KR20050106483A - 천식 또는 그 밖의 알러지성 또는 염증성 질환을 진단 및치료하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

천식 또는 그 밖의 알러지성 또는 염증성 질환을 진단 및치료하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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마이클 알. 보우먼
데브라 엘리스
맥시밀리안 티. 폴리티
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Abstract

본 발명은 천식 또는 그 밖의 알러지성 또는 염증성 질환을 진단 또는 치료하는데 유용한 조성물 및 방법을 제공한다. 한가지 관점에서, 본 발명의 방법은 천식 또는 그 밖의 알러지성 또는 염증성 질환에 걸린 조직에서 아르기닌 대사경로의 성분의 활성 또는 발현을 억제하는 것을 포함한다. 다수의 양태에서, 억제되는 성분은 양이온성 아미노산 트랜스포터, 아르기나제, 또는 아르기나제의 하류 성분이다. 그 밖의 다수의 양태에서, 이 성분의 활성 또는 발현은 이 성분에 결합하는 약제에 의해서 억제된다. 그 밖의 또 다른 양태에서, 이 성분의 활성 또는 발현은 이 성분을 암호화한 폴리뉴클레오티드를 결합시키는 약제에 의해서 억제된다.

Description

천식 또는 그 밖의 알러지성 또는 염증성 질환을 진단 및 치료하기 위한 조성물 및 방법{Compositions and methods for diagnosing and treating asthma or other allergic or inflammatory diseases}
본 발명은 천식 또는 그 밖의 알러지성 또는 염증성 질환을 진단 또는 치료하는데 유용한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
천식은 가역적인 기도 폐쇄 및 기도 과반응성(AHR)의 재발성 에피소드를 특징으로 하는 기도의 만성 염증성 질환이다. 전형적인 임상적 증상에는 생명에 위협적이거나 치명적이 될 수 있는 호흡의 짧음, 천명, 기침 및 흉부 압박감이 포함된다. 기존의 치료법들은 증상적 기관지경련 및 폐 염증을 감소시키는데 중점을 두고 있지만, 천식 환자에게서 가속화된 폐 변패에 있어서의 장기간의 기도 리모델링의 역할에 대한 인식이 증가하고 있다. 기도 리모델링은 상피 평활근 및 근섬유아세포 과형성 및/또는 이형성, 상피하 섬유증 및 매트릭스 침착을 포함한 다수의 병리학적 현상을 의미한다. 이 과정들은 총괄적으로 치명적인 천식의 경우에 약 300%까지의 기도 비후를 야기시킨다. 천식의 병태생리학을 밝히는데 있어서 상당한 진전이 이루어져 왔음에도 불구하고, 질환의 유병력, 이환율 및 사망율은 지난 20년 동안에 증가되어 왔다. 1995년에 미국에서만 거의 180만명의 응급실 방문자, 466,000명의 입원자 및 5,429명의 사망자가 직접적으로 천식에 기인한 것이었다.
일반적으로, 알러지성 천식은 공기매개 알러지원에 대한 부적합한 염증성 반응에 의해서 개시되는 것으로 받아들여지고 있다. 천식 환자의 폐는 림프구, 비만세포 및 호산구의 강력한 침윤을 나타낸다. 증거의 큰 집단은 이러한 면역반응이 TH2 사이토킨 프로필을 발현하는 CD4+ T-세포에 의해서 구동되는 것을 증명되었다. 천식의 한가지 쥐 모델은 오브알부민(OVA)에 대한 동물의 감작화에 이어서 OVA 챌린지의 기관내 전달을 수반한다. 이러한 과정은 마우스 폐에서 TH2 면역반응을 발생시키고, 상향조절된 혈청 IgE(아토피), 호산구증가증, 과도한 점액 분비 및 AHR을 포함하는 사람의 천식에서 나타나는 4가지 주된 병태생리학적 반응을 모사한다. 호염기구, 비만세포, 활성화된 T 세포 및 NK 세포에 의해서 발현된 사이토킨 IL-13은 마우스 폐에서 OVA에 대한 염증성 반응에 중심적 역할을 한다. 쥐 IL-13의 직접적인 폐 점적주입은 천식-관련된 병변의 4가지 모두를 유도하며, 반대로 가용성 IL-13 길항제(sIL-13Rα2-Fc)의 존재는 OVA-챌린지 유도된 잔모양 세포(goblet cell) 점액 합성 및 아세틸콜린에 대한 AHR 둘 다를 완전히 차단한다. 따라서, IL-13 매개된 시그날링은 천식-관련된 병태생리학적 표현형 4가지 모두를 유도하는데 충분하며, 마우스 모델에서 점액의 과분비 및 유도된 AHR에 필요하다.
생물학적 활성 IL-13은 저-친화성 결합쇄 IL-13Rα1에, 및 IL-4 시그날링 복합체의 공유 성분인 IL-4R 및 IL-13Rα1로 구성된 고-친화성 다량체성 복합체에 특이적으로 결합한다. 고-친화성 복합체는 단핵구-대식세포 집단, 호염기구, 호산구, 비만세포, 내피세포, 섬유아세포, 기도 평활근 및 기도 상피세포를 포함한 광범위한 종류의 세포 타입에서 발현된다. 기능적 수용체 복합체의 IL-13 매개된 연결은 JAK1 및 JAK2 또는 Tyk-2 키나제 및 IRS1/2 단백질의 포스포릴화 의존적 활성화를 야기시킨다. IL-13 경로 다단계의 활성화는 전사 활성화제 Stat6의 동원, 포스포릴화 및 궁극적인 핵 전위를 유발시킨다. 다수의 생리학적 연구는 Stat6-/- 공대립유전자에 대해서 동형접합성인 마우스에서 호산구 침윤, 점액 과분비 및 기도 과반응성을 포함하는 주된 병리학 관련된 표현형을 유도하는데 대한 폐 OVA-챌린지의 무능력을 입증한다. 최근의 유전자 연구는 IL-13의 특이적 사람 대립유전자 및 이의 시그날링 성분과 천식 및 아토피 사이의 연계성을 입증하였으며, 이는 사람 질환에서 이 경로의 결정적인 역할을 입증하는 것이다.
IL-13은 또한, 아직 규명되지 않은 생리학적 기능을 갖는 사람 및 마우스 둘 다에서 발현된 추가의 수용체 쇄, IL-13Rα2에 결합한다. 쥐의 IL-13Rα2는 IL-13Rα1에 비해서 대략 100-배 더 큰 친화성(0.5 내지 1.2 nM의 Kd)을 가지고 IL-13에 결합함으로써 강력한 가용성 IL-13 길항제인 sIL-13Rα2-Fc의 구성이 이루어지도록 한다. sIL-13Rα2-Fc는 주혈흡충증 유도된 간 섬유증 및 육아종 형성에 있어서의 IL-13의 역할을 입증하기 위한 다양한 질환 모델, 종양 면역 감시, 및 OVA-챌린지 천식 모델에서 길항제로서 사용되어 왔다.
만성 폐쇄성 폐질환(COPD)은 주로 폐기종 및 만성 기관지염과 연관된 기류 폐쇄를 기술하기 위해서 사용되는 포괄적 용어이다. 폐기종은 폐 내에서 폐포의 약화 및 파괴에 의한 비가역적인 폐 손상을 야기한다. 그 결과로, 폐 조직의 탄성은 소실되어 기도가 붕괴하고 기류의 폐쇄가 발생한다. 만성 기관지염은 폐 내의 더 작은 기도에서 시작하여 더 큰 기도로 점진적으로 진행하는 염증성 질환이다. 이것은 기도 내의 점액 및 기관지에서 세균 감염을 증가시키며, 이것은 다시 기류를 방해한다.
수천만의 미국인이 COPD에 걸려 있으며, 이것은 미국에서 심각한 건강상의 문제이다. 1998년의 우세한 연구는 300만 미국인이 폐기종을 갖는 것으로 진단되고, 900만명은 만성 기관지염에 걸렸음을 시사한다. COPD는 1998년에 미국에서 4번째의 주된 사망원인이고, 1998년에 112,584명의 사망예의 원인이다. COPD는 또한, 1998년에 산정된 668,362명의 병원 퇴원자들의 원인이 되었다.
천식 및 COPD에 대한 현재의 치료법에는 기관지확장제, 코르티코스테로이드 및 류코트리엔 억제제의 사용이 포함된다. 치료법들은 기관지를 확장시키고, 염증을 감소시키고, 거담을 촉진시키는 동일한 치료적 목표를 공유한다. 그러나, 이러한 치료법들의 대부분은 원치 않는 부작용을 포함하며, 일정 기간 동안 사용한 후에는 유효성을 상실한다. 추가로, 치료적 개입을 위한 단지 제한된 약제들만이 천식에서 나타나는 기도 리모델링 과정을 감소시키는데 유용하다. 따라서, 천식 및 COPD에 대한 분자적 이해의 증가에 대한 필요성 및 이들 복잡한 질환에 대항하기 위한 신규의 치료적 전략의 인식에 대한 필요성이 잔존한다.
발명의 요약
본 발명은 비-천식성 폐 조직에 비해서 천식성 폐 조직에서 상이하게 발현되는 다수의 유전자를 동정하는 것이다. 따라서, 동정된 유전자에는 양이온성 아미노산 트랜스포터 2 유전자(CAT2) 및 아르기나제 I형 유전자(ARG1)와 같은 아르기닌 대사경로의 구성원이 포함된다. 이들 유전자는 천식 또는 그 밖의 다른 알러지성 또는 염증성 질환을 치료하기 위한 잠재적인 약물 표적이다.
한가지 관점에서, 본 발명은 알러지성 또는 염증성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 알러지성 또는 염증성 질환을 갖는 포유동물에게 질환에 걸린 조직에서 아르기닌 대사경로의 성분의 활성 또는 발현을 억제하는 약제를 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 억제되는 성분은 일산화질소 신타제(NOS)는 아니다. 다수의 양태에서, 억제되는 성분은 아르기나제(예, 아르기나제 I형) 또는 그의 하위 단백질이다. 하위 단백질의 예로는 오르니틴 데카복실라제, 오르니틴 아미노트랜스퍼라제, 오르니틴 트랜스카바밀라제, 스페르미딘 신타제 및 스페르민 신타제가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 한가지 예에서는, 폴리아민의 생합성에 수반되는 S-아데노실메티오닌 데카복실라제도 또한 억제될 수 있다. 또 다른 양태에서, 억제되는 성분은 양이온성 아미노산 트랜스포터(예, 양이온성 아미노산 트랜스포터 2)이다.
본 발명에 따르는 알러지성 또는 염증성 질환에는 천식, 기도 과반응성, 만성 기도 리모델링, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 및 관절염이 포함되나, 이들로 제한되지 않는다. 아르기닌 대사에 있어서의 기능부전 또는 이상과 연관된 그 밖의 다른 질환도 또한 본 발명에 의해서 치료될 수 있다. 다수의 양태에서, 알러지성 또는 염증성 질환은 호흡기 질환이다. 본 발명의 치료제의 투여는 폐 조직에서 아르기닌 대사경로의 성분의 활성 또는 발현을 억제함으로써 질환과 연관된 증후를 개선하거나 제거한다.
본 발명에 적합한 치료제에는 RNA 간섭 또는 안티센스 메카니즘에 의해서 표적 성분의 발현을 억제할 수 있는 폴리뉴클레오티드, 표적 성분과 반응성인 항체, 표적 성분의 생물학적 기능의 억제제, 또는 표적 성분 또는 이를 암호화한 폴리뉴클레오티드(예, 3' 또는 5' 비해독 조절서열을 포함하는 mRNA 또는 게놈 서열)에 결합할 수 있는 그 밖의 조절제가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 다수의 양태에서, 활성 또는 발현은 전사시, 전사-후, 해독시, 또는 해독-후 수준에서 억제된다. 그 밖의 다른 다수의 양태에서, 억제성 약제는 원래의 활성 또는 발현 수준에 비해서 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상까지 표적 성분의 활성 또는 발현을 감소시킬 수 있다.
한가지 양태에서, 본 발명의 치료제는 CAT2, ARG1 또는 아르기나제의 하위 성분을 암호화하는 그 밖의 다른 유전자에 대해 지향되는 siRNA 서열을 암호화하거나 포함한다. 또 다른 양태에서, 치료제는 유전자요법 벡터로부터 발현된다. 다수의 예에서, 유전자요법 벡터는 조직- 또는 세포-특이적 프로모터의 조절하에 있다. 한가지 예에서, 프로모터는 폐 특이적이다. 폐-특이적 프로모터의 예로는 폐 상피세포-특이적 계면활성제 단백질 B 유전자 프로모터 및 클라라(Clara) 세포-특이적 프로모터 CC10이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 또 다른 예에서, 프로모터는 단핵구 또는 대식세포 특이적이다. 대식세포-특이적 프로모터의 예로는 사람 아세틸-LDL 수용체(SRA) 유전자의 근위 프로모터 및 문헌[참조: Ross et al., J. Biol. Chem., 273:6662-6669, 1998]에 기술된 것이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
또한, 또 다른 양태에서, 본 발명의 치료제는 라이신, 폴리-L-라이신, 폴리-L-아르기닌, 또는 양이온성 아미노산 트랜스포터를 억제할 수 있는 그밖의 양이온성 폴리펩티드로부터 선택된다. 추가의 양태에서, 치료제는 오르니틴 데카복실라제의 기능을 억제하는 α-디플루오로메틸오르니틴이다. 추가의 또 다른 양태에서, 치료제는 IL-13 길항제 또는 길항적 항-IL-13 항체이다. 한가지 예로서, 치료제는 가용성 IL-13 수용체이다.
본 발명의 치료제는 그들의 목적하는 투여 경로에 적합하도록 제형화될 수 있다. 투여 경로의 예로는 비경구, 장내, 및 국소 투여가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 예를 들어, 본 발명의 치료제는 피부내, 표피, 흡입, 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 근육내, 피하, 진피내, 경피, 점막내 또는 그 밖의 다른 적합한 경로를 통해서 투여될 수 있다. 한가지 양태에서, 치료제는 흡입을 통해 투여된다. 예를 들어, 치료제는 적합한 추진제(예, 이산화탄소)를 함유하는 가압 용기 또는 디스펜서, 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이의 형태로 전달될 수 있다.
한가지 양태에서, 치료할 동물은 천식 또는 또 다른 알러지성 또는 염증성 질환을 갖는 사람이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 천식 또는 그 밖의 알러지성 또는 염증성 질환의 치료를 위한 약제를 동정하거나 평가하는데 유용한 방법을 제공한다. 이 방법은 후보 분자를 천식 또는 또 다른 알러지성 또는 염증성 질환에 걸린 조직과 접촉시키고, 후보 분자가 조직 내에서 질환 증후 또는 표현형을 개선하거나 제거할 수 있는지를 측정하는 단계를 포함한다. 후보 분자는 조직 내에서 아르기닌 대사경로의 비-NOS 성분의 활성 또는 발현을 억제한다. 비-NOS 성분의 예로는 아르기나제 또는 양이온성 아미노산 트랜스포터가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 조직에는 질환의 동물 모델 내의 조직/세포, 질환의 동물 모델로부터 단리된 조직/세포, 또는 질환에 걸린 조직/세포의 특정 관점(예, 발현 프로필)을 모사한 세포 배양물이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 한가지 예로서, 후보 분자의 치료적 효과는 사람 임상실험에 의해서 평가된다.
한가지 양태에서, 후보 분자는 구조-기본 이상적 약물 디자인을 기초로 하여 선택되거나 생성된다. 아르기닌 대사경로의 비-NOS 성분과 상호작용할 수 있는 분자를 동정한다. 그 후에 이들 분자를 천식 또는 그 밖의 알러지성 또는 염증성 질환에 걸린 조직과 접촉하도록 하여 이들이 질환 증후 또는 표현형을 개선하거나 제거할 수 있는지 여부를 측정한다. 또 다른 양태에서는, 약물 후보물질을 동정하기 위하여 고처리량 스크리닝 방법 또는 화합물 라이브러리가 사용된다.
본 발명은 또한, 천식 또는 그 밖의 알러지성 또는 염증성 질환을 검출, 진단 또는 모니터하는데 유용한 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 포유동물의 생물학적 샘플 내의 적어도 하나의 유전자의 발현 프로필을 검출하고, 이 발현 프로필을 유전자의 참조 발현 프로필과 비교하여 포유동물이 알러지성 또는 염증성 질환을 갖거나 이들에 대한 위험이 있는지 여부를 측정하는 단계를 포함한다. 다수의 경우에, 유전자는 아르기닌 대사경로의 비-NOS 성분을 암호화한다.
한가지 양태에서, 알러지성 또는 염증성 질환은 천식 또는 COPD이다. 생물학적 샘플은 폐 샘플일 수 있다. 점액, 혈액 또는 그 밖의 다른 유형의 샘플이 사용될 수도 있다. 또 다른 양태에서, 참조 발현 프로필은 질환이 없는 조직에서의 아르기닌 대사 유전자의 평균 발현 프로필이다. 참고 발현 프로필은 또한, 질환에 걸린 조직에서의 아르기닌 대사 유전자의 발현 프로필일 수도 있다. 또 다른 양태에서, 아르기닌 대사 유전자는 ARG1 또는 CAT2로부터 선택된다. 천식 또는 그 밖의 알러지성 또는 염증성 질환의 검출 또는 진단을 위해서 사용되는 물질이 키트 내에 포함될 수 있다.
또한, 또 다른 관점에서, 본 발명은 천식 또는 그 밖의 알러지성 또는 염증성 질환을 치료하는데 유용한 약제학적 조성물을 제공한다. 이 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체, 및 아르기닌 대사경로의 비-NOS 성분의 활성 또는 발현을 억제할 수 있는 약제의 치료적 유효량을 포함한다. 대부분의 양태에서, 약제는 비-NOS 성분, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 결합할 수 있다. 한가지 예에서, 비-NOS 성분은 ARG1 또는 CAT2에 의해서 암호화된다.
본 발명의 그 밖의 목적, 특징 및 이점은 이하의 상세한 설명으로부터 명백해 질 수 있다. 상세한 설명 및 구체적인 실시예는 바람직한 양태를 지적하고 있지만, 단지 설명을 위해서 제시된 것이며, 이는 본 발명의 범주 내에서의 다양한 변화 및 변형은 이러한 상세한 설명으로부터 당해 기술분야에서 숙련된 전문가에게 명백할 것이기 때문이다. 또한, 실시예는 본 발명의 원리를 설명하는 것이며, 명백하게 선행 기술분야 숙련가들에게 유용할 것인 감염의 모든 예에 대한 본 발명의 적용을 구체적으로 설명하는 것으로 예상되지는 않아야 한다.
도면은 제한이 아닌 설명을 위해서 제공된 것이다. 본 출원에는 2004년 3월 4일에 "천식 또는 그 밖의 알러지성 또는 염증성 질환을 진단 또는 치료하기 위한 조성물 및 방법"이라는 명칭으로 출원된 미국 특허원(Michael R. Bowman, et al.)의 도 1, 6, 8 및 9가 참조로서 인용된다.
도 1은 CAT2 및 아르기나제 I형(ARG1)이 알러지원(OVA) 및 재조합 쥐 IL-13(IL-13) 둘 다에 의해서 Balb/c 마우스에서 동시-유도되는 것을 나타내는 그래프이다. 간략하게는, Balb/c 마우스를 0일째에 OVA를 복강내 주사함으로써 OVA에 대해 감작화시키고, 14일 및 25일째에 비히클(포스페이트 완충된 식염수(PBS)) 또는 OVA를 기관내(IT) 주사함으로써 챌린지하고, 28일째에 폐를 수거하였다. 추가로, 비감작 Balb/c 마우스를 연속 3일 동안 PBS 또는 IL-13으로 IT 처리하고, 72시간 째에 폐를 수거하였다. 전체 폐 RNA를 분리하여, 실시예 1에 기술된 바와 같이 진칩(GeneChip) 기술(Affymetrix)을 사용하여 mRNA 발현에 대해 분석하였다. mRNA 빈도는 백만부당 부로 표현된다.
도 2는 ARG1 발현이 알러지원(OVA) 및 재조합 쥐 IL-13(IL-13) 둘 다에 의해서 Balb/c 마우스에서 유도되는 것을 나타내는 그래프이다. 간략하게는, Balb/c 마우스를 0일째에 OVA를 복강내 주사함으로써 OVA에 대해 감작화시키고, 14일 및 25일째에 비히클(포스페이트 완충된 식염수(PBS)) 또는 OVA를 기관내(IT) 주사함으로써 챌린지하고, 28일째에 폐를 수거하였다. 추가로, 비감작 Balb/c 마우스를 연속 3일 동안 PBS 또는 IL-13으로 IT 처리하고, 72시간 째에 폐를 수거하였다. 전체 폐 RNA를 분리하여, 실시예 1에 기술된 바와 같이 진칩 기술(Affymetrix)을 사용하여 mRNA 발현에 대해 분석하였다. mRNA 빈도는 백만부당 부로 표현된다.
도 3은 ARG1 유전자가 Balb/c 마우스에서 OVA, 또는 IL-13의 아데노바이러스-매개된 발현에 의해서 유도되는 것을 나타내는 그래프이다. 간략하게는, Balb/c 마우스를 0일째에 재조합 아데노바이러스 발현 쥐 IL-13 또는 쥐 분비된 알칼리성 포스파타제(SEAP)로 기관내 접종하고, 3일째에 폐를 수거하였다. 대조 마우스는 도 1에 기술된 바와 같이 PBS, OVA 또는 IL-13으로 처리하였다. mRNA 빈도는 백만부당 부로 표현된다.
도 4는 ARG1 유전자가 C57b1/6 마우스에서 IL-13의 아데노바이러스-매개된 발현에 의해서 유도되는 것을 나타내는 그래프이다. 간략하게는, C57b1/6 마우스를 0일째에 재조합 아데노바이러스 발현 쥐 IL-13 또는 쥐 분비된 알칼리성 포스파타제(SEAP)로 기관내 접종하고, 3일째에 폐를 수거하였다. mRNA 빈도는 백만부당 부로 표현된다.
도 5는 아르기닌 섭취가 쥐 대식세포주 RAW264.7에서 LPS/IL-13에 의해서 최적으로 유도되는 것을 나타내는 그래프이다. 간략하게는, RAW264.7 대식세포를 LPS 및/또는 IL-13으로 24시간 동안 처리함으로써 다양한 수준의 CAT2를 발현하도록 유도하였다. 경쟁적 L-라이신의 존재 또는 부재하에서의 아르기닌 수송을 실시예 3에 기술된 바와 같이 400μM의 최종 아르기닌 농도에서 3-분의 기간에 걸쳐서 평가하였다. 특이적 아르기닌 섭취(CPM/단백질 용해물의 ㎎)는 비-자극된 세포에서 측정된 것의 백분율로 표현된다.
도 6은 CAT2 및 ARG1이 쥐 대식세포주 RAW264.7에서 리포폴리사카라이드(LPS)/IL-13에 의해서 동시-유도되는 것을 나타내는 그래프이다. 간략하게는, RAW264.7 세포를 10ng/㎖의 IL-13 및/또는 1㎍/㎖의 LPS로 처리하였다. 처리한 지 24시간 후에 세포로부터 분리된 총 RNA를 실시예 2에 기술된 바와 같이 타크맨(TaqMan) 실시간 정량적 RT-PCR을 사용하여 ARG1 및 CAT 이소형-특이적 mRNA 발현에 대하여 분석하였다. 글루코즈-6-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH)-표준화된 mRNA 빈도는 문헌[참조: Fink et al., Nat. Medicine, 4:1329-1333, 1998]에 기재된 방법을 사용하여 역치 사이클 수로부터 산정하여 복제수/GAPDH의 복제로 표현하였다.
도 7은 아르기닌 섭취가 LPS/IL-13 처리된 RAW264.7 쥐 대식세포에서 20mM 라이신에 의해서 억제되는 것을 나타내는 그래프이다. 간략하게는, RAW264.7 세포를 24시간 동안, 매질 단독(대조군) 또는 CAT2-유도성 조건(LPS/IL-13)에 노출시킨 다음에, 100μM의 최종 아르기닌 농도에서 3-분의 기간에 걸쳐서 아르기닌 수송에 대하여 평가하였다. 수송 완충제에 대한 경쟁적 CAT 억제제인 20mM 라이신의 첨가는 대조군 및 LPS/IL-13 처리된 세포에서 포화가능한 아르기닌 수송 모두를 파괴시켰다.
도 8은 쥐 대식세포주 RAW264.7에서의 우레아 생성이 20mM 라이신에 의해서 억제되는 것을 나타내는 그래프이다. 간략하게는, 24시간 동안 매질 단독(대조군) 또는 CAT2-유도성 조건(LPS/IL-13)에 노출된 RAW264.7 대식세포를 그 후에 아르기닌 수송 완충제 내에서 2시간 동안 평형화시켰다. 400μM의 최종 아르기닌 농도를 함유하는 아르기닌 수송 완충제 내에서 경쟁적 L-라이신의 존재 또는 부재하에 24시간 동안 배양한 후에, 실시예 4에 기술된 바와 같이 우레아 생성을 평가하였다. 우레아 생성은 상등액 내의 우레아 ㎍/세포 용해물 단백질의 ㎎으로 표현된다.
도 9는 카바콜-유도된 랫트 기관 수축이 100mM 라이신에 의해서 억제되는 것을 나타내는 그래프이다. 간략하게는, 랫트 기관 외식편을 매질 또는 100mM L-라이신을 함유하는 매질과 함께 15 내지 20시간 동안 전배양하였다. 그 후, 기관을 세척하고, 수축을 100mM L-라이신의 존재 또는 부재하의 크렙스-헨셀라이트(Krebs-Henseleit) 용액 내에서 측정하였다. 장력은 장력의㎎/기관의㎎으로 계산하여, 최대 수축율 %(즉, 라이신의 부재하에서 10-5M 카바콜에 의해서 야기된 수축)의 평균치 및 표준오차로 표현된다.
도 10은 ARG1 발현의 유도는 IL-4 수용체를 필요로 한다는 것을 나타내는 그래프이다. 간략하게는, IL-4 수용체 녹아웃 마우스(IL4R-/-) 및 IL-4 녹아웃 마우스(IL4-/-)를 OVA에 대해서 감작화시키거나, 도 1에 기술된 바와 같이 PBS 또는 IL-13으로 처리하였다. 전체 폐 RNA를 분리하여, 실시예 1에 기술된 바와 같이 진칩 기술(Affymetrix)을 사용하여 mRNA 발현에 대해 분석하였다. mRNA 빈도는 백만부당 부로 표현된다.
도 11은 CAT-2 녹아웃 마우스에서의 기관 수축을 야생형 마우스에서의 기관 수축과 비교한 것이다. CATS2-KO는 CAT2 녹아웃 마우스를 나타낸다.
