KR20220079621A - 척수 손상의 치료 및/또는 재수초화를 위한 펩타이드의 전신 투여 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 환자에게 전신 경로를 통해 투여되는 SCO-스폰딘 유래 펩타이드를 이용한 척수 손상 및/또는 시신경 손상과 같은 뇌를 제외한 신경계 손상의 치료 방법에 관한 것이다. 이러한 펩타이드는 아미노산 서열 X1-W-S-A1-W-S-A2-C-S-A3-A4-C-G-X2를 가지며, 서열에서 A1, A2, A3 및 A4는 아미노산 1-5개로 이루어진 아미노산 서열로 구성되고, X1 및 X2는 아미노산 1-6개로 이루어진 아미노산 서열로 구성되거나; 또는 X1 및 X2는 생략되며; N-말단 아미노산은 아세틸화되거나, C-말단 아미노산은 아미드화되거나, 또는 N-말단 아미노산은 아세틸화되고 C-말단 아미노산은 아미드화될 수 있다. 또한, 본 발명은 재수초화를 위한 상기한 펩타이드의 용도를 기술한다.

Description

척수 손상의 치료 및/또는 재수초화를 위한 펩타이드의 전신 투여
본 발명은 척수 손상 및/또는 시신경 손상과 같은 뇌 이외의 신경계 손상을 치료하기 위한 SCO-스폰딘 유래 펩타이드의 전신 투여에 관한 것이다. 또한, 척수 손상 등의 척수병증, 및 척수 또는 중추 신경계와 관련한 다른 형태의 척수병증에서의 재수초화 (remyelination)를 위한 SCO-스폰딘 유래 펩타이드의 전신 투여에 관한 것이다.
척수 손상 (SCI)은 불완전/완전한 감각-운동 마비를 동반한 높은 이환율을 야기한다. 일차 손상은 괴사와 출혈을 유발하며, 신경아교증을 비롯한 2차 손상으로 이어진다.
외상성 시신경 손상은 전세계적으로 비가역적인 실명을 유발하는 주 요인으로서, 진행성 시각 장애를 유발한다. 지금까지, 약리학적 또는 외과적 개입도 시력 상실의 진행을 멈추거나 또는 회복하기에 충분하지 않다. 축삭돌기 재생은 시신경 손상 후 기능적인 시력 회복에 중요하다. 시신경 손상은 일차 기전 및 2차 기전에 의해 발생할 수 있다. 일차 손상은 기계적 전단, 좌상 및 신경 축삭돌기의 허혈성 괴사로부터 충격을 받는 순간에 축삭돌기의 영구적인 손상에 의한 것이다. 2차 기전은 세포자살, 부종 및 세포 사멸로 인한 것이며, 처음 충격 후 추가적인 축삭돌기 손상으로 이어지는 다양한 기전들을 통합한다 (Schmidek and Sweet, Operative Neurosurgical Techniques (Sixth Edition), 2012, Pages 2329-2338). 신경계는 2가지 영역으로 나뉜다: 말초 신경계와 중추 신경계. 손상된 말초 신경은 손상된 후 재생될 수 있지만, 다양한 저해 인자들이 손상 후 시신경과 척수의 재생을 방해한다. 그래서, 척수 및/또는 시신경 손상의 치료에 충족되지 못한 중대한 의학적 요구들이 존재한다.
척수 및 시신경은 뇌척수액 (CSF)으로 둘러싸여 있으며, 특히 혈액 뇌 장벽 (BBB), 혈액 척수 장벽 및 혈액 시신경 장벽 (이하 "혈액 장벽"으로 지칭함)에 의해 혈액과 분리되어 있다.
