e Cwirla eoutros (1990), Proe. Natl. Aead. Sei. USA 87, 6378-6382).

Inibidores de imunopeptídeos podem ser administrados em umaquantidade de, por exemplo, aproximadamente 0,05 mg a aproximadamente2,5 mg por injeção. Como um outro exemplo, inibidores de imunopeptídeospodem ser injetados sob uma concentração de aproximadamente 0,1 mg aaproximadamente 1 mg por injeção. Preferencialmente, inibidores de imuno-peptídeos são injetados sob uma concentração de aproximadamente 0,3 mga aproximadamente 0,5 mg por injeção.

INIBIDORES DE MOLÉCULA PEQUENA

Inibidores de molécula pequena de sinalização de EGFR inclu-em inibidores de tirosina quinase de EGFR. Muitos desses inibidores de tiro-sina quinase de EGFR são conhecidos no estado da técnica e incluemPD153035, EKB-569 e AG1478 (4-(3-cloroanilino)-6; 7-dimetoxiquinazolina);inibidor de EGFR análogo tirfostina não-fenólico RG-14620; os inibidores dereceptores quinase de EGFR Tirfostina 23 (RG-50810), Tirfostina 25 (RG-50875), Tirfostina 46, Tirfostina 47 (RG-50864); AG-213), Tirfostina 51 (Bl-OMOL Research Laboratories, Plymoth Meeting, PA; BioSource Internatio-nal, Camarillo CA)·, BIBX 1522 (Boehringer Ingelheim, Inc., Ingelheim, Ale-manha); CGP59326B (Novartis Corporation, Basel, Suíça); inibidores deEGFR 4-aminoquinazolina (descritos na Patente U. S. No. 5.760.041); com-postos de estireno substituídos que podem também ser um naftaleno, umindano ou um benzoxazina, incluindo compostos de nitrila e molononitrila(descritos na Patente U. S. No. 5.217.999); os inibidores descritos na Paten-te U.S. No. 5.773.476; inibidor de carboxipeptidase de batata (PCI), um inibi-dor de 39-aminoácidos protease com três pontes dissulfeto, (Blanco-Aparicioe outros (1998), J. Biol. Chem. 273 (20): 12370-12377); antagonista de bom-besina RC-3095 (Szepeshazi e outros (1997), Proc. Nati Acad. Sei. USA 94:10913-10918); piridopirimidinas, pirimidopirimidinas, pirrolpirimidinas, taiscomo CGP 59326, CGP 60261 e CGP 62706 e pirazolpirimidinas (Strawn eShawver (1998), Exp. Opin. Invest. Drugs 7(4), 553-573); 4-(fenilamino)-7H-pirrol[2,3-d] pirimidinas (Traxier e outros (1996), J. Med. Chem. 39: 2285-2292); curcumina (Korutta e outros (1994), Biochim. Biophys. Acta 1224:597-600); {Laxmin arayana (1995), Carcinogen 16: 1741-1745); etc.

Inibidores de molécula pequena de sinalização de EGFR tambémincluem a proteína G não-acopladora Suramina sódica (BIOMOL ResearchLaboratories, Plymoth Meeting, PA, BioSource International, Camarillo, CA).

Inibidores de molécula pequena de sinalização de IL-13 incluemaqueles que direcionam sinalização a jusante tal como PD98059 (direciona-mento MEK 1/2 ERK 1/2) e LY294002 (direcionamento P13K -> AKT).

Inibidores de molécula pequena podem ser administrados emuma quantidade de aproximadamente 0,1 μg a aproximadamente 100 mgpor kg em peso de indivíduo por administração. Aqueles versados pronta-mente entenderão que níveis de dose podem variar como uma função docomposto específico, da gravidade dos sintomas e da susceptibilidade doindivíduo a efeitos colaterais, conforme discutidos mais totalmente abaixo.INIBIDORES ANTI-SENTIDO

Oligodesoxinucleotídeos anti-sentido inibem expressão gênicade uma maneira altamente seletiva e específica por meio de hibridização amRNA complementar e diminuição de expressão protéica.

Inibidores de sinalização de EGFR de oligonucleotídeos anti-sentido e métodos de sua produção incluem, por exemplo, aqueles descritosem Kronmiller e outro (1991), Dev. Bioi 147(2), 485-8; Hu e outros (1992)Int. J. Dev. Biol. 36(4), 505-16; Roy e Harris (1994) Molecular Endocrinology8, 1175-1181; Casamassimi e outros (2000) Ann-Oncol. 11(3), 319-325;Normanno e outros, (1996) Câncer Detection and Prevention 20(5); He eoutros (2000) World J. Gastroentero 6(5), 747-749; Riedel e outros, Int. J.OncoL (2002) 21, 11-16; Zeng e outros (2002), J. Exp. Ther. Oneol. 2(3),174-186; Deng e outros (2003) Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao 23(9), 877-81;Li e outros (2002), Clin. CancerRes. 8, 3570-3578. Inibidores de sinalizaçãode EGFR oligonucleotídeo anti-sentido também incluem aqueles produzidospor métodos similares àqueles acima. A segurança e eficácia de terapia gê-nica EGFR anti-sentido é discutida in Zeng e outros (2002), J. Exp. Ther.Oneol. 2(3), 174-186.

Inibidores de sinalização de IL-13 oligonucleotídeo anti-sentido emétodos para sua produção incluem, por exemplo, aqueles descritos emMousavi e outros (2004) Iran. Biomed. J. 8(4), 185-191.Oligonucleotídeos anti-sentido podem ser administrados via inje-ção intravítrea sob uma concentração de aproximadamente 10 μς/dia a a -proximadamente 3 mg/dia. Por exemplo, dosagem administrada pode seraproximadamente de 30 μg/dia a aproximadamente 300 μg/dia. Como umoutro exemplo, oligonucleotídeo anti-sentido pode ser administrado a apro-ximadamente 100 μg/dia. Administração de oligonucleotídeos anti-sentidopode ocorrer como um único evento ou durante um curso de tempo de tra-tamento. Por exemplo, oligonucleotídeos anti-sentido podem ser injetadosdiária, semanal, bissemanal ou mensalmente. Curso de tempo de tratamentopode ser de aproximadamente uma semana a aproximadamente um ano oumais. Em um exemplo, oligonucleotídeos anti-sentidos são injetados diaria-mente por um mês. Em um outro exemplo, oligonucleotídeos anti-sentidossão injetados semanalmente por aproximadamente 10 semanas. Em um e-xemplo adicional, oligonucleotídeos anti-sentidos são injetados a cada 6 se-manas por 48 semanas.

INTERFERÊNCIA DE RNA

Os caminhos de sinalização de EGFR e IL-13 podem ser repri-midos por interferência de RNA administrando ao paciente uma quantidadeterapeuticamente eficaz de pequenos RNAs interferentes (siRNA) específi-cos a componentes desses caminhos, tais como EGF, EGFR, IL-13, IL-4Ra,ou IL-13Rcc1. siRNA é comercialmente disponível de fontes tal como Ambion(Austin, TX). O siRNA pode ser administrado ao indivíduo por quaisquermeios adequados para transferência do siRNA para as células do tecido emou próximo da área de hiperplasia epitelial e metaplasia e/ou hipersecreção.Por exemplo, o siRNA pode ser administrado por arma genética, eletropora-ção, ou por outras vias de administração parenterais ou entéricas adequa-das, tal como injeção intravítrea.

Interferência de RNA é o processo por qual RNA fita dupla (ds-RNA) especificamente suprime a expressão de um gene que transporta suaseqüência complementar. Supressão do gene inibe a produção da proteínacorrespondente. Sob introdução, o dsRNAs longo entra em um caminho ce-lular que é comumente referido como o caminho de interferência RNA(RNAi). Primeiro, obtêm-se os dsRNAs processados em pequenos RNAsinterferentes (siRNAs) de 20-25 nucleotídeos (nt) por uma enzima semelhan-te a RNase Ill chamada Dicer (etapa de iniciação). Em seguida, a montagemde siRNAs para complexos contendo endoribonuclease conhecidos comocomplexos silenciadores induzidos por RNA (RISCs), desenrolamento noprocesso. As fitas de siRNA subseqüentemente conduziram o RISCs paramoléculas de RNA complementares, em que elas clivam e destroem o RNAcognato (etapa efetuadora). Clivagem de RNA cognato ocorre próxima aocentro da região ligada pela fita (strand) de siRNA. Preferencialmente, o siRNA compreende curto RNA fita dupla de aproximadamente 17 nucleotí-deos a aproximadamente 29 nucleotídeos de comprimento, preferencialmen-te de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleotídeos de compri-mento, que são direcionados ao mRNA alvo.