도 12는 ARG1 mRNA 발현이 rIL-13의 직접적인 폐 흡입 또는 기관내 오브알부민 알러지원 챌린지에 의해서 증가하는 것을 나타내는 그래프이다. sIL13Rα2.Fc의 투여에 의한 IL-13 시그날링의 차단은 유도된 Arg1 mRNA 발현의 67%를 억제한다. 가용성 수용체 sIL13Rα2.Fc를 사용한 IL-13의 차단은 알러지원 유도된 점액 생성 및 기도 과반응성(AHR)을 억제한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 천식 또는 그 밖의 알러지성 또는 염증성 질환의 진단 및 치료에 유용한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 한가지 관점에서, 본 발명의 방법은 천식 또는 그 밖의 알러지성 또는 염증성 질환을 앓고 있는 조직에서 아르기닌 대사경로의 성분의 활성 또는 발현을 억제하는 것을 포함한다. 다수의 양태에서, 억제되는 성분은 양이온성 아미노산 트랜스포터, 아르기나제, 또는 아르기나제의 하위 성분이다. 이들 성분의 활성 또는 발현의 억제는 질환에 걸린 조직에서 질환의 징후 또는 표현형을 감소시키거나 제거한다. 본 발명은 또한, 천식 또는 그 밖의 알러지성 또는 염증성 질환을 치료하기 위한 치료제를 동정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다양한 관점은 이하의 하부항목에서 더 상세하게 기술된다. 하부항목의 이용은 본 발명을 제한하는 것을 의미하지 않으며; 하부항목은 본 발명의 어떤 관점에도 적용할 수 있다. 본 출원에서, "또는"의 사용은 다른 식으로 언급되지 않는 한은 "및/또는"을 의미한다.
CAT2 , ARG1 및 염증성 질환
감작화된 마우스에서 기관내 OVA 챌린지는 사람 알러지성 천식의 몇가지 생리학적 특징을 모사한 폐에서 TH2 면역반응을 발생시킨다. 중요한 증거는 이러한 동물 질환 모델에서 IL-13 매개된 시그날 형질도입의 중추적 역할을 입증하여 왔다. 올리고뉴클레오티드 어레이(arrays)를 사용하여 기관내 OVA 챌린지 또는 IL-13의 직접적인 폐 점적주입에 의한 마우스 폐 조직에서의 전사 변화의 프로필을 작성하였다. 도 1-4에 나타낸 바와 같이, CAT2 및/또는 ARG1의 mRNA 빈도는 마우스를 OVA 또는 IL-13으로 처리한 경우에 유의적으로 증가하였다. 마찬가지로, CAT2 및 ARG1은 또한 리포폴리사카라이드(LPS) 및 IL-13의 배합물로 처리한 쥐 대식세포 RAW264.7에서 동시-유도된다(도 5 및 6). 유도된 CAT2 및 ARG1 발현은 아르기닌 수송의 증가(도 7) 뿐만 아니라 RAW264.7 세포에서의 우레아 생성의 증가(도 8)와도 연관되며, 이는 아르기닌 경로의 활성화를 시사한다. 추가의 연구에 의해, 아르기닌 섭취 및 우레아 생성의 증가가 CAT2의 경쟁적 억제제인 라이신을 사용하여 억제될 수 있음을 밝혀내었다(도 7 및 8). 또한, 카바콜-유도된 기관 수축은 라이신(도 9) 또는 CAT2 유전자의 유전적 결실(도 11)에 의해서도 억제되며, 이는 또한 염증성 질환의 병태생리학에 CAT2가 연루됨을 시사하는 것이다. 더구나, ARG1 발현의 유도는 도 10에서 입증되는 바와 같이 IL-4 수용체를 필요로 한다. 마지막으로, 가용성 IL13Rα2.Fc의 투여는 IL-13 시그날링을 차단하며, 이는 다시 ARG1 mRNA 발현을 억제한다.
아르기닌은 중요한 조절성 분자로 대사되는 반-필수 아미노산이다. 아르기닌은 단백질의 양이온성 아미노산 트랜스포터(CAT) 부류에 의해서 혈관 평활근 세포(SMC) 내로 수송되며, 여기서, 이것은 일산화질소(NO), 폴리아민 또는 프롤린으로 대사된다. 염증성 매개체, 성장인자 및 혈류역학적 힘은 CAT 유전자 발현을 유도함으로써 혈관 SMC에서 아르기닌의 수송을 촉진시킨다. 염증성 사이토킨은 또한, 유도성 NO 신타제(iNOS)의 발현을 유도하고, 항증식성 가스인 NO로의 아르기닌의 대사를 지시한다. 반대로, 순환의 기계적 변형은 iNOS 및 ODC 활성 둘다를 차단하며, 아르기닌 I 유전자 발현을 촉진시킴으로써 L-프롤린 및 콜라겐을 형성하는 아르기닌의 대사를 지시한다.
아르기닌을 재순환시킬 수 없는 비-간 조직에서, 상향조절된 CAT2 트랜스포터는 기질인 아르기닌의 충분한 공급과 함께 증가된 아르기나제 활성을 제공한다. 아르기나제 활성에 있어서의 이러한 증가는 염증성 질환에서 공통적으로 나타나는 섬유증, 기도 과반응성, 잔모양 세포 과형성, 산화성 스트레스 연관된 아폽토시스 및 기도 염증과 같은 병원성 과정에 대해 결정적인 생화학적 경로의 부분이다. 따라서, 아르기닌의 CAT2 수송의 억제는, 또한, 아르기나제를 이용하지만 기질로서 아르기닌을 재순환시킬 수 있는 간의 우레아 사이클은 유지시키면서 유도된 비-간 아르기나제 경로를 차단할 수 있다.
CAT2 의 생화학적 및 생물학적 특징
사람 CAT2(SLC7A2로도 또한 공지됨)의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 서열번호 1 및 2로 나타낸다. 쥐 CAT2의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 서열번호 3 및 4로 나타낸다.
사람 CAT2 cDNA(서열번호 1)은 사람 장 cDNA 라이브러리로부터 분리되었다. 암호화 영역의 뉴클레오티드 서열은 71,669의 계산된 분자량을 갖는 658-아미노산 단백질(서열번호 2)을 예상한다. 잔기의 91%가 마우스 CAT2의 것과 동일하기 때문에, 사람 CAT2는 마우스 CAT2의 사람 대응물인 것으로 보인다. 노던 블롯 분석에서는, 단일(9.0kb)의 사람 CAT2 mRNA 전사물이 다양한 조직에 존재하였다. 최고 수준의 발현은 골격근에서 관찰되었으며, 최저 수준은 신장에서 관찰되었다. 수치요법 플롯은 해독된 단백질이 3개의 잠재적인 N-글리코실화 부위를 갖는 14개의 트랜스막 도메인을 갖는 것으로 예상된다. 사람 CAT2 유전자는 사람 염색체 8p21.3-p22로 지정되었다.
게놈 기구의 분석은 사람 CAT2가 12개의 해독된 엑손 및 아마도 2개의 비해독된 엑손으로 구성되는 것을 밝혀내었다. CAT2 유전자는 상호 배타적인 교호성 스플라이싱(CAT2A에 대해서는 엑손 7 및 CAT2B에 대해서는 엑손 6)으로부터 유래하는 두개의 단백질 이소형 CAT2A 및 CAT2B를 암호화한다. 사람 CAT2 유전자 구조는 사람 CAT1의 구조와 밀접하게 연관되며, 이는, 이들이 공통 유전자 부류에 속함을 시사하는 것이다.
마우스에서, CAT2 유전자는 18kb의 공간에 걸쳐서 분산된 5개의 별개의 프로모터로부터 해독되며, 이는 별개의 프로모터에서의 전사 개시로 인하여 몇개의 별개의 CAT2 mRNA 이소형을 생성시킨다. 가장 원위의 프로모터에 인접한 이소형은 마우스 CAT2를 발현하는 것으로 이미 나타난 모든 조직 및 세포형에서 확인되는 반면에, 다른 5'UTR 이소형은 그들의 발현에서 더욱 조직 특이적이다. 5개의 추정상의 프로모터 중의 일부 또는 전부의 이용은 림프종 세포 클론, 간 및 골격근에서 입증되었다. TATA-함유 및 (G+C)-풍부 TATA-빈약 프로모터가 마우스 CAT2 유전자 발현을 조절하는 것으로 보인다. CAT2 mRNA의 다수의 이소형이 이러한 양이온성 아미노산 트랜스포터 유전자의 유연성이 있는 전자 조절을 허용하는 것으로 시사되었다.
CAT2는 암을 포함한 다양한 질환과 연관된 매우 반응성인 자유 라디칼인 NO의 생성에 중요한 역할을 하기 때문에, CAT2의 억제는 원치않는 수준의 NO를 특징으로 하는 질환에 대한 치료법으로 제안되어 왔다. 예를 들어, 맥레오드(MacLeod)의 미국특허 제5,866,123호에는 마우스 CAT2 단백질에 대항하여 야기된 항체에 의해서 CAT2 발현을 억제하는 방법이 기술되어 있다. 국제특허출원 WO 제00/44766호에는 또한, 안티센스 및 항체 기술 둘 다에 의해서 CAT2 발현을 억제하는 방법이 기술되어 있다.
ARG1 의 생화학적 및 생물학적 특징
사람 ARG1의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 서열번호 5 및 6으로 나타낸다. 쥐 ARG1의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 서열번호 7 및 8로 나타낸다.
아르기나제는 아르기닌을 오르니틴 및 우레아로 가수분해시키는 반응을 촉매한다. 포유동물 아르기나제는 그들의 조직 분포, 하위세포 국소화, 면역학적 교차반응성 및 생리학적 기능이 상이한 2개 이상의 이소형(I형 및 II형)이 존재한다. ARG1은 세포질 효소이며, 주로 간에서 우레아 사이클의 성분으로서 발현되는 I형 이소형태를 암호화한다. ARG1은 3개의 동일한 서브유니트의 삼량체로서 작용한다. 이 효소의 유전된 결핍은 고암모니아혈증을 특징으로 하는 상염색체성 열성 장애인 아르기닌혈증을 야기한다.
삼량체성 랫트 ARG1의 구조는 2.1-A 분할[참조: Kanyo et al., 383:554-55, 1996]에서 측정되었다. 구조의 핵심적 특징은 단량체간 접촉의 약 54%를 매개하는 단백질의 카복실 말단에서의 신규한 S-형 올리고머화 모티프이다. 이러한 올리고머화 모티프 내에 위치하는 Arg-308은 일련의 단량체내 및 단량체간 염 결합의 핵이 된다. 삼량체성 야생형 효소와는 반대로, 랫트 ARG1의 R308A, R308E 및 R308K 변이체는 겔 여과 및 분석용 초원심분리에 의해서 측정되는 바와 같이 단량체성 종으로 존재하며, 이는, Arg-308의 돌연변이가 삼량체 해리를 위한 평형을 적어도 105의 인수까지 이동시킴을 시사한다. 이들 단량체성 아르기나제 변이체는 촉매적으로 활성으로서 야생형 효소에 대한 값의 13 내지 17%의 kcat/Km값을 갖는다. 랫트 ARG1 변이체는 야생형 효소에 비해서 감소된 온도 안정성을 특징으로 한다. 사람 아르기나제와 L-아르기닌의 붕소산 동족체인 2(S)-아미노-6-보로노헥사노산(ABH) 사이의 복합체의 결정 구조는, 1.7 A 분할에서 측정되었다[참조: Cox et al., Nat. Strucu. Biol. 6: 1043-1047, 1999]. 돌연변이 분석으로, 또한, 아미노산 잔기 Lys-141, Glu-256, 및 Gly-235가 사람 ARG1의 기능에 대해 결정적임이 밝혀졌다.
사람 ARG1 유전자를 클로닝하여 구조를 측정하였다. 사람 ARG1 유전자는 길이가 11.5kb이며, 8개의 엑손으로 분할된다. 캡 부위는 뉴클레아제 S1 맵핑 및 프라이머 연장에 의해서 결정되었다. "TATA 박스 "-유사 서열은 캡 부위로부터 28 염기 상류에 위치하며, 전사 인자 CTF/NF1의 결합 부위와 유사한 서열인 "CAAT 박스"-결합 단백질은 72 염기 상류에 위치한다. 5' 말단 영역에는 글루코코르티코이드 반응성 요소와 유사한 서열, cAMP 반응성 요소, 및 인핸서 코어 서열들이 존재한다. -105 위치까지의 사람 ARG1 유전자의 바로 근접한 5' 플랭킹 부분은 랫트 유전자의 상응하는 절편과 84% 동일하다. 사람 ARG1 유전자의 이러한 영역에서, 하나의 DNase I-보호된 영역 및 몇개의 과민성 절단부위가 풋프린트(footprint) 분석에 의해서 검출되었다. 보호된 영역은 CTF/NF1의 결합부위와 유사한 서열을 함유하며, 또한 글루코코르티코이드 반응성 요소와 유사한 서열과 중첩된다.
아르기나제 활성을 측정하기 위해서 다수의 시험방법이 개발되어 왔다. 예를 들어, 그린버그(Greenberg)는 문헌[참조: P. Boyer, H. Lardy, and K. Myrback, Academic Press, NY, 257, 1960]에서 효소 4인 아르기나제에서의 효소적 시험을 기술하였다. 게이어(Geyer) 등은 조직 균질물 내에서의 아르기나제에 대한 시험을 기술하였다[참조: Geyer et al., Anal. Biochem. 39:412, 1971]. 니시베(Nishibe)와 마키노(Makino)는 적혈구 아르기나제에 대한 자동화된 시험방법을 보고하였다[참조: Nishibe et al., Anal. Biochem. 43:357, 1971]. 마이크로시험방법도 또한 기술되었다[참조: Hirsch-Kolb et al., Anal. Biochem. 35:60, 1970]. 대부분의 방법은 아르기닌의 가수분해 중에 방출된 우레아 질소의 비색측정을 기초로 하였다.
아르기나제의 과-발현은 대장암인 환자에게서 검출되었다[참조: Porembska et al., Cancer 94:2930-2934, 2002]. 증가된 아르기나제 활성은 cNOS-유도된 일산화질소의 알러지원-유도된 결핍 및 기도 과반응성과 연관되어 있다[참조: Meurs et al., Br. J. Pharmacol. 136:391-398, 2002].
아르기나제 활성의 억제
아르기나제 활성은 발린, 라이신, 로이신, 이소로이신, 프롤린 및 트레오닌과 같은 다수의 아미노산뿐만 아니라 L-카나바닌(Can) 및 L-오르니틴(Orn)과 같은 아르기닌 동족체 및 유도체에 의해서 억제될 수 있다. 이들 아미노산 은 모두 경쟁적 억제제로서 작용한다. 아르기나제에 의해서 촉매된 반응의 생성물인 오르니틴과 우레아도 또한 아르기나제의 경쟁적 억제제로서 작용한다. 생성물인 오르니틴과 우레아에 의한 경쟁적 억제는 효소에 대한 신속한-평형 랜덤 메카니즘을 시사하는 것이다.
아르기나제 활성은 이의 촉매적 작용이 더욱 엉성하게 결합된 Mn++을 첨가함으로써 촉진될 수 있는 단단히 결합된 Mn++과 연관되어 완전히 활성화된 효소 형태를 발생시킨다. 그러나, 아르기나제의 활성화에서 첨가된 이가 양이온에 대한 이러한 필요성에도 불구하고, EDTA 및 시트레이트와 같은 금속 킬레이트화제는 효소를 억제하지 않는다. 따라서, 금속 결합부위는 용매에 쉽게 영향을 받지 않는 것으로 보인다. 다른 한편으로, 아르기나제 활성은 S-쌍곡선 I-쌍곡선 비-경쟁적 억제제로서 작용하며 효소와 경쟁적 억제제인 L-오르니틴(Ki = 2+/-0.5mM), L-라이신(Ki = 2.5+/-0.4mM) 및 구아니디늄 클로라이드(Ki = 100+/-10mM)와의 상호작용에 영향을 미치지 않는 보레이트에 의해서 억제된다. 보레이트는 엉성하게 결합된 Mn++에 근접하게 결합하여 이의 촉진 작용을 방해하는 것으로 제안되었다. 보레이트 억제는 이핵성 Mn++ 중심에서 Mn++의 킬레이트화로부터 발생하며, 이로써 구아니디늄 탄소에 대한 친핵성 챌린지의 원인이 되는 금속-결합된 물 분자를 치환시키는 것으로 제안되었다[참조: Carvajal et al., J. Inorg. Biochem. 77: 163-167, 1999]. 그 밖의 다른 실험들도 또한, 보레이트와 우레아는 상호 배타적인 방식으로 결합하는 반면, L-오르니틴과 보레이트는 동시에 효소에 결합할 수 있음을 입증하고 있다.
랫트 간 아르기나제(RLA)에 의한 L-아르기닌(L-Arg)의 가수분해에 대한 N3 -, NO2 -, BO4 3 -, SCN-, -CH3COO-, SO4 2 -, ClO4 -, H2PO4 -, CN-, I-, Br-, Cl- 및 F-와 같은 음이온의 억제 효과가 연구되었다[참조: Pethe et al., J. Inorg. Biochem. 88:397-402, 2002]. 이들 모든 음이온들 중에서, 단지 F-만이 mM 수준에서 명백한 억제효과를 나타내었다. F-에 의한 RLA의 억제는 가역적이며, pH 7.4에서 1.3+/-0.5mM의 K(i)값을 가지고 L-Arg 결합에 대하여 비경쟁적이다. 이 효과는 RLA에 대한 F-의 IC50 값이 pH가 7에서 10으로 증가하는 경우에 1.2에서 1.9로 증가하는 바와 같이 pH에 대해 의존적이다. 또 다른 연구는 플루오라이드가 랫트 간 아르기나제의 비경쟁적 억제제임을 확인하였다. 이 연구는 또한, 플루오라이드가 4mM 이상의 기질 농도에서 랫트 간 아르기나제의 기질 억제를 야기하였음을 나타내었다[참조: Tormanen CD, J. Inorg. Biochem. 93:243-246, 2003].
N(오메가)-하이드록시-L-아르기닌(L-NOHA)은 지금까지 보고된 가장 강력한 아르기나제 억제제의 하나이다(Ki= 150μM). NO 신타제의 그 밖의 생성물은 효과가 없거나(NO2 -, NO3 -), 또는 아르기나제의 훨씬 더 약한 억제제(L-Cit 및 NO)이다. L-Arg(L-Orn 및 우레아) 또는 L-NOHA(L-Cit, 하이드록시우레아 및 하이드록실아민)의 가능한 가수분해로부터 유도된 생성물도 또한 2mM 이하의 농도에서 아르기나제에 대하여 불활성이다. L-NOHA의 배열은, D-NOHA가 훨씬 덜 활성이고, 이의 유리 -COOH 및 알파-NH2 작용기가 간 아르기나제의 인식을 위해서 필요하기 때문에 중요하다. L-NOHA는 또한, 랫트 간 균질물 및 쥐 대식세포의 아르기나제 활성의 강력한 억제제이다(각각 150 및 450μM의 IC50)[참조: Buga et al., Am. J. Physiol., 271:H1988-1998, 1996].
아르기나제의 또 다른 특이적 억제제인 N(오메가)-하이드록시-L-노르-아르기닌(노르-NOHA)는 비자극된 쥐 대식세포에 의해서 촉매된 L-아르기닌의 L-오르니틴으로의 가수분해를 억제하는데 있어서 L-NOHA보다 약 40-배 더 강력하다(각각 IC50 값 12+/-5 및 400+/-50μM). 인터페론-감마 및 리포폴리사카라이드(IFN-감마 + LPS)에 의한 쥐 대식세포의 자극은 유도성 NOS(iNOS)의 명백한 발현을 일으켜서 아르기나제 활성을 증가시킨다. 노르-NOHA도 또한, IFN-감마 + LPS-자극된 대식세포에서 아르기나제의 강력한 억제제이다(IC50 값 10+/-3μM). NOHA와는 반대로, 노르-NOHA는 기질도 아니고 iNOS에 대한 억제제도 아니며, 이는 아르기나제와 NOS 사이의 상호작용을 연구하는 유용한 도구인 것으로 보인다[참조: Tenu et al., Nitric Oxide, 3:427-438, 1999].
최근에 발견된 그 밖의 다른 아르기나제 억제제에는 다음의 것이 포함된다: 간 아르기나제 및 폐포 대식세포 내의 아르기나제 둘다를 억제하는 N 오메가-하이드록시-D,L-인도스피신 및 4-하이드록시아미디노-D,L-페닐알라닌[참조: Hey et al., Br. J. Pharmacol. 121:395-400, 1997]; 내부 항문 괄약근에서 아르기나제 활성을 억제하는데 있어서 L-NOHA보다 약 250배 더 강력한 것으로 확인된 2(S)-아미노-6-보로노헥산산(ABH)[참조: Baggio et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 290:1409-1416, 1999]; 및 통상적으로 특이적 오르니틴 데카복실라제 비가역적 억제제로서 사용될 뿐만 아니라, 완전 세포에서 아르기나제를 통한 L-아르기닌의 유출에 대한 억제성 효과를 나타내는 α-디플루오로메틸오르니틴(DFMO)[참조: Selamnia et al., Biochem. Pharmacol. 55:1241-1245, 1998]. 이들 아르기나제 억제제는 상승된 아르기나제 활성과 관련된 질환에서 중요한 병태생리학적 및 치료적 영향을 가질 수 있다.
아르기나제 활성의 직접 억제에 대한 대체방법은 아르기나제 활성 또는 아르기나제 발현의 활성화를 유도하는 시그날 형질도입 경로의 억제이다. 예를 들어, 상승된 아르기나제 활성과 관련된 병인은 IL-13 수용체(IL-13R)의 투여에 의해서 개선될 수 있다. 전술한 바와 같이, IL-13은 활성화된 TH2 세포에 의해서 주로 분비되는 면역조절성 사이토킨이다. 과거 수년에 걸쳐서, IL-13이 알러지성 염증의 병인에서 핵심적인 매개체인 것이 명백하게 되었다. 마우스에서, IL-13 매개된 시그날링은 4가지의 천식-관련된 병태생리학적 표현형 모두를 유도하기에 충분하며, 점액의 과분비 및 유도된 AHR에 필수적이다. 이펙터 분자로서의 IL-13의 중요성을 가정하면, 이의 수용체 수준에서의 조절은 IL-13 반응을 조절하고, 따라서 알러지성 반응의 전파하는데 중요한 메카니즘일 수도 있다.
IL-13은 IL-4와 공통적인 수용체 서브유니트, 즉 IL-4 수용체의 알파 서브유니트(IL-4Rα)를 공유한다. IL-13-결핍성 마우스, IL-4-결핍성 마우스, 및 IL-4 수용체 알파-결핍성(IL-4R(-/-)) 마우스의 특성화로 IL-13에 대한 비-중복성 역할을 증명하였다. IL-13은 IL-4Rα 및 2개의 IL-13 결합 단백질인 IL-13Rα1 및 IL-13Rα2로 이루어진 복잡한 수용체 시스템과 상호작용함으로써 이의 효과를 매개한다. IL-13 수용체는 사람 B 세포, 호염기구, 호산구, 비만세포, 내피세포, 섬유아세포, 단핵구, 대식세포, 호흡기 상피세포, 및 평활근 세포 상에서 발현된다.
그러나, 작용성 IL-13 수용체는 사람 또는 마우스 T 세포 상에서는 증명되지 않았다. IL-4와는 달리, IL-13은, CD4 T 세포가 TH2-형 세포로의 초기 분화에서 중요한 것으로 보이지 않으며, 오히려 알러지성 염증의 이펙터 상에서 중요한 것으로 보인다. 이러한 평가는, IL-13의 투여가 알러지성 염증을 일으키고, 형질도입된 마우스의 폐에서 IL-13의 조직-특이적 과발현이 기도 염증 및 점맥 과분비를 일으키며, IL-13 차단은 IL-4와는 독립적으로 알러지성 염증을 파괴시키고, IL-13은 점액 과분비에서 IL-4보다 더 중요한 것으로 보인다는 결과를 포함하는 다수의 생체내 관찰결과에 의해서 더 지지된다. 따라서, IL-13은 알러지성 장애에서의 약리학적 개입을 위한 매력적이고 신규한 치료적 표적이다. IL-13R의 투여는 IL-13 시그날링 경로를 잠재적으로 억제하거나 차단하기까지 할 수 있으며, IL-13-유도된 ARG1 발현을 예방하고, 천식-관련된 병리학을 개선시킬 수 있었다.
염증성 질환에 대한 마커로서의 ARG1 및 CAT2
본 발명은, CAT2 및 ARG1이 천식의 동물 모델의 폐 조직에서 과-발현됨을 확인하는 것이다. 따라서, 이들 유전자 또는 그들의 발현 생성물은 천식 또는 COPD와 같은 염증성 질환에 대한 마커로서 사용될 수 있다. 이들 유전자의 발현 수준은, 예를 들어 RT-PCR, 핵산 어레이, 또는 면역측정법을 사용하여 검출될 수 있다. 면역측정법 포맷의 예로는 라텍스 또는 그 밖의 입자 응집반응, 전기화학발광, ELISA, RIA, 샌드위치 또는 면역계측적 측정방법, 시간-분해 형광(time-resolved fluorescence), 측류 시험방법(lateral flow assays), 형광 편광, 유동 세포측정법(flow cytometry), 면역조직화학적 시험방법, 웨스턴 블롯 및 단백질체성 칩(proteomic chips)이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. CAT2 및 ARG1 단백질 또는 mRNA 수준은 체액 또는 조직 샘플 내에서 검출될 수 있다.
마커를 사용하여 특정의 피검체 샘플 내에서 진단 또는 예후 정보를 제공하거나, 염증성 질환의 처리 또는 치료의 효능을 평가할 수 있다. 예를 들어, 질환 진행의 상이한 단계에서 CAT2 및 ARG1의 발현 수준의 비교는 생존을 포함한 장기간 예후를 예측하기 위한 방법을 제공한다. CAT2 및 ARG1 유전자 다형성은 또한 염증성 질환에 대한 피검체의 감수성을 나타낼 수도 있다.
또 다른 예로서는, 특정 약물이 특정 환자에게서 장기간 예후를 개선하도록 작용할 수 있는지 여부를 포함하여 특정의 치료 방식의 효능이 평가될 수 있다. 천식, COPD 및 관절염은 임상적 증상이 다양하고 가변적인 복잡한 질환이다. 환자들은 질병 과정 및 이용가능한 치료법에 대한 반응 둘 다에 관하여 가지각색이며, 이들 변화는 대개 질환의 유형에서 차이를 반영한다. 따라서, 본 발명의 부가된 유용성은 치료 과정에 가장 반응하기 쉬운 환자를 동정하는 방법을 제공하는 것이다.
초기 분화 발현분석은 마우스 모델에서 수행되었지만, 동물에서 질환을 유도하는 기능부전 유전자가 사람에게서 기능부전인 경우에도 사람에게서 유사한 증후를 유도할 수 있다는 것은 익히 공지되고 있다. 따라서, 본 발명이 사람 CAT2 및 ARG1 유전자를 구체적으로 포함하는 것은 본 발명에서 구체적으로 목적으로 하며, 이해되는 것이다. 다른 유기체로부터 유래하는 CAT2 및 ARG1 동족체도 천식, COPD 또는 그 밖의 염증성 질환의 연구를 위한 동물 모델의 사용에서 유용할 수 있다. 다른 유기체로부터 유래하는 ARG1 및 CAT2 동족체는 당해 기술분야에서 공지된 어떠한 방법을 사용하여서도 수득될 수 있다.
CAT2 또는 ARG1 활성의 억제에 의한 염증성 질환의 치료
CAT2 또는 ARG1 게놈 서열, 프로모터, 엑손, 인트론, RNA 전사체, 또는 암호화된 단백질은 처리 또는 치료제를 위한 표적일 수 있다. 이들은 또한, CAT2 및/또는 ARG1 발현 또는 CAT2 및/또는 ARG1 단백질 활성을 억제하는 유전자요법 벡터를 생성하는데 사용될 수 있다.