펩타이드는 안전성, 표적 특이성 및 효능으로 인해, 점차 다수의 질환 상황에서 치료제를 개발하기 위해 선택하는 치료 방식이 되고 있다. 치료학적 펩타이드의 주요 제한 중 한가지는 짧은 반감기이며, 그래서 생체이용성이 낮다. CNS 병태용 치료학적 펩타이드를 개발하는데 있어 다른 중요한 문제는 특히 혈액 뇌 장벽 (BBB), 혈액 척수 장벽 및 혈액 시신경 장벽과 같은 생물학적 장벽을 통한 침투성이 낮다는 것이다.
SCO-스폰딘 유래 펩타이드는 신경재생 특성, 특히 세포 생존 및 신경돌기 생장을 시험관내에서 개선하는 능력에 대해 개시되어 있다. NX210 SCO-스폰딘 유래 펩타이드는 콜라겐 튜브에서 병소 부위에 직접 투여할 경우 랫 SCI 모델에서 축삭돌기 재성장을 개선하는 것으로 입증된 바 있다 (Sakka et al. 2014, Plos One 9(3): e93179). 동일 저자는 NX210이 병변에 투여시 랫의 SCI 좌상 모델에서 기능적인 회복을 현저하게 개선한다는 것을 입증하였다.
본 발명자들은 SCO-스폰딘 유래 펩타이드가 전신 경로를 통해 투여할 수 있으며, 척수 손상 및 시신경 손상과 같은 뇌를 제외한 신경계 손상을 치료하는데 효능을 유지할 수 있다는 것을, 예상치 못하게도 알게 되었다. 이는, SCO-스폰딘 유래 펩타이드가 충분한 시간 동안 혈액 순환계에 잔류할 수 있으며, 혈액 장벽을 통해 충분한 수준으로 통과해 손상, 특히 척수 및/또는 시신경의 1차 및/또는 2차 손상의 영향을 줄일 수 있으며, 이러한 손상 후, 특히 척수 및/또는 시신경의 손상 후 회복을 돕거나 또는 개선할 수 있는 것으로 입증되었음을 의미한다.
본 발명의 펩타이드는 전신 투여가 특정 상황에서 예상치 못하게도 효과적이다. 이는, 전신 투여가 치료할 환자에게 더 안전하고 더 편리하므로, 병변 부위에의 직접 투여 또는 CSF (척수강내 또는 척수내 주사)에의 직접 투여를 능가하는 상당한 이점을 제공한다. 이러한 투여 방식의 중요한 또는 유익한 측면은, 건강 전문가가 주어진 환자에 대해 시간 경과에 따라 반복 투여 가능하다는 것이다. 이러한 투여 방식의 또 다른 중요한 또는 유익한 성과는, 상당한 조기 치료가 특히 응급 치료 과정 시점에 특히 신경아교세포 반흔이 생기기 전에 가능하고, 환자가 치료를 수용하기 용이하다는 것이다. 펩타이드는 관류를 비롯해 주사 또는 주입을 통해 쉽게 투여할 수 있다 (관류 방식은 펩타이드 전용이거나 또는 전용이 아니며, 그래서 다른 제품을 투여하는데 이용되는 관류도 유익하게 이용할 수 있음). 조기 치료가 처음 세포 사멸로 인한 독성과 2차 손상을 감소 또는 저해할 수 있는 것으로 보인다. 또한, 본 발명자들은, 전신 투여 후 병변 수준에서 이들 펩타이드의 생체이용성으로 인해 펩타이드의 과도한 다량 투여가 필요 없다는 것을, 알게 되었다. 이로써 이러한 손상 후 펩타이드의 전신 투여는 환자에게 매우 편리하고 유망하다.
뇌량 (corpus callosum)의 국소 병변 마우스 모델에서, 본 발명에 따른 펩타이드의 전신 투여는 마이엘린 결합 단백질 수준에서 확인된 바와 같이 재수초화, (마이엘린 수초를 합성하는데 필요한) Olig2-양성 전구 세포 동원 (progenitor recruitment) 및 Olig2-양성 세포의 생성에 유익한 효과를 발휘하였다. 이에, 본 발명에 따른 SCO-스폰딘 유래 펩타이드의 전신 투여는 척수 손상 등의 척수병증 및 척수 또는 CNS와 관련한 다른 형태의 척수병증에서 재수초화를 위해 이용할 수 있다.