Como um exemplo, uma quantidade eficaz do siRNA pode ser uma quantidade suficiente para causar degradação mediada por RNAi domRNA alvo, ou uma quantidade suficiente para inibir os caminhos de sinali-zação de EGFR ou IL-13 em um indivíduo. Aquele versado no estado datécnica pode prontamente determinar uma quantidade eficaz do siRNA dainvenção a ser administrado a um dado indivíduo levando em consideraçãofatores tais como o tamanho e peso do indivíduo; o grau da neovasculariza-ção ou penetração da doença; a idade, saúde e sexo do indivíduo; a via deadministração; e se a administração é regional ou sistêmica. Geralmente,uma quantidade eficaz de siRNA compreende uma concentração intercelularem ou próxima do sítio de hiperplasia epitelial e metaplasia de aproximada- mente 1 nanomolar (nM) a aproximadamente 100 nM, preferencialmente deaproximadamente 2 nM a aproximadamente 50 nM, mais preferencialmentede aproximadamente 2,5 nM a aproximadamente 10 nM. Considera-se quequantidades maiores ou menores de siRNA podem ser administradas.

O siRNA pode ser direcionado a qualquer extensão de aproxi-madamente 19-25 nucleotídeos contíguos em qualquer uma das seqüên-cias-alvo de mRNA. Pesquisas do banco de dados genômico humano(BLAST) podem ser realizadas para assegurar que seqüência de siRNA se-lecionada não direcionará outros transcritos gênicos. Técnicas para selecio-nar seqüências-alvo de siRNA são dadas, por exemplo, em Elbashir e outros((2001) Nature 411, 494-498). Desse modo, a fita de sentido do siRNA pre-sente compreende uma seqüência de nucleotídeos idêntica a qualquer ex-tensão contígua de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleotí-deos no mRNA alvo de EGF, EGFR, IL-13, IL-4Ra1, ou IL-13Ra1. Geralmen-te, uma seqüência-alvo no mRNA alvo pode ser selecionada de uma dadaseqüência de cDNA correspondente ao mRNA alvo, preferencialmente inici-ando 50 a 100 nt a jusante (isto é, na direção 3') do códon de partida. A se- qüência-alvo pode, contudo, ser localizada nas regiões 5' ou 3' não-traduzidas, ou na região próxima ao códon de partida.

DOSAGEM E CURSO DE TEMPO DE TRATAMENTO

Quando usada nos tratamentos descritos neste relatório, umaquantidade terapeuticamente eficaz de um dos compostos da presente in-venção poderá ser empregada em forma pura ou, em que tais formas exis-tem, em forma de sal farmaceuticamente aceitável e com ou sem um excipi-ente farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, os compostos da invençãopodem ser administrados em uma quantidade suficiente para inibir sinaliza-ção de EGFR e sinalização de IL-13 ou reduzir a formação de produtos re- sultantes da cascata de sinalização de EGFR e IL-13 sob uma razão benefí-cio/risco aceitável aplicável a qualquer tratamento médico. Dosagens especí-ficas para cada tipo de inibidor são discutidas mais totalmente acima. Enten-der-se-á, contudo, que o uso diário total dos compostos e composições dapresente invenção será decidido pelo médico assistente dentro do escopo de critério médico perfeito.

O nível de dose específica terapeuticamente eficaz para qual-quer paciente particular dependerá de uma variedade de fatores, incluindo odistúrbio a ser tratado e a gravidade do distúrbio; atividade do composto es-pecífico empregado; a composição específica empregada; a idade, pesocorporal, saúde geral, sexo e dieta do paciente; o tempo de administração; avia de administração; a taxa de excreção do composto específico emprega-do; a duração do tratamento; fármacos usados em combinação ou coinci-dentes com o composto específico empregado e como fatores bem-conhecidos no estado da técnica médico. Por exemplo, está bem dentro doestado da técnica iniciar doses do composto sob níveis menores que aque-les exigidos para obter o efeito terapêutico desejado e para gradualmenteaumentar a dosagem até o efeito desejado ser obtido. Se desejado, a dosediária eficaz poderá ser dividida em doses múltiplas para fins de administra-ção. Conseqüentemente, composições em dose única poderão conter essasquantidades ou submúltiplos destas para produzir a dose diária.

Administração dos inibidores de sinalização de EGFR e IL-13pode ocorrer como um único evento ou durante um curso de tempo de tra-tamento. Por exemplo, inibidores podem ser administrados diariamente, se-manal, bissemanal ou mensalmente. Para tratamento de condições agudas,o curso de tempo de tratamento será usualmente pelo menos diversos dias.Certas condições podem estender tratamento de vários dias a várias sema-nas. Por exemplo, tratamento pode se estender durante uma semana, duassemanas, ou três semanas. Para condições mais crônicas, tratamento podese estender de várias semanas a vários meses ou ainda um ano ou mais.

De acordo com os métodos apresentados neste relatório, trata-mento profilático e terapêutico de distúrbios inflamatórios caracterizados porativação de EGFR, expressão de IL-13, e metaplasia de células caliciformespode ser efetuado por meio de bloqueio, redução ou regulação descendentede sinalização de EGFR e IL-13 através de administração de inibidores des-ses caminhos.

ADMINISTRAÇÃO TERAPÊUTICA

Os inibidores de sinalização de EGFR e IL-13 podem ser usadosterapeuticamente como materiais exógenos ou como materiais endógenos.Agentes exógenos são aqueles produzidos fora do corpo e administrados aocorpo.

Agentes endógenos são aqueles produzidos para o interior docorpo por algum tipo de dispositivo (biológico ou outro) de transferência paradentro ou para outros órgãos no corpo.TERAPIA EXOGENA

Uma quantidade segura e eficaz de inibidores de sinalização deEGFR e IL-13 é, por exemplo, aquela quantidade que causaria o efeito tera-pêutico desejado em um paciente enquanto minimizando efeitos colateraisindesejados. O regime de dosagem será determinado por versados na técni-ca, com base em fatores tais como a natureza exata da condição a ser trata-da, a gravidade da condição, a idade e a condição física geral do paciente, eassim por diante.

As composições da presente invenção incluirão um ou mais ini-bidores de sinalização de EGFR e IL-13 e um veículo farmaceuticamenteaceitável para esse(s) composto(s). Vários tipos de veículos poderão serusados. Os veículos podem ser aquosos na natureza. Os compostos podemser também prontamente incorporados em outros tipos de composições, taiscomo suspensões, géis viscosos ou semiviscosos ou outros tipos de compo-sições sólidas ou semi-sólidas. Suspensões poderão ser preferidas para a-gentes que são relativamente insolúveis em água. As composições da pre-sente invenção poderão também incluir vários outros ingredientes, tais comotampões, conservantes, co-solventes e agentes de formação de viscosidade.

Os inibidores de sinalização de EGFR e IL-13 poderão ser conti-dos em vários tipos de composições farmacêuticas, de acordo com técnicasde formulação conhecidas daqueles versados na técnica. O tipo específicode formulação selecionado dependerá de vários fatores, tais como inibidoresde sinalização de EGFR e IL-13 que são usados, a freqüência de dosagem,e o local que é tratado. Por exemplo, os agentes poderão ser incluídos emsoluções, suspensões e outras formas de dosagem adaptadas para aplica-ção tópica aos tecidos envolvidos, tais como soluções de irrigação de tecido,ou injeção para os tecidos envolvidos. Um sistema de tampão apropriado(por exemplo, fosfato de sódio, acetato de sódio ou borato de sódio) poderáser adicionado para impedir desvio de pH sob condições de armazenagem.

Conservantes são desse modo geralmente exigidos para impedircontaminação microbiana durante uso. Exemplos de conservantes adequa-dos incluem: cloreto de benzalcônio, timerosal, clorobutanol, metilparabeno,propilparabeno, álcool feniletílico, edetato dissódico, ácido sórbico, poliqua-térnio-1 ou outros agentes conhecidos daqueles versados na técnica. Essesconservantes são tipicamente empregados sob um nível de aproximadamen-te 0,001 a aproximadamente 1,0 por cento em peso, com base no peso totalda composição (% em peso).

Alguns dos inibidores de sinalização de EGFR e lL-13 poderãoapresentar solubilidade limitada em água e, portanto, poderão exigir um ten-soativo ou outro co-solvente apropriado na composição. Tais co-solventesincluem: óleos de rícino polietoxilados, Polissorbato 20, 60 e 80; TM F-68Plurônico Registrado, F-84 e P-103 (BASF Corp., Parsippany N. J., USA)·,ciclodextrina; ou outros agentes conhecidos daqueles versados na técnica.Tais co-solventes são tipicamente empregados sob um nível de aproxima-damente 0,01 a aproximadamente 2% em peso.