메카니즘에 대한 제한이 없이, 본 발명은, 부분적으로 CAT2 및/또는 ARG1 발현 또는 활성의 억제가 천식 또는 COPD와 같은 염증성 질환을 개선시킬 수 있다는 원리에 근거한다. CAT2 및/또는 ARG1 억제제는 또한, 섬유증, 기도 과반응성, 잔모양 세포 과형성, 기도 염증 및 산화성 스트레스를 치료하는데 효과적일 수 있다. 억제는 전사시, 전사-후, 해독시 또는 해독-후 수준에서 일어날 수 있다. 예를 들어, CAT2 또는 ARG1 프로모터 또는 mRNA는 각각, 전사 또는 해독을 억제하도록 표적화될 수 있다. 또한, 글리코실화 및 이량체화와 같은 CAT2 또는 ARG1 단백질의 해독-후 과정이 표적화될 수도 있다.
천식의 마우스 모델에서 CAT2 및 ARG1 발현 패턴의 발견으로 CAT2 및/또는 ARG1 발현 또는 CAT2 및/또는 ARG1 활성을 조절하는 것을 목표를 하는 시험약제를 스크리닝할 수 있다. 시험약제는 mRNA 또는 단백질 수준에서 CAT2 및/또는 ARG1 발현에 대한 이들의 효과에 의해서, 또는 CAT2 및/또는 ARG1 유전자 생성물의 활성에 대한 이들의 효과에 의해서 스크리닝될 수 있다.
또 다른 양태에서, CAT2 및/또는 ARG1 발현 또는 CAT2 및/또는 ARG1 활성의 조절제는 천식, COPD 및 그 밖의 염증성 질환을 위한 치료제로서 사용될 수 있다. 조절제는 리보자임 또는 RNAi와 같은 폴리뉴클레오티드, 야생형 CAT2 및/또는 ARG1의 활성에 대한 우성의 음성효과를 갖는 CAT2 및/또는 ARG1 돌연변이체와 같은 폴리펩티드, 바이러스성 또는 비-바이러스성 유전자요법 벡터, 또는 CAT2 및/또는 ARG1 활성 또는 CAT2 및/또는 ARG1 유전자 발현을 억제할 수 있는 그 밖의 소분자 또는 생체분자일 수 있다. 이러한 조절제는 본 발명에서 사용하기 위한 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다.
프로브 , 프라이머 , 안티센스 및 RNAi 서열
본 발명의 한 관점은 생물학적 샘플 내에서 CAT2 또는 ARG1 유전자 생성물을 검출하거나 정량화하기 위한 폴리뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머에 관한 것이다. CAT2 또는 ARG1 프로브/프라이머는 CAT2 또는 ARG1 유전자의 어떤 부분으로부터도 유도될 수 있다. 이 프로브/프라이머는 목적하는 어떤 길이라도 가질 수 있다. 예를 들어, 프로브는 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 400개 또는 그 이상의 연속적 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 다수의 양태에서, 프로브는 엄격한 또는 고도로 엄격한 조건하에서 CAT2 또는 ARG1 유전자의 RNA 전사체, 또는 그의 보체에 하이브리드화할 수 있다.
다양한 하이브리드화의 엄격한 조건의 예는 표 1에 열거되어 있다. 고도로 엄격한 조건은 적어도 조건 A-F 만큼 엄격한 조건이며; 엄격한 조건은 적어도 조건 G-L 만큼 엄격하고; 감소된 엄격한 조건은 적어도 조건 M-R 만큼 엄격하다. 표 1에서 사용된 바와 같이, 하이브리드화는 약 2시간 동안 제시된 하이브리드화 조건하에서 수행되고, 이어서 상응하는 세척조건(들)하에서 2회의 15-분 세척을 수행한다.
엄격한 조건
엄격성조건 폴리뉴클레오티드 하이브리드 하이브리드 길이(bp)1 하이브리드화 온도 및 완충액H 세척 온도 및 완충액H
A DNA:DNA > 50 65℃; 1×SSC -또는-42℃; 1×SSC, 50% 포름아미드 65℃; 0.3×SSC
B DNA:DNA < 50 TB *; 1×SSC TB *; 1×SSC
C DNA:RNA > 50 67℃; 1×SSC -또는-45℃; 1×SSC, 50% 포름아미드 67℃; 0.3×SSC
D DNA:RNA < 50 TD *; 1×SSC TD *; 1×SSC
E RNA:RNA > 50 70℃; 1×SSC -또는-50℃; 1×SSC, 50% 포름아미드 70℃; 0.3×SSC
F RNA:RNA < 50 TF *; 1×SSC TF *; 1×SSC
G DNA:DNA > 50 65℃; 4×SSC -또는-42℃; 4×SSC, 50% 포름아미드 65℃; 1×SSC
H DNA:DNA < 50 TH *; 4×SSC TH *; 4×SSC
I DNA:RNA > 50 67℃; 4×SSC -또는-45℃; 4×SSC, 50% 포름아미드 67℃; 1×SSC
J DNA:RNA < 50 TJ *; 4×SSC TJ *; 4×SSC
K RNA:RNA > 50 70℃; 4×SSC -또는-50℃; 4×SSC, 50% 포름아미드 67℃; 1×SSC
L RNA:RNA < 50 TL *; 2×SSC TL *; 2×SSC
M DNA:DNA > 50 50℃; 4×SSC -또는-40℃; 6×SSC, 50% 포름아미드 50℃; 2×SSC
N DNA:DNA < 50 TN *; 6×SSC TN *; 6×SSC
O DNA:RNA > 50 55℃; 4×SSC -또는-42℃; 6×SSC, 50% 포름아미드 55℃; 2×SSC
P DNA:RNA < 50 TP *; 6×SSC TP *; 6×SSC
Q RNA:RNA > 50 60℃; 4×SSC -또는-45℃; 6×SSC, 50% 포름아미드 60℃; 2×SSC
R RNA:RNA < 50 TR *; 4×SSC TR *; 4×SSC
1: 하이브리드 길이는 하이브리드화 폴리뉴클레오티드의 하이브리드화된 영역(들)에 대해 예상되는 것이다. 폴리뉴클레오티드가 공지되지 않은 서열의 표적 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화하는 경우에, 하이브리드 길이는 하이브리드화 폴리뉴클레오티드의 길이인 것으로 여겨진다. 공지된 서열의 폴리뉴클레오티드가 하이브리드화된 경우에, 하이브리드 길이는 폴리뉴클레오티드의 서열을 정렬하고, 최적 서열 상보성의 영역 또는 부분들을 동정함으로써 측정될 수 있다.H: SSPE(1×SSPE는 0.15M NaCl, 10mM NaH2PO4 및 1.25mM EDTA, pH 7.4이다)가 하이브리드화 및 세척 완충액 내의 SSC(1×SSC는 0.15M NaCl 및 15mM 나트륨 시트레이트이다)에 대해 대체될 수 있다.TB * - TR *: 길이가 50 염기쌍 미만인 것으로 예상되는 하이브리드에 대한 하이브리드화 온도는 하이브리드의 융점(Tm)보다 5-10℃ 미만이어야 하며, 여기서, Tm은 다음의 식에 따라서 측정된다. 길이가 18 염기쌍 미만인 하이브리드의 경우에, Tm(℃)=2(A+T 염기수)+4(G+C 염기수)이다. 길이가 18 내지 49 염기쌍인 하이브리드의 경우에, Tm(℃)=81.5+16.6(log10Na+)+ 0.41(%G + C)-(600/N)이며, 여기서, N은 하이브리드 내의 염기의 수이고, Na+는 하이브리드화 완충액 내의 나트륨 이온의 몰농도이다(1×SSC에 대한 Na+=0.165 M).
본 발명의 또 다른 관점은 아미노산 잔기에서의 변화를 함유하는 CAT2 및 ARG1 돌연변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 이러한 돌연변이체는 야생형 CAT2 및 ARG1 단백질과 경쟁할 수 있으며, 야생형 CAT2 및 ARG1 단백질의 활성을 억제한다. 돌연변이체 CAT2 및 ARG1 유전자를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드 분자는 하나 이상의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실이 암호화된 단백질 내에 도입되도록 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 첨가 또는 결실을 도입시킴으로써 생성될 수 있다. 이러한 기술은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다. 돌연변이는 부위-지시된 돌연변이유발 및 PCR-매개된 돌연변이유발과 같은 표준기술에 의해서 CAT2 및 ARG1 유전자 내에 도입될 수 있다. 대체방법으로, 돌연변이는 포화 돌연변이유발과 같은 방법에 의해서 CAT2 및 ARG1 유전자 또는 cDNA의 암호화 서열의 전부 또는 일부를 따라서 무작위적으로 도입될 수 있으며, 생성된 돌연변이체는 야생형 단백질 활성을 억제할 수 있는 돌연변이체(우성 음성 돌연변이체)를 동정하기 위해서 생물학적 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. 돌연변이유발에 이어서 암호화된 단백질이 재조합적으로 발현될 수 있으며, 단백질의 활성이 측정될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 생체 내에서의 안정성을 증가시키기 위해서 더 변형될 수 있다. 가능한 변형에는 5' 및/또는 3' 말단에서 플랭킹 서열의 첨가; 골격 구조에서 포스포디에스테라제 결합보다는 포스포로티오에이트 또는 2-o-메틸의 사용; 및/또는 이노신, 쿠에오신 및 와이부토신과 같은 비통상적인 염기 및 아데닌, 시티딘, 구아닌, 티민 및 우리딘의 아세틸-, 메틸-, 티오- 및 그 밖의 변형된 형태의 봉입이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명의 또 다른 관점은 CAT2 또는 ARG1 유전자 또는 그들의 전사체에 대해 안티센스인 분리된 폴리뉴클레오티드 분자에 관한 것이다. "안티센스" 폴리뉴클레오티드는 단백질을 암호화하는 "센스" 폴리뉴클레오티드에 대해 상보적인, 예를 들어 이본쇄 cDNA 분자의 암호화 쇄에 대해 상보적이거나 mRNA 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 따라서, 안티센스 폴리뉴클레오티드는 센스 폴리뉴클레오티드와 수소 결합을 형성할 수 있다. 안티센스 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 CAT2 또는 ARG1 유전자의 전체 암호화 쇄에 대해서, 또는 단지 이의 일부분에 대해서 상보적일 수 있다. 한가지 양태에서, 안티센스 폴리뉴클레오티드 분자는 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 암호화 쇄의 "암호화 영역"에 대해 안티센스이다. 또 다른 양태에서, 안티센스 폴리뉴클레오티드 분자는 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 암호화 쇄의 "비암호화 영역"에 대해 안티센스이다.
본 발명의 안티센스 폴리뉴클레오티드는 왓슨과 크릭(Watson and Crick) 염기 짝지음의 규칙에 따라서 디자인될 수 있다. 안티센스 폴리뉴클레오티드 분자는 본 발명의 유전자에 상응하는 mRNA의 전체 암호화 부분에 대해 상보적일 수 있다. 이는 또한, 암호화 또는 비암호화 영역의 단지 일부분에 대해 안티센스인 올리고뉴클레오티드일 수도 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 길이가 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 안티센스 폴리뉴클레오티드는 당해 기술분야에서 공지된 절차를 사용하는 화학적 합성 및 효소적 연결반응을 사용하여 작제될 수 있다. 예를 들어, 안티센스 폴리뉴클레오티드(예, 안티센스 올리고뉴클레오티드)는 천연적으로 존재하는 뉴클레오티드, 또는 분자들의 생물학적 안정성을 증가시키거나, 안티센스 및 센스 폴리뉴클레오티드 사이에서 형성된 중복체의 물리적 안정성을 증가시키도록 디자인된 다양하게 변형된 뉴클레오티드를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있으며, 예를 들어 포스포로티오에이트 유도체 및 아크리딘 치환된 뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 안티센스 폴리뉴클레오티드를 생성시키기 위해서 사용될 수 있는 변형된 뉴클레오티드의 예로는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이포크산틴, 크산틴, 4-아세틸시토신, 5-(카복시하이드록시메틸)우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 베타-D-갈락토실쿠에오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실쿠에오신, 5'-메톡시카복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데노신, 우라실-5-옥시아세트산(v), 와이부톡소신, 슈도우라실, 쿠에오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 3-(3-아미노-3-N-2-카복시프로필)우라실, (acp3)w, 및 2,6-디아미노푸린이 포함된다. 대안으로, 안티센스 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드가 안티센스 배향으로 서브클로닝된 발현 벡터(즉, 삽입된 폴리뉴클레오티드로부터 전사된 RNA는 이하의 하부항목에서 더 기술되는 목적하는 표적 폴리뉴클레오티드에 대해서 안티센스 배향일 수 있다)를 사용하여 생물학적으로 생산될 수 있다.
본 발명의 안티센스 폴리뉴클레오티드 분자는 전형적으로, 이들이 CAT2 및 ARG1 단백질을 암호화하는 세포성 mRNA 및/또는 게놈성 DNA와 하이브리드화하거나 이에 결합하여 예를 들어, 전사 및/또는 해독을 억제함으로써 단백질의 발현을 억제하도록 피검체에게 투여되거나, 피검체 내에서 생성된다. 하이브리드화는 안정한 중복체를 형성하는 통상적인 뉴클레오티드 상보성에 의해서, 또는 예를 들어, DNA 중복체에 결합하는 안티센스 폴리뉴클레오티드 분자의 경우에는 이중 나선의 주된 그루브에서의 특이적 상호작용을 통해서 이루어질 수 있다. 본 발명의 안티센스 폴리뉴클레오티드 분자의 투여 경로의 예로는 조직 부위(예, 장 또는 혈액)에서의 직접 주사가 포함된다. 대안으로, 안티센스 폴리뉴클레오티드 분자는 선택된 세포를 표적으로 하도록 변형된 다음에 전신으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 전신 투여를 위해서 안티센스 분자는, 이들이 예를 들어, 세포 표면 수용체 또는 항원에 결합하는 펩티드 또는 항체에 안티센스 폴리뉴클레오티드 분자를 결합시킴으로써 선택된 세포 표면상에서 발현된 수용체 또는 항원에 특이적으로 결합하도록 변형될 수 있다. 안티센스 폴리뉴클레오티드 분자는 또한, 본원에 기술된 벡터를 사용하여 세포에 전달될 수도 있다. 안티센스 분자의 충분한 세포내 농도에 도달하기 위해서는, 안티센스 폴리뉴클레오티드 분자가 강력한 pol II 또는 pol III 프로모터의 조절하에 배치된 벡터 작제물이 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 관점은 α-아노머성 폴리뉴클레오티드 분자에 관한 것이다. α-아노머성 폴리뉴클레오티드 분자는 통상의 β-유니트와는 반대로 쇄가 서로 평행으로 주행하는 CAT2 및 ARG1 RNA를 갖는 특이적 이본쇄 하이브리드를 형성할 수 있다. α-아노머성 폴리뉴클레오티드 분자는 또한, 2-o-메틸리보뉴클레오티드 또는 키메라성 RNA-DNA 동족체를 포함할 수도 있다.
또 다른 양태에서, 분리된 폴리뉴클레오티드는 리보자임이다. 리보자임은, 이에 대해 상보적 부분을 갖는 mRNA와 같은 단일쇄 폴리뉴클레오티드를 절단할 수 있는 리보뉴클레아제 활성을 갖는 촉매적 RNA 분자이다. 따라서, 리보자임을 사용하여 CAT2 및/또는 ARG1 유전자의 mRNA 전사체를 촉매적으로 절단함으로써 상기의 mRNA의 해독을 억제할 수 있다. CAT2 및 ARG1 유전자에 대한 특이성을 갖는 리보자임은 CAT2 및 ARG1 유전자의 뉴클레오티드 서열을 기초로 디자인될 수 있다. CAT2 및 ARG1 유전자로부터 전사된 mRNA를 사용하여 RNA 분자의 풀(pool)로부터 특이적 리보뉴클레아제 활성을 갖는 촉매적 RNA를 선택할 수 있다. 대안으로, CAT2 및 ARG1 유전자의 발현은 이들 유전자의 조절영역(예, 프로모터 및/또는 인핸서)에 대해서 상보적인 뉴클레오티드 서열을 표적화된 세포에서 유전자의 전사를 예방하는 삼중나선 구조를 형성하도록 표적화시킴으로써 억제될 수 있다.
CAT2 및 ARG1 유전자의 발현은 또한, RNA 간섭(RNAi)을 사용하여 억제될 수도 있다. 이것은 표적 유전자 활성이 동족 이본쇄 RNA("dsRNA")에 의해서 특이적으로 파괴되는 전사-후 유전자 사일런싱("PTGS")을 위한 기술이다. 다수의 양태에서, 표적 유전자에 대해서 동족성인 약 21개의 뉴클레오티드의 dsRNA를 세포 내에 도입시키고, 유전자 활성에서의 서열 특이적인 감소를 관찰한다. RNA 간섭은 mRNA 수준에서 유전자 사일런싱의 메카니즘을 제공한다. 이는 치료적 목적뿐만 아니라 유전자 녹아웃을 위한 효율적이며 광범위하게 적용가능한 접근방법을 제공한다.
RNA 간섭에 의해서 유전자 발현을 억제할 수 있는 서열은 목적하는 어떤 길이라도 가질 수 있다. 예를 들어, 서열은 적어도 15, 20, 25개, 또는 그 이상의 연속적 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 서열은 dsRNA 또는 임의의 다른 유형의 폴리뉴클레오티드일 수 있지만, 단, 서열은 기능적 사일런싱 복합체를 형성하여 표적 mRNA 전사체를 분해할 수 있다.
한가지 양태에서, 서열은 짧은 간섭성 RNA(siRNA)를 포함하거나 이로 구성된다. siRNA는 예를 들어, 19-25개의 뉴클레오티드를 갖는 dsRNA일 수 있다. siRNA는 다이서(Dicer)라고 불리는 RNase III-관련된 뉴클레아제에 의한 더 긴 dsRNA 분자의 분해에 의해서 내인적으로 생산될 수 있다. siRNA는 또한, 외인적으로 또는 발현 작제물의 전사에 의해서 세포 내로 도입될 수 있다. 일단 형성되면, siRNA는 단백질 성분들에 의해서 RNA-유도된 사일런싱 복합체(RISC)로 공지된 엔도리보뉴클레아제-함유 복합체로 어셈블리된다. siRNA의 ATP-생성된 언와인딩(unwinding)은 RISC를 활성화시키며, 이는 다시 왓슨-크릭 염기-짝지음에 의해서 상보적 mRNA 전사체를 표적화함으로써 mRNA를 절단 및 파괴시킨다. mRNA의 절단은 siRNA 쇄에 의해서 결합된 영역의 중앙에 가깝게 일어난다. 이러한 서열-특이적 mRNA 분해는 유전자 사일런싱을 일으킨다.
siRNA-매개된 사일런싱을 달성하기 위해서는 두가지 이상의 방도가 사용될 수 있다. 첫째로, siRNA는 시험관 내에서 합성되고, 세포 내로 도입되어 일시적으로 유전자 발현을 억제할 수 있다. 합성 siRNA는 RNAi를 달성하는 용이하며 효율적인 방도를 제공한다. siRNA는 예를 들어, 대칭적 디뉴클레오티드 3' 오버행을 갖는 19개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있는, 짧은 혼합된 올리고뉴클레오티드의 중복체이다. 서열-특이적 유전자 사일런싱은 합성 21bp siRNA 중복체(예, 19 RNA 염기에 이어서 UU 또는 dTdT 3' 오버행)를 사용하여 포유동물 세포에서 달성될 수 있다. 이들 siRNA는, 다수의 단백질의 해독의 비-특이적 억제를 일으킬 수 있는 더 긴 dsRNA에 의한 DNA-의존성 단백질 키나제(PKR)의 활성화가 없이 포유동물 세포에서 표적화된 유전자 해독을 특이적으로 억제할 수 있다.
둘째로, siRNA는 벡터로부터 생체 내에서 발현될 수 있다. 이러한 접근방법을 사용하여 세포 또는 형질도입된 동물에서 siRNA를 안정적으로 발현시킬 수 있다. 한가지 양태에서, siRNA 발현 벡터는 폴리머라제 III(pol III) 전사 유니트로부터 siRNA 전사를 구동하도록 조작될 수 있다. Pol III 전사 유니트는, 헤어핀 모양의 siRNA에 대한 2bp 오버행(예, UU)의 첨가를 유도하는 짧은 AT 풍부 전사 종결부위를 배치시키기 때문에 헤어핀 모양의 siRNA 발현에 적합하며, 이러한 특징은 siRNA 기능에 도움을 주는 것이다. Pol III 발현 벡터를 사용하여 siRNA를 발현하는 형질도입 마우스를 발생시킬 수도 있다.
또 다른 양태에서, siRNA는 조직-특이적 방식으로 발현될 수 있다. 이러한 접근방법에 따라서, 긴 이본쇄 RNA(dsRNA)가 우선 선택된 세포주 또는 형질도입된 마우스의 핵에서 조직-특이적 프로모터로부터 발현된다. 긴 dsRNA는 핵 내에서(예, 다이서에 의해서) siRNA로 처리된다. siRNA는 핵으로부터 나와서 유전자-특이적 사일런싱을 매개한다. 유사한 접근방법을 조직-특이적 프로모터와 함께 사용하여 조직-특이적 녹다운 마우스를 발생시킬 수 있다. UU와 같은 임의의 3' 디뉴클레오티드 오버행이 siRNA 디자인을 위해서 사용될 수 있다. 일부의 경우에, 일본쇄 G 잔기에서 RNase에 의해서 절단되는 siRNA의 잠재성으로 인해서 오버행 내의 G 잔기는 회피된다. siRNA 서열 그 자체에 관하여, 30-50% GC 함량을 갖는 siRNA는 특정의 경우에 더 높은 G/C 함량을 갖는 것보다 더 활성일 수 있는 것으로 밝혀졌다. 더구나, 4-6 뉴클레오티드 폴리(T) 트랙트(tract)는 RNA pol III에 대한 종결 시그날로서 작용할 수 있기 때문에, 표적 서열에서 > 4 Ts 또는 As의 확장은, 서열을 RNA pol III 프로모터로부터 발현되도록 디자인할 때는 특정의 경우에 회피될 수 있다. 또한, mRNA의 일부의 영역들은 고도로 조직화되거나, 조절 단백질에 의해서 결합될 수 있다. 따라서, 이는 유전자 서열의 길이를 따라서 상이한 위치에서 siRNA 표적부위를 선택하는데 도움이 될 수 있다. 마지막으로, 잠재적 표적부위들을 적절한 게놈 데이타베이스(사람, 마우스, 랫트 등)와 비교할 수 있다. 다른 암호화 서열에 대해 동종성인 16-17개보다 많은 인접한 염기쌍을 갖는 임의의 표적 서열은 특정한 경우에는 고려대상으로부터 제외될 수 있다.
한가지 양태에서, siRNA는 짧은 스페이서 서열에 의해서 분리된 두개의 전화된 반복부를 가지고, 전사 종결부위로 작용하는 Ts의 스트링으로 종결하도록 디자인된다. 이 디자인은 짧은 헤어핀 모양의 siRNA로 폴딩될 것으로 예상되는 RNA 전사체를 생성시킨다. siRNA 표적 서열의 선택, 추정상의 헤어핀 모양의 스템(stem)을 암호화하는 전화된 반복체의 길이, 전화된 반복체의 순서, 헤어핀 모양의 루프를 암호화하는 스페이서 서열의 길이 및 조성, 및 5'-오버행의 존재 또는 부재는 목적하는 결과를 달성하도록 변화시킬 수 있다.
siRNA 표적은 AA 디뉴클레오티드를 위한 mRNA 서열을 스캐닝하고, AA 바로 하류의 19개의 뉴클레오티드를 기록함으로써 선택될 수 있다. siRNA 표적을 선택하기 위해서 그 밖의 다른 방법이 또한 사용될 수도 있다. 한가지 예로서, siRNA 표적 서열의 선택은, 표적 서열이 GG로 시작하고 BLAST 탐색에 의해서 분석되는 바와 같이 다른 유전자와 유의적인 서열 상동성을 공유하지 않는 한은, 순수하게 실험적으로 측정된다[참조: Sui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 5515-5520, 2002]. 또 다른 예로서는, 더 정교한 방법을 사용하여 siRNA 표적 서열을 선택한다. 이 절차는 내인성 mRNA 내의 임의의 접근가능한 부위에서라도 합성 올리고데옥시리보뉴클레오티드/RNase H 방법에 의한 분해에 대해서 표적화될 수 있다는 관찰결과를 이용한다[참조: Lee et al., Nature Biotechnol. 20: 500-505, 2002].
또 다른 양태에서, 헤어핀 모양의 siRNA 발현 카셋트(cassette)는 표적의 센스 쇄에 이어서 짧은 스페이서, 표적의 안티센스 쇄, 및 전사 종결자로서 5-6 Ts를 함유하도록 작제된다. siRNA 발현 작제물 내에서 센스 및 안티센스 쇄의 순서는 헤어핀 모양의 siRNA의 유전자 사일런싱 활성에 영향을 미치지 않으면서 변화될 수 있다. 특정의 경우에, 순서의 반전은 유전자 사일런싱 활성에서 부분적인 감소를 야기할 수 있다.
siRNA 발현 카셋트의 스템으로 사용될 뉴클레오티드 서열의 길이는 예를 들어, 19 내지 29의 범위일 수 있다. 루프 크기는 3 내지 23 뉴클레오티드의 범위일 수 있다. 그 밖의 다른 길이 및/또는 루프 크기가 사용될 수도 있다.
역시 또 다른 양태에서는, 헤어핀 모양의 siRNA 작제물에서 5' 오버행이 사용될 수 있지만, 단, 헤어핀 모양의 siRNA는 유전자 사일런싱에서 기능적이어야 한다. 한가지 예로서, 5' 오버행은 약 6개의 뉴클레오티드 잔기를 포함한다.
또 다른 양태에서, RNAi에 대한 표적 서열은 서열번호 1 및 5와 같은 CAT2 및 ARG1 암호화 서열로부터 선택된 약 21량체 서열 단편이다. 표적 서열은 ORF 영역 또는 비-ORF 영역으로부터 선택될 수 있다. 각각의 표적 서열의 5' 말단은 디뉴클레오티드 "NA"를 가지며, 여기서, "N"은 임의의 염기일 수 있으며, "A"는 아데닌을 나타낸다. 잔여 19량체 서열은 30% 내지 65% 사이의 GC 함량을 갖는다. 다수의 예에서, 잔여 19량체 서열은 4개의 연속적인 A 또는 T(즉, AAAA 또는 TTTT), 3개의 연속적인 G 또는 C(즉, GGG 또는 CCC), 또는 일렬로 7개의 "GC"중의 어떠한 것도 포함하지 않는다. 상술한 기준("느슨한 기준")을 사용하여 제조된 표적 서열의 예는 표 2에 예시되어 있다. 표 2에서 각각의 표적 서열은 서열번호 3n을 가지며, 상응하는 siRNA 센스 및 안티센스 쇄는 각각 서열번호 3n+1 및 서열번호 3n+2를 가지며, 여기서, n은 양의 정수이다. 각각의 CAT2 및 ARG1 암호화 서열(예를 들어, 각각 서열번호 1 및 5)에 대해서는 다수의 표적 서열이 선택될 수 있다.