이에, 본 발명의 과제는 척수 손상 및/또는 시신경 손상과 같은 뇌를 제외한 신경계 손상을 치료하는데 사용하기 위한, SCO-스폰딘의 트롬보스폰딘 리피트 (TR 또는 TSR)로부터 유래한 하나 이상의 펩타이드(들), 또는 SCO-스폰딘의 TR로부터 유래한 하나 이상의 펩타이드(들)를 포함하는 약학적 조성물이며, 펩타이드(들)는 환자에게 전신 경로를 통해 투여된다.
본 발명의 다른 과제는 펩타이드(들)를 전신 경로를 통해 환자에게 투여하는 것을 포함하는, SCO-스폰딘의 TR로부터 유래한 하나 이상의 펩타이드(들)를 유효량 또는 충분량으로 이를 필요로 하는 환자에게 척수 및/또는 시신경과 같은 뇌를 제외한 손상된 신경계에 전달하는데 이용하기 위한, SCO-스폰딘의 TR로부터 유래한 하나 이상의 펩타이드(들), 또는 SCO-스폰딘의 TR로부터 유래한 하나 이상의 펩타이드(들)를 포함하는 약학적 조성물이다. 이러한 전달이 펩타이드(들)가 뇌척수액에 도달할 수 있게 하는 것으로 보인다. 이러한 전달은 또한 전달된 펩타이드(들)가 이를 필요로 하는 환자에서 척수 손상 및/또는 시신경 손상을 치료 가능하게 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 과제는 척수 손상 및/또는 시신경 손상과 같은 뇌를 제외한 신경계 손상을 치료하기 위해 환자에게 전신 투여하기 위한 약학적 조성물의 제조에 있어, SCO-스폰딘의 TR로부터 유래한 하나 이상의 펩타이드(들)의 용도이다.
본 발명의 다른 과제는 SCO-스폰딘의 TR로부터 유래한 하나 이상의 펩타이드(들) 또는 이들 펩타이드(들)를 포함하는 약학적 조성물을 유효량 또는 충분량으로 전신 경로를 통해 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 필요한 환자에서 척수 손상 및/또는 시신경 손상과 같은 뇌를 제외한 신경계 손상을 치료하는 방법이다.
본 발명의 다른 과제는 펩타이드(들)를 환자에게 전신 경로를 통해 투여하는 것을 포함하는, 필요한 환자에서 척수 및/또는 시신경과 같은 뇌를 제외한 손상된 신경계에, 특히 뇌척수액에 SCO-스폰딘의 TR로부터 유래한 하나 이상의 펩타이드(들)를 유효량 또는 충분량으로 전달하는 방법이다. 이러한 전달은 전달된 펩타이드(들)가 필요한 환자에서 척수 손상 및/또는 시신경 손상을 치료하게 허용하는 것을 또한 특징으로 할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명에 따른 펩타이드의 전신 투여는, 예를 들어 마이엘린 결합 단백질 및/또는 Olig2-양성 전구 세포의 동원 및/또는 Olig2-양성 세포 생성 측정을 이용해 평가할 수 있는 바와 같이, 수초화 또는 재수초화에 유익한 효과를 가진다.
본 발명의 다른 과제는 척수 손상을 비롯한 척수병증 및 척수 또는 CNS와 관련한 다른 형태의 척수병증에서 재수초화에 이용하기 위한, SCO-스폰딘의 트롬보스폰딘 리피트 (TR 또는 TSR)로부터 유래한 하나 이상의 펩타이드(들), 또는 SCO-스폰딘의 TR로부터 유래한 하나 이상의 펩타이드(들)를 포함하는 약학적 조성물이며, 이 경우 펩타이드(들)는 환자에게 전신 경로를 통해 투여된다.