Soluções de irrigação fisiologicamente equilibradas podem serusadas como veículos farmacêuticos para os inibidores de sinalização deEGFR e lL-13. Conforme usado neste relatório, o termo "solução de irriga-ção fisiologicamente equilibrada" significa uma solução que é adaptada paramanter a estrutura física e função de tecidos durante procedimentos médicosinvasivos ou não-invasivos. Esse tipo de solução tipicamente conterá eletróli-tos, tais como sódio, potássio, cálcio, magnésio e;ou cloreto; uma fonte deenergia, tal como dextrose; e um tampão para manter o pH da solução emou próximo níveis fisiológicos. Várias soluções desse tipo são conhecidas(por exemplo, Solução Lactato de Ringers). Solução de irrigação estéril TMregistrada BSS e Solução de Irrigação Intra-ocular estéril TM Registradamais BSS (Alcon Laboratories, Inc. Fort Worth, Tex., USA) são exemplos desoluções de irrigação intra-oculares fisiologicamente equilibradas.

Viscosidade maior que aquela de soluções aquosas simples po-derá ser desejável para aumentar absorção do composto ativo ao tecido,para diminuir variabilidade em dispensar as formulações, para diminuir sepa-ração física de componentes de uma suspensão ou emulsão de formulaçãoe/ou de outra maneira aperfeiçoar a formulação oftálmica. Esses agentes deformação de viscosidade incluem, por exemplo, álcool polivinílico, polivinilpir-rolidona, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, hidroxietilcelulose, carbo-ximetilcelulose, hidroxipropilcelulose ou outros agentes conhecidos daquelesversados na técnica. Esses agentes são tipicamente empregados em umnível de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 2% em peso.

As composições da invenção podem ser embaladas em formamultidose.

TERAPIA ENDÓGENA

Os princípios de terapia gênica para a produção de produtos te-rapêuticos podem ser usados para transferir inibidores de sinalização EGFR e IL-13. Em regulagens clínicas, os sistemas de transferência genética parainibidores de sinalização de EGFR e IL-13 podem ser introduzidos em umpaciente (ou animal não-humano) por qualquer um de vários métodos, cadaum dos quais é versado na técnica. Por exemplo, inibidores de sinalizaçãode ácido nucléico anti-sentido EGFR e IL-13 podem ser introduzidos via veí- culos de transferência (denominados vetores) que podem ser variantes viraisnão-patogênicos (por exemplo, vetores retrovirais de murino defectivos porreplicação e vetores virais associados a adeno), vesículas lipídicas (por e-xemplo, lipossomos, Iipofectinas e citofectinas), cârboidrato e/ou outros con-jugados químicos de seqüências de nucleotídeos que codificam a proteína ou substância terapêutica. Como um outro exemplo, vetores podem ser in-troduzidos nas células do corpo por absorção física (por exemplo, microinje-ção, eletroporação e "arma gênica" pneumática), química, ou receptor celu-lar (por exemplo, endocitose à base de receptores) mediada. Uma vez quenas células, as seqüências de nucleotídeos podem ser elaboradas para pro-duzir a substância terapêutica dentro dos ambientes celulares (epissômicos)ou nucleares (núcleo). Epissomos usualmente produzem o produto desejadopor períodos limitados visto que seqüências de nucleotídeos nucleares in-corporadas podem produzir o produto terapêutico por períodos prolongados,incluindo permanentemente.

A preparação farmacêutica do constructo de terapia gênica podeconsistir essencialmente no sistema de transferência gênica em um diluenteaceitável, ou pode compreender uma matriz de liberação lenta em que o veí-culo de transferência gênica é embutido. Alternativamente, onde o sistemade transferência gênica completa pode ser produzido intacto de células re-combinantes, por exemplo, vetores retrovirais, a preparação farmacêuticapode compreender uma ou mais células que produzem o sistema de transfe-rência gênica.

Metodologias de terapia gênica podem ser também descritas pormeio de sítio de transferência. Meios fundamentais para transferir genes in-cluem transferência gênica ex vivo, transferência gênica in vivo e transferên-cia gênica in vitro. Em transferência gênica ex vivo, as células são tomadasdo paciente e crescidas em cultura celular. O DNA é transfectado para ascélulas, e as células transfectadas são expansivas em número e em seguidareimplantadas no paciente. Em transferência gênica in vitro, as células trans-formadas são células que crescem em cultura, tais como células de culturade tecido, e não células particulares de um paciente particular. Essas "célu-Ias de laboratório" são transfectadas, e as células transfectadas são selecio-nadas e expandidas para implantação em um paciente ou para outros usos.Transferência gênica in vivo envolve introdução do DNA nas células do paci-ente quando as células estão dentro do paciente. Transferência gênica invivo também envolve introdução do DNA especificamente nas células endo-teliais oculares do paciente usando vetores de terapia gênica contendo pro-motores endoteliais específicos. Todas as três das categorias amplas base-adas descritas acima poderão ser usadas para obter transferência gênica invivo, ex vivo e in vitro.

Terapia gênica também contempla a produção de uma proteínaou polipeptídeo em que a célula foi transformada com uma seqüência gené-tica que desativa o gene que ocorre naturalmente que codifica a proteína,isto é, técnicas de ativação gênica endógena.

Tendo descrito a invenção em detalhes, será visível que modifi-cações e variações são possíveis sem desviar-se do escopo da invençãodefinido nas reivindicações anexas. Além disso, deve-se entender que todosos exemplos na presente descrição são proporcionados como exemplosnão-limitativos.EXEMPLOS

Os exemplos seguintes não-limitativos são proporcionados paraadicionalmente ilustrar a presente invenção. Aquele versado na técnica en-tenderá que as técnicas descritas nos exemplos que seguem representam abordagens, os inventores verificaram funcionar bem na prática da invenção,e desse modo podem ser consideradas constituir exemplos de modos parasua prática. Contudo, aqueles versados na técnica devem, a luz da presentedescrição, considerar que muitas alterações podem ser feitas nas modalida-des específicas que são descritas, e ainda obter um resultado semelhanteou similar sem desviar-se do espírito e escopo da invenção.

MÉTODOS USADOS NOS SEGUINTES EXEMPLOS

Embora certos métodos usados nos Exemplos descritos abaixoestão contidos dentro dos Exemplos si próprios, técnicas adicionais foramtambém empregadas e são descritas imediatamente abaixo.

MARCADORES DE PROLIFERAÇÃO. Para imunocoloração deBrdU, camundongos receberam BrdU (100 mg/kg) intraperitonealmente em48 h, 24 h, e 4 h antes de eutanásia. BrdU foi detectado com um kit de colo-ração anti-BrdU (Zymed Laboratories, Inc. San Francisco, CA) de acordocom o protocolo do fabricante. Imunocoloração Ki67 foi realizada com Abanti-Ki67 (Novocastra Laboratories Ltd, Newcastie, UK) usando o mesmoprotocolo como para imunocoloração EGFR exceto para pré-tratamento derecuperação de antígeno induzido por calor usando Solução de Não-Mascaração de Antígeno (Vector Laboratories). Coloração de PCNA foi rea-lizada com Ab PCNA biotinilada anticamundongo (DAKO Corporation, Car-pinteria, CA) usando o método ABC (Vector Laboratories).

CULTURA CELULAR EPITELIAL E TRATAMENTO DAS VIAS AÉREAS.