추가의 기준이 RNAi 표적 서열 디자인을 위해서 사용될 수 있다. 한가지 예로서, 잔여 19량체 서열의 GC 함량은 35% 내지 55%로 제한되며, 3개의 연속적인 A 또는 T(즉, AAA 또는 TTT)를 갖는 19량체 서열 또는 5개 이상의 염기를 갖는 팔린드롬(palindrome) 서열은 배제된다. 또한, 19량체 서열은 다른 사람 유전자에 대하여 낮은 서열 상동성을 갖도록 선택될 수 있다. 한가지 양태에서, 잠재적 표적 서열은 BLASTIN에 의해서 NCBI의 사람 유니젠(UniGene) 집락 서열 데이타베이스에 대하여 탐색된다. 사람 유니젠 데이타베이스는 유전자-배향된 집락의 비-중복성 세트를 함유한다. 각각의 유니젠 집락은 독특한 유전자를 나타내는 서열을 포함한다. BLASTIN 탐색하에서 다른 사람 유전자에 대한 충돌을 발생시키지 않는 19량체 서열이 선택될 수 있다. 탐색 중에, e-값이 엄격한 값(예를 들어 "1")로 설정될 수 있다. 또한, 표적 서열은 ORF 영역으로부터 선택될 수 있으며, 개시 및 중지 코돈으로부터 적어도 75-bp이다. 이들 기준("엄격한 기준")을 사용하여 제조된 표적 서열의 예는 표 2에 나타내었다(서열번호 3n, 여기서, n은 양의 정수이다). 각각의 표적 서열(서열번호 3n)에 대한 siRNA 센스 및 안티센스 서열(각각 서열번호 3n+1 및 서열번호 3n+2)도 또한 제공된다.
RNAi 표적 서열 및 siRNA 서열
서열번호(암호화 서열) 느슨한 기준(표적: 서열번호 3n;siRNA 센스: 서열번호 3n+1;siRNA 안티센스: 서열번호 3n+2) 엄격한 기준(표적: 서열번호 3n;siRNA 센스: 서열번호 3n+1;siRNA 안티센스: 서열번호 3n+2)
서열번호 1 서열번호 9-725 서열번호 1,332-1,490
서열번호 4 서열번호 726-1,331 서열번호 1,410-1,517
siRNA 서열의 유효성은 당해 기술분야에서 공지된 다양한 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 siRNA 서열을 CAT2 또는 ARG1 유전자를 과-발현하는 세포 내로 도입시킬 수 있다. 세포 내에서의 CAT2 또는 ARG1의 폴리펩티드 또는 mRNA 수준이 검출될 수 있다. siRNA 서열의 도입 전후에 LRG의 발현 수준에서의 상당한 변화는 CAT2 또는 ARG1 유전자의 발현을 억제하는데 있어서의 siRNA 서열의 유효성을 나타내는 것이다. 한가지 예로서, siRNA 서열의 도입 전후에 그 밖의 다른 유전자의 발현 수준이 또한 모니터된다. CAT2 또는 ARG1 발현에 대하여 억제효과를 갖지만 다른 유전자의 발현에는 유의적인 영향을 미치지 않는 siRNA 서열이 선택될 수 있다. 또 다른 예로는, 다수의 siRNA 또는 그 밖의 다른 RNAi 서열을 동일한 표적 세포 내로 도입시킬 수 있다. 이들 siRNA 또는 RNAi 서열은 CAT2 또는 ARG1 유전자 발현을 유의적으로 억제하지만, 다른 유전자의 발현은 억제하지 않는다. 또 다른 예에서는, CAT2 또는 ARG1 유전자 및 그 밖의 다른 유전자 또는 유전자들 모두의 발현을 억제하는 siRNA 또는 그 밖의 다른 RNAi 서열이 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자가 예를 들어, 분자의 안정성, 하이브리드화 또는 용해도를 개선시키도록 염기 잔기, 당 잔기 또는 포스페이트 골격에서 변형될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 분자의 데옥시리보스 포스페이트 골격은 펩티드 폴리뉴클레오티드를 생성시키도록 변형될 수 있다. 본 발명에서 사용된 "펩티드 폴리뉴클레오티드" 또는 "PNA"는 데옥시리보스 포스페이트 골격이 슈도펩티드 골격에 의해서 대체되고 단지 4개의 천연 핵염기만이 보유되는 폴리뉴클레오티드 모사체, 예를 들어 DNA 모사체를 나타낸다. PNA의 중성 골격은 낮은 이온 강도의 조건하에서 DNA 및 RNA에 대한 특이적 하이브리드화를 허용하는 것으로 나타났다. PNA 올리고머의 합성은 표준 고체상 펩티드 합성 프로토콜을 사용하여 수행될 수 있다.
PNA는 치료적 및 진단적 적용분야에서 사용될 수 있다. 예를 들어, PNA는 예를 들어, 전사 또는 해독 정지를 유도하거나, 복제를 억제함으로써 CAT2 또는 ARG1 발현의 서열-특이적 억제를 위한 안티센스 약제로 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자의 PNA는 또한, 예를 들어 PNA-지시된 PCR 클램핑(clamping)에 의한 유전자 내의 단일 염기쌍 돌연변이의 분석에서 다른 효소(예, S1 뉴클레아제)와 함께 사용되는 경우에는 인공적 제한효소로서, 또는 DNA 서열분석 또는 하이브리드화를 위한 프로브 또는 프라이머로서 사용될 수도 있다.
또 다른 양태에서, PNA는 친유성 또는 그 밖의 다른 헬퍼 그룹을 PNA에 부착시키거나, PNA-DNA 키메라를 형성시키거나, 또는 리포좀 또는 당해 기술분야에서 공지된 약물 전달의 다른 기술을 사용함으로써(예를 들어, 이들의 안정성 또는 세포성 섭취를 증진시키도록) 변형될 수 있다. 예를 들어, PNA와 DNA의 유익한 특성을 결합시킬 수 있는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자의 PNA-DNA 키메라가 생성될 수 있다. 이러한 키메라는, PNA 부분이 높은 결합 친화성 및 특이성을 제공하면서 DNA 인식효소(예, DNA 폴리머라제)가 DNA 부분과 상호작용하도록 허용한다. PNA-DNA 키메라는 염기 적중, 핵염기들 사이의 결합의 수, 및 배향의 관점에서 선택된 적절한 길이의 링커를 사용하여 연결될 수 있다. PNA-DNA 키메라의 합성이 수행될 수 있다. 예를 들어, DNA 쇄는 표준 포스포르아미다이트 커플링 화학을 사용하여 고체 지지체 상에서 합성될 수 있으며, 변형된 뉴클레오시드 동족체, 예를 들어 5'-(4-메톡시트리틸)아미노-5'-데옥시티미딘 포스포르아미다이트가 PNA와 DNA의 5' 말단 사이에서 스페이서로 사용될 수 있다. 그 후, PNA 단량체를 단계적 방식으로 커플링하여 5'PNA 절편 및 3'DNA 절편을 갖는 키메라성 분자를 생성시킨다. 대안으로, 키메라성 분자는 5'DNA 절편과 3'PNA 절편을 사용하여 합성될 수 있다.
CAT2 및 ARG1 폴리펩티드
본 발명의 몇 개의 관점은 정상 CAT2 또는 ARG1 활성을 억제할 수 있는 돌연변이된 CAT2 및 ARG1 폴리펩티드, 및 항-CAT2 또는 항-ARG1 항체를 야기하는 면역원으로 사용하기에 적합한 폴리펩티드 단편에 관한 것이다. 한가지 양태에서, 돌연변이된 CAT2 및 ARG1 폴리펩티드(예, 우성-음성 돌연변이체)는 재조합 DNA 기술에 의해서 생성된다. 대안으로, 돌연변이된 CAT2 및 ARG1 폴리펩티드는 표준 펩티드 합성기술을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다.
본 발명은 또한, CAT2 또는 ARG1 폴리펩티드에 대한 길항제로서 작용하는 CAT2 또는 ARG1 폴리펩티드의 변이체에 관한 것이다. 한가지 양태에서는, CAT2 또는 ARG1 폴리펩티드의 길항제 또는 효능제가 치료적 약제로 사용된다. 예를 들어, CAT2 또는 ARG1 폴리펩티드의 길항제는 CAT2 또는 ARG1 단백질의 활성을 감소시킬 수 있으며, CAT2 또는 ARG1 단백질이 과-발현된 피검체에게서 염증성 질환을 개선시킬 수 있다. CAT2 또는 ARG1 폴리펩티드의 변이체는 돌연변이유발, 예를 들어 이산적 점돌연변이 또는 CAT2 또는 ARG1 유전자의 절단에 의해서 생성될 수 있다.
특정의 양태에서, CAT2 또는 ARG1 폴리펩티드의 길항제는 예를 들어, CAT2 또는 ARG1 폴리펩티드의 활성을 경쟁적으로 조절시킴으로써 CAT2 또는 ARG1 폴리펩티드의 천연적으로 존재하는 형태의 활성의 하나 이상을 억제할 수 있다. 따라서, 특이적 생물학적 효과는 제한된 기능의 변이체로 처리함으로써 유발될 수 있다.
CAT2 또는 ARG1 폴리펩티드 효능제로서, 또는 CAT2 또는 ARG1 폴리펩티드 길항제로서 작용하는 CAT2 또는 ARG1 폴리펩티드의 돌연변이체는 돌연변이체의 집합적 라이브러리를 스크리닝함으로써 동정될 수 있다. 특정의 양태에서, 이러한 변이체는 예를 들어, 본 발명의 치료적 단백질로서 사용될 수 있다. CAT2 또는 ARG1 폴리펩티드 변이체의 다채로운 라이브러리는 예를 들어, 잠재적인 CAT2 또는 ARG1 폴리펩티드 서열의 변성 셋트가 개개 폴리펩티드로, 또는 대안으로 그 안에 CAT2 또는 ARG1 폴리펩티드 서열의 셋트를 함유하는 (예를 들어, 파아지 디스플레이를 위한) 더 큰 융합 단백질의 셋트로서 발현가능하도록 합성 올리고뉴클레오티드를 유전자 서열에 효소적으로 연결시킴으로써 생산될 수 있다. 변성 올리고뉴클레오티드 서열로부터 잠재적인 CAT2 또는 ARG1 폴리펩티드의 라이브러리를 생성시키기 위해서 사용될 수 있는 다양한 방법이 있다. 변성 유전자 서열의 화학적 합성은 자동 DNA 합성기에서 수행될 수 있으며, 그 후에 합성 유전자를 적절한 발현 벡터 내에 연결시킨다. 유전자의 변성 셋트의 사용은 잠재적인 CAT2 또는 ARG1 폴리펩티드 서열의 목적하는 셋트를 암호화하는 서열 모두를 하나의 혼합물로 제공할 수 있도록 한다. 변성 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다.
또한, CAT2 또는 ARG1 유전자에 상응하는 단백질 암호화 서열 단편의 라이브러리를 사용하여 CAT2 또는 ARG1 폴리펩티드의 변이체를 스크리닝하고 이어서 선택하기 위한 CAT2 또는 ARG1 폴리펩티드 단편의 다채로운 집단을 생성시킬 수 있다. 한가지 양태에서, 암호화 서열 단편의 라이브러리는, CAT2 또는 ARG1 유전자-암호화 서열의 이본쇄 PCR 단편을 니킹(nicking)이 분자당 단지 대략 한번 일어나도록 하는 조건하에서 뉴클레아제로 처리하고, 이본쇄 DNA를 변성시키고, DNA를 복원시켜 다양한 니킹된 생성물로부터의 센스/안티센스 쌍을 포함할 수 있는 이본쇄 DNA를 형성시키고, S1 뉴클레아제 처리에 의해서 재형성된 중복체로부터 일본쇄 부분을 제거하고, 생성된 단편 라이브러리를 발현 벡터 내로 연결시킴으로써 생성될 수 있다. 이 방법에 의해, CAT2 또는 ARG1 폴리펩티드의 다양한 크기의 N-말단, C-말단 및 내부 단편을 암호화하는 발현 라이브러리가 유도될 수 있다.
점돌연변이 또는 절단에 의해서 만들어진 집합적 라이브러리의 유전자 생성물을 스크리닝하고, 선택된 특성을 갖는 유전자 생성물에 대해서 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 몇 가지 기술이 당해 기술분야에 공지되어 있다. 고-처리량 분석에 적용할 수 있는, 큰 유전자 라이브러리를 스크리닝하는 가장 광범위하게 사용되는 기술은 전형적으로 유전자 라이브러리를 복제가능한 발현 벡터에 클로닝하고, 생성된 벡터의 라이브러리로 적절한 세포를 형질전환시키고, 목적하는 활성의 검출이 이의 생성물이 검출되는 유전자를 암호화하는 벡터의 분리를 촉진시키는 조건하에서 집합적 유전자를 발현시키는 것을 포함한다. 라이브러리에서 기능적 돌연변이체의 빈도를 증진시키는 귀납적 앙상블 돌연변이유발(recursive ensemble mutagenesis; REM)을 스크리닝 방법과 함께 사용하여 CAT2 또는 ARG1 폴리펩티드 변이체를 동정할 수 있다[참조: Delgrave et al., Protein Engineering 6:327-331, 1993].
약 100개 미만의 아미노산, 일반적으로는 약 50개 미만의 아미노산을 갖는 CAT2 또는 ARG1 폴리펩티드의 일부분 또는 CAT2 또는 ARG1 폴리펩티드의 변이체는 또한, 당해 기술분야 숙련가에게 잘 공지된 기술을 사용하는 합성방법에 의해서 생성될 수도 있다. 예를 들어, 이러한 폴리펩티드는 성장하는 아미노산 쇄에 아미노산을 순차적으로 첨가하는 메리필드(Merrifield) 고체상 합성방법과 같은 시판중인 고체상 기술 중의 어떤 것이라도 사용하여 합성될 수 있다. 폴리펩티드의 자동화 합성을 위한 장치는 Perkin Elmer/Applied BioSystems Division(Foster City, Calif.)과 같은 공급자로부터 시판품을 이용할 수 있으며, 제조자의 지침에 따라서 작동될 수 있다.
단백질 억제제 또는 활성화제를 스크리닝하기 위한 방법 및 조성물은 당해 기술분야에서 공지되어 있다[참조: 본원에 참조로 인용된 미국특허 제4,980,281호, 제5,266,464호, 제5,688,635호 및 제5,877,007호].
항체
또 다른 관점에 따르면, CAT2 또는 ARG1 단백질에 대해 특이적인 항체가 제조될 수 있다. 다수의 양태에서, 본 발명의 항체는 105M-1 이상의 결합 친화성을 가지고 CAT2 또는 ARG1 단백질에 결합할 수 있다. 항체는 제한이 없이 모노클로날, 폴리클로날, 키메라성, 사람화된, scFv, Fv, Fab', Fab, 또는 F(ab')2일 수 있다.
전체-길이 CAT2 또는 ARG1 단백질이 사용될 수 있거나, 또는 대안으로 본 발명은 면역원으로 사용하기 위한 CAT2 또는 ARG1 단백질의 항원성 펩티드 단편을 제공한다. 다수의 양태에서, CAT2 또는 ARG1 단백질의 항원성 펩티드는 적어도 8개의 아미노산 잔기를 함유하며, 펩티드에 대항하여 야기된 항체가 CAT2 또는 ARG1 단백질과 특이적 면역 복합체를 형성하도록 CAT2 또는 ARG1 단백질의 에피토프를 포함한다. 그 밖의 다수의 양태에서, 항원성 펩티드는 적어도 8, 12, 16, 20개 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 포함한다.
면역원성 부분(에피토프)은 일반적으로 잘 공지된 기술을 사용하여 동정될 수 있다. 이러한 기술에는 항원-특이적 항체, 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과 반응하는 능력에 관하여 폴리펩티드를 스크리닝하는 것이 포함된다. 이러한 항혈청 및 항체는 본원에 기술된 바와 같이, 잘 공지된 기술을 사용하여 제조될 수 있다. CAT2 또는 ARG1 단백질의 에피토프는 실질적으로 (예를 들어, ELISA 및/또는 T-세포 반응성 시험에서) 전체-길이 폴리펩티드의 반응성보다 작지 않은 수준에서 이러한 항혈청 및/또는 T-세포와 반응하는 부분이다. 이러한 에피토프는 이러한 시험법에서는 전체-길이 폴리펩티드의 반응성과 유사하거나 그보다 더 큰 수준에서 반응할 수 있다. 이러한 스크리닝은 일반적으로 당해 기술분야 숙련가에게 잘 알려진 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드를 고체 지지체 상에 고정화시키고, 환자 혈청과 접촉시켜 혈청 내의 항체가 고정화된 폴리펩티드에 결합하도록 할 수 있다. 그 후, 결합되지 않은 혈청을 제거하고, 결합된 항체는 예를 들어, 125I-표지된 단백질 A를 사용하여 검출할 수 있다.
항원성 펩티드에 포함되는 에피토프의 예는 폴리펩티드의 표면 상에 위치하는 CAT2 또는 ARG1 단백질의 영역, 예를 들어 친수성 영역 및 높은 항원성을 갖는 영역이다.
CAT2 또는 ARG1 면역원(예, CAT2 또는 ARG1 단백질, 이의 단편, 또는 CAT2- 또는 ARG1-융합 단백질)은 일반적으로, 면역원으로 적합한 피검체(예, 토끼, 염소, 마우스 또는 그 밖의 다른 포유동물)를 면역시킴으로써 항체를 제조하기 위해서 사용된다. 적절한 면역원성 제제는 예를 들어, 재조합적으로 발현된 CAT2 또는 ARG1 면역원 또는 화학적으로 합성된 CAT2 또는 ARG1 면역원을 함유할 수 있다. 이 제제는 추가로, 프로인트(Freund) 완전 또는 불완전 아쥬반트와 같은 아쥬반트, 또는 유사한 면역촉진성 성분을 포함할 수 있다. 면역원성 제제에 의한 적합한 피검체의 면역화는 항-CAT2 또는 -ARG1 항체반응을 유도한다. 모노클로날 및 폴리클로날 항-CAT2 또는 -ARG1 항체를 제조, 분리 및 사용하는 기술은 당해 기술분야에서 잘 공지되어 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 관점은 모노클로날 또는 폴리클로날 항-CAT2 또는 -ARG1 항체에 관한 것이다. 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부분의 예로는, 항체를 펩신과 같은 효소로 처리함으로써 생성될 수 있는 F(ab) 및 F(ab')2 단편이 포함된다. 본 발명은 CAT2 또는 ARG1 단백질에 결합하는 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 제공한다.
면역된 피검체에서 항-CAT2 또는 -ARG1 항체 역가는 고정화된 CAT2 또는 ARG1 단백질 또는 CAT2 또는 ARG1 단백질의 단편을 사용하는 효소 결합된 면역흡착시험(ELISA)과 같은 표준 기술에 의해서 시간의 경과에 따라서 모니터될 수 있다. 필요한 경우에, CAT2 또는 ARG1 단백질에 대항하게 되는 항체 분자는 포유동물로부터(예, 혈액으로부터) 분리될 수 있으며, 단백질 A 크로마토그래피와 같은 잘 알려진 기술에 의해서 더 정제되어 IgG 분획을 수득할 수 있다. 면역화시킨 후의 적절한 시점에, 예를 들어 항-CAT2 또는 -ARG1 항체 역가가 최고일 때, 항체-생성 세포를 피검체로부터 수득하고 하이브리도마 기술, 사람 B 세포 하이브리도마 기술, EBV-하이브리도마 기술 또는 트리오마 기술과 같은 표준 기술에 의해서 모노클로날 항체를 제조하기 위해서 사용할 수 있다. 모노클로날 항체 하이브리도마를 생성시키는 기술은 잘 알려져 있다.
림프구와 불멸화된 세포주를 융합시키기 위해서 사용되는 다수의 잘 알려진 프로토콜 중의 어떤 것이라도 항-CAT2 또는 -ARG1 모노클로날 항체를 생성시킬 목적으로 적용될 수 있다. 일반적으로, 불멸성 세포주(예, 골수종 세포주)은 림프구와 동일한 포유동물 종으로부터 유도된다. 예를 들어, 쥐 하이브리도마는 본 발명의 면역원성 제제로 면역된 마우스로부터 유래하는 림프구와 불멸화된 마우스 세포주를 융합시킴으로써 제조될 수 있다. 불멸성 세포주의 예로는 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 함유하는 배양배지("HAT 배지")에 대해 민감한 마우스 골수종 세포주가 포함된다. 다수의 골수종 세포주, 예를 들어 P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 또는 Sp210-Ag14 골수종 라인 중의 어떤 것이라도 표준 기술에 따라 융합 파트너로서 사용될 수 있다. 이들 골수종 라인은 ATCC로부터 입수할 수 있다. 일반적으로, HAT-민감성 마우스 골수종 세포는 폴리에틸렌 글리콜("PEG")을 사용하여 마우스 비장세포에 융합된다. 그 후, 융합으로부터 생성된 하이브리도마 세포는 비융합 및 비증식성 융합된 골수종 세포를 사멸시키는 (비융합된 비세포는 형질전환되지 않았기 때문에 수일 후에 사멸한다) HAT 배지를 사용하여 선택된다. 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는 예를 들어, 표준 ELISA 시험방법을 사용하여, 하이브리도마 배양 상등액을 특이적으로 CAT2 또는 ARG1 폴리펩티드에 결합하는 항체에 대하여 스크리닝함으로써 검출된다.
모노클로날 항체-분비성 하이브리도마를 제조하는 것의 대안으로는, CAT2 또는 ARG1 단백질을 갖는 재조합 집합적 면역글로불린 라이브러리(예, 항체상 디스플레이 라이브러리)를 스크리닝함으로써 CAT2 또는 ARG1 단백질에 결합하는 면역글로불린 라이브러리 구성원을 분리시켜 모노클로날 항-CAT2 또는 -ARG1 항체를 동정 및 분리시킬 수 있다. 파아지 디스플레이 라이브러리를 생성 및 스크리닝하기 위한 키트는 시판품을 이용할 수 있다[참조: the Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01; 및 the Stratagene SurfZAP™ Phage Display Kit, Catalog No. 240612].
항-CAT2 또는 -ARG1 항체는 또한 "단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편을 포함한다. scFv 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 여기서, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 추가로, VH 및 VL 영역 사이에 scFv가 항원 결합을 위한 목적하는 구조를 형성시키도록 할 수 있는 폴리펩티드 링커를 포함한다.
추가로, 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있으며, 사람 및 비-사람 부분 모두를 포함하는 키메라성 및 사람화된 모노클로날 항체와 같은 재조합 항-CAT2 또는 -ARG1 항체가 본 발명의 범주 내에 포함된다. 이러한 키메라성 및 사람화된 모노클로날 항체는 당해 기술분야에서 공지된 재조합 DNA 기술에 의해서 생산될 수 있다.
사람화된 항체는 사람 피검체의 치료적 처리에 바람직할 수 있다. 비-사람(예, 쥐) 항체의 사람화된 형태는 비-사람 면역글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 함유하는 면역글로불린의 키메라성 분자, 면역글로불린 쇄 또는 이의 단편(예, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 그 밖의 항원-결합성 서브서열)이다. 사람화된 항체에는 수용주의 상보적 결정화 영역(CDR)을 형성하는 잔기가 목적하는 특이성, 친화성 및 용량을 갖는 마우스, 랫트 또는 토끼와 같은 비-사람 종(공여주 항체)의 CDR로부터 유래하는 잔기에 의해서 대체된 사람 면역글로불린(수용주 항체)이 포함된다. 일부의 예에서, 사람 면역글로불린의 Fv 외곽구조 잔기는 상응하는 비-사람 잔기에 의해서 대체된다. 사람화된 항체는 또한, 수용주 항체 내에서도, 수입된 CDR 또는 외곽구조 서열 내에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 사람화된 항체는 적어도 하나, 일반적으로 두개의 가변적 도메인을 실질적으로 모두 포함할 수 있으며, 여기서, CDR 영역의 모두 또는 실질적으로 모두는 비-사람 면역글로불린의 부분에 상응하며, 불변영역의 모두 또는 실질적으로 모두는 사람 면역글로불린과 공통 서열이다. 사람화된 항체는 또한, 사람 면역글로불린의 불변영역과 같은 면역글로불린 불변영역(Fc)의 적어도 일부분을 포함할 수 있다.
이러한 사람화된 항체는 내인성 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현할 수 없지만 사람 중쇄 및 경쇄 유전자는 발현할 수 있는, 형질도입된 마우스를 사용하여 생산될 수 있다. 형질도입된 마우스는 선택된 항원, 예를 들어 CAT2 또는 ARG1 단백질의 전부 또는 일부분을 사용하여 표준 방식으로 면역된다. 항원에 대항하도록 지시된 모노클로날 항체는 통상적인 하이브리도마 기술을 사용하여 수득될 수 있다. 형질도입된 마우스에 의해서 제공된 사람 면역글로불린 형질도입된 유전자를 B 세포 분화 중에 재정렬하고, 이어서 클래스 스위치 및 체세포 돌연변이를 일으킨다. 따라서, 이러한 기술을 사용하여 치료적으로 유용한 IgG, IgA 및 IgE 항체를 생산할 수 있다.
선택된 에피토프를 인식하는 사람화된 항체는 "유도된 선택"으로 불리는 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 접근방법에서는, 선택된 비-사람 모노클로날 항체, 예를 들어 쥐 항체를 사용하여 동일한 에피토프를 인식하는 사람화된 항체를 선택하도록 유도한다.
한가지 양태에서, CAT2 또는 ARG1 단백질에 대한 항체는 CAT2 또는 ARG1 단백질의 생물학적 기능을 감소시키거나 제거할 수 있다. 대부분의 경우에, 활성에 있어서의 적어도 25% 감소가 수득될 수 있다. 그 밖의 다수의 경우에는 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상의 활성 감소가 성취될 수 있다.
항-CAT2 또는 -ARG1 항체를 사용하여 친화성 크로마토그래피 또는 면역침강법과 같은 표준 기술에 의해서 CAT2 또는 ARG1 단백질 또는 CAT2 또는 ARG1 단백질의 돌연변이체를 분리시킬 수 있다. 항-CAT2 또는 -ARG1 항체는 세포로부터의 천연 또는 돌연변이 CAT2 또는 ARG1 단백질 및 숙주 세포 내에서 발현된 재조합적으로 생산된 CAT2 또는 ARG1 단백질의 정제를 촉진시킬 수 있다. 추가로, 항-CAT2 또는 -ARG1 항체를 사용하여 CAT2 또는 ARG1 단백질의 발현의 풍부성 및 패턴을 평가하기 위해 (예를 들어, 세포 표면 상의 세포성 용해물 또는 세포 상등액에서) CAT2 또는 ARG1 단백질을 검출할 수 있다. 항-CAT2 또는 -ARG1 항체를 진단적으로 사용하여 예를 들어, 소정의 치료 방식의 효능을 측정하기 위한 임상적 시험절차의 일부로서 조직 내의 단백질 수준을 모니터할 수 있다. 검출은 항체를 검출가능한 물질에 커플링 (즉, 물리적으로 결합)시킴으로써 촉진될 수 있다. 검출가능한 물질의 예로는 다양한 효소, 보결 그룹, 형광성 물질, 발광성 물질, 생물발광성 물질, 및 방사성 물질이 포함된다. 적합한 효소의 예로는 호스래디쉬(horseradish) 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스테라제가 포함되며; 적합한 형광성 물질의 예로는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 댄실 클로라이드 또는 피코에리트린이 포함되고; 발광성 물질의 예로는 루미놀이 포함되며; 생물발광성 물질의 예로는 루시퍼라제, 루시페린, 및 에쿠오린이 포함되고; 적합한 방사성 물질의 예로는 125I, 131I, 35S 및 3H가 포함된다.
본 발명의 항-CAT2 또는 -ARG1 항체는 또한, 치료제를 상승된 CAT2 또는 ARG1 발현을 갖는 세포 또는 조직에 대하여 표적화시키는데 유용하다. 예를 들어, 소분자 CAT2 또는 ARG1 길항제와 같은 치료제는 치료제를 상승된 CAT2 또는 ARG1 발현을 갖는 세포 또는 조직에 대해 표적화시키기 위해 항-CAT2 또는 항-ARG1 항체에 결합시킬 수 있다.