본 발명의 다른 과제는 SCO-스폰딘의 TR로부터 유래한 하나 이상의 펩타이드(들), 또는 펩타이드(들)를 포함하는 약학적 조성물을 유효량 또는 충분량으로 전신 경로를 통해 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 필요한 환자에서 척수병증을 치료하는 방법 또는 재수초화를 달성하는 방법이다. 이러한 척수병증의 치료 방법은 재수초화를 포함한다. 척수병증은 척수 손상, 및 척수 또는 CNS와 관련한 다른 형태의 척수병증을 포함한다.
이제 본 발명은 도면을 참조하여 비-제한적인 예를 들어 보다 상세히 설명될 것이다.
도 1: 비히클 처리 마우스 (n=8) 및 NX210 처리 마우스 (n=7)에서 BMS 스코어로 나타낸, 오픈 필드 운동 검사를 이용한 T8 등쪽 반측절단 (척수 손상) 후 하지 기능 회복 평가. *: p<0.05, **: p<0.01, ***: p<0.001. 이원식 ANOVA 및 후속적인 본페로니의 사후 검정.
도 2: 비히클 처리 마우스 (n=8) 및 NX210 처리 마우스 (n=7)에서 BMS 서브스코어로 나타낸, 오픈 필드 운동 검사를 이용한 T8 등쪽 반측절단 (척수 손상) 후 하지 기능 회복 평가. *: p<0.05, **: p<0.01. 이원식 ANOVA 및 후속적인 본페로니의 사후 검정.
도 3: 비히클 처리 마우스 (n=3) 및 NX210 처리 마우스 (n=5)에서 면역형광을 이용한 손상부의 앞쪽 1000 ㎛ 및 뒷쪽 1000 ㎛에서의, T8 등쪽 반측절단 (척수 손상) 후 마이엘린 염기성 단백질 (MBP)의 염색 강도 분석.
도 4: 비히클 처리 마우스 (n=8) 및 4 mg/kg (n=9), 8 mg/kg (n=7) 및 16 mg/kg (n=8) 처리 마우스에서 BMS 스코어로 나타낸, 오픈 필드 운동 검사를 이용한 T8 등쪽 반측절단 (척수 손상) 후 하지 기능 회복 평가. @ 또는 * 또는 #: p<0.05, ** 또는 ##: p<0.01. 이원식 ANOVA 및 후속적인 본페로니의 사후 검정.
도 5: 비히클 처리 마우스 (n=8) 및 4 mg/kg (n=9), 8 mg/kg (n=7) 및 16 mg/kg (n=8) 처리 마우스에서 BMS 서브스코어로 나타낸, 오픈 필드 운동 검사를 이용한 T8 등쪽 반측절단 (척수 손상) 후 하지 기능 회복 평가. * 또는 #: p<0.05, **: p<0.01. 이원식 ANOVA 및 후속적인 본페로니의 사후 검정.
도 6: 시험관내 글루타메이트-유발성 흥분 독성에 대한 NX210 및 NX218 (NX210 산화된 형태) 펩타이드에 의한 랫 피질 뉴런의 보호. E15 랫 배아로부터 분리한 일차 피질 뉴런에 13일에 20분간 시험관내에서 글루타메이트 (glu, 20 μM)와, 비히클, NX210 또는 NX218 (100, 250, 500 ㎍/mL)을 20분간 공동-처리하였다. 2일 후, 뉴런을 고정하고, 뉴런 마커 미소관 관련 단백질-2 (MAP-2)로 염색하였다. A. 뉴런 생존성을 MAP-2-양성 뉴런 개수로 평가하였다. B. 신경돌기 네트워크를 MAP-2-양성 뉴런의 누적 신경돌기 길이로 평가하였다. A, B. 데이터는 중앙값 및 사분위 범위로 나타낸다. 크루스칼-왈리스 및 후속적인 둔 검정: ###p<0.001 대조군 vs glu; ***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05 glu vs glu + NX; $$p<0.01, $p<0.05 NX210 vs NX218, n=5-6.