Culturas interfaciais ar-líquido primárias de células epiteliais tra-queais de camundongo (mTECs) foram estabelecidas como descritas anteri-ormente (You, e outros (2002) Am. J. Physioi. Lung Celi MoL Physiol.283.L1315-1321). Culturas celulares epiteliais das vias aéreas humanas fo-ram estabelecidas de espécimes traqueobronquiais colhidas de explantespulmonares de pacientes com COPD que foram submetidos a transplante ede doadores de transplante do pulmão sem doença pulmonar usando asmesmas condições de cultura. Em todos os casos, as células foram cresci-das em meio básico (DMEM/HanYs F-12 com HEPES 30 mM, L-glutamina 4mM, NaHCO3 3,5 mM, 0,01% de Fungizona e penicilina/estreptomicina) su-plementadas com 10 μg/ml de insulina, 10 μg/ml de transferina, 0,1 μg/ml detoxina colérica, 25 ng/ml de EGF (Bectin Dickinson, Bedford, MA), 30 μg/mlde extrato pituitário bovino e 5% de FBS nos compartimentos superiores einferiores. Após as células desenvolverem resistência elétrica transmembra-na > 1000 Ohnvcm2, a condição interfâcial ar-líquido foi estabelecida porlavagem da membrana com PBS e alteração do meio no compartimento infe-rior a meio básico suplementado com 2% de NuSerum (BD BioSciences,San Diego, CA). Para estimulação de EGFR, as células foram incubadas emmeio básico por 24 horas e em seguida em meio básico contendo EGF (1-100 ng/ml, Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) adicionadas a compar-timentos superiores e/ou inferiores por 10 minutos a 37°C. Inibidores de si-nalização de EGFR ou veículo de controle (0,1% de DMSO) foram adiciona-dos a compartimentos inferiores sobre uma base diária em relação a expe-rimentos a longo prazo ou por 1,5 a 6 horas a compartimentos superiores einferiores em relação a experimentos a curto prazo. Inibidor EGFR tirosinaquinase PD153035, inibidor MEK1/2 PD98059, inibidor EGFR tirosina quina-se AG1478 e inibidor PI3K LY294002 foram de Calbiochem {La Jolla, CA) ez-Val-Ala-Asp fluormetilcetona (z-VAD-fmk) foi de Enzyme Systems Products(Livermore, CA). IL-13 recombinante humana ou de camundongo de Prepro-tech (Rocky HiHi NJ) foi adicionada a compartimentos superiores e inferioresem 24 horas antes de condições interfaciais ar-líquido e foi mantida no com-partimento inferior em todo o experimento.IMUNOCITOQUÍMICA. Células cultivadas foram lavadas duasvezes com PBS a 4°C, fixadas em 4% de paraformaldeído por 10 minutos a25°C, lavadas com PBS, e permeabilizadas com etanol:ácido acético (2:1,vol/vol) por 5 minutos a -20°C para reação de TUNEL ou com 0,2% de Tri-ton-X por 5 minutos a 25°C para imunocoloração. Células permeabilizadasforam em seguida lavadas com PBS e submetidas à reação de TUNEL (In-tergen, Purchase, NY) ou bloqueadas com 2% de gel de peixe 1 h a 25°C eincubadas com anticorpos caspase 3 antiativa de coelho (BD Biosciences,San Diego, CA), anti-EGFR de coelho (Santa Cruz Biotechnology, SantaCruz, CA), anti-p-EGFR de coelho (Cell Signaling Technology, Inc. Beverly, MA), anti-p-tubulina-IV de camundongo ou anti-p-tubulina de coelho {Sigma,St. Louis, MO) da noite para o dia a 4°C. Ligação primária a anticorpos foidetectada com anticorpo de cabra anticamundongo ou anticorpo de asnoanticoelho FITC ou CY3 secundário. As células foram contracoradas com 4μg/ml de Hoechst 33258 {Molecular Probes, Eugene, OR) para checar mor-fologia nuclear, e ém seguida reproduzidas conforme descrito acima.

CITOMETRIA DE FLUXO. Células epiteliais traqueais de ca-mundongo foram cultivadas conforme acima e removidas de cultura Trans-well usando solução de dissociação celular (Sigma, St Louis, MO) contendo0,25% de Tripsina e 0,1% de EDTA. As células foram lavadas com HBSS contendo 0,2% de BSA e incubadas com 5 μg/ml de JC-1 (Molecular Probes,Eugene, OR) por 15 minutos a 25°C. As células com despolarização demembrana mitocondrial foram detectadas por um desvio de emissão baixa aalta em fluorescência verde (FL1) usando um citômetro de fluxo FACSCaIi-bure software CeIIQuest (Becton Dickinson, Mountain View, CA).

MICROSCOPIA ELETRÔNICA. Células sobre membranas forampreparadas de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) conforme ante-riormente descrito (You e outros (2004), Am. J. Physiol. Lung CeH. MoL Phy-siol. 286:L650-657). Em resumo, amostras foram fixadas com 2,5% de gluta-raldeído e coradas com 1,25% de tetróxido de ósmio. As células foram con- tracoradas com 2,0% de ácido tânico, bloqueadas para secionamento, e re-produzidas em um microscópio modelo Zeiss 902.

ANÁLISE ESTATÍSTICA. Valores para histoquímica de tecidosde camundongo foram analisados usando uma análise unidirecional de vari-ação (ANOVA) para um projeto fatorial experimental. Se significância foi ob- tida por análise unidirecional, comparação pós-ANOVA de meios foi realiza-da usando teste F de Scheffe.EXEMPLO 1: ATIVAÇÃO PERSISTENTE DE EGFR EM CÉLULAS EPITE-LIAIS CILIADAS

Comportamento de EGFR em epitélio das vias aéreas de ca-mundongo foi avaliado em camundongos inoculados com vírus parainfluenza de camundongo (vírus Sendai; SeV), como paramixovírus humano comum(por exemplo, vírus sincicial respiratório ou metapneumovírus) geralmentereplicado pobremente em camundongos. Nesse sistema- modelo, inoculaçãoresulta em replicação com alta eficiência na mucosa bronquiolar com indu-ção conseqüente de expressão gênica de resposta imune, infiltração celular imune, e dano do epitélio (Walter e outros (2001), J. Exp. Med. 193, 339-352). Essa resposta de hospedeiro permite depuração completa de SeV por10-12 dias após inoculação. (Walter e outros (2002), J. Clin. Invest. 110:165-175; Tyner e outros (2005), Nat. Med. 11:1180-1187). A lesão é seguida porreparo e restauração epitelial de arquitetura normal das vias aéreas em al- gumas cepas de camundongo, mas pode ser seguida por metaplasia de cé-lulas caliciformes de longo prazo (provavelmente permanente) em camun-dongos C57BL/6J que surgiu aproximadamente 21 dias após inoculação(Walter e outros (2002), J. Clin. Invest. 110, 165-175).

Camundongos C57BL/6J e Balb/cJ foram obtidos de The Jack-son Laboratory (Bar Harbor, Maine) e foram mantidos e monitorados sobcondições livres de patógenos para estudo em 7 semanas de idade confor-me descrito anteriormente (Walter e outros (2001); Walter e outros (2002);Tyner e outros (2006); J. Clin. Invest. 116:309-321). SeV (Fushimi Strain 52)foi crescida em ovos de galinha embrionados e colhidas para proporcionaruma solução de estoque viral tal que 5000 EID50 (50% de dose infecciosade ovo) foi equivalente a 2 χ 105 de UFP (unidades formadoras de placas).Esse inóculo ou uma quantidade equivalente de SeV inativada por UV foitransferido intranasalmente em 30 μΙ de PBS sob anestesia de cetami-na/xilazina. Sob essas condições, níveis de tecido viral são máximos em 3-5 dias após injeção e depuração viral é completa por 12 dias (Walter e outros(2001); Walter e outros (2002); Tyner e outros (2006); J. Clin. Invest.116:309-321). Camundongos sentinelas e camundongos de controle experi-mental foram manipulados identicamente a camundongos inoculados e exibi-ram nenhuma evidência sorológica ou histológica de exposição a 11 patóge-nos roedores (incluindo SeV). Para bloqueio de EGFR, camundongos foramtratados com EKB-569 (obtido de Lee Greenberger, Wyeth Ayerst Pharma- ceuticals, Pearl River, NY; 20 mg/kg em pH 2,0 de água dada por gavagem(gavage) (alimentação forçada) ou veículo de controle dado diariamente apartir de 10-21 dias pós-infecção. Para bloqueio de IL-13, foram dadas acamundongos injeções subcutâneas de IL-13Roc2 murino solúvel fundidascom Fc (sIL Exemplo 2: inibição de EGFR diminui aspectos de remodelação epitelial de 13Rcx2-Fc; obtido de Deborah Donaldson, Wyeth Ayerst, 200μg/camundongo em PBS) ou Fc de controle em 12, 14, 17 e 20 dias pós-infecção (Donaldson (1998); J. Immunol. 161, 2317).