치료제는 직접적으로 또는 간접적으로 (예를 들어, 링커 그룹을 통해서) 적합한 모노클로날 항체에 커플링(예를 들어, 공유적으로 결합)될 수 있다. 약제와 항체 사이의 직접적인 반응은 각각이 다른 것과 반응할 수 있는 치환체를 갖는 경우에 가능하다. 예를 들어, 어떤 하나 상의 아미노 또는 설프하이드릴 그룹과 같은 친핵성 그룹은 무수물 또는 산 할라이드와 같은 카보닐-함유 그룹과, 또는 다른 하나 상의 우수한 이탈 그룹(예, 할라이드)을 함유하는 알킬 그룹과 반응할 수 있다.
대안으로, 치료제와 항체는 링커 그룹을 통해서 커플링시키는 것이 바람직할 수 있다. 링커 그룹은 결합능력에 의한 간섭을 회피하기 위해 항체를 약제로부터 떼어 놓는 스페이서로 작용할 수 있다. 링커 그룹은 또한, 약제 또는 항체 상의 치환체의 화학적 반응성을 증가시키고, 따라서 커플링 효율성을 증가시키는 작용을 할 수도 있다. 화학적 반응성의 증가는 또한, 다른 식으로는 불가능할 수 있는 약제 또는 약제 상의 작용적 그룹의 사용을 용이하게 할 수 있다.
호모- 및 헤테로-작용성 둘 다인 다양한 이작용성 또는 다작용성 시약이 링커 그룹으로 사용될 수 있다는 것은 당해 기술분야 숙련가에게 명백할 것이다. 커플링은 예를 들어 아미노 그룹, 카복실 그룹, 설프하이드릴 그룹 또는 산화된 카보하이드레이트 잔기를 통해서 이루어질 수 있다. 여기에는 이러한 방법을 기술한 다수의 문헌, 예를 들어 미국특허 제4,671,958호(Rodwell et al.)가 있다.
치료제가 본 발명의 면역접합체의 항체 부분을 갖지 않을 때 더 강력한 경우에는, 세포 내로의 내부이행 중에, 또는 내면화 후에 절단할 수 있는 링커 그룹을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이들 링커 그룹으로부터 약제를 세포내 방출시키는 메카니즘에는 디설파이드 결합의 환원(예를 들어, 미국특허 제4,489,710호(Spitler)), 광불안정성 결합의 방사선 조사(예를 들어, 미국특허 제4,625,014호(Senter et al.)), 유도체화된 아미노산 측쇄의 가수분해(예를 들어, 미국특허 제4,638,045호(Kohn et al.)), 혈청 보체-매개된 가수분해(예를 들어, 미국특허 제4,671,958호(Rodwell et al.)), 및 산-촉매화된 가수분해(예를 들어, 미국특허 제4,569,789호(Blattler et al.))에 의한 절단이 포함된다.
하나 이상의 약제를 항체에 커플링시키는 것이 바람직할 수 있다. 하나의 양태에서는, 약제의 다수의 분자를 하나의 항체 분자에 커플링시킨다. 또 다른 양태에서는 한가지 유형 이상의 약제를 하나의 항체에 커플링시킬 수 있다. 특정의 구체예와는 무관하게, 하나 이상의 약제와의 면역접합체는 다양한 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 약제를 직접적으로 항체 분자에 커플링시킬 수 있거나, 다수의 부착 부위를 제공하는 링커가 사용될 수 있다.
벡터
본 발명의 또 다른 관점은 CAT2 및 ARG1 폴리펩티드 또는 그의 일부분을 암호화한 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터에 관한 것이다. 벡터는 플라스미드이거나 바이러스성 벡터일 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 원핵성 또는 진핵성 세포에서 CAT2 및 ARG1 폴리펩티드를 발현시키기 위해서 디자인될 수 있다. 예를 들어, CAT2 및 ARG1 폴리펩티드는 이. 콜라이(E. coli)와 같은 박테리아 세포, 곤충 세포(바큘로바이러스 발현 벡터를 사용), 효모 세포, 또는 포유동물 세포 내에서 발현될 수 있다. 특정의 양태에서는, 이러한 단백질을 예를 들어, 본 발명의 치료적 단백질로서 사용할 수 있다. 대안으로, 발현 벡터는 예를 들어, T7 프로모터 조절서열 및 T7 폴리머라제를 사용하여 시험관내에서 전사 및 해독될 수 있다.
또 다른 양태에서는, 조직-특이적 조절요소를 포함하는 포유동물 발현 벡터를 사용하여 목적하는 폴리뉴클레오티드를 발현시킨다. 조직-특이적 조절요소는 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 상피세포-특이적 프로모터를 포함할 수 있다. 적합한 조직-특이적 프로모터의 그 밖의 다른 비-제한적 예로는 간-특이적 알부민 프로모터, 림프구-특이적 프로모터, T 세포 수용체 및 면역글로불린의 프로모터, 뉴런-특이적 프로모터(예, 신경미세섬유 프로모터), 췌장-특이적 프로모터, 및 유선-특이적 프로모터(예, 유장(milk whey) 프로모터)가 포함된다. 발생적으로-조절된 프로모터, 예를 들어 α-페토단백질 프로모터도 또한 포함된다.
본 발명은 또한, 안티센스 배향으로 발현 벡터내에 클로닝된 CAT2 또는 ARG1 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 즉, DNA 분자는 본 발명의 CAT2 또는 ARG1 유전자에 상응하는 mRNA에 대해 안티센스인 RNA 분자의 (DNA 분자의 전사에 의한) 발현을 허용하는 방식으로 조절서열에 작동적으로 결합된다. 안티센스 배향으로 클로닝된 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 결합된 조절서열은 다양한 세포 타입에서 안티센스 RNA 분자의 연속적 발현을 지시하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 바이러스성 프로모터 또는 인핸서, 또는 조절서열은 안티센스 RNA의 구성적, 조직 특이적 또는 세포 타입 특이적 발현을 지시하도록 선택될 수 있다. 안티센스 발현 벡터는 안티센스 폴리뉴클레오티드가 고효율 조절 부분의 조절하에서 생산되는 재조합 플라스미드, 파아지미드(phagemid) 또는 약독화된 바이러스의 형태일 수 있다, 프로모터/인핸서의 활성은 벡터가 도입된 세포형에 의해서 측정될 수 있다.
본 발명은 추가로, 발현을 위해서 세포, 조직 또는 포유동물에게 폴리뉴클레오티드를 전달하기 위한 유전자 전달 비히클을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 유전자 전달 비히클 내에서 국소적으로 또는 전신적으로 투여될 수 있다. 이들 작제물은 생체내 또는 생체외 양식의 바이러스성 또는 비-바이러스성 벡터 방법을 이용할 수 있다. 이러한 암호화 서열의 발현은 내인성 포유동물 또는 이종 프로모터를 사용하여 유도될 수 있다. 생체내에서 암호화 서열의 발현은 조직화될 수 있거나 조절될 수 있다. 본 발명은 당해 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 유전자 전달 비히클을 포함한다. 유전자 전달 비히클은 예를 들어 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV), 헤르페스 바이러스 또는 알파바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스성 벡터는 또한 아스트로바이러스, 코로나바이러스, 오르토믹소바이러스, 파포바바이러스, 파라믹소바이러스, 파르보바이러스, 피코르나바이러스, 폭스바이러스, 또는 토가바이러스 바이러스성 벡터일 수도 있다.
본 발명의 유전자 요법 작제물의 세포 내로의 전달은 상기 언급된 바이러스성 벡터로 제한되지는 않는다. 예를 들어, 핵산 발현 벡터, 사멸된 아데노바이러스 단독에 결합되거나 결합되지 않은 다이온성 축합된 DNA, 리간드-결합된 DNA, 리포좀-DNA 복합체, 진핵세포 전달 비히클 세포, 광중합된 하이드로겔 물질의 침착, 소형 유전자 전이 입자총, 이온화 방사선조사, 핵 전하 중화 또는 세포막과의 융합과 같은 그 밖의 다른 전달방법 및 매체가 사용될 수 있다. 입자 매개된 유전자 전이가 사용될 수도 있다. 간략하게는, 서열을 높은 수준의 발현을 위한 통상적인 조절서열을 함유하는 통상적인 벡터 내로 삽입한 다음에, 아시알로오로소뮤코이드, 인슐린, 갈락토즈, 락토즈 또는 트랜스페린과 같은 세포 표적화 리간에 결합된 폴리라이신, 프로타민 및 알부민 등의 중합체성 DNA-결합 양이온과 같은 합성 유전자 전이 분자와 함께 배양할 수 있다. 노출된 DNA가 사용될 수도 있다. 섭취 효율은 생체분해성 라텍스 비드를 사용하여 개선될 수 있다. DNA 코팅된 라텍스 비드는 비드에 의한 세포내이입 개시 후에 세포 내로 효율적으로 수송된다. 이 방법은 소수성이 증가하고, 이에 따라 엔도좀의 붕괴 및 세포질 내로의 DNA의 방출이 용이하도록 비드를 처리함으로써 더 개선될 수 있다.
본 발명의 또 다른 관점은 조절가능한 발현 시스템을 사용한 CAT2 또는 ARG1 유전자의 발현에 관한 것이다. 이들 시스템에는 Tet-온/오프 시스템, 엑디손(Ecdysone) 시스템, 프로게스테론-시스템 및 라파마이신-시스템이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명의 또 다른 관점은 CAT2 또는 ARG1 폴리펩티드 또는 그의 일부분을 암호화하거나 함유하는 벡터로 형질전환되거나, 형질감염되거나, 형질도입된 숙주 세포의 사용에 관한 것이다. 숙주 세포는 원핵성 또는 진핵성 세포일 수 있다. 이들 숙주 세포를 사용하여 목적하는 CAT2 또는 ARG1 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다.
검출방법
전술한 바와 같이, CAT2 또는 ARG1 유전자의 발현 수준은 염증성 질환에 대한 마커로 사용될 수 있다. CAT2 또는 ARG1 생성물(폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드)의 상대적 양의 검출 및 측정은 당해 기술분야에서 공지된 임의의 방법에 의해서 이루어질 수 있다. 검출 또는 측정은 정성적 또는 정량적일 수 있다.
전사된 폴리뉴클레오티드의 검출을 위한 대표적인 방법에는 세포 또는 조직 샘플로부터의 RNA의 추출, 이에 이어서 추출된 RNA에 대한 표지된 프로브의 하이브리드화 및 표지된 프로브의 검출(예, 노던 블롯팅 또는 핵산 어레이)가 포함된다.
펩티드 검출을 위한 대표적인 방법에는 세포 또는 조직 샘플로부터의 단백질 추출, 이에 이어서 표적 단백질에 대해 특이적인 항체의 단백질 샘플에 대한 결합, 및 항체의 검출이 포함된다. 예를 들어, CAT2 또는 ARG1 폴리펩티드의 검출은 항-CAT2 또는 항-ARG1 폴리클로날 항체를 사용하여 이루어질 수 있다. 항체는 일반적으로, 표지된 이차 항체를 사용하여 검출된다. 표지물은 방사성동위원소, 형광성 화합물, 효소, 효소 공동-인자, 또는 리간드일 수 있다. 이러한 방법은 당해 기술분야에서 잘 이해되고 있다.
또 다른 양태에서, CAT2 또는 ARG1 단백질 발현의 검출은 CAT2 또는 ARG1 단백질 생성물에 대해 높은 결합 친화성을 갖는 소분자를 사용하여 수행된다. 다수의 예에서, 소분자는 용이하게 검출할 수 있다. 그 밖의 다수의 예에서, 소분자는 그 밖의 다른 검출가능한 물질에 의해서 직접적으로 또는 간접적으로 표지될 수 있다. 이들 검출가능한 물질의 예로는 효소, 보결 그룹, 형광성 물질, 발광성 물질, 생물발광성 물질, 방사성 물질, 미립상 물질 또는 콜로이드성 금속이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
특정의 양태에서는, CAT2 또는 ARG1 유전자 그 자체가 염증성 질환에 대한 마커로 작용할 수도 있다. 예를 들어, 유전자의 중복 또는 결실과 같은 방법에 의한 CAT2 또는 ARG1 유전자의 게놈 복제수의 증가 또는 감소는 염증성 질환과 서로 관련될 수 있다.
특이적 CAT2 또는 ARG1 폴리뉴클레오티드 분자의 검출은 또한, 겔 전기영동, 칼럼 크로마토그래피, 또는 직접적인 서열결정, 정량적 PCR, RT-PCR, 내부-PCR, 또는 당해 기술분야에서 공지된 그 밖의 다른 기술에 의해서 평가될 수도 있다.
CAT2 또는 ARG1 유전자의 전부 또는 일부의 존재 또는 복제수의 검출은 당해 기술분야에서 공지된 임의의 방법으로 수행될 수 있다. 한가지 양태에서는, 서던 분석을 사용하여 CAT2 또는 ARG1 유전자의 게놈 복제의 존재 및/또는 양을 평가한다. DNA 검출 및/또는 정량화를 위한 그 밖의 유용한 방법에는 직접 서열결정, 정량적 PCR, 또는 당해 기술분야 숙련가에게 인식되는 그 밖의 다른 수단이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
스크리닝 방법
본 발명은 또한, 조절제, 즉 (a) CAT2 또는 ARG1 단백질에 결합하거나, (b) CAT2 또는 ARG1 단백질의 활성에 대한 억제효과를 갖거나, 더욱 구체적으로는 (c) CAT2 또는 ARG1와 하나 이상의 그의 천연 기질(예, 펩티드, 단백질, 호르몬, 공동-인자, 또는 폴리뉴클레오티드)과의 상호작용에 대한 조절효과를 갖거나, (d) CAT2 또는 ARG1 유전자의 발현에 대한 억제효과를 갖는 치료적 잔기(예, 펩티드, 펩티도모사체, 펩토이드, 폴리뉴클레오티드, 소분자 또는 그 밖의 약물)를 함유하는 후보물질 또는 시험 화합물 또는 약제를 동정하는 방법(여기서, 또한, "스크리닝 시험방법"이라고도 불림)을 제공한다. 이러한 시험방법은 일반적으로 CAT2 또는 ARG1 유전자와 하나 이상의 시험 성분 사이의 반응을 포함한다. 그 밖의 다른 성분은 시험 화합물 그 자체이거나, 시험 화합물과 CAT2 또는 ARG1 단백질의 결합 파트너의 배합물일 수 있다.
본 발명의 시험 화합물은 일반적으로 무기분자, 소유기분자, 및 생체분자이다. 생체분자에는 아미노산, 핵산, 지질, 당, 스테로이드, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 폴리사카라이드, 및 포유동물에서 생체활성을 갖는 천연적으로 존재하거나 합성인 유기 화합물이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 한가지 양태에서, 시험 화합물은 유기소분자이다. 또 다른 양태에서, 시험 화합물은 생체분자이다.
본 발명의 시험화합물은 천연 및/또는 합성 화합물의 계통적 라이브러리를 포함하는 이용가능한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 시험 화합물은 또한, 다음의 것을 포함하는 당해 기술분야에서 공지된 집합적 라이브러리 방법에서 다수의 접근방법 중의 임의의 것에 의해서 수득될 수 있다: 생물학적 라이브러리; 펩토이드 라이브러리(펩티드의 작용성을 갖지만, 효소적 분해에 대해 저항성이면서도 생체활성을 유지하는 신규한 비-펩티드 골격구조를 갖는 분자의 라이브러리; 참조예: Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37: 2678-85, 1994); 공간적으로 어드레스가능한 평행 고체상 또는 용액상 라이브러리; 탈합성을 필요로 하는 라이브러리 방법; '1-비드 1-화합물' 라이브러리 방법; 및 친화성 크로마토그래피 선택을 사용한 합성 라이브러리 방법. 생물학적 라이브러리 및 펩토이드 라이브러리 방법은 펩티드 라이브러리로 제한되지만, 그 밖의 다른 4가지 접근방법은 펩티드, 비-펩티드 올리고머, 또는 화합물의 소분자 라이브러리에 적용할 수 있다[참조: Lam, Anticancer Drug Des. 12: 145, 1997].
본 발명에서 사용된 "결합 파트너"는 CAT2 또는 ARG1 단백질에 대한 기질로서, 또는 대안으로 CAT2 또는 ARG1 단백질에 대한 결합 친화성을 갖는 리간드로서 작용하는 생체활성제를 의미한다. 상기 언급한 바와 같이, 생체활성제는 임의의 천연적으로 존재하거나 합성인 다양한 화합물, 아미노산, 폴리펩티드, 폴리사카라이드, 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
CAT2 또는 ARG1 단백질의 억제제에 대한 스크리닝
본 발명은 CAT2 또는 ARG1 단백질의 억제제에 대하여 시험 화합물을 스크리닝하고, 시험 화합물을 함유하는 약제학적 조성물에 대하여 스크리닝하는 방법을 제공한다. 스크리닝 방법은 CAT2 또는 ARG1 발현 세포 샘플의 분취량을 다수의 시험 화합물 중의 하나와 접촉시키고, 각각의 분취액에서의 CAT2의 발현을 비교하여 시험 화합물 중의 어떤 것이 다른 시험 화합물에 비해서, 또는 비처리된 샘플 또는 대조샘플에 비해서 CAT2 또는 ARG1의 발현 또는 활성이 실질적으로 감소된 수준을 제공하는지 여부를 측정하는 단계를 포함한다. 또한, 스크리닝의 방법은 시험 화합물을 CAT2 또는 ARG1 단백질과 결합시키고, 이렇게 하여 CAT2 또는 ARG1 단백질에 대한 시험 화합물의 효과를 측정함으로써 고안될 수 있다.
또한, 본 발명은 추가로 시험 화합물, CAT2 또는 ARG1 단백질, 및 결합 파트너를 함께 결합시키고, 결합 파트너와 CAT2 또는 ARG1 단백질의 결합이 일어나는지 여부를 측정함으로써 결합 파트너에 대한 CAT2 또는 ARG1 단백질의 결합을 조절시킬 수 있는 시험 화합물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 시험 화합물은 소분자이거나 생체분자일 수 있다. 후술하는 바와 같이, 시험 화합물은 당해 기술분야에서 잘 알려진 다양한 라이브러리로부터 제공될 수 있다.
단백질 억제제에 대하여 스크리닝하는 그 밖의 다른 방법 및 조성물도 당해 기술분야에 공지되어 있다[참조: 본원에 참조로 인용된 미국특허 제4,980,281호, 제5,266,464호, 제5,688,635호, 및 제5,877,007호].
CAT2 또는 ARG1 발현, 활성 또는 결합능의 억제제는 본 발명의 치료적 조성물로 유용하다. CAT2-매개된 아르기닌 수송에 대한 억제제의 하나는 라이신이다. 이러한 억제제는 여기서, 후술하는 바와 같이 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다.
고-처리량 스크리닝 시험방법
본 발명은 CAT2 또는 ARG1의 활성 또는 발현을 억제할 수 있는 시험 화합물에 대한 고-처리량 스크리닝을 수행하는 방법을 제공한다. 한가지 양태에서, 고-처리량 스크리닝 방법은 시험 화합물과 CAT2 또는 ARG1 단백질의 결합 및 CAT2 또는 ARG1 단백질에 대한 시험 화합물의 효과의 검출을 포함한다. 사이토센서 마이크로피지오미터(cytosensor microphysiometer)와 같은 기능적 시험방법, FLIPR(Molecular Devices Corp, Sunnyvale, CA)와 같은 칼슘 유량 시험방법, 또는 TUNEL 시험방법을 사용하여 후술하는 바와 같이 세포 활성을 측정할 수 있다.
당해 기술분야에서 잘 알려져 있는 다양한 고-처리량 기능적 시험방법은 시험 화합물을 활성화시키는 다양한 유형의 반응성을 스크리닝 및/또는 연구하기 위해서 조합하여 사용될 수 있다. 커플링 시스템은 종종 예상하기가 어렵기 때문에, 광범위한 커플링 메카니즘을 검출하기 위해서 구성되는 다수의 시험방법이 필요하다. BRET 또는 FRET(둘 다 Packard Instrument Co., Meriden, CT에 의해서 제공됨)을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 광범위한 형광-기본 기술은 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 활성에 대한 고-처리량 및 초-고처리량 스크리닝이 가능하다. BIACORE 시스템은 또한, 치료적 표적의 개개 성분들과 시험 화합물의 결합을 검출하도록 조작될 수 있다.
시험 화합물을 CAT2 또는 ARG1 단백질과 결합시키고, 이들 사이의 결합 활성을 측정함으로써 진단적 분석을 수행하여 커플링 시스템을 설명할 수 있다. 사이토센서 마이크로피지오미터를 사용한 일반적 시험방법을 사용하여 대사적 활성화를 측정할 수도 있으며, 한편으로 칼슘 가동화에서의 변화는 FLIPR(Molecular Devices Corp, Sunnyvale, CA)와 같은 형광-기본 기술을 사용함으로써 검출될 수 있다. 또한, 아폽토시스 세포의 존재는 유동세포분석법을 이용하여 아폽토시스 중에 게놈성 DNA의 절단으로 인한 3-OH 말단을 검출하는 TUNEL 시험방법에 의해서 측정될 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 당해 기술분야에서 잘 알려진 다양한 기능적 시험방법을 조합해서 사용하여 시험 화합물을 활성화시키는 다양한 유형의 반응성을 스크리닝하고/하거나 연구할 수 있다. 한가지 양태에서, 본 발명의 고-처리량 스크리닝 시험방법은 BIACORE 시스템(Biacore International AB, Uppsala, Sweden)에 의해서 제공되는 표지물-비함유 플라즈몬(plasmon) 공명기술을 이용한다. 표면 플라스몬 파장이 금속/액체 계면에서 여기되는 경우에 플라즈몬 자유 공명이 일어난다. 샘플과의 접촉의 결과로서 표면으로부터 지향된 빛을 반사시킴으로써, 표면 플라즈몬 공명은 표면층에서 굴절율에서의 변화를 야기한다. 표면층에서의 질량 농도의 소정의 변화에 대한 굴절율 변화는 다수의 생체활성제(단백질, 펩티드, 지질 및 폴리뉴클레오티드를 포함)에 대해 유사하며, BIACORE 센서 표면은 이들 다양한 생체활성제를 결합시키도록 작용화될 수 있기 때문에 시험 화합물의 광범위한 선택의 검출이 성취될 수 있다.
따라서, 본 발명은 시험 화합물과 CAT2 또는 ARG1 단백질을 BIACORE와 같은 고-처리량 시험방법에서, 또는 BRET와 같은 형광-기본 시험방법에서 결합시킴으로써 CAT2 또는 ARG1 단백질의 활성을 억제하는 능력에 대하여 시험 화합물을 고-처리량 스크리닝하는 방법을 제공한다. 또한, 고-처리량 시험방법을 이용하여 CAT2 또는 ARG1 단백질에 결합하는 특이적 인자를 동정하거나, 대안으로 CAT2 또는 ARG1 단백질의 결합 파트너에 대한 결합을 방지하는 시험 화합물을 동정할 수 있다. 추가로, 고-처리량 스크리닝 시험방법은, 시험 화합물이 CAT2 또는 ARG1 단백질에, 또는 CAT2 또는 ARG1 단백질의 결합 파트너에 결합할 수 있는지 여부를 측정하도록 변형될 수 있다.
진단적 시험방법
생물학적 샘플 내에서 CAT2 또는 ARG1, 또는 CAT2 또는 ARG1를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 검출하는 방법의 예는 시험 피검체로부터 생물학적 샘플을 수득하고, 이러한 생물학적 샘플을 생물학적 샘플 내에 CAT2 또는 ARG1 폴리뉴클레오티드의 존재가 검출되도록 CAT2 또는 ARG1를 암호화하는 단백질 또는 폴리뉴클레오티드(예, mRNA, 게놈 DNA)를 검출할 수 있는 약제 또는 화합물과 접촉시키는 것을 포함한다. CAT2 또는 ARG1 유전자 또는 CAT2 또는 ARG1 단백질에 상응하는 mRNA 또는 게놈 DNA를 검출하는 약제의 예는 CAT2 또는 ARG1 mRNA 또는 게놈 DNA에 하이브리드화할 수 있는 표지된 폴리뉴클레오티드 프로브이다. 본 발명의 진단적 시험방법에서 사용하기에 적합한 프로브는 본원에 기술되어 있다. CAT2 또는 ARG1 단백질을 검출하기 위한 약제의 예는 CAT2 또는 ARG1 단백질을 특이적으로 인식하는 항체이다.
또한, 진단적 시험방법을 사용하여 생물학적 샘플 내에 CAT2 또는 ARG1의 발현 또는 활성의 양을 정량분석할 수도 있다. 이러한 정량분석은 예를 들어, 천식, COPD 및 관절염과 같은 염증성 질환의 진행 또는 중증도를 측정하는데 유용하다. 이러한 정량분석은 또한, 예를 들어 치료 후의 염증성 질환의 중증도를 측정하는데도 유용하다.
본원에 기술된 방법은 예를 들어, 천식, COPD 및 관절염과 같은 염증성 질환의 증상 또는 가족력을 나타내는 피검체를 진단하기 위한 임상적 셋팅에서 편리하게 사용될 수 있는 본원에 기술된 적어도 하나의 프로브 폴리뉴클레오티드 또는 항체 시약을 포함하는 포장된 진단용 키트를 이용하여 수행될 수 있다.
또한, CAT2 또는 ARG1가 발현되는 어떤 세포 타입 또는 조직이라도 본원에 기술된 예후적 또는 진단적 시험방법에서 이용될 수 있다.
염증성 질환의 중증도 측정
진단적 시험의 분야에서, 본 발명은 또한 피검체로부터 샘플을 분리하고, 샘플 내의 CAT2 또는 ARG1의 존재, 양 및/또는 활성을 정상 샘플 또는 대조 샘플로부터의 제 2 샘플과 대비하여 검출함으로써 천식, COPD 및 관절염과 같은 염증성 질환의 중증도를 측정하는 방법을 제공한다. 한가지 양태에서는, 두가지 샘플 내에서의 CAT2 또는 ARG1의 발현 수준을 비교하고, 시험 샘플 내에서의 증가된 CAT2 또는 ARG1 발현은 천식, COPD 및 관절염과 같은 염증성 질환을 시사하는 것이다.