도 7: 비히클-처리 마우스 (n=7) 및 NX210 (n=8) 또는 NX218 (n=8) 5 mg/kg 처리 마우스에서 자기 공명 이미징 (MRI)을 이용한 리소레시틴 (lysolecithin) 주사 후 병변 용적 추이. 이원식 ANOVA 및 후속적인 본페로니의 사후 검정.
도 8: 비히클-처리 마우스 (시기별 n=3) 및 NX210 (시기별 n=3) 또는 NX218 (시기별 n=3) 5 mg/kg 처리 마우스에서 마이엘린 결합 단백질 (MBP)의 면역염색을 이용한 리소레시틴 주사 후 병변 면적 평가. 병변 면적은 동측 뇌량 (CC)의 %로 나타낸다. *: p<0.05, t-검정.
도 9: 비히클-처리 마우스 (시기별 n=3) 및 NX210 (시기별 n=3) 또는 NX218 (시기별 n=3) 5 mg/kg 처리 마우스에서 Olig2 면역염색을 이용한 리소레시틴 주사 후 뇌량 (CC)에서의 Olig2-양성 세포의 밀도 평가. *: p<0.05, t-검정.
도 10: 원숭이에서 NX210 IV 투여 후 PK 프로파일 (NX 210 10 mg/kg 볼루스 IV 주사). NX218 (NX210 고리 형태)의 평균 원숭이 혈장 농도 (ng/mL)를 십진 로그 스케일로 y 축에 나타낸다.
"SCO-스폰딘"은 중추 신경계 특이 당단백질로서, 전척 (prochordal)에서 인간에 이르는 모든 척추동물에 존재한다. 이것은 하부-연결 기관인 제3 뇌실의 루프에 위치한 특정 기관에 의해 분비되는 세포외 매트릭스 분자로 알려져 있다. 이것은 큰 크기의 분자이다. 이는 아미노산 4,500개 이상으로 구성되며, 특히 26종의 TR 또는 TSR 패턴을 비롯한 다양한 보존된 단백질 패턴을 포함하는 다중-모듈 방식으로 구성된다. TSR 패턴으로부터 시작하는 SCO-스폰딘 유래 일부 펩타이드는 신경 또는 신경 세포에서 생물학적 활성을 가지는 것으로 알려져 있다 (특히 WO-99/03890에 기술됨).
"TSR 또는 TR 패턴"은 보존된 아미노산 시스테인, 트립토판 및 아르기닌 정렬을 기본으로, 대략 잔기 55-60개로 이루어진 단백질 도메인이다. 이들 패턴은 응고에 개입하는 분자인 TSP-1 (트롬보스폰딘 1)에서 처음으로 분리되었다. 이후 이는 SCO-스폰딘과 같은 여러가지 다른 분자들에서도 언급되었다. 실제, 이 트롬보스폰딘 타입 1 유닛 (TSR)은 지금까지 연구된 이전에 언급된 모든 단백질들에서 약 55-60개의 아미노산 (AA)을 포함하며, 이중 일부는 시스테인 (C), 트립토판 (W), 세린 (S), 글리신 (G), 아르기닌 (R) 및 프롤린 (P)과 같이 매우 보존되어 있다.
"전신 투여"는 투여된 펩타이드(들) 또는 펩타이드 화합물(들)이 전신 투여 후 혈액 순환계에서 상당량 또는 충분량을 달성하는 임의의 투여 방식을 의미한다. 척수강내 투여뿐 아니라 펩타이드를 혈액 순환계로 표적화 하지 않는 임의의 전신 투여 방식은 제외된다. 본 발명의 전신 투여 경로는 "혈액-표적화된 전신 투여 경로"로 한정할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 펩타이드 또는 펩타이드 화합물의 맥락에서, 펩타이드 또는 펩타이드 화합물은 일단 혈액 순환계에서 BBB, 혈액 척수 장벽 및/또는 혈액 시신경 장벽과 같은 혈액 장벽을 통과할 수 있다.