Para análise total do pulmão, o lóbulo esquerdo de pulmão de.camundongo foi homogeneizado em tampão RIPA Página 16 (1% de NP-40,0,5% de desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS em PBS) contendo coquetel deinibidor fosfatase {Sigma). Tecido traqueal e mTECs foram coletados emtampão Iise celular contendo 20 mM de Tris-HCI, 150 mM de NaCI, 1 mM deEDTA, 1 mM de EGTA, 1% de Triton-X 100, 1,0 μg/ml de leupeptina, 10μg/ml de aprotinina, 0,2 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonila, 1 mM de orto- vanadato de sódio, 0,1 mM de fluoreto de sódio, 2,5 mM de pirofosfato desódio e 1 mM de β-glicerofosfato. Lisatos celulares foram limpos por centri-fugação, e proteínas sobrenadantes foram separadas em 4-15% de gradien-te SDS-PAGE e transferidas para membranas PVDF (Millipore, Bedford,MA). As membranas foram blotted contra anticorpos para EGFR, fosfo- EGFR, fosfo-ERK1/2, caspase 3 ativada, fosfor-Stat6 (Celi Signaling Tech-nology, Beverly, MA), e β-actina (Chemicon, Temecula, CA). Ligação primá-ria a anticorpo foi detectada com anticorpos secundários conjugados paraperoxidase de raiz-forte e quimiluminescência acentuada (Amersham Phar-macia Biotech, Buckinghamshire, UK).

Pulmão de camundongo foi fixo por instilação intratraqueal de4% de paraformaldeído em 25 cm de pressão de H2O. Após fixação da noitepara o dia a 4°C, tecido foi embutido em parafina, e cortado em seções de 3μηM de espessura de hematoxilina/eosina ou imunocoloração.

Para tecido humano, indivíduos asmáticos (com e sem tratamen-to com glicocorticóide) e indivíduos sadios de controle foram recrutados, ca-racterizados, e submetidos à biópsia endobronquial conforme descrito ante-riormente (Walter e outros, (2001); Sampath e outros (1999); J. Clin. Invest.103:1353-1361; Taguchi (1998); J. Exp. Med. 187, 1927-1940). Em resumo,em relação a indivíduos asmáticos, biópsias endobronquiais foram tomadasem seguida indivíduos foram tratados com proprionato de fluticasona inalado(1.760 μg/d) por 30 dias e em seguida após fluticasona ser descontinuadapor 6 semanas ou até fluxo expiratório de pico ter diminuído em 25% e vo-lume expiratório forçado em 1 segundo por 15%. Em relação a todos os indi-víduos, não há história de infecção respiratória em relação aos 3 meses an-teriores. Biópsias endobronquiais foram lavadas com PBS e incubadas com10% de formalina tamponada neutra por 18 horas a 25°C seguidas por his-toquímica conforme descrita acima. Além disso, foram obtidas amostras detecido pulmonar de pacientes com COPD que passaram por resseção outransplante do pulmão e processadas conforme descritas acima.

Em relação à imunocoloração, seções de tecido foram despara-finizadas, reidratadas em álcool graduado e envolvidas com uma películahidrofóbica (ImmEdge PEN, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Em rela-ção à recuperação de antígenos, seções foram digeridas com Proteinase K(Sigma, St. Louis, MO) sob uma concentração final de 40 μg/ml em PBS por5 minutos e em seguida tratadas em peróxido de hidrogênio a 3% em águadestilada por 10 minutos para suprimir a atividade da peroxidase endógena.Ligação à proteína não-específica foi bloqueada com BSA a 3% e soro decabra a 2% em solução salina tamponada Tris (pH 8) com 0,2% de Tween20 (TBST) por 1 hora. Anticorpos primários foram diluídos em tampão debloqueio e incubados da noite para o dia a 4°C sob uma concentração finalde 0,05 ou 0,1 μg/ml de seções de tecido humano e camundongo, respecti-vãmente. EGFR foi detectado usando anticorpo SC-03 EGFR de coelho anti-humano de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) conduzidos contraresíduos de aminoácidos 1005-1016 que são idênticos a seqüência corres-pondente em EGFR de murino. EGFR fosforilado (p-EGFR) foi detectadousando anticorpo (Tyr845) de coelho anti-fosfo-EGFR No. 2231 de Cell Sig-naling Technology Inc. (Beverly, MA) conduzido contra Tyr845. Para esse an-ticorpo, concentrações finais de 0,16 e 0,32 μς/ηιΙ foram usadas para tecidoshumanos e murino, respectivamente. Células ciliadas, claras e caliciformesforam identificadas usando anticorpo murino anti-p-tubulina-IV mAb {Sigma),proteína secretória de célula anticlara de cabra (CCSP) (Santa Cruz Biote-chnology) e mAb 45M1 de murino anti-humano MUC5AC (Lab Vision Corp.,Fremont, CA), respectivamente. Para verificar especificidade, seções foramtambém incubadas com anticorpos primários que foram pré-absorvidos com10 vezes excesso de antígeno peptídico ou com IgG não-imune de coelho(Santa Cruz). Após ligação a anticorpos primários, seções foram lavadascom TBST e em seguida incubadas com IgG biotinilada de cabra anticoelho(2 μg/ml). Sinais foram amplificados com o método Elite ABC e 3,3'-diaminobenzidina cromógeno de acordo com os protocolos do fabricante(Vector Laboratories). Seções foram contracoradas com hematoxilina, desi-dratada e montada com Citoseal 60 (Stephens Scientific, Riverdale, NJ). I-munofluorescência foi realizada da mesma maneira como imunocoloraçãopara microscopia óptica exceto que tecidos foram congelados em Tissue-Tek OCT (Sakura Finetek, Torrance, CA), seções foram bloqueadas comsoro de asno a 2% (Jackson ImmunoResearch Labs., West Grove, PA), liga-ção a anticorpo primário foi detectada usando CY-3- ou anticorpos conjuga-dos a FITC (Jackson ImmunoReseareh Labs) por 30 minutos a 25°C, e se-ções foram contracoradas com corante Hoechst 33432 (Molecular Probes,Eugene, OR). Seções foram reproduzidas Com microscopia óptica ou imuno-fluorescente (Modelo Olympus BX-51) interfaceadas com um sistema de fo-tomicrografia digital (Câmara Optronix CCD e software Magnafire v2). Repór-ter foi quantificado por contagem de células ciliadas em vias aéreas pulmo-nares por mm de membrana basal com análise realizada em um computadorMacintosh usando o programa NIH Image de domínio público (desenvolvidono U.S. National Institutes of Health e disponível na Internet sobrsb.info.nih.gov/nih-image) conforme descrito anteriormente (Walter e outros(2001); Walter e outros (2002); Sampath e outros (1999)). Microscopia con-focal foi realizada usando um sistema de varredura a laser Zeiss com soft-ware LSM-510 (Zeiss, Thornwood, NY).

Resultados de análise Western blot indicaram que anticorposanti-EGFR e anti-fosfo-EGFR especificamente reconheceram o receptor emamostras de tecido das vias aéreas (dados não mostrados). Resultados deimunocoloração de tecido das vias aéreas com anticorpo anti-EGFR indica-ram que expressão de EGFR foi predominantemente localizada à membranaapical de células epiteliais ciliadas, embora outros tipos celulares (por exem- pio, células basais e células de músculo liso das vias aéreas) foram tambémfracamente imunocoradas (figura 1). Nenhuma diferença significativa foi ob-servada no padrão ou no nível de imunocoloração anti-EGFR entre camun-dongos infectados com SeV versus camundongos de controle que foraminoculados com SeV-UV. Por contraste, imunocoloração para fosfo-EGFR(usando anticorpo anti-fosfo-EGFR que reconhece Tyr845 fosforilado) indicouque níveis de EGFR ativado foram persistentemente aumentados em apro-ximadamente 21 dias após inoculação com SeV comparado com camun-dongos de controle não-inoculados ou SeV-UV inoculado. Similar a padrãode expressão de EGFR1 fosfo-EGFR foi também localizado principalmente àsuperfície apical de células epiteliais ciliadas, mas nesse caso, coloração decélula apical foi também acompanhada por coloração nuclear corresponden-te nessa mesma população de células ciliadas (figura 1). Outros tipos celula-res (por exemplo, células basais) foram também fracamente imunocoradasem locais nucleares e citosólicos. Essas descobertas são consistentes comrelatos de translocação nuclear de EGFR ativado (Lin e outros (2001) NatureCell Biol 3:802-808). Esse padrão de imunocoloração indicou que o anticor-po EGFR inicial reconhece predominantemente o receptor não-fosforilado.Para ambos os anticorpos, imunocoloração foi completamente abolida porpré-absorção com antígeno correspondente. Além disso, IgG normal de coe- lho foi usada como um controle de isotipo negativo e mostrou nenhum sinalsignificativo acima do fundamento. Resultados de dupla marcação e imuno-fluorescência detectados por microscopia confocal de varredura a laser indi-caram que EGFR co-localizadas com um marcador de células epiteliais cilia-das (isto é, β-tubulina) mas não com marcadores de células Clara (isto é,CCSP) ou células caliciformes (isto é, MUC5AC) em vias aéreas de camun-dongo (figura 2). Isso é de acordo com expressão de EGFR localizada pre-dominantemente a células epiteliais ciliadas.