CAT2 또는 ARG1을 검출하는 약제의 예는 CAT2 또는 ARG1에 결합할 수 있는 항체이다. 일부의 경우에는, 항체를 검출가능한 표지물에 직접 또는 간접적으로 커플링시킬 수 있다. 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날일 수 있다. 완전 항원 또는 이의 단편(예, Fab 또는 F(ab')2)이 사용될 수 있다. 프로브 또는 항체와 관련한 용어 "표지된"은 검출가능한 물질을 프로브 또는 항체에 커플링 (예를 들어, 물리적으로 결합)시킴으로써 프로브 또는 항체를 직접 표지하는 것뿐만 아니라 직접적으로 표지된 다른 시약과의 반응성에 의해서 프로브 또는 항체를 간접적으로 표지하는 것을 포함하는 의미이다. 간접적인 표지의 예로는 형광으로-표지된 이차 항체를 사용한 일차 항체의 검출, 및 형광으로-표지된 스트렙타비딘에 의해서 검출될 수 있도록 비오틴에 의한 DNA 프로브의 말단-표지가 포함된다. 용어 "생물학적 샘플"은 피검체로부터 분리된 조직, 세포 및 생물학적 유체, 및 피검체 내에 존재하는 조직, 세포 및 유체를 포함하는 의미이다. 즉, 본 발명의 검출방법을 사용하여 시험관 내에서뿐만 아니라 생체 내에서 생물학적 샘플 내의 CAT2 또는 ARG1 mRNA, 단백질 또는 게놈 DNA를 검출할 수 있다. 예를 들어, CAT2 또는 ARG1 mRNA의 검출을 위한 시험관내 기술에는 노던 하이브리드화 및 동일계 하이브리드화가 포함된다. CAT2 또는 ARG1를 검출하는 시험관내 기술에는 효소 결합된 면역흡착시험(ELISA), 웨스턴 블롯, 면역침강법 및 면역형광법이 포함된다. CAT2 또는 ARG1 게놈 DNA를 검출하는 시험관내 기술에는 서던 하이브리드화가 포함된다. 또한, CAT2 또는 ARG1의 검출을 위한 생체내 기술에는 피검체에 표지된 항-CAT2 또는 ARG1 항체를 도입시키는 것이 포함된다. 예를 들어, 항체를 방사성 마커로 표지할 수 있으며, 피검체 내에서의 마커의 존재 및 위치는 표준 영상기술에 의해서 검출될 수 있다.
한가지 양태에서, 생물학적 샘플은 시험 피검체로부터의 단백질 분자를 함유한다. 대안으로, 생물학적 샘플은 시험 피검체로부터의 mRNA 분자 또는 시험 피검체로부터의 게놈 DNA 분자를 함유할 수 있다. 한가지 예로서, 생물학적 샘플은 피검체로부터 통상적인 수단, 예를 들어 조직생검에 의해서 분리된 조직 샘플이다.
예후적 시험방법
또한, 본원에 기술된 진단적 방법을 이용하여 비정상적인 CAT2 또는 ARG1 발현 또는 활성과 연관된 천식, COPD 및 관절염과 같은 염증성 질환을 갖거나, 이러한 질환을 나타낼 위험이 있는 피검체를 확인할 수 있다.
또한, 본원에 기술된 예후적 시험방법을 사용하여 피검체에게 비정상적인 CAT2 또는 ARG1 발현 또는 활성과 연관된 염증성 질환을 치료하거나 예방하는 약제(예, 효능제, 길항제, 펩티도모사체, 단백질, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 소분자, 또는 그 밖의 다른 약물 후보물질)를 투여할 수 있는지 여부를 측정할 수 있다. 따라서, 본 발명은 피검체가 약제를 사용하여 비정상적인 CAT2 또는 ARG1 발현 또는 활성과 연관된 염증성 질환에 대해서 효과적으로 치료될 수 있는지 여부를 측정하는 방법을 제공한다.
예후적 시험방법은 염증성 질환에 대한 치료를 받고 있는 피검체가 장기간 생존 또는 질환 진행에 대하여 열등한 전망을 갖는지 여부를 측정하도록 고안될 수 있다. 한가지 구체예로서, 예후는 진단 직후에, 즉 며칠 이내에 측정될 수 있다. 염증성 질환의 개시부터 추후의 단계까지의 다양한 단계의 CAT2 또는 ARG1 발현 프로필을 정립함으로써, 발현 패턴은 특정의 발현 프로필이 열등한 예후의 증가된 가능성과 서로 관련이 있는 것으로 나타날 수 있다. 이후, 예후를 사용하여 더 챌린지적인 치료 프로그램을 고안하고, 장기간 생존 및 웰빙의 가능성을 증진시킬 수 있다.
유전자 변형의 검출
또한, 본 발명의 방법을 사용하여 CAT2 또는 ARG1 유전자에서의 유전적 변형을 검출함으로써 변형된 유전자를 갖는 피검체가 CAT2 또는 ARG1 활성 또는 폴리뉴클레오티드 발현에 있어서의 비정상적인 조절을 특징으로 하는 위험에 처했는지 여부를 측정할 수 있다. 다수의 양태에서, 본 방법은 피검체로부터의 세포의 샘플에서 CAT2 또는 ARG1 유전자의 통합에 영향을 미치는 하나 이상의 변형, 또는 CAT2 또는 ARG1 유전자의 비정상적인 발현을 특징으로 하는 유전적 변형의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다. 예를 들어, 이러한 유전적 변형은 다음 중의 적어도 하나의 존재를 확인함으로써 검출될 수 있다: 1) CAT2 또는 ARG1 유전자로부터 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실; 2) CAT2 또는 ARG1 유전자에 대한 하나 이상의 뉴클레오티드의 첨가; 3) CAT2 또는 ARG1 유전자의 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환; 4) CAT2 또는 ARG1 유전자의 염색체성 전위; 5) CAT2 또는 ARG1 유전자의 메신저 RNA 전사체의 수준에 있어서의 변형; 6) 게놈 DNA의 메틸화 패턴과 같은 CAT2 또는 ARG1 유전자의 비정상적인 변이; 7) CAT2 또는 ARG1 유전자의 메신저 RNA 전사체 비-야생형 스플라이싱 패턴의 존재; 8) CAT2 및 ARG1의 비-야생형 수준; 9) CAT2 또는 ARG1 유전자의 대립유전자 소실; 및 10) CAT2 또는 ARG1의 부적절한 해독후 변이. 본원에 기술된 바와 같이, CAT2 또는 ARG1 유전자에 있어서의 변형을 검출하기 위해서 사용될 수 있는 다수의 시험방법이 당해 기술분야에 공지되어 있다. 생물학적 샘플의 예는 피검체로부터 통상적인 수단에 의해서 분리된 혈액 샘플이다.
특정의 양태에서, 변형의 검출은 앵커(anchor) PCR 또는 RACE PCR과 같은 폴리머라제 연쇄반응(PCR)에서, 또는 대안으로 연결 연쇄반응(LCR)에서 (이들 중의 후자의 경우는 CAT2 또는 ARG1 유전자에서의 점 돌연변이를 검출하기 위해서 사용될 수 있다) 프로브/프라이머를 사용하는 것이 포함된다. 이 방법은 피검체로부터 세포의 샘플을 수집하고, 샘플의 세포로부터 폴리뉴클레오티드(예, 게놈, mRNA 또는 둘다)를 분리시키고, 폴리뉴클레오티드 샘플을 (존재하는 경우에) CAT2 또는 ARG1 유전자의 하이브리드화 및 증폭이 일어나도록 하는 조건하에서 CAT2 또는 ARG1 유전자에 대해서 특이적으로 하이브리드화하는 하나 이상의 프라이머와 접촉시키고, 증폭 생성물의 존재 또는 부재를 검출하거나, 증폭 생성물의 크기를 검출하여 길이를 대조 샘플과 비교하는 단계를 포함할 수 있다. PCR 및/또는 LCR은 본원에 기술된 돌연변이를 검출하기 위해서 사용된 임의의 기술과 함께 예비 증폭단계로서 사용하기에 바람직할 수 있는 것으로 이해된다.
대안적 증폭방법에는 다음이 포함된다: 자체-지속적인 서열 복제, 전사적 증폭 시스템, Q-베타 레플리카제(Q-Beta Replicase), 또는 그 밖의 다른 폴리뉴클레오티드 증폭방법, 및 이에 이어서 당해 기술분야 숙련가에게 잘 알려진 기술을 사용한 증폭된 분자의 검출. 이들 검출안은 이러한 분자가 매우 적은 수로 존재하는 경우에 폴리뉴클레오티드 분자를 검출하는데 유용하다.
대안적 양태에서, 샘플 세포로부터의 CAT2 또는 ARG1 유전자에서의 돌연변이는 제한효소 절단 패턴에서의 변형에 의해서 확인될 수 있다. 예를 들어, 샘플 및 대조 DNA를 분리하고, (임의로) 증폭시켜, 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제로 분해시키고, 단편 길이 크기를 겔 전기영동에 의해서 측정하여 비교한다. 샘플과 대조 DNA 사이에서 단편 길이 크기에서의 차이는 샘플 DNA에서의 돌연변이를 시사한다. 또한, 서열 특이적 리보자임을 사용하여 리보자임 절단부위의 발생 또는 소실에 의해 특이적 돌연변이의 존재에 대해 점수를 매긴다.
그 밖의 다른 양태에서, CAT2 또는 ARG1 유전자에서의 유전적 돌연변이는 샘플 및 대조 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 DNA 또는 RNA를 수백 또는 수천개의 올리고뉴클레오티드 프로브를 함유하는 고밀도 어레이에 대해 하이브리드화시킴으로써 확인될 수 있다. 예를 들어, CAT2 또는 ARG1 유전자에서의 유전적 돌연변이는 생성된 가벼운 DNA 프로브를 함유하는 이차원적 어레이에서 확인될 수 있다. 간략하게는, 프로브의 제1 하이브리드화 어레이를 사용하여 샘플 및 대조군 내의 DNA의 긴 확장을 통해서 스캐닝하여 순차적인 중복성 프로브의 선형 어레이를 만들어서 서열들 사이의 염기 변화를 확인할 수 있다. 이 단계는 점 돌연변이의 확인을 가능하게 한다. 이 단계는 검출된 모든 변이체 또는 돌연변이에 대해 상보적인 더 작은 특수화된 프로브 어레이를 사용함으로써 특정 돌연변이의 특정화를 허용하는 제2 하이브리드화 어레이로 이어진다. 각각의 돌연변이 어레이는 하나는 야생형 유전자에 대해 상보적이고, 다른 것은 돌연변이체 유전자에 대해 상보적인 평행 프로브 셋트로 구성된다.
또 다른 양태에서, 당해 기술분야에서 공지된 임의의 다양한 서열결정 반응을 사용하여 CAT2 또는 ARG1 유전자를 직접 서열결정하고, 샘플 CAT2 또는 ARG1 유전자의 서열을 상응하는 야생형 (대조) 서열과 비교함으로써 돌연변이를 검출할 수 있다. 또한, 질량 분광광도법에 의한 서열결정을 포함한 임의의 다양한 자동화된 서열결정 절차를 사용하여 진단적 시험방법을 수행할 수 있는 것으로 간주된다.
CAT2 또는 ARG1 유전자에서 돌연변이를 검출하는 그 밖의 다른 방법에는 절단제로부터의 보호를 사용하여 RNA/RNA 또는 RNA/DNA 이종중복체에서 미스매치된 염기를 검출하는 방법이 포함된다[참조: Myers et al., Science, 230:1242, 1985]. 일반적으로, "미스매치 절단"의 기술은 야생형 CAT2 또는 ARG1 유전자 서열을 함유하는 (표지된) RNA 또는 DNA를 조직 샘플로부터 수득된 잠재적인 돌연변이체 RNA 또는 DNA와 하이브리드화시켜 이종중복체를 제공함으로써 개시한다. 이본쇄 중복체를 대조 쇄와 샘플 쇄 사이의 염기쌍 미스매치로 인하여 존재할 수 있는 중복체의 일본쇄 부분을 절단하는 약제로 처리한다. 예를 들어, RNA/DNA 중복체를 RNase로 처리할 수 있으며, DNA/DNA 하이브리드는 S1 뉴클레아제로 처리하여 미스매치된 영역을 효소적으로 분해시킬 수 있다. 그 밖의 다른 양태에서는, 미스매치된 부분을 분해시키기 위해서 DNA/DNA 또는 RNA/DNA 중복체를 하이드록실아민 또는 오스뮴 테트록사이드 및 피페리딘으로 처리할 수 있다. 미스매치된 부분을 분해시킨 후에, 생성된 물질을 변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 크기별로 분리시켜 돌연변이의 부위를 측정한다. 한가지 양태에서는, 검출을 위해서 대조 DNA 또는 RNA를 표지할 수 있다.
또 다른 양태에서, 미스매치 절단반응은 세포의 샘플로부터 수득된 CAT2 또는 ARG1 cDNA에서의 점 돌연변이를 검출하고 맵핑하는 규정된 시스템에서 이본쇄 DNA(소위 "DNA 미스매치 수복" 효소) 내의 미스매치된 염기쌍을 인식하는 하나 이상의 단백질을 사용한다. 예를 들어, 이 콜라이의 mutY 효소는 G/A 미스매치에서 A를 절단하고, HeLa 세포로부터의 티미딘 DNA 글리코실라제는 G/T 미스매치에서 T를 절단한다. 예시적인 구체예에 따르면, CAT2 또는 ARG1 유전자 서열, 예를 들어 야생형 CAT2 또는 ARG1 유전자 서열을 기본으로 하는 프로브를 시험 세포(들)로부터의 cDNA 또는 다른 DNA 생성물에 대해 하이브리드화시킨다. 중복체를 DNA 미스매치 수복 효소로 처리하고, 절단 생성물이 존재하는 경우에는 이를 전기영동 프로토콜 등으로부터 검출할 수 있다[참조: 미국특허 제5,459,039호].
또 다른 양태에서는, 전기영동적 이동성에서의 변형을 사용하여 CAT2 또는 ARG1 유전자에서의 돌연변이를 확인할 수 있다. 예를 들어, 단일쇄 형태 다형성(SSCP)을 사용하여 돌연변이체와 야생형 폴리뉴클레오티드 사이에서의 전기영동적 이동성의 차이를 검출할 수 있다. 샘플 및 대조 CAT2 또는 ARG1 폴리뉴클레오티드의 일본쇄 DNA 단편을 변성시키고, 복원시킬 수 있다. 일본쇄 폴리뉴클레오티드의 이차 구조는 서열에 따라서 변화한다. 전기영동적 이동성에서 일어난 변형은 단일 염기 변화까지도 검출할 수 있게 한다. DNA 단편은 표지된 프로브를 사용하여 표지되거나 검출될 수 있다. 시험의 민감성은 이차 구조가 서열의 변화에 대해 (DNA보다는) 더 민감한 RNA를 사용함으로써 증진될 수 있다. 한가지 양태에서, 당해 방법은 이종중복체 분석을 이용하여 전기영동적 이동성의 변화를 기초로 이본쇄 이종중복체 분자를 분리시킨다[참조: Keen et al., Trends Genet. 7:5-7, 1991].
또 다른 양태에서는, 변성제의 구배를 함유하는 폴리아크릴아미드 겔 내에서의 돌연변이체 또는 야생형 단편의 이동을 변성적 구배 겔 전기영동(DGGE)를 사용하여 시험한다. 분석의 방법으로 DGGE를 사용하는 경우에, DNA는 예를 들어, PCR에 의해서 고융점의 GC-풍부 DNA의 약 40bp의 GC 클램프를 첨가함으로써, 이것이 완전히 변성하지 않는 것을 보장하도록 변이될 수 있다. 추가의 양태에서는, 변성제 구배 대신에 온도 구배를 사용하여 대조 및 샘플 DNA의 이동성에 있어서의 차이를 확인한다[참조: Rosenbaum and Reissner, Biophys. Chem. 265: 12753, 1987].
점 돌연변이를 검출하기 위한 그 밖의 다른 기술의 예로는 선택적 올리고뉴클레오티드 하이브리드화, 선택적 증폭, 또는 선택적 프라이머 연장이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 프라이머가 제조될 수 있는데, 여기서, 공지된 돌연변이를 중앙에 위치시킨 다음에 완전한 매치가 발견되는 경우에만 하이브리드화가 일어나는 조건하에서 표적 DNA에 대해 하이브리드화시킨다[참조: Saiki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 6230, 1989]. 이러한 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드가 하이브리드화 막에 부착되고 표지된 표적 DNA에 의해서 하이브리드화된 경우에는 다수의 상이한 돌연변이, 또는 PCR 증폭된 표적에 대해 하이브리드화된다.
대안으로, 선택적 PCR 증폭반응에 따라 좌우되는 대립유전자-특이적 증폭기술을 본 발명과 함께 사용할 수 있다. 특이적 증폭반응을 위한 프라이머로 사용된 올리고뉴클레오티드는 분자의 중앙에 (증폭반응이 차등 하이브리드화에 따르도록 함), 또는 적절한 조건하에서 미스매치가 폴리머라제 연장을 방지하거나 감소시킬 수 있는 하나의 프라이머의 극단의 3' 말단에 목적하는 돌연변이를 수반할 수 있다. 또한, 돌연변이의 부위에 신규의 제한부위를 도입시켜 절단-기본 검출이 일어나도록 하는 것이 바람직할 수도 있다. 특정의 양태에서, 증폭은 또한 증폭을 위한 Taq 리가제를 사용하여 수행될 수도 있는 것으로 예상된다. 이러한 경우에, 연결반응은 5' 서열의 3' 말단에 완전한 매치가 있는 경우에만 일어나서 증폭의 존재 또는 부재를 찾아 봄으로써 특정 부위에서 공지된 돌연변이의 존재를 검출할 수 있게 만들 수 있다.
임상실험 중의 모니터링 효과
CAT2 또는 ARG1의 발현 또는 활성에 대한 약제(예, 약물, 소분자, 단백질, 뉴클레오티드)의 영향의 모니터링은 기본적 약물 스크리닝에서 뿐만 아니라 임상실험에서도 적용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이 스크리닝 시험에 의해서 측정된 CAT2 또는 ARG1 발현, 단백질 수준 또는 하향-조절된 CAT2 또는 ARG1 활성을 감소시키는 약제의 유효성은 증가된 CAT2 또는 ARG1 발현, 단백질 수준 또는 상향-조절된 CAT2 또는 ARG1 활성을 나타내는 피검체의 임상실험에서도 모니터링될 수 있다. 이러한 임상실험에서, CAT2 또는 ARG1의 발현 또는 활성은 특정 조직의 표현형의 "리드-아웃(read-out)"으로 사용될 수 있다.
예를 들어, 임상실험에서 CAT2- 또는 ARG1-관련된 손상에 대한 약제의 효과를 시험하기 위해서는 세포를 분리하고, RNA를 제조하여 CAT2 또는 ARG1의 발현 수준에 대하여 분석할 수 있다. 유전자 발현의 수준은 본원에 기술된 바와 같이 노던 블롯 분석, RT-PCR, 진칩(GeneChip) 또는 타크만(Taqman) 분석에 의해서 정량화될 수 있거나, 또는 대안으로 생산된 단백질의 양을 측정함으로써, 본원에 기술된 방법들 중의 하나에 의해서, 또는 CAT2 또는 ARG1의 활성의 수준을 측정함으로써 정량화될 수 있다. 이러한 방식으로, 유전자 발현 수준은 약제에 대한 세포의 생리학적 반응의 지표인 리드-아웃으로 이용될 수 있다. 따라서, 이러한 반응상태는 약제에 의한 개체의 처리 전, 및 처리 중의 다양한 시점에 측정될 수 있다.
한가지 양태에서, 본 발명은 (i) 약제를 투여하기 전에 피검체로부터 투여-전 샘플을 수득하고; (ii) 투여-전 샘플에서 CAT2 또는 ARG1 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 검출하고; (iii) 피검체로부터 하나 이상의 투여-후 샘플을 수득하고; (iv) 투여-후 샘플에서 CAT2 또는 ARG1 단백질 또는 mRNA의 발현 또는 활성의 수준을 검출하고; (v) 투여-전 샘플에서의 CAT2 또는 ARG1 단백질 또는 mRNA의 발현 또는 활성의 수준을 투여-후 샘플 또는 샘플들에서의 CAT2 또는 ARG1 단백질 또는 mRNA의 발현 또는 활성의 수준과 비교하고; (vi) 이에 따라서 피검체에 대한 약제의 투여를 변형시키는 단계들을 포함하여, 약제(예, 길항제, 펩티도모사체, 단백질, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 소분자, 또는 본원에 기술된 스크리닝 시험방법에 의해서 동정된 그 밖의 다른 약물 후보물질)에 의한 피검체의 치료의 유효성을 모니터링하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 약제의 감소된 투여가 CAT2 또는 ARG1의 발현 또는 활성을 검출된 것보다 더 높은 수준로 증가시키는데, 즉 약제의 유효성을 감소시키는데 바람직할 수 있다. 이러한 구체예에 따르면, CAT2 또는 ARG1 발현 또는 활성은 관찰가능한 표현형적 반응이 부재하는 경우에 조차도 약제의 유효성의 지표로 사용될 수 있다.
치료의 방법
본 발명은 천식, COPD, 골관절염 및 류마티스성 관절염과 같은 염증성 질환의 위험이 있거나, 이러한 질환에 민감하거나, 이러한 질환을 갖는 것으로 진단된 피검체를 처리하는 예방적 및 치료적 방법 둘 다를 제공한다. 처리의 예방적 및 치료적 방법 둘 다와 관련하여, 이러한 처리는 약물유전학의 분야에서 수득된 지식을 기초로 하여 특이적으로 조정되거나 변형될 수 있다. 본 발명에서 사용된 것으로 "약물유전학"은 임상적으로 개발되고, 시판중인 약물에 대한 유전자 서열결정, 통계학적 유전학, 및 유전자 발현분석과 같은 게놈 기술의 적용을 포함한다. 더욱 구체적으로, 이 용어는, 피검체의 유전자가 약물에 대한 그들의 반응(예, 피검체의 "약물 반응 표현형" 또는 "약물 반응 유전자형")을 측정하는 방법에 대한 연구를 의미한다. 따라서, 본 발명의 또 다른 관점은 개체의 약물 반응에 따라 CAT2 또는 ARG1 조절제에 의해서 개체의 예방적 또는 치료적 처리를 조정하는 방법을 제공한다. 약물유전학은, 임상의 또는 의사가 처리에 의해 대부분의 이점을 가질 수 있는 피검체에게는 예방적 또는 치료적 처리를 표적화시키고, 독성 약물-관련된 부작용을 경험할 수 있는 피검체에게는 처리를 피할 수 있도록 한다.
예방적 방법
한가지 관점에서, 본 발명은 CAT2 또는 ARG1 발현 또는 활성을 조절시키는 약제를 피검체에게 투여함으로써 피검체에서 CAT2- 또는 ARG1-관련된 병원성 과정을 예방하는 방법을 제공한다.
비정상적인 CAT2 또는 ARG1 발현 또는 활성과 연관된 천식과 같은 염증성 질환의 위험이 있는 피검체는 예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은 진단적 또는 예후적 시험방법 중의 어느 하나 또는 조합에 의해서 확인될 수 있다.
예방적 약제의 투여는, 질병이 예방되거나, 대안으로는 그의 진행이 지연되도록, 증가된 CAT2 또는 ARG1 단백질 발현의 특징적인 증상이 나타나기 전에 수행될 수 있다. CAT2 또는 ARG1 비정상성(예를 들어, 일반적으로는 정상적인 표준편차를 벗어나는 조절)의 유형에 따라, 피검체를 치료하기 위해서 예를 들어 CAT2 또는 ARG1 돌연변이체 단백질, CAT2 또는 ARG1 단백질 길항제, 항-CAT2 또는 -ARG1 항체, 또는 CAT2 또는 ARG1 안티센스 폴리뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 적절한 약제는 본원에 기술된 스크리닝 시험방법을 기초로 측정될 수 있다.
치료적 방법
본 발명의 또 다른 관점은 치료적 목적으로 CAT2 또는 ARG1 단백질 발현 또는 활성을 조절시키는 방법에 관한 것이다. 따라서, 예시적 양태에서 본 발명의 조절방법은 세포를 CAT2 또는 ARG1 발현, 또는 세포와 연관된 CAT2 또는 ARG1 단백질의 하나 이상의 활성을 억제하는 약제와 접촉시키는 것을 포함한다. CAT2 또는 ARG1 발현 또는 단백질 활성을 변조시키는 약제는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 폴리사카라이드, CAT2 또는 ARG1 단백질의 천연적으로 존재하는 표적분자(예, CAT2 또는 ARG1 단백질 기질 또는 수용체), 항-CAT2 또는 항-ARG1 항체, CAT2 또는 ARG1 단백질 길항제, CAT2 또는 ARG1 단백질 길항제의 펩티도모사체, 또는 그 밖의 유기소분자 및 무기분자와 같은 본원에 기술된 약제일 수 있다.
이들 변조방법은 (예를 들어, 약제를 피검체에게 투여함으로써) 생체내에서 수행될 수 있다. 그 자체로서, 본 발명은 CAT2 또는 ARG1의 증진된 발현 또는 활성을 특징으로 하는 염증성 질환으로 진단되거나, 그러한 질환의 위험이 있는 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 한가지 양태에서, 이 방법은 CAT2 또는 ARG1 발현 또는 활성을 하향-조절하는 약제 (예를 들어, 본원에 기술된 스크리닝 시험방법에 의해서 동정된 약제) 또는 약제의 배합물을 투여하는 것을 포함한다. 처리는 또한, 염증성 질환에 걸린 조직 또는 세포에 국소화될 수도 있다.
약물유전학
CAT2 또는 ARG1 조절제를 사용한 천식, COPD 및 관절염과 같은 염증성 질환의 처리와 함께, 약물유전학 (즉, 개체의 유전자형과 외래 화합물 또는 약물에 대한 개체의 반응 사이의 관계에 대한 연구)이 고려될 수 있다. 치료제의 대사에 있어서의 차이는 약리학적 활성약물의 투여량과 혈중 농도 사이의 관계를 변화시킴으로써 중증의 독성 또는 치료 실패를 야기할 수 있다. 따라서, 의사 또는 임상의는 CAT2 또는 ARG1 조절제를 투여할 지 여부를 측정하고, CAT2 또는 ARG1 조절제에 의한 처리의 투여량 및/또는 치료적 방식을 조정하는 해당 약물유전학적 연구에서 수득된 지식을 이용하여 고려할 수 있다.
약물유전학은 병에 걸린 사람에게서의 변화된 약물 소인 및 비정상적인 작용으로 인하여 약물에 대한 반응에서의 임상적으로 유의적인 유전적 변이를 다루는 것이다. 일반적으로, 두가지 유형의 약물유전학적 조건이 차별화될 수 있다. 유전적 조건은 약물이 신체에 작용하는 방식을 변화시키는 단일 인자로서 전달되거나(변형된 약물 작용), 유전적 조건은 신체가 약물에 대해 작용하는 방식을 변화시키는 단일 인자로서 전달된다(변형된 약물 대사). 이들 약물유전학적 조건은 드문 유전자적 결함으로서, 또는 천연적으로 존재하는 다형현상으로 일어날 수 있다. 예를 들어, 글루코즈-6-포스페이트 데하이드로게나제 결핍(G6PD)은 주된 임상적 합병증이 산화제 약물(항-말라리아제, 설폰아미드, 진통제, 니트로푸란)의 섭취 및 잠두의 소비 후의 용혈현상인 통상의 유전된 효소병이다.
"게놈-와이드 연합(genome-wide association)"으로 알려진 약물 반응을 예언하는 유전자를 동정하는 한가지 약물유전학적 접근방법은 주로 이미 공지된 유전자-관련된 부위로 구성된 사람 게놈의 고해상도 지도(예를 들어, 사람 게놈 상의 60,000-100,000개의 다형성 또는 가변적 부위로 구성된 "바이-대립유전자성(bi-allelic)" 유전자 마커 지도(이들은 각각 두개의 변이체를 갖는다))를 근거로 한다. 이러한 고해상도 유전자 지도를 특별히 관찰된 약물 반응 또는 부작용과 연관된 유전자를 동정하기 위해서 II/III상 약물 실험에 참여하는 통계학적으로 상당한 수의 피검체 각각의 게놈의 지도와 비교할 수 있다. 대안으로, 이러한 고해상도 지도는 사람 게놈에서 1000만의 공지된 단일 뉴클레오티드 다형현상(SNP) 중의 일부를 조합한 것으로부터 생성될 수 있다. 본 발명에서 사용된 것으로, "SNP"는 DNA의 확장 내의 단일 뉴클레오티드 염기에서 나타나는 공통적인 변형이다. 예를 들어, SNP는 DNA의 매 1000개의 염기당 한번 일어날 수 있다. 그러나, 대다수의 SNP는 질병과 연관되지 않을 수 있다. 이러한 SNP의 발생을 근거로 한 유전자 지도가 주어지면, 개체는 그들의 개개 게놈 내에서의 SNP의 특정한 패턴에 따라서 유전자 카테고리로 분류될 수 있다. 이러한 방식으로, 치료 방식은 이러한 유전적으로 유사한 개체들 사이에서 공통적일 수 있는 형질을 고려하여, 유전적으로 유사한 개체들의 그룹에 맞도록 조정될 수 있다.