"펩타이드", "펩타이드들" 또는 "펩타이드(들)"의 투여 또는 사용은 관용적인 표현이며, 본 발명은 하나의 단일 펩타이드 또는 하나 보다 많은 단일 펩타이드의 투여 또는 사용, 즉 본 발명에 따른 2종 이상의 펩타이드의 투여 또는 사용을 망라한다. 이에, 본 발명에서, 단수 형태 또는 복수 형태는 달리 지시되지 않은 한 제한되지 않으며, 각각 하나의 단일 펩타이드 또는 적어도 2종의 펩타이드를 망라할 수 있다. 이는 "펩타이드"와 상호 호환적으로 사용될 수 있는, 동일한 표현 "펩타이드 화합물"에도 동일하게 적용된다.
"척수 손상"은 특히 척추 절단 또는 압박으로 인한 모든 손상을 의미한다. 척추 절단은 외상 또는 수술에 의해 발생할 수 있다. 척추 압박은 외상에 의해 또는 척추 종양 또는 척추 전이와 같은 주변 세포의 증식으로 인해 이차적으로 발생할 수 있다. 척추 압박은 또한 경추 관절염성 척수병증 또는 슈나이더 증후군과 같은 척수 환경에 영향을 미치는 질환으로 인해 발생할 수 있다. 척추 압박은 요추, 흉추 및/또는 경추 부위에 발생할 수 있으며, 환자의 손상 경과는 위치에 따라 다를 것이다.
"시신경"은 시각 세상에서부터 뇌로 정보를 전달하는 특수 감각 신경이다. 시신경은 발생학적으로 전뇌의 파생물로부터 유래하며, 그래서 중추 신경계 (CNS)의 일부이고, CNS 섬유로 (fiber tract)로 구성된다. Liang Li 등의 문헌 Frontiers in Cellular Neuroscience, April 2020, vol 14, article 109)에는 마우스 시신경 크러쉬 (ONC) 모델이 중추 신경계 (CNS)의 축삭돌기 손상 및 회복을 연구하기 위해 널리 사용되고 있음을 기술되어 있다.
ONC는 퇴행 기전을 연구하고 신경보호 및 재생 요법을 평가하기 위해 이용할 수 있는 CNS 신경퇴행 모델을 제공해준다. 반면, SCI 또는 CNS 손상 모델의 결과는 시신경 손상에 유용한 것으로 여겨진다.
"시신경 손상"은 시신경의 외상 또는 수술 또는 압박으로 인해 발생하는 병태를 의미하며, 시력 저하 또는 상실로 이어질 수 있다.
"손상"은 경미한 손상, 중등도의 손상 또는 중증 손상, 특히 척수 또는 시신경이 일부 또는 완전히 절단된 손상일 수 있다.
척수 또는 CNS와 관련한 척수병증은 특히 척수 손상, 시신경 손상, 외상성 뇌 손상, 다발성 경화증, 백신 접종 후 척수병증, 감염성 척수병증, 바이러스성 척수병증을 포함한다.
척수 손상 및/또는 시신경 손상과 같은 뇌를 제외한 신경계 손상에 대한 "치료" 또는 "치료한다"는 본 발명에 따른 펩타이드 화합물을 소정량 전달하고, 일차적인 신경 사멸 및/또는 축삭돌기 변성의 저해 또는 감소; 및/또는 일차적인 세포 사멸로 인한 독성의 감소 또는 저해; 및/또는 손상으로 인한 이차적인 결과의 감소 또는 저해; 및/또는 신경 세포 및/또는 축삭돌기의 재생 측면에서 이점 획득; 및/또는 환자의 기능 회복 측면에서 이점 획득 등의, 손상, 특히 척수 및/또는 시신경 손상으로 인한 한가지 또는 수종의 유해 효과를 저해하는 측면에서, 일차 손상 및/또는 이차 손상에 대해 우호적인 효과를 달성하는 것을 의미한다.