O padrão de imunocoloração de EGFR encontrado em camun-dongos foi similar àquele em indivíduos humanos. Em particular, expressãode EGFR foi também localizada à membrana celular apical de células epite-liais ciliadas em indivíduos normais e asmáticos, e fosfo-EGFR foi aumenta- do em indivíduos asmáticos que também manifestam metaplasia de célulascaliciformes (figura 29). Expressão de fosfo-EGFR foi similarmente localiza-da à porção apical de células epiteliais ciliadas, e expressão foi acompanha-da por coloração nuclear correspondente nas mesmas células ciliadas. Em-bora adicional imunocoloração mais fraca de fosfo-EGFR estava tambémpresente em células basais tanto em indivíduos normais quanto asmáticos.EXEMPLO 2: PAPEL FUNCIONAL DE SINALIZAÇÃO DE EGFR EM CÉLU-LAS EPITELIAIS CILIADAS

Para definir um papel funcional de sinalização persistente deEGFR em células epiteliais ciliadas, seções pulmonares foram submetidas àimunocoloração com marcadores de células epiteliais ciliadas, células clarase células caliciformes. Preparação e imunocoloração de tecido foram con-forme descritas acima.

Análise quantitativa de tipos celulares encontrados no epitéliodas vias aéreas indicou que camundongos infectados por SeV desenvolve-ram aumento em células ciliadas e caliciformes e diminuição concomitanteem células clara em 21 dias (mas não por 12 dias) após inoculação compa-rada com camundongos de controle inoculados com SeV-UV (figuras 3-4).Determinou-se em seguida se sinalização de EGFR é necessária para essasalterações observadas na arquitetura epitelial. Usando um inibidor EGFRirreversível oralmente administrado, EKB-569, para tratar camundongos dia-riamente a partir de pós-infecção de 10 a 21 dias, inibição total de ativaçãode Akt foi obtida em todo o pulmão de camundongo em 21 dias pós-infecção(figura 30), indicando que sinalização de EGFR pró-sobrevivência foi eficaz-mente bloqueada sob essas condições. Para esses estudos, usou-se umnovo inibidor EGFR irreversível (EKB-569) que seletivamente inibe sinaliza-ção de EGFR em células epiteliais das vias aéreas in vitro (figura 30). Paraobter bloqueio in vivo, administrou-se oralmente EKB-569 a cada dia a partirde 10 dias pós-inoculação (a fim de não interferir com depuração viral oureparo epitelial) até 21 dias (quando a resposta de remodelação desenvol-veu). Sob essas condições de tratamento, EKB-569 também bloqueou sina-lização de EGFR in vivo (figura 30).

Tratamento com inibidor EGFR foi também observado ajudar acorrigir todos os três aspectos de remodelação epitelial. Especificamente,bloqueio completo de aumento de células ciliadas e diminuição de célulaClara,e inibição parcial mas significativa de metaplasia de células calicifor-mes, foras observados (figura 6). Tratamento com EKB-569 não apresentavanenhum efeito sobre o número total de células epiteliais das vias aéreas (cé-lulas de coloração com citoqueratina eram 133 ± 3 após veículo e 137 ± 5por mm de membrana basal após tratamento com fármaco em 21 dias pós-inoculação), consistente com alterações compensatórias em outras popula-ções de célula epitelial (por exemplo, célula basal e Clara). Baseados emdados imunohistoquímicos que mostram localização de EGFR e expressãode β-tubulina juntamente na mesma população de célula ciliada, esperou-seque bloqueio de EGFR pode influenciar hiperplasia de célula ciliada. Contu-do, o efeito de interromper sinais de EGFR em níveis de célula Clara ou cé-lula caliciforme foi inesperado com base na ausência relativa de expressãode EGFR ativada em cada um desses tipos celulares.

Experimentos adicionais foram elaborados para melhor entenderos mecanismos fundamentais do papel de EGFR em remodelação epitelialcrônica. Hiperplasia epitelial pode ser um resultado de aumento de prolifera-ção ou diminuição de morte celular. Como tal, buscou-se evidência de au-mento de proliferação em camundongos com remodelação epitelial. Confor-me observado anteriormente, há proliferação epitelial transitória (marcadapor marcação BrdU) durante 5-12 dias após infecção (figuras 5A e 6; (Look eoutros (2001) Am. J. Pathoi 159, 2055-2069)). O mesmo padrão de imuno-coloração foi encontrado para marcadores de proliferação Ki-67 e PCNA(dados não mostrados). Essa resposta proliferativa também permite substitu-ição de células hospedeiras que sofrem efeitos citopáticos diretos e mortecelular mediada imune na vigília de replicação viral (Tyner, J. W. e outros(2006) J. Clin. InvesU 16:309-321). Não surpreendentemente, essa fase dereparo é acompanhada por ativação de EGFR em células epiteliais (geral-mente células basais), bem como células subepiteliais (também imune) (figu-ra 5B). Contudo, mediante 21 dias pós-inoculação, não há mais evidência deuma resposta proliferativa progressiva, uma vez que proliferação celular nãofoi diferente de camundongos de controle não-inoculados (figuras 3A e 3B).Além disso, essa fase de substituição (marcada por absorção de BrdU e ati-vação de EGFR no compartimento celular basal) foi a mesma em uma linha-gem de camundongos (Balbc/J) que não desenvolveu remodelação epitelial de longo prazo (figuras 5A-5C, 6 e 7). Desse modo, essa resposta prolifera-tiva transitória não pode ser responsável por remodelação subseqüente delongo prazo que foi verificada apenas em camundongos geneticamente sus-cetíveis (C57BL6J), Além disso, a falta de uma resposta proliferativa epitelialprogressiva sugeriu que hiperplasia de células ciliadas pode refletir em umaumento seletivo na sobrevivência celular dependente de EGFR com baseem supressão de morte celular nessa subpopulação de células epiteliais.EXEMPLO 3: SINALIZAÇÃO DE EGFR E SOBREVIVÊNCIA DE CÉLULACILIADA EM CULTURA

Para determinar se EGFR proporciona sinais de sobrevivêncianecessários para células epiteliais ciliadas, bloqueio de EGFR foi analisadoem cultura de tecidos em que depuração de macrófagos não obscureceriadetecção de células apoptóticas e em que eventos de sinalização podem sermelhores definidos. Experimentos iniciais visados a determinar se EGFR foilocalizado para células epiteliais ciliadas em cultura conforme verificou-se invivo. O sistema epitelial foi reconstituído in vitro usando culturas interfaciaisar-líquido de células epiteliais das vias aéreas colhidas de traquéia de ca-mundongo. Nesse sistema, células ciliadas (β-tubulina positiva) representa-ram 45 ± 1% da população celular total, um nível que foi similar a vias aé-reas normais de camundongo (36% de vias aéreas por tamanho grande) e avalores de espécimes traqueais de camundongo registrados anteriormente(Pack e outros (1980); Cell Tissue Res. 208, 65-84). Como foi o caso in vivo,as células epiteliais ciliadas em cultura exibiram expressão constitutiva deEGFR e fosfo-EGFR junto da membrana celular apical e fosfo-EGFR foi veri-ficado neste local, bem como uma ativação nuclear uma após ativação porIigante (figura 5 e dados não mostrados). Outros registraram que EGFR po-derá também ser localizado à membrana celular basolateral em células epi-teliais das vias aéreas cultivadas (Vermeer e outros (2003); Nature 422, 322-326), mas qualquer diferença pode depender das condições de cultura, hete-rogenicidade de receptor que influencia reconhecimento por diferentes anti-corpos, ou abundância de receptor que poderá influenciar localização apicalversus basolateral (Kuwada e outros (1998); Am. J. Physioi Cell Physiol.275, C1419-C1428).Em seguida definiu-se o papel· de sinalização de EGFR em cres-cimento e sobrevivência de células epiteliais ciliadas usando tratamento cominibidores seletivos. Experimentos iniciais para validar especificidade de ini-bidor usaram culturas que foram primeiro, removidas de meio completo e emseguida estimuladas com EGF para maximizar sinais dependentes de EGFR.Sob essas condições, verificou-se que inibição de EGFR tirosina quinasecom PD153035 bloqueou todos os sinais a jusante, enquanto inibição dePI3K com LY294002 bloqueou fosforilação de Akt e inibição de MEK1/2 comPD98059 bloqueou fosforilação de ERK1/2 (figuras 5 e 6). Em seguida, de-terminou-se o efeito desses sinais de EGFR em sobrevivência de célulasciliadas. Verificou-se que tratamento com PD153035 causou uma perda decélulas ciliadas dependente de dose fora de proporção para a diminuiçãoconseqüente em células epiteliais totais (figuras 6 e 7).Resultados similares foram obtidos com um outro inibidor espe-cífico a EGFR AG1478 (dados não mostrados). Reconhecendo que ativaçãode EGFR provoca diversos caminhos de sinalização a jusante, culturas decélulas epiteliais traqueais (mTEC) de camundongo foram em seguida trata-das com inibidores de PI3K e MEK1/2 e verificou-se que apenas tratamentocom LY294002 causou uma perda similar de células epiteliais ciliadas (figura11). Uma vez que esse sistema de cultura não exibe crescimento celularsignificativo sob alta densidade, parece provavelmente que a perda de célu-Ias epiteliais ciliadas foi devido à diminuição na sobrevivência celular.