대안으로, "후보물질 유전자 접근방법"이라 불리는 방법을 이용하여 약물 반응을 예언하는 유전자를 동정할 수 있다. 이 방법에 따르면, 약물 표적을 암호화하는 유전자가 알려지면(예, CAT2 또는 ARG1 유전자), 이 유전자의 통상적인 변이체 모두를 집단에서 상당히 쉽게 동정할 수 있으며, 유전자의 하나의 변형이 다른 것에 대비하여 특정의 약물 반응과 연관되는지 여부를 측정할 수 있다.
예시적인 양태로서, 약물 대사성 효소의 활성은 약물 작용의 강도 및 기간 둘 다의 주된 결정인자이다. 약물 대사성 효소(예, N-아세틸트랜스퍼라제 2(NAT 2) 및 사이토크롬 P450 효소 CYP2D6 및 CYPZC19)의 유전적 다형현상의 발견은 일부의 피검체가 약물의 표준 안정 용량을 복용한 후에 예상되는 약물 효과를 얻지 못하는 이유, 또는 과장된 약물 반응 및 심각한 독성을 나타내는 이유에 대한 설명을 제공한다. 이들 다형현상은 집단에서 빠른 대사제 및 느린 대사제의 두가지 표현형으로 발현된다. 느린 대사제 표현형의 우세는 집단에 따라서 상이하다. 예를 들어, CYP2D6을 암호화하는 유전자는 상당히 다형성이며 몇 가지 돌연변이가 느린 대사제에서 확인되는데, 이들은 모두 작용적 CYP2D6의 부재를 유도한다. CYP2D6 및 CYP2C19의 느린 대사제는 이들이 표준 용량으로 투여되는 경우에, 과장된 약물 반응 및 부작용을 매우 빈번하게 경험한다. 대사산물이 활성의 치료적 부분이면, 느린 대사제는 이의 CYP2D6-형성된 대사산물인 모르핀에 의해서 매개되는 코데인의 진통효과에 대해 입증된 바와 같이 치료적 반응을 나타내지 않는다. 그 밖의 다른 것은 표준 용량에 대해 반응하지 않는 소위 초고속 대사제이다. 최근에, 초고속 대사의 분자적 기준은 CYP2D6 유전자 증폭에 기인하는 것으로 확인되었다.
대안으로, "유전자 발현 프로필화"라 불리는 방법을 이용하여 약물 반응을 예언하는 유전자를 동정할 수 있다. 예를 들어, 약물이 투여된 동물의 유전자 발현(예, CAT2 또는 ARG1 조절제에 대한 반응으로 CAT2 또는 ARG1 발현)은 독성과 관련된 유전자 경로가 시작되었는지 여부에 대한 지표를 제공할 수 있다.
하나 이상의 상기 약물유전학적 접근방법으로부터 생성된 정보를 사용하여 개체를 예방적 또는 치료적 처리하기 위한 적절한 투여량 및 처리 방식을 결정할 수 있다. 이러한 지식을 투여 또는 약물 선택에 적용하면 부작용이나 치료적 실패를 피할 수 있으며, 따라서 피검체를 CAT2 또는 ARG1 조절제로 처리하면 치료적 또는 예방적 효율을 증진시킬 수 있다.
약제학적 조성물
본 발명은 추가로 CAT2 또는 ARG1 조절제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 약제학적 투여와 혼화성인 임의의 용매, 가용화제, 충전제, 안정화제, 결합제, 흡수제, 염기, 완충제, 윤활제, 조절 방출 비히클, 희석제, 유화제, 습윤제, 윤활제, 분산매질, 피복제, 항균제 또는 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등 및 이들 모두를 포함하는 의미이다. 약제학적으로 활성인 물질에 대한 이러한 매질 및 성분의 사용은 당해 기술분야에 잘 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 성분이 활성성분과 비혼화성인 경우를 제외하고는, 조성물에서 이들의 사용이 고려된다. 보충제도 또한 조성물 내에 포함될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 이의 목적하는 투여 경로와 혼화성이도록 제형화된다. 투여 경로의 예로는 비경구, 예를 들어 정맥내, 피부내, 피하, 경구(예, 흡입, 설하, 기관지 및 폐), 경피(국소), 경점막 및 직장 투여가 포함된다. 비경구, 피부내, 또는 피하 적용하기 위해서 사용되는 용액 또는 현탁액은 다음의 성분들을 포함할 수 있다: 주사용 물, 식염수, 불휘발성 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린과 같은 멸균 희석제; 프로필렌 글리콜 또는 그 밖의 다른 합성 용매; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; 아스코르빈산 또는 나트륨 바이설페이트와 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트화제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충제; 및 염화나트륨 또는 덱스트로즈와 같은 삼투압 조절제. pH는 염산 또는 수산화나트륨과 같은 산 또는 염기에 의해서 조정될 수 있다. 비경구용 제제는 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰플, 일회용 주사기, 또는 수회 용량형 바이알 내에 봉입될 수 있다.
주사용으로 사용하기에 적합한 약제학적 조성물은 (가용성인 경우) 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조용 멸균 분말이 포함된다. 정맥내 투여의 경우에 적합한 담체에는 생리적 식염수, 정균수, Cremophor EL™(BASF, Parsippany, NJ) 또는 포스페이트 완충된 식염수(PBS)가 포함된다. 모든 경우에, 주사용 조성물은 멸균되어야 하며, 쉬운 주사가능성이 존재할 정도로 유체이어야 한다. 이것은 제조 및 저장의 조건하에서 안정하여야 하며, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염작용에 대항하여 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 피복제를 사용하고, 분산액의 경우에는 필요한 입자 크기를 유지시키고, 계면활성제를 사용함으로써 유지될 수 있다. 미생물의 작용을 방지하는 것은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르빈산, 티머로살 등에 의해서 달성될 수 있다. 대부분의 경우에, 염화나트륨, 당 또는 폴리알코올(예, 만니톨, 소르비톨)과 같은 등장화제가 조성물 내에 포함될 수도 있다. 주사용 조성물의 장기간 흡수는 조성물에 흡수를 지연시키는 성분, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 유도될 수 있다.
멸균 주사용 용액은 필요한 양의 활성 CAT2 또는 ARG1 조절제를 상기 열거된 성분들 중의 하나 또는 배합물과 함께 적절한 용매에 혼입시키고, 필요에 따라, 이어서 여과 멸균시킴으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 기본적인 분산매질 및 상기 열거된 성분들로부터 선택된 그 밖의 필요한 성분들을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 제조를 위한 예시적 방법은 이미 멸균-여과된 그들의 용액으로부터 활성성분과 추가의 목적하는 성분의 분말을 수득하는 동결-건조 및 진공 건조이다.
경구용 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 이들은 젤라틴 캅셀 내에 봉입되거나, 정제로 압착될 수 있다. 경구의 치료적 투여 목적으로, 활성 화합물은 부형제와 함께 통합되어 정제, 트로치, 또는 캅셀의 형태로 사용될 수 있다. 경구용 조성물은 또한, 구강청정제로 사용하기 위해서 유체 담체를 사용하여 제조될 수도 있으며, 여기서, 유체 담체 내의 화합물은 경구적으로 적용되어, 스위시되고(swished), 객출되거나 삼켜진다. 약제학적으로 혼화성인 결합제 및/또는 아쥬반트 물질이 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 정제, 환제, 캅셀제, 트로치 등은 다음의 임의의 성분 또는 유사한 성질의 화합물을 함유할 수 있다: 미세결정성 셀룰로즈, 트라가칸트 고무 또는 젤라틴과 같은 결합제; 전분 또는 락토즈와 같은 부형제; 알긴산, 프리모젤(Primogel), 또는 옥수수 전분과 같은 붕해제; 마그네슘 스테아레이트 또는 스테르테스(Stertes)와 같은 윤활제; 콜로이드성 실리콘 디옥사이드와 같은 활주제; 슈크로즈 또는 사카린과 같은 감미제; 또는 페퍼민트, 메틸 살리실레이트, 또는 오렌지 향료와 같은 풍미제.
흡입에 의한 투여의 경우에, 화합물은 적합한 추진제, 예를 들어 이산화탄소와 같은 가스를 함유하는 가압 용기 또는 디스펜서로부터의 에어로졸 스프레이, 분무기, 기관 흡입기 또는 점비제의 형태로 전달될 수 있다. 또한, 화합물은 액체 용액, 겔, 또는 건조 생성물의 형태일 수 있다. 흡입제제는 예를 들어 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 글리코콜레이트 및 데옥시콜레이트를 함유하는 수용액일 수 있다. 흡입제제는 또한, 필요한 경우에 락토즈와 같은 부형제를 함유할 수도 있다. 분무기는 pH 및/또는 삼투압을 조정하는 담체 또는 부형제를 포함하는 수성 현탁액 또는 용액의 형태일 수 있다.
한가지 양태에서, 생체활성 화합물을 함유할 수 있는 치료적 잔기는 임플란트 및 미세캅셀화 전달 시스템을 포함한, 조절 방출 제형과 같이 화합물이 신체로부터 신속하게 제거되는 것을 방지할 수 있는 담체를 사용하여 제조된다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산과 같이 생체분해성이고 생체혼화성인 중합체가 사용될 수 있다. 이러한 제형을 제조하는 방법은 당해 기술분야 숙련가에게 명백할 것이다. 재료들은 또한 예를 들어, Alza Corporation 및 Nova Pharmaceuticals, Inc.사로부터의 시판품으로 수득될 수 있다. 리포좀 현탁액(바이러스성 항원에 대한 모노클로날 항체에 의해서 감염된 세포에 대해 표적화된 리포좀을 포함)이 또한, 약제학적으로 하용되는 담체로 사용될 수도 있다. 이들은 예를 들어, 미국특허 제4,522,811호에 기술된 바와 같이 당해 기술분야 숙련가에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.
한가지 양태에서, 단위 투여형으로 제형화된 경구 또는 비경구용 조성물은 투여의 용이성 또는 투여량의 균일성을 위해서 사용된다. 본원에 사용된 단위 투여형은 처리될 피검체에 대한 단일의 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 포함하며, 각각의 단위는 필요한 약제학적 담체와 함께 목적하는 치료적 효과를 생성시키도록 계산된 예정량의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 단위 투여형에 대한 사양은 활성 화합물의 독특한 특징 및 수득하고자 하는 특정의 치료적 효과, 및 개체의 치료를 위해서 이러한 활성 화합물을 배합시키는 기술분야에서 고유한 제한조건에 의해서 지시되거나, 이들에 따라 직접적으로 좌우된다.
이러한 화합물의 독성 및 치료적 효능은 예를 들어, LD50(집단의 50%에 대한 치사량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)을 측정하기 위한, 세포 배양물 또는 실험 동물 내에서의 표준 약제학적 절차에 의해서 측정될 수 있다. 독성과 치료적 효과 사이의 용량비는 치료 지수이며, 이것은 LD50/ED50 비로서 표현될 수 있다. 큰 치료지수를 나타내는 화합물이 선택될 수 있다. 독성 부작용을 나타내는 화합물이 사용될 수도 있지만, 감염되지 않은 세포에 대한 잠재적인 손상을 최소화시키기 위해서 이러한 화합물을 병에 걸린 조직의 부위에 대해서 표적화시키고, 이렇게 하여 부작용을 감소시키는 전달 시스템을 디자인하도록 주의를 기울여야 한다.
세포배양시험 및 동물시험으로부터 수득된 데이타가 사람에게서 사용하기 위한 일정 범위의 투여량을 제형화하는데 사용될 수 있다. 대부분의 경우에, 이러한 화합물의 투여량은 독성이 거의 또는 전혀 없이 ED50을 포함하는 농도를 순환시키는 범위에 있다. 투여량은 이 범위 안에서 사용된 투여형 및 이용되는 투여의 경로에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용된 임의의 화합물에 대해서도 치료적 유효량은 일차적으로 세포배양시험으로부터 추정될 수 있다. 용량은 동물 모델에서, 세포배양에서 측정된 IC50(즉, 증상의 최대 억제의 절반을 수득하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도범위를 얻도록 제형화될 수 있다. 이러한 정보를 사용하여 사람에게서 유용한 용량을 더 정확하게 측정할 수 있다. 혈장 내에서의 수준은 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해서 측정될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 투여를 위한 투여량 방식은 질환의 유형, 병변의 부위, 질환의 중증도, 환자의 연령, 성별 및 식이, 염증의 중증도, 투여의 시기 및 그 밖의 임상적 인자와 같은 다양한 인자들을 기초로 하여 주치의에 의해서 측정될 수 있다. 한가지 양태에서 흡입성, 전신적 또는 주사에 의한 투여는 최소로 효과적인 용량으로 시작할 수 있으며, 이 용량은 양성 효과가 관찰될 때까지 미리-선택된 시간에 걸쳐서 증가시킬 수 있다. 이어서, 투여량에서의 점증적인 증가는 나타날 수 있는 임의의 부작용을 감안하면서 효과에 있어서의 상응하는 증가를 제공하는 수준까지 제한적으로 이루어질 수 있다. 그 밖의 다른 공지된 인자들을 최종 조성물에 첨가하는 것도 또한, 투여량에 영향을 미칠 수 있다. 진행은 표준 방법을 사용하여 질병 진행을 주기적으로 평가함으로써 모니터링될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 하나의 용량 또는 수회 용량으로 투여될 수 있다. 용량은 임의의 바람직한 간격으로 투여될 수 있다. 하나의 양태에서, 각각의 용량은 약 0.1㎍-100㎎, 1㎍-10㎎, 10㎍-1㎎, 또는 100㎍-500㎍의 활성 치료제를 포함한다. 0.1㎍ 이하, 또는 100㎎ 이상의 투여량이 사용될 수도 있다. 각각의 용량의 용적은 예를 들어, 0.1㎖ 내지 5㎖, 0.1㎖ 내지 1㎖, 또는 0.2㎖ 내지 0.5㎖의 범위일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 투여를 위한 지침서와 함께 용기, 팩 또는 디스펜서 내에 포함될 수 있다.
키트
본 발명은 또한, 생물학적 샘플 내에서 CAT2 또는 ARG1 유전자의 존재를 검출하는 키트를 포함한다. 이 키트는 뉴클레오티드 또는 단백질 수준에서 CAT2 또는 ARG1의 발현을 평가하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 한가지 양태에서, 시약은 항체 또는 이의 단편일 수 있으며, 여기서, 항체 또는 이의 단편은 CAT2 또는 ARG1에 특이적으로 결합한다. 예를 들어, 목적하는 항체는 당해 기술분야에서 공지된 방법에 의해서 제조될 수 있다. 임의로, 키트는 폴리뉴클레오티드 프로브를 포함할 수 있으며, 여기서, 프로브는 CAT2 또는 ARG1 유전자에 상응하는 전사된 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합한다. 이 키트는 샘플 내의 CAT2 또는 ARG1 단백질 또는 mRNA의 양을 측정하는 수단 및 샘플 내의 CAT2 또는 ARG1 단백질 또는 mRNA의 양을 대조군 또는 표준품과 비교하는 수단을 함유할 수 있다. 화합물 또는 약제는 적합한 용기 내에 포장될 수 있다. 이 키트는 추가로, CAT2 또는 ARG1 단백질 또는 폴리뉴클레오티드를 검출하기 위해서 키트를 사용하는 지침서를 포함할 수 있다.
본 발명은 추가로, 피검체에게서 염증성 질환을 억제하는 다수의 화합물 각각의 적합성을 평가하기 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 시험할 다수의 화합물, 및 CAT2 또는 ARG1의 발현을 평가하는 시약 (즉, 상응하는 단백질에 대해 특이적인 항체, 또는 상응하는 폴리뉴클레오티드에 대해 특이적인 프로브 또는 프라이머)을 포함한다.
실시예 1: 알러지성 반응과 연관된 마우스 폐에서의 유전자 발현 변화
Balb/c 마우스(6-8 주령)는 Jackson Laboratories사로부터 입수하였다. 이 시험에서 사용된 모든 동물은 층류 후드(laminar flow hood)하에서 환경적으로 조절되고 병원체가 없는 설비 내에 수용하였다. 모든 실험은 동물의 실험적 사용을 위한 지침[참조: the Aniaml Welfare Act and the Department of Health, Education and Welfare(NIH) guidelines]에서 개략적으로 나타낸 실험실 동물 연구를 위한 원칙에 순응하였다.
Balb/c 마우스를 0일째에 200㎕의 PBS 중의 10㎍의 OVA(Sigma, St. Louis, MO)를 복강내(i.p.) 주사함으로써 면역시켰다. 14 및 25일째에 마우스를 케타민과 자일라진(각각 45 및 8㎎/㎏)의 혼합물로 마취시키고, 50㎕의 1.5% OVA 용액 또는 등량의 PBS로 기관내 챌린지하였다. 마우스에게 100㎕의 PBS, hIgG(400㎍/㎖) 또는 sIL-13α2-Fc(400㎍/㎖)를 24, 25 및 27일째에 복강내로 주사하였다. hIgG의 정제는 문헌[참조: Urban et al., Immunity 8(2): 255-645, 1998]에 따라서 수행하였다. 28일째에 RNA 분리를 위해서 폐를 수거하고 즉시 동결시켰다.
IL-13 매개된 시그날 형질도입에 대해 의존적인 mRNA 농도에서의 변화를 확인하기 위하여, 두마리의 OVA-챌린지된 마우스를 알러지성 챌린지의 과정 전 및 중에 가용성 IL-13 수용체 융합 단백질인 sIL-13Rα2-Fc를 3회 복강내 주사하여 처리하였다. 수용체 융합 단백질의 Fc-잔기에 대한 대조를 위해서 두마리의 OVA-챌린지된 마우스를 hIgG를 복강내 투여하여 유사하게 처리하였다. 6마리 대조 마우스의 두번째 셋트를 후속 챌린지가 없이 OVA로 유사하게 감작시키고, 동일한 시간 과정에 PBS 완충액을 단독으로(n=2), 또는 hIgG(n=2) 또는 sIL-13Rα2-Fc(n=2)의 복강내 주사와 함께 기관내 투여하여 처리하였다. OVA-챌린지 및 완충액-단독의 대조 마우스에 대한 폐 조직은 이차 폐 항원 챌린지 후(28일째), 78시간에 수확하였다.
재조합 쥐 IL-13(mIL-13; 50㎕의 최종 용적 중의 5㎍)은 케타민과 자일라진 (각각 45 및 8㎎/㎏)의 혼합물로 마취시킨 비감작 Balb/c 마우스 또는 Stat 6 결핍성 마우스에게 기관내 점적주입함으로써 3일 동안 매일 투여하였다. 최초의 IL-13을 투여한 후, 72시간에 폐를 수거하고 드라이 아이스 상에서 즉시 동결시켰다.
즉시 동결된 마우스 폐 조직을 액체 질소 냉각된 막자사발 및 막자를 사용하여 분말화하고, 6㎖의 4M 구아니디늄 이소티오시아네이트/0.7% β-머캅토에탄올(GTC/ME)에 현탁시키고, 2분 동안 펄스 초음파파쇄하였다. 조직 현탁액을 산 평형화된 페놀(Promega Total RNA 키트)로 2회 추출하고, 핵산을 동용적의 이소프로판올로 침전시켰다. 펠릿을 0.8㎖ GTC/ME에 재현탁시키고, 동용적의 산 페놀로 2회 및 클로로포름으로 1회 재추출하였다. RNA를 에탄올 침전시키고, I DEPC 처리된 H2O로 현탁시키고, OD280으로 정량하였다.
cDNA는 이미 상세히 기술된 변화[참조: Byrne et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (New York), 2000]를 갖는 Superscript 키트(BRL)를 사용하여 10㎍의 총 RNA로부터 합성되었다. 첫번째 쇄 합성은 리보좀 RNA로부터의 미스프라이밍(mispriming)을 예방하도록 50℃에서 수행되었으며, 후속 시험관내 안티센스 RNA(cRNA) 증폭 및 비오틴 표지화를 위해서 폴리-T 프라이머(T7T24)를 함유하는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터를 이용하였다. cDNA는 제조자의 지침에 따라서 BioMag 카복시 종결된 비드(Polysciences)를 사용하여 정제하고, 48㎕의 10mM 나트륨 아세테이트, pH 7.8에서 용출시켰다.
안티센스 cRNA의 합성 및 비오틴 표지를 위해서 시험관내 T7 폴리머라제 구동된 전사반응, 퀴아겐 RN-이지(Qiagen Rneasy) 스핀 칼럼 정제 및 cRNA 단편화는 기술된 바와 같이 수행되었다(상기 참조). 진칩 하이브리드화 혼합물은 제조자의 지침에 따라서 200㎕의 총용적으로 1×MES 완충액 중에 10 ㎍의 단편화된 cRNA, 0.5㎎/㎖의 아세틸화된 BSA, 0.1㎎/㎖의 청어 정자 DNA를 함유하였다. 반응혼합물은 45℃에서 18시간 동안 Affymetrix사의 MullKsubA 및 MullKsubB 올리고뉴클레오티드 어레이에 대해 하이브리드화되었다. 하이브리드화 혼합물을 제거하고, 어레이는 세척하고 진칩 플루이디틱스 스테이션(GeneChip Fluiditics Station) 400(Affymetrix)을 사용하여 스트렙타비딘 R-파이코에리트린(Molecular Probes)으로 염색하여 제조자의 지침에 따라 Hewlett Packard사의 진어레이 스캐너로 스캐닝하였다. 형광 데이타를 수집하고, 마이크로어레이 슈트(Microarray Suite) 4.0 소프트웨어를 사용하여 유전자 특이적 차이 평균으로 전환시켰다.
클로닝된 박테리아성 및 박테리오파지 서열로부터 유도된 유전자 단편으로 이루어진 11개 멤버의 표준곡선은 2kb의 평균 전사체 크기를 추정하는 약 3.3 내지 1000ppm의 RNA 빈도를 나타내는 0.5pM 내지 150pM 범위의 농도에서 각각의 하이브리드화 혼합물로 스파이크되었다. 비오티닐화 표준곡선 단편은 플라스미드-기본 주형으로부터의 T7-폴리머라제 구동된 IVT 반응에 의해서 합성되었다(상기 참조). 스파이크된 비오티닐화 RNA 단편은 칩 감수성을 평가하기 위한 내부 표준으로서, 및 개개 유전자로부터 측정된 형광성 차이 평균을 RNA 빈도수(ppm)로 전환시키기 위한 표준곡선으로 모두 작용한다. 유전자-특이적 올리고뉴클레오티드를 함유하는 완전 매치 및 단일 미스매치 프로브 셋트 사이의 평균 형광 차이를 사용하여 스파이크된 표준곡선에 관한 빈도수 값을 측정하였다. 또한, 주로 개개 양성 또는 음성 반응성 프로브 짝의 분율을 기준으로 한 알고리즘의 두번째 셋트를 사용하여 유전자 생성물의 절대 존재 또는 부재를 평가한다[참조: Lockhart et al., Nat. Biotechnol. 14:1850-1856, 1996]. 개개 마이크로어레이 칩의 민감성은 주형 내의 3개의 인접한 펴준곡선 스파이크 중의 두개가 존재하는 것으로 불리는 , 최소 농도의 1/2로 설정된다. 표준곡선 선형 회귀는 강제적으로 0을 통과하도록 하며, 보고된 최소 유전자 빈도는 개개 GeneChip의 민감성으로 설정된다.
처리 또는 대조 실험조건의 각각에 대한 다수의 독립적인 복제가 측정되었으며, 발현 데이타는 거짓 양성을 제거하기 위한 노력으로 일상적인 통계학적 분석에 적용하였다. 소정의 실험 셋트에 대하여 개개 측정으로부터 측정된 빈도값들은 일차적으로 엑셀 소프트웨어를 사용하여 비교되었다. 처리 및 대조 동물에 대한 평균값을 비교하여 평균 배수 변화(AFC)를 수득하였다. 2-테일드(tailed) 스투던트(Student) T-시험은 원래의 빈도값에 의한 불균등한 공분산 또는 로그-변형된 빈도값에 의한 균등한 공분산을 사용하여 계산되었다. 이 작업에서는 적어도 하나의 실험조건에서 스투던트 t-시험 P < 0.05에 결합된 AFC에서 2-배보다 더 크게 변화하는 유전자들만이 보고된다. AFC > 2-배 및 t-시험 P < 0.05 기준에 의해서 확정된 유전자 셋트는 이어서 대부분의 시험 화일에 부재하는 것으로 불리는 유전자를 제거하고, MullKsubA 및 subB 올리고뉴클레오티드 어레이 상에 수회 타일된(tiled) 유전자로 인한 중복성을 제거하기 위해서 편집되었다. 마지막으로, 처리된 동물의 평균 발현 빈도가 실험 완충액 단독인 대조군들 사이의 평균 보다 2-배 미만으로 더 큰 유전자는 제외되었다.
쥐의 11K subA 및 subB GeneChip은 13,000개 이상의 쥐 유전자, EST 및 대조서열의 호출을 허용하였다. 올리고뉴클레오티드 어레이는 MullKsubA 및 subB 올리고뉴클레오티드 어레이에 대해서 각각 13ppm 및 12ppm의 평균 민감성을 갖고 응답하였다. 정제된 RNA 및 유도된 cDNA 생성물의 품질은 각각의 유전자의 5'-말단 대비 3'-말단을 나타내는 독립적으로 프로브 셋트로부터 유도된 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제 및 액틴에 대하여 계산된 빈도들의 비를 비교함으로써 모니터되었다. 대조 및 처리 동물의 상이한 셋트로부터 분리된 RNA에 대해 측정된 5'/3' 비는 표 3에 보고된 바와 같이 0.77 내지 0.90의 범위를 가지고 평균 0.81로 균형을 이루었다. 결합된 MullKsubA 및 subB GeneChip 상의 총 13,179개의 타일드 서열 중에서, 평균 5294(+/- 533)개의 유전자가 총체적 분산계수를 10.1%로 하여 개개 분석된 화일에 존재하는 것으로 간주되었다(표 3). 추가로, 적어도 하나의 화일에 존재하는 것으로 간주된 모든 유전자에 대하여 산정된 빈도의 합은 서브그룹의 각각에 대하여 총체적 분산계수를 20.9%로 하여 평균 485000으로 보고된다. 개개 GeneChip 실험의 칩 민감도와 RNA 품질의 유사성은 측정된 유전자 발현에서의 총체적인 균형으로 반영되었으며, 이것은 개개 화일을 표준화시키기 위해서 공통의 스파이크된 표준곡선을 사용하는 것을 지지한다[참조: Hill, A.A. et al., Genome Biol. 2(12), 2001].
알러지원-챌린지 유도된 유전자 발현을 확인하기 위해서 사용된 3개의 처리그룹 각각에 대해 측정된 총체적 유전자 발현(표 3에 나타낸 바와 같음)은 mRNA 일체성, 존재하는 것으로 간주된 유전자의 수, 및 다양한 대조 및 처리 화일에 걸쳐서 산정된 총 mRNA 빈도와 잘 균형을 이루었다.