본 발명을 수행하는데 유용한 SCO-스폰딘의 TR로부터 유래한 펩타이드 또는 펩타이드 화합물에 대한 설명 (본 발명의 다른 과제, 즉 펩타이드 용도, 사용 방법, 치료 방법, 의약제 제조에 있어 펩타이드의 용도 등)
구체적으로, 본 발명은 하기 서열의 펩타이드를 이용한다:
X1-W-S-A1-W-S-A2-C-S-A3-A4-C-G-X2 (서열번호 1)
서열번호 1에서:
A1, A2, A3 및 A4는 아미노산 1-5개로 이루어진 아미노산 서열로 구성되고,
시스테인 2개가 이황화 결합을 형성하거나 또는 형성하지 않으며,
X1 및 X2는 아미노산 1-6개로 이루어진 아미노산 서열로 구성되거나; 또는 X1 및 X2는 생략되고;
N-말단 아미노산은 아세틸화되거나 (예를 들어, H3CCOHN-을 가짐), C-말단 아미노산은 아미드화되거나 (예를 들어, -CONH2를 가짐), 또는 N-말단 아미노산은 아세틸화되고 C-말단 아미노산은 아미드화될 수 있다.
일 구현예에서, 서열번호 1의 식에서, X1 또는 X2 또는 X1과 X2 둘다 생략된다. 일 구현예에서, X1 및/또는 X2가 생략되는 경우, N-말단 W는 아세틸화되거나 및/또는 C-말단 G는 아미드화된다. 바람직하게는, X1과 X2 둘다 생략되고, N-말단 W는 아세틸화되고, C-말단 G는 아미드화된다.
특히, 본 발명은 하기 서열의 펩타이드를 이용한다:
W-S-A1-W-S-A2-C-S-A3-A4-C-G (서열번호 2)
서열번호 2에서:
A1, A2, A3 및 A4는 아미노산 1-5개로 이루어진 아미노산 서열로 구성되고,
시스테인 2개가 이황화 결합을 형성하거나 또는 형성하지 않는다.
서열번호 1 및 2의 식에 대한 일 구현예에서, 펩타이드는 선형 펩타이드이거나, 또는 서열번호 1 및 2의 펩타이드 식에 존재하는 시스테인은 이황화 결합을 형성하지 않는다 (환원된 형태).
다른 구현예에서, 서열번호 1 및 2의 펩타이드 식에 존재하는 시스테인은 이황화 결합을 형성한다 (산화된 형태).
바람직하게는, 서열번호 1 및 2의 식에서, A1, A2, A3 및/또는 A4, 바람직하게는 및 A4는 바람직하게는 아미노산 1 또는 2개, 더 바람직하게는 아미노산 1개로 구성된다.
바람직하게는, A1은 G, V, S, P 및 A로부터, 더 바람직하게는 G, S로부터 선택된다.
바람직하게는 A2는 G, V, S, P 및 A로부터, 더 바람직하게는 G, S로부터 선택된다.
바람직하게는, A3는 R, A 및 V로부터, 더 바람직하게는 R, V로부터 선택된다.
바람직하게는, A4는 S, T, P 및 A로부터, 더 바람직하게는 S, T로부터 선택된다.
바람직하게는, A1 및 A2는 독립적으로 G 및 S로부터 선택된다.
바람직하게는, A3-A4는 R-S 또는 V-S 또는 V-T 또는 R-T로부터 선택된다.
X1이 아미노산 1-6개로 된 아미노산 서열일 경우, 이들 아미노산은 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 V, L, A, P 및 이들의 임의 조합으로부터 선택된다.