Em seguida testou-se se o bloqueio de sinalização de EGFRlevou a alterações concordantes no nível de apoptose. Em paralelo comperda de células epiteliais ciliadas, ativação rápida de caspase-3 e célulaspositivas TUNEL (dentro de 6 horas) foi observada no mesmo padrão para aquela de perda celular, isto é, quando sinalização de EGFR ou PI3K masnão de MEL1/2 foi bloqueada (figura 8). Nessa regulação, células positivas aTUNEL sofreram apoptose, uma vez que esse processo foi bloqueado portratamento com o inibidor z-VAD-fmk caspase (figura 9) e foi associado aclivagem/ativação caspase-3 e caspase-9 (figura 10) e perda de potencial membranoso mitocôndria (figura 11). Esses resultados, portanto, definemum caminho de sinalização de EGFR que protege contra apoptose de célu-las ciliadas via sinalização de PI3K seletiva a fatores a jusante que proíbemdisfunção mitocondrial e conseqüente morte celular programada. Esses a-chados permanecem em algum contraste para registros de EGFR e outros sinais de receptores a ERK1/2 que impedem morte celular sob outras cir-cunstâncias (Tyner e outros (2005); Nat. Med. 11: 1180-1187; Monick e ou-tros (2005); J. Bioi Chem., 280:2147-2158; Roux e outros (2004); Microbiol.Mol. Biol. Rev. 68:320-344).

EXEMPLO 4: SINALIZAÇÃO DE EGFR E METAPLASIA DE CÉLULAS CA- LICIFORMES IN VITRO E IN VIVO

Conforme observadas acima, as ações de sinalização de EGFRem células ciliadas não prontamente explicam o efeito de bloqueio de EGFRem metaplasia de células caliciformes in vivo. Expressão seletiva de EGFR efunção conseqüente de sobrevivência em células ciliadas são responsáveis por inibição de hiperplasia de células ciliadas, mas não responsáveis direta-mente por bloqueio de metaplasia de células caliciformes. Questionou-se emseguida, se EGFR pode ainda apresentar um efeito funcional similar em so-brevivência de células caliciformes. Para testar essa possibilidade, vantagem foitomada de estudos concomitantes que definiram dependência de IL-13 de me-taplasia de células caliciformes após infecção viral (observações não-publi-cadas, EY Kim e MJ Holtzman). Esse caminho efetuador, portanto, sobrepõe com aquele estabelecido em estudos de produção de mucina após desafioalérgeno (Grunig e outros (1998) Science 282: 2261-2263; Wills-Karp e ou-tros (1998) Science 282, 2258-2261). Além disso, a capacidade de tratamen-to com IL-13 para estimular formação de células caliciformes em células epi-teliais das vias aéreas cultivadas de cobaias (porquinho-da-índia) e seres humanos (Laoukili e outros (2001); J. Clin. Invest. 108:1817-1824; Kondo eoutros (2002); Am. J. fíespir. Cell. Moi Biol. 27:536-541; Atherton e outros(2003); Am. J. Physiol. Lung Cell MoL Physiol. 285:L730-L739), bem comocamundongos (observações não-publicadas, JD Morton e MJ Holtzman),foram reconhecidos. Células epiteliais traqueais de camundongo cultivadas15 foram tratadas com IL-13 e o desenvolvimento subseqüente de células calici-formes foi marcado por expressão de MUC5AC (Nakanishi e outros (2001)Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 98, 5175-51809; Zhou e outros (2001); Am. J.Respir. Cell Moi Bioi 25, 486-491). Morte celular foi rastreada com ativaçãode caspase 3, uma vez que o procedimento para a reação de TUNEL parece diminuir teor de mucina. Em contraste com células ciliadas, verificou-se quecélulas caliciformes não exibiram aumento nas taxas de morte celular emresposta à inibição de EGFR (figura 12). Quantificação do nível de célulasativas caspase 3 em populações positivas a MUC5AC versus negativas aMUC5AC indicou que o nível de apoptose foi similar em células caliciformes com ou sem bloqueio de EGFR visto que as células não-caliciformes (isto é,células epiteliais ciliadas) exibiram coloração significativa positiva a caspasesob essas condições de tratamento (figura 5C). Além disso, o nível de mortede células não-caliciformes com ou sem tratamento com IL-13 indicando queo caminho de morte em células ciliadas não é influenciado por ações depen- dentes de IL-13 em formação de células caliciformes.

Uma vez que bloqueio de EGFR causou nenhum efeito em so-brevivência in vitro de células caliciformes, deduziu-se que os efeitos poten-tes de bloqueio de EGFR em metaplasia in vivo de células caliciformes podeser a jusante de bloqueio de EGFR de hiperplasia de células ciliadas. Supor-te para que possibilidade chegasse de imediato quando se verificou que tra-tamento com lL-13 levou à desenvolvimento de células que transitoriamentecompartilharam características de células ciliadas e caliciformes. Desse mo-do, microscopia eletrônica de culturas mTEC proporcionou evidência de umsubconjunto de células ciliadas caliciformes com preservação de cílios e odesenvolvimento gradual de grânulos mucosos sob a influência de IL-13 (fi-gura 18). Essas células de transição foram mais proeminentes prematuras(1-2 dias) após iniciação de tratamento com IL-13, enquanto células calici-formes maduras sem cílios foram mais abundantes em tempos posteriores(5 dias) após tratamento. As características morfológicas de células ciliadascaliciformes sob essas condições mostram-se similares a grânulos mucososcontendo células ciliadas encontrados por microscopia eletrônica em viasaéreas de camundongos desafiados por alérgeno (Hayashi e outros (2004);Virchows Arch. 444:66-73.

Uma vez que culturas epiteliais das vias aéreas foram estabele-cidas sob condições que utilizam tratamento com IL-13 para promover for-mação de células caliciformes em um ambiente que de outra maneira produ-ziria células ciliadas, essas células ciliadas caliciformes foram provavelmenteredirecionadas por IL-13 para transdiferenciar-se de um fenótipo ciliado acélula caliciforme. A possibilidade de que transdiferenciação similar tambémse desenvolveu in vivo foi confirmada em seções tomadas de camundongosque exibem metaplasia de células caliciformes após inoculação com SeV.Microscopia confocal indicou que, embora a maioria de células ciliadas oucaliciformes expressou β-tubulina ou MUC5AC, respectivamente, há umasubpopulação de células epiteliais que expressou tanto β-tubulina quantoMUC5AC (figura 19). Similarmente, imagens confocais também indicaramque, em geral, células ciliadas mas não caliciformes expressaram EGFR,mas há uma subpopulação adicional de células que expressou tanto EGFRquanto MUC5AC (figura 20). Em cada caso, foram usadas seções múltiplasconfocais juntamente com o eixo ζ e reconstrução tridimensional para con-firmar co-localização em uma única célula. A subpopulação que expressaMUC5AC e β-tubulina e/ou MUC5AC e EGFR pareceu estar em transição,uma vez que eles não freqüentemente atingiram sua forma e posição carac-terísticas na superfície Iumenal da camada epitelial da mucosa conformeverificado em relação a células caliciformes maduras. Além disso, nessascélulas de transição, os grânulos mucosos foram freqüentemente localizadosem um compartimento mais basal das células versus um local mais apical decélulas caliciformes totalmente diferenciadas. Esse comportamento morfoló-gico também sugere que essas células ciliadas caliciformes representamprecursores de células caliciformes. Conforme observado anteriormente emrelação À metaplasia de células caliciformes induzidas por alérgeno, umasubpopulação de células epiteliais com co-expressão de CCSP e MUC5ACfoi também detectada (figura 21) sob níveis comparáveis para detecção decélulas ciliadas-caliciformes (figura 23).O objetivo seguinte foi estabelecer se IL-13 também promoveformação in vivo de células ciliadas a caliciformes como foi observado in vi-tro. Esses experimentos levaram vantagem de uma proteína de fusão cc2 Fcde receptor IL-13 solúvel recombinante (designada slL-13Roc2-Fc) que agecomo um receptor isca para especificamente bloquear ação de IL-13 quandotransferida para camundongos (Grunig e outros (1998) Science 282, 2261-2263;Wills-Karp e outros (1998) Science 282, 2258-2261). Condições de tratamentoforam escolhidas ser similar àquelas usadas em relação a bloqueio de EGFR,desse modo tratamento prolongou de 12 para 21 dias após inoculação viral.Esse tempo de análise também coincide com a indução de expressão gênicade IL-13, mCLCA3 e MUC5AC de comum acordo com o desenvolvimento demetaplasia de células caliciformes (figura 22). Sob essas condições, verifi-camos que tratamento com slL-13Ra2-Fc foi altamente eficaz na prevençãode metaplasia de células caliciformes induzidas por vírus (figura 23). Contu-do, em algum contraste com bloqueio de EGFR, tratamento com slL-13Roc2também causou um aumento adicional no nível de hiperplasia de célulasciliadas (consistente com um bloqueio em seu movimento para células calici-formes) e nenhuma alteração em níveis de célula clara (consistente com apossibilidade de que formação de célula caliciforme deriva pelo menos emparte, de populações de células ciliadas em vez de célula Clara). A possibili-dade de que outras fontes celulares (por exemplo, células Clara ou célulasbasais) poderão também contribuir para metaplasia de células caliciformesnessa regulação não pode ser totalmente excluída, mas o emparelhamentopróximo de aumento de células ciliadas para diminuição de células calicifor-mes após bloqueio de IL-13 sugere que transdiferenciação da população decélulas ciliadas é um caminho significativo de metaplasia de células calici-formes sob essas condições. Na verdade, juntamente com evidência anterior e presente de expressão de célula Clara de genes de mucina, os presentesresultados poderão simplesmente proporcionar evidência de plasticidadeadicional de diferenciação de células epiteliais.