RNA 균형의 요약
Balb/C 72시간 (IL-13) STAT6 72시간 (IL-13) Balb/C 72시간 (OVA)
대조군N=5 IL-13N=6 대조군N=4 IL-13N=5 대조군N=6 OVAN=4 OVA+xFc13Ra2N=2
평균 RNA5'/3' 비 0.90 0.77 0.88 0.80 0.76 0.78 0.80
존재하는 유전자 # 5396 +/- 813 4984+/- 568 5553+/- 475 5422+/- 5143 5143+/- 285 5352+/- 568 5210+/- 394
총 빈도1 450+/- 101 581+/- 131 482+/- 80 539+/- 174 447+/- 83 414+/- 52 480+/- 89
1 적어도 하나의 화일에 존재하는 것으로 간주된 모든 유전자의 평균 총 빈도(×10-3).
PBS로 처리된 대조 마우스에 대해서 측정된 유전자 발현 프로필은 사람 IgG 또는 sIL-13Rα2-Fc의 복강내 동시-투여에 의해서 유의적으로 변화되지 않았으며, 따라서 6마리의 대조 마우스로부터의 빈도값은 평균 비처리 기준선 발현값의 계산에서 단일 셋트로 조합되었다. 유사하게, 완충제 또는 hIgG의 복강내 동시-투여로 처리된 4마리의 OVA-챌린지 마우스는 폐 알러지원-챌린지된 mRNA 빈도에 대한 평균 빈도값의 계산에서 단일 셋트로서 조합되었다. 6마리의 PBS-처리된 대조 마우스와 4마리의 OVA-챌린지된 마우스 사이의 평균 폐 mRNA 빈도의 비교는 246개의 타일드 서열을 확인하였으며, 여기서, AFC는 2-배 또는 그 이상이었다. 이들 유전자의 셋트 중에서, 132개가 P < 0.05인 두번째 선택기준에 부합하였으며, 이하의 표 4에 나타내었다.
유전자 발현 변화의 요약
Balb/C 72시간IL-13 대 PBS STAT6 72시간IL-13 대 PBS Balb/C 72시간OVA 대 PBS STAT6 72시간OVA 대 PBS
존재하는 유전자 #* 5306+/-615 5480+/-536 5224+/-386 5472+/-622
총 빈도† 522+/-130 514+/-136 441+/-72 466+/-86
>2 × AFC‡ 279 28 246 43
P < 0.05§ 288 5 344 54
2×AFC + P < 0.05 136 0 132 1
* 13,179개의 타일 서열 중에서 존재하는 것으로 간주된 mRNA 전사물의 총 수.† 적어도 하나의 화일에 존재하는 것으로 간주된 모든 유전자의 평균 총 빈도(×10-3).‡ 2-배 또는 그 이상의 평균 배수 변화의 기준에 부합하는 유전자의 수.§ P<0.05의 스투던트 t-시험 기준에 부합하는 유전자의 수.∏ 2-배 AFC 및 스투던트 t-시험 P<0.05의 이중 기준에 부합하는 유전자의 수.
이러한 알러지원-유도된 유전자 셋트는 이어서 여과하여 대부분의 시험 측정에서 부재하는 것으로 간주된 유전자 및 올리고뉴클레오티드 어레이에 과도하게 타일된 몇개의 유전자를 제거하였다. 평균 mRNA 빈도값은 완충제 단독인 대조 마우스, OVA-챌린지된 마우스 및 OVA-챌린지되고 IL-13 길항제가 동시-투여된 마우스에 대해서 보고된다. 유전자는 배경 색상에 의해서 지정된 OVA-유도 및 대조 폐 발현 사이의 상대적 AFC에 따른 기능적 주석에 의해서 분류되었다. 폐 알러지성 반응은 유전자의 다양한 셋트의 발현을 단지 3개의 통계학적으로 유의적인 감소를 가지고 상향-조절하는 것으로 확인되었다. 유도된 알러지성 반응 유전자 셋트의 멤버 중의 대부분은 Fc 수용체, 프로테아제, 프로테아제 억제제, 상보체, 키티나제-관련된 단백질, 면역글로불린, 및 케모킨 및 트레포일 인자를 포함한 몇개의 분비된 시그날링 단백질을 포함한 관련된 기능적 패밀리로부터 유래하는 것이다. 유전자 및 유전자 패밀리의 몇개는 상피세포 이형성 및 점액 과분비, 호산구증가증, 기도 리모델링 및 기도 과반응성(AHR)의 천식 병리생물학과 연관될 수 있다.
생리학적 연구는 Stat6-/- 공대립유전자를 갖는 마우스에서 OVA 챌린지에 의해서 야기된 폐 호산구 침윤, 점액 과다생성 및 AHR의 억제가 증명되었다[참조: Kuperman, D. et al., J. Exp. Med. 187: 939-948, 1998; Akimoto, T. et al., J. Exp. Med. 187: 1537-1542, 1998; Miyata, S. et al., Clin. Exp. Allergy 29: 114-123, 1999]. Stat6-/- 공대립유전자를 Balb/C 유전적 배경에 역교차시키고, Balb/C 야생형 마우스에 대한 것과 동일한 프로토콜 및 스케쥴을 사용하여 mIL-13(n=5) 또는 PBS 완충액 대조군(n=4)의 폐 점적주입에 의해서 처리하였다. 수회 용량의 mIL-13 폐 점적주입에 따른 폐 조직의 발현 프로필은 Stat6-/- 마우스에서 2 내지 3.2-배의 범위인 AFC를 갖는 28개의 유전자를 확인하였지만, 이들 유전자 중의 어떤 것도 T-시험 기준(p<0.05)에 부합하지 않았고 통계학적으로 유의적인 것으로 간주될 수 없었다(표 4). 또한, 이들 28개의 유전자 중의 어떤 것도 Balb/C 야생형 배경에서 mIL-13 유도된 유전자에 상응하지 않았다. Balb/C 배경에서 AFC에 의해 선택된 상부 25개의 통계학적으로 유의적인 유전자들은 OVA-챌린지 쥐 폐 조직에서의 발현에 의해서 분류되고, Stat-/- 대립유전자를 갖는 유사하게 처리된 마우스에 대해서 얻어진 빈도값과 비교하였다. 이들 데이타는 Stat-/- 공마우스에서 알러지원 챌린지에 대한 생리학적 반응의 결여와 일치하는 것으로서, Balb/C 야생형에서 측정된 mIL-13-매개된 유전자 유도의 모두에 대한 Stat 기능의 필요성을 나타낸다.
대조군으로서, PBS-완충제 처리된 Balb/C 야생형(n=4)에서 측정된 폐 유전자 발현을 Stat-/- 공대립유전자를 갖는 완충제-단독으로 처리된 마우스(n=4)와 비교하였다. 이 비교에 의해서 2-배 또는 그 이상의 AFC를 갖는 43개의 유전자와 스투던트 T-시험에서 P<0.05인 54개의 유전자를 동정하였다(표 4). 그러나, 이들 유전자 빈도 비교에서는 단지 하나의 유전자만이 이중 선택기준에 부합하였다. 혈청 알부민 D-박스 단백질은 Stat-/- 공마우스에서 3.2-배 감소하였다(P=0.03). 알부민 D-박스 결합 단백질을 유일한 예외로 하고, 이들 데이타는 면역 촉진의 부재하에서 Stat-/- 공대립유전자로 인한 마우스 폐에서의 총체적인 유전자 발현에는 매우 제한된 차이가 있었음을 나타내었다. Stat-/- mIL-13 처리된 마우스 및 완충제 대조 마우스의 비교 이외에도, 이들 결과는 추가로 데이타를 여과하기 위해서 사용된 이중 AFC 및 통계학적 기준은 거짓 양성 신호를 제거하는데 효과적임을 시사하였다.
실시예 2: IL -13 폐 점적주입에 의해 유도된 마우스 폐에서의 유전자 발현 변화
폐 유전자 발현에서의 IL-13 매개된 변화를 확인하기 위해서 6마리의 Balb/c 마우스(Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)를 재조합 마우스 IL-13(mIL-13)의 수회 5㎍ 용량(0시간, 24시간 및 48시간)을 폐 점적주입하여 처리하였다. 대조군 Balb/C 마우스(n=4)의 두번째 셋트는 동일한 스케쥴로 완충제 만을 점적주입하였다. 추가로, Stat-/- 공마우스의 셋트를 발현 프로필화를 위해 78시간에 모든 폐를 수거하기 전에 수회 용량 mIL-13(n=4) 또는 PBS 완충제(n=5) 폐 점적주입에 의해서 동일하게 처리하였다. mIL-13의 기관내 점적주입에 의해서 처리된 Balb/c 마우스의 유전자 발현 프로필 데이타와 완충제 단독 대조군을 비교하여 개개 화일에 존재하는 것으로 간주된 평균 5306개의 유전자 내에서 2-배보다 큰 평균 배수 차이를 갖는 279개의 유전자를 확인하였다. 이들 279개의 유전자 중에서, 136개가 스투던트 t-시험 P<0.05 의 두번째 기준에 부합하였다(상기의 표 4).
알러지원 챌린지 및 직접적인 IL-13 점적주입에 의해 매개된 유전자 발현에는 극적인 중복이 있었다. OVA-유도된 모델에서 확인되지 않은 IL-13 상향-조절된 유전자의 관찰소견은 대개 사이토킨의 직접 점적주입에 의해서 제공된 시그날의 강도에서의 차이를 반영한다. 기관내 IL-13 투여 또는 IL-13의 폐-특이적 형질도입된 과발현이 알러지성 천식의 마우스 모델에서 나타나는 병태생리학적 반응을 모두 유도하기 때문에, IL-13 변조된 유전자는 필시 질병-관련된 유전자의 확대된 셋트를 반영하는 것이다. 도 1은 CAT2 및 ARG1 유전자가 OVA 또는 IL-13 처리를 받은 Balb/c 마우스에서 상향-조절되는 것을 나타낸다. 도 2는 OVA 또는 IL-13-처리된 Balb/c 마우스에서 ARG1의 mRNA 빈도를 나타낸 것이다.
실시예 3: Balb /c 마우스에서 OVA 또는 IL -13의 아데노바이러스 - 매개된 발현에 의한 ARG1 유전자의 유도
간략하게는, Balb/c 마우스를 재조합 아데노바이러스 발현 쥐 IL-13(Ad-IL13) 또는 쥐 분비된 알칼리성 포스파타제(Ad-SEAP)의 5×1010 입자로 비내 접종하였다. 대조 마우스는 실시예 1에 기술된 바와 같이 PBS, OVA 또는 IL-13으로 처리하였다. 접종한 지 72시간 후에 동물을 희생시키고, RNA 추출을 위해서 폐를 수거하였다. RNA는 제조자의 제안에 따라서 RN-이지 미니 키트(RN-easy Mini kit; Qiagen)를 사용하여 폐 조직으로부터 제조되었다. ARG1 발현은 Affymetrix사의 Mu U74Av2 올리고뉴클레오티드 어레이를 사용하여 측정되었다. 결과는 도 3에 나타내었다. mRNA 빈도는 ppm으로 표현된다.
실시예 4: C57b1 /6 마우스에서 IL -13의 아데노바이러스 - 매개된 발현에 의한 ARG1 유전자의 유도
간략하게는, Balb/c 마우스를 Ad-IL13 또는 Ad-SEAP의 5×1010 입자로 비내 접종하였다. 대조 마우스는 실시예 1에 기술된 바와 같이 PBS로 처리하였다. 접종한 지 72시간 후에 동물을 희생시켰다. 총 폐 RNA를 분리시키고, 실시예 2에 기술된 바와 같이 ARG1 발현에 대해서 분석하였다. 결과는 도 4에 나타내었다. mRNA 빈도는 ppm으로 표현된다.
실시예 5: LPS 및 IL -13으로 처리된 쥐 대식세포 세포주 RAW264 .7에서의 CAT2 및 ARG1 발현
융합성 RAW264.7 세포를 4mM L-글루타민(CTS), 10% 소태아혈청(JRH Biosciences), 비-필수 아미노산(Gibco), 및 10mM HEPES(Gibco)가 보충된 20 ㎖의 완전 둘베코(Dulbecco) 변형된 이글(Eagle) 배지(cDME) 내에서 1:5로 분할하였다. 그 후, 하위융합의 세포를 24시간 후에 100ng/㎖의 재조합 마우스 IL-13(R&D Systems) 및/또는 슈도모나스 에루기노자(Pseudomonas aeruginosa) 혈청형 10(Sigma)으로의 1㎍/㎖ 리포폴리사카라이드(LPS)로 자극하였다. 자극한 지 24시간 후에 플라스크로부터 세포를 긁어서 냉 PBS로 1회 세척하고, 세포 펠릿을 10㎕/㎖ β-머캅토에탄올을 함유하는 600㎕의 완충제 RLT(RN-easy Mini Kit, Qiagen) 중에서 용해시켰다. 용해물은 -80℃에서 저장하였다.
RNA는 제조자의 제안에 따라서 RN-이지 미니 키트(Qiagen)를 사용하여 처리된 RAW264.7 세포로부터 제조되었다. RNA는 260㎚에서의 흡광도에 의해 정량화하였으며, 1:6 표준곡선은 150ng/반응으로 시작하여 LPS/IL-13 처리된 샘플로부터 작성되었다. 나머지 모든 샘플은 표준화시키기 위한 타크맨 EZ RT-PCR 키트(Applied Biosystems) 및 GAPDH mRNA 발현을 사용하여 Arg1, CAT1, CAT2A, CAT2B, CAT3, 및 CAT4에 대해 50ng/반응에서 시험하였다. 프라이머는 프라이머 발현 소프트웨어(Applied Biosystems)를 사용하여 디자인되었다. Arg1, CAT1, CAT3 및 CAT4에 대한 입력은 진뱅크(GenBank)로부터의 전체 mRNA 암호화 서열이었으며, 그 반면에 단지 CAT2A- 및 CAT2B-특이적 엑손이 CAT2의 경우에 사용되었다. 공공의 데이타베이스는 특이성을 보장하도록 프라이머 서열을 사용하여 탐색된 BLAST였다. 다음의 서열 (5'→3')에서 프라이머와 FAM-표지된/TAMRA-퀀칭된 프로브 올리고뉴클레오티드는 와이어스(Wyeth)에서 합성되었다:
프라이머
유전자 5' 프라이머 FAM 프로브 3' 프라이머
CAT1 서열번호 1,518 서열번호 1,519 서열번호 1,520
CAT2A 서열번호 1,521 서열번호 1,522 서열번호 1,523
CAT2B 서열번호 1,524 서열번호 1,525 서열번호 1,526
CAT3 서열번호 1,527 서열번호 1,528 서열번호 1,529
CAT4 서열번호 1,530 서열번호 1,531 서열번호 1,532
ARG1 서열번호 1,533 서열번호 1,534 서열번호 1,535
PCR 증폭은 EZ RT-PCR 키트에서 추천된 표준 40 사이클 매개변수를 사용하여 ABI 7700 서열 검출기(Applied Biosystems) 상에서 수행되었다. 역치 사이클 수를 사용하여 핑크(Fink) 등의 방법[참조: Fink et al., Nat. Medicine, 4:1329-1333, 1998]을 사용하는 발현의 지표를 생성시켰다. 레이저-보조된 세포 피킹 이후에 실시간 정량적 RT-PCR을 행하였다.
도 5는 CAT2A, CAT2B 및 ARG1 발현이 LPS 단독에 의해서는 근소하게 유도되는 반면에 LPS 및 IL-13의 조합에 의해서는 유의적으로 유도되는 것을 나타낸다.
실시예 6: LPS 및 IL -13으로 처리된 RAW264 .7 세포에서 아르기닌 섭취
RAW264.7 세포를 1×106으로 0.5㎖ cDME 내의 24-웰 조직배양 플레이트 상에 도말하였다. 2시간 동안 부착시킨 후에 LPS(Sigam) 및/또는 rhIL13(R&D Systems)을 함유하는 0.5㎖ 배지를 각각 1㎍/㎖ 및 10ng/㎖의 최종 농도로 첨가하였다. 5% CO2 및 95% 공기의 대기 중에서 37℃로 20시간 동안 배양한 후에 세포를 Arg 세척 완충액 #1(140mM 콜린 클로라이드, 5mM KCl, 0.9mM CaCl2, 1mM MgSO4, 5.6mM 글루코즈, 및 25mM HEPES, pH 7.4)로 3회 세척한 다음에 추가로 Arg 수송 완충액(137mM 콜린 클로라이드, 5.4mM KCl, 1.8mM CaCl2, 1.2mM MgSO4, 10mM HEPES, pH 7.4로 조정됨)으로 4회 세척하였다. 수송 완충액(0.5㎖)을 5mM L-로이신(Sigma), 및 400μM L-아르기닌 또는 100μM L-아르기닌의 최종 농도까지 L-아르기닌(Sigma)과 혼합된 38nM L-[2,3,4,5-3H]아르기닌(Amersham)을 첨가하고, 주위온도에서 3분 동안 배양하였다. 비-포화성 결합은 각각의 처리의 복제 웰을 5mM L-아르기닌을 함유하는 수송 완충액과 함께 배양함으로써 정량화하였다. CAT2 차단은 추가의 복제물에서 수송 완충액에 20mM L-아르기닌(Sigma)을 첨가함으로써 수행되었다. 빙냉된 Arg 세척 완충액 #2(137mM NaCl, 10mM 트리스, 10mM HEPES, pH 7.4)로 4회 세척하여 수송을 중단시켰다. 세포를 10mM HEPES, pH 7.4 중의 500㎕ 1.0% SDS로 용해시켰다. 단백질 정량분석은 마이크로-BCA 키트(Pierce)를 사용하여 수행되었으며, 400㎕의 용해물을 10㎖의 신틸레이션 유체에 현탁시키고, 유리 신틸레이션 바이알에 부하하여 1분 동안 방출을 계수하였다. 특이적 아르기닌 섭취는 포화성 결합(CPM/㎎ 단백질 400μM Arg) - 비포화성 결합(CPM/㎎ 단백질 5 mM Arg)으로 계산되었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 아르기닌 섭취는 RAW264.7 세포를 LPS 및 IL-13의 배합물로 처리함으로써 최적으로 유도된다. 그러나, 증가된 아르기닌 섭취는 아르기닌 수송에 대하여 CAT2의 경쟁적 억제제인 라이신에 의해서 억제된다(도 7).
실시예 7: LPS 및 IL -13으로 처리된 RAW264 .7 세포에서 우레아 생산
RAW264.7 대식세포를 아르기닌 수송시험(상기 참조)에 대한 것과 같은 24-웰 플레이트 내에서 자극하였다. 자극한 지 20시간 후에, 세포를 Arg 세척 완충액 #1로 3회 세척한 다음에 추가로 Arg 수송 완충액으로 4회 세척하였다. 세포를 5mM L-로이신, 400μM L-아르기닌 +/- 20mM L-라이신을 함유하는 Arg 수송 완충액 내에서 5% CO2 및 95% 공기의 대기하에 24시간 동안 37℃에서 배양하였다. 상등액은 12,000rpm에서 10분 동안 원심분리시킴으로써 청정화시키고, 100㎕를 300㎕/웰의 총용적으로 96-웰 시험 플레이트에서 1/10 스케일로 수행하는 것을 제외하고는 제조자의 지침에 따라서 UV 흡수 키트방법(R-Biopharma)를 사용하여 삼배수로 우레아에 대하여 시험하였다. 세포를 10mM HEPES, pH 7.4 중의 500㎕ 1.0% SDS로 용해시키고, 단백질은 마이크로-BCA 키트(Pierce)를 사용하여 정량분석하였다. 우레아 생성은 우레아 ㎍/단백질 용해물 ㎎로 표현되었다.
도 8은 LPS/IL-13 처리가 RAW264.7에서 우레아 생산을 증가시키는 것을 나타낸다. 도 6 및 7에서 나타낸 아르기닌 섭취 데이타와 마찬가지로, 증가된 우레아 생산은 아르기닌 수송에 대하여 CAT2의 경쟁적 억제제인 라이신에 의해서 억제된다.
실시예 8: ARG1 발현의 유도는 IL -4 수용체를 필요로 한다.
IL-4 수용체 녹아웃 마우스(IL4R-/-) 및 IL-4 녹아웃 마우스(IL4-/-)를 OVA에 대해 감작시키거나, 도 1에 기술된 바와 같이 PBS 또는 IL-13으로 처리하였다. 총 폐 RNA를 분리하여 실시예 2에 기술된 바와 같이 ARG1 발현에 대하여 분석하였다. 결과는 도 10에 나타내었다. mRNA 빈도는 ppm으로 표현된다.
실시예 9: 카바콜 -유도된 기관수축에 대한 라이신의 영향
8-10주령의 랫트를 이 실험을 위해서 사용하였다. 기관을 신속하게 절제하여 부착된 결합조직을 제거하였다. 각각의 기관을 3-4mm의 길이로 절단한 다음에, RPMI-1640 및 DMEM(v/v) 배지와 비히클인 로이신(25mM), 라이신(100mM) 또는 이들 둘다와의 혼합물 중에서 15-20시간 동안 배양하였다. 배지의 조성물(mM)은 0.1 비필수 아미노산, 4% FBS, 2.0 글루타민, 0.05 β-머캅토에탄올, 100U/㎖의 페니실린/100㎍/㎖의 스트렙토마이신을 포함하였다.
기관을 다음 조성(mM)의 크렙스-헨젤라이트(K-H) 용액(37℃) 15㎖가 충진된 이중-쟈켓의 유리 기관욕의 기저에 스테인레스 스틸 핀을 갖는 로드(rod)에 의해서 세로로 현수시켰다: 118 NaCl; 4.7 KCl; 1.2 KH2PO4; 11.1 덱스트로즈; 1.2 MgSO4; 2.8 CaCl2; 및 25 NaHCO3. 용액은 각각의 실험의 기간 중에 5% CO2 및 95% O2 혼합물로 연속적으로 가스 공급하였다. 상부 지지체는 실크사의 루프에 의해서 TSD125 힘변환기에 부착되었다. 기관 링의 장력에서의 변화는 MP150 시스템(BIOPAC Systems, Inc.)을 사용하여 동시에 기록하고, PC 컴퓨터 상에 표시하였다.
약물로 처리된 기관을 K-H 용액으로 10-분 간격을 두고 3회 세척하였다. 카바콜(10-8 내지 10-5M)-반응곡선을 작도하였다. 약제의 농도는 이전의 농도애 대한 수축반응이 안정화한 경우에만 증가시켰다.
각각의 실험의 종료시에 모든 기관을 거즈 패드 상에서 잘 빨아들이고, 평량하였다. 장력은 중량 ㎎당 장력의 ㎎(㎎/㎎)으로 계산되었으며, 약물의 부재하에서의 기관의 10-5M 카바콜-유도된 힘의 각각의 백분율(%)로서 표현된다. 모든 값은 평균±SE로 표현되었다. 이 효과에서는 스투던트 페어드(paired) t-시험이 사용되었다. 0.05 미만의 p 값은 유의적으로 간주되었다.
도 9에서 나타낸 바와 같이, 카바콜-유도된 랫트 기관 수축은 라이신에 의해서 억제된다.
실시예 10: 카바콜 -유도된 기관 수축은 CAT2 유전자의 결실에 의해서 감소된다.
CAT2 녹아웃 마우스(CAT2-/-)를 실시예 9에 기술된 바와 같이 처리하였다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 카바콜-유도된 기관 수축은 또한 CAT2 유전자의 결실에 의해서 억제되며, 이것은 추가로 염증성 질환의 병태생리학에 CAT2가 관련됨을 시사하는 것이다.
실시예 11: IL -13 시그날링 차단과 ARG1 mRNA 발현의 억제의 연관
Balb/C-처리 및 비처리 마우스를 OVA에 대해서 감작시키고, 실시예 1에 기술된 바와 같이 PBS, rIL-13 또는 sIL13Ra2.Fc으로 처리하였다. 총 폐 RNA를 분리하고, 실시예 2에 기술된 바와 같이 ARG1 발현에 대하여 분석하였다. 결과는 도 12에 나타내었다. mRNA 빈도는 ppm으로 표현된다.
본 발명은 도면 및 전술한 설명에서 상세하게 예시되고 기술되었지만, 이것은 특징에 있어서 예시적이지만 제한적이지는 않은 것으로 간주되며, 단지 바람직한 구체예가 제시되고 기술된 것으로 이해되고, 본 발명의 범주 내에 포함되는 모든 변화 및 변형을 보호받고자 한다.

Claims (20)

  1. 알러지성 또는 염증성 질환을 갖는 포유동물에게 질병에 걸린 조직 내의 아르기닌 대사경로의 성분의 활성 또는 발현을 억제하는 약제의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하고, 여기서, 상기 성분이 일산화질소 신타제(NOS)가 아닌 방법.
  2. 제1항에 있어서, 질환이 호흡기 질환인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 호흡기 질환이 천식, 만성 기도 리모델링 또는 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 약제가 성분, 또는 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 결합할 수 있는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 성분이 아르기나제인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 성분이 양이온성 아미노산 트랜스포터인 방법.
  7. 제4항에 있어서, 성분이 경로에서 아르기나제의 하위 성분인 방법.
  8. 제2항에 있어서, 약제가 RNA 간섭 또는 안티센스 메카니즘에 의해서 성분의 발현을 억제하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 약제가 RNA 간섭에 의해 조직 내에서 ARG1의 발현을 억제할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 약제가 RNA 간섭에 의해 조직 내에서 CAT2의 발현을 억제할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하는 방법.
  11. 제2항에 있어서, 약제가 α-디플루오로메틸오르니틴인 방법.
  12. 제2항에 있어서, 약제가 라이신 또는 양이온성 폴리펩티드인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 포유동물이 사람인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 사람이 천식 또는 COPD를 앓고 있으며, 성분은 아르기나제 또는 양이온성 아미노산 트랜스포터이고, 약제가 상기 성분 또는 상기 성분을 암호화한 폴리뉴클레오티드에 결합할 수 있는 방법.
  15. 아르기닌 대사경로의 비-NOS 성분 또는 상기 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 결합할 수 있는 분자를 천식 또는 또 다른 알러지성 또는 염증성 질환에 걸린 조직과 접촉시키고;
    상기 분자가 상기의 천식 또는 질환과 연관된 증후 또는 표현형을 개선시키거나 제거할 수 있는지 여부를 측정하는 단계를 포함하여, 알러지성 또는 염증성 질환을 치료하기 위한 약제를 동정하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 분자가 구조-기본 이상적 약물 디자인을 기초로 하거나, 화합물 라이브러리의 스크리닝을 기초로 선택되거나 생산되는 방법.
  17. 제15항에 있어서, 성분이 아르기나제 또는 양이온성 아미노산 트랜스포터인 방법.
  18. 포유동물의 생물학적 샘플에서 아르기닌 대사경로의 비-NOS 성분을 암호화하는 하나 이상의 유전자의 발현 프로필을 검출하고;
    상기의 발현 프로필을 상기의 하나 이상의 유전자의 참조 발현 프로필과 비교하여 포유동물이 알러지성 또는 염증성 질환을 갖거나 이에 대한 위험성이 있는지 여부를 측정하는 것을 포함하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 질환이 천식인 방법.
  20. 약제학적으로 허용되는 담체, 및 아르기닌 대사경로의 비-NOS 성분의 활성 또는 발현을 억제할 수 있는 약제를 포함하는 약제학적 조성물.
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