Em dois conjuntos de experimentos finais, os achados foramnovamente prolongados de camundongos para estudos de indivíduos huma-nos. No primeiro conjunto de experimentos, tecidos das vias aéreas de paci-entes com COPD que exibem níveis notadamente elevados de células calici-formes nas vias aéreas e que proporcionam tecido do pulmão adequado pa-ra análise quando de transplante de pulmão foram analisados. Ao aplicar omesmo protocolo de imunocoloração para imunofluorescência e microscopiaconfocal quanto a camundongo-modelo, verificou-se que seções de explan-tes do pulmão de pacientes com COPD também exibem evidência de co-expressão de p-tubulina-MUC5AC em um subconjunto de células epiteliaisdas vias aéreas (figura 25). Coloração Iuminal de β-tubulina em vias aéreashumanas (ou de camundongos), consistente com a proposta de que cílios poderão ser processados por degradação endossômica em vez de cairem,não foi detectada. Conforme observado anteriormente (Boers e outros (1999);Am. J. fíespir. Crit. Care Med. 159), verificaram também co-expressão deCCSP-MUC5AC em um subconjunto de células epiteliais. No segundo con-junto de experimentos, a estratégia que foi usada para estudos de camun- dongos foi novamente aplicada e o comportamento de células epiteliais dasvias aéreas humanas em condições de cultura interfacial ar-líquido sem oucom IL-13 foi analisado. Nesse caso, verificou-se que células epiteliais das viasaéreas cultivadas de pacientes com COPD conduziram a desenvolvimento deum subconjunto de células que co-expressaram β-tubulina e MUC5AC sob ainfluência de IL-13. Conforme observado anteriormente, β-tubulina é locali-zada nos corpos basais de células ciliadas (You e outros (2004); Am. J. Phy-siol. Lung CeH Mol. Physiol. 286:L650-657), e assim proporciona ainda co-localização mais próxima com MUC5AC encontrada em grânulos mucosos.O mesmo padrão de co-expressão induzida por IL-13 de marcadores de cé-lulas ciliadas e células caliciformes foi encontrado em células epiteliais dasvias aéreas cultivadas de doadores de transplante de pulmão de outra ma- neira sadios em resposta a IL-13 mesmo no primeiro dia de tratamento comIL-13 (figura 27). Como é o caso dos estudos de tecido murino e humano,imagens múltiplas confocais foram examinadas juntamente com o eixo ζ ereconstrução tridimensional para estabelecer co-localização de marcadoresde células ciliadas e caliciformes em uma única célula. Desse modo, similar à ativação de EGFR experimentada em indivíduos humanos, verificou-seque o mecanismo a jusante de metaplasia de células caliciformes encontra-da no camundongo-modelo, isto é, transdiferenciação de células ciliadaspara caliciformes conduzida por IL-13, parece apresentar uma contraparteem doença hipersecretória humana.

Claims

1. Composição para o tratamento de hipersecreção das vias aé-reas que compreende um inibidor do caminho de sinalização de EGFR, uminibidor do caminho de sinalização de IL-13, e um veículo farmaceuticamenteaceitável.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, na qual o inibi-dor do caminho de sinalização de EGFR é um imunopeptídeo.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, na qual o inibi-dor do caminho de sinalização de IL-13 é um imunopeptídeo.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 2, na qual o imu-nopeptídeo é um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal ou fragmentode anticorpo.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 3, na qual o imuno-peptídeo é um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal ou um fragmentode anticorpo.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 2, na qual o imu-nopeptídeo de sinalização anti-EGFR é C225 ou EMD55900.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 3, na qual o imu-nopeptídeo de sinalização anti-IL-13 é slL-13Rcc2-Fc.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 1, na qual o inibi-dor do caminho de sinalização de EGFR é um ácido nucléico anti-sentidoque reduz a expressão de EGF ou EGFR.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 1, na qual o inibi-dor do caminho de sinalização de IL-13 é um ácido nucléico anti-sentido quereduz a expressão de IL-13, IL-13R ou IL-4R.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 1, na qual o ini-bidor do caminho de sinalização de EGFR é um inibidor de tirosina quinase.

11. Composição, de acordo com a reivindicação 10, na qual oinibidor de tirosina quinase é PD153035, EKB-569, 4-(3-cloroanilino)-6;7-dime-toxiquinazolina, RG-14620; Tirfostina 23, Tirfostina 25, Tirfostina 46, Tirfosti-na 47, ou Tirfostina 51.

12. Composição, de acordo com a reivindicação 1, na qual o ini-bidor do caminho de sinalização de EGFR ou do caminho de sinalização deIL-13 é um inibidor específico de PI3K.

13. Composição, de acordo com a reivindicação 12, na qual oinibidor de PI3K é LY294002.

14. Composição, de acordo com a reivindicação 1, na qual o ini-bidor do caminho de sinalização de IL-13 é um PD98059 ou LY294002.

15. Processo de tratamento de hipersecreção das vias aéreasem um indivíduo, processo este que compreende administrar um inibidor docaminho de sinalização de EGFR e um inibidor do caminho de sinalizaçãode IL-13.

16. Processo, de acordo com a reivindicação 15, no qual o inibi-dor do caminho de sinalização de EGFR e o inibidor do caminho de sinaliza-ção de IL-13 são administrados simultaneamente.

17. Processo, de acordo com a reivindicação 15, no qual o inibi-dor do caminho de sinalização de EGFR e o inibidor do caminho de sinaliza-ção de IL-13 são administrados simultaneamente como a composição comodefinido na reivindicação 1.

18. Processo, de acordo com a reivindicação 15, no qual pelomenos um inibidor é um imunopeptídeo administrado em uma quantidade de(i) aproximadamente 0,05 mg a aproximadamente 2,5 mg; (ii) aproximada-mente 0,1 mg a aproximadamente 1 mg; ou (iii) aproximadamente 0,3 mg aaproximadamente 0,5 mg.

19. Processo, de acordo com a reivindicação 15, no qual pelomenos um inibidor é um inibidor anti-sentido administrado em uma quantida-de de (i) aproximadamente 10 μg/dia a aproximadamente 3 mg/dia; (ii) apro-ximadamente 30 μg/dia a aproximadamente 300 μg/dia; ou (iii) aproximada-mente 100 μg/dia.

20. Processo, de acordo com a reivindicação 15, no qual pelomenos um inibidor é um inibidor tirosina quinase administrado em uma quan-tidade de aproximadamente 0,1 μg a aproximadamente 100 mg por kg poradministração.

21. Processo, de acordo com a reivindicação 15, no qual os ini-bidores são administrados por injeção, inalação, oralmente, lipossomo, ouvetor retroviral.