X2가 아미노산 1-6개로 된 아미노산 서열일 경우, 이들 아미노산은 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 L, G, I, F 및 이들의 임의 조합으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 서열번호 1 또는 2의 펩타이드는, A1 및 A2가 독립적으로 G 및 S로부터 선택되고, A3-A4가 R-S 또는 V-S 또는 V-T 또는 R-T로부터 선택되는 것이다. 구체적인 양상으로, 펩타이드는 추가로 아세틸화 및/또는 아미드화된다. 일 구현예에서, 펩타이드는 선형 펩타이드이거나, 또는 시스테인은 이황화 결합을 형성하지 않는다. 다른 구현예에서, 펩타이드는 이황화 결합을 형성하는 (C-말단 고리화) 시스테인 2개를 가진다. 다른 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 펩타이드 또는 전신 경로를 통해 환자에게 투여되는 펩타이드는 이들 2가지 형태 모두, 즉 산화된 펩타이드 및 선형 펩타이드를 포함한다.
본 발명의 목적에서, 용어 "아미노산"은 천연 아미노산 및 비-천연 아미노산을 모두 의미하며, 천연에서 비-천연을 아우르는 아미노산의 변형은 본래의 펩타이드의 기능 또는 효능은 유지하면서 당업자가 통상적으로 행할 수 있다. "천연 아미노산"은 천연 단백질에서 발견할 수 있는 L 형태의 아미노산, 즉 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인; 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린을 의미한다. "비-천연 아미노산"은 상기한 아미노산의 D 형태뿐 아니라 아르기닌, 라이신, 페닐알라닌 및 세린과 같은 특정 아미노산의 호모 형태 또는 루신 또는 발린의 nor 형태를 의미한다. 이러한 정의는 또한 α-아미노부티르산, 아그마틴, α-아미노이소부티르산, 사르코신, 스타틴, 오르니틴, 데아미노티로신과 같은 기타 아미노산도 포괄한다. 펩타이드 서열을 나타내기 위해 사용되는 명명법은 한문자 코드를 이용하는 국제 명명법이며, 아미노-말단은 좌측에, 카르복시-말단은 우측에 나타낸다. 대시 "-"는 서열의 아미노산을 연결하는 일반적인 펩타이드 결합을 표시한다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 펩타이드, 예를 들어 서열번호 1-63의 펩타이드들 중 어느 하나는 N-말단 아세틸화, C-말단 아미드화, 또는 N-말단 아세틸화와 N-말단 아세틸화를 둘다 포함한다.
여러가지 구현예들에서, 본 발명은 하기 아미노산 서열 (표 1)로 구성되거나 또는 이들로 필수적으로 구성되는 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다:
표 1:
W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G 서열번호 3
W-S-S-W-S-G-C-S-R-S-C-G 서열번호 4
W-S-S-W-G-S-C-S-R-S-C-G 서열번호 5
W-S-S-W-G-G-C-S-R-S-C-G 서열번호 6
W-S-S-W-S-S-C-S-R-S-C-G 서열번호 7
W-S-G-W-S-G-C-S-R-S-C-G 서열번호 8
W-S-G-W-G-S-C-S-R-S-C-G 서열번호 9
W-S-G-W-G-G-C-S-R-S-C-G 서열번호 10
W-S-S-W-S-S-C-S-V-S-C-G 서열번호 11
W-S-S-W-S-G-C-S-V-S-C-G 서열번호 12
W-S-S-W-G-S-C-S-V-S-C-G 서열번호 13
W-S-S-W-G-G-C-S-V-S-C-G 서열번호 14
W-S-G-W-S-S-C-S-V-S-C-G 서열번호 15
W-S-G-W-S-G-C-S-V-S-C-G 서열번호 16
W-S-G-W-G-S-C-S-V-S-C-G 서열번호 17
W-S-G-W-G-G-C-S-V-S-C-G 서열번호 18
W-S-S-W-S-S-C-S-V-T-C-G 서열번호 19
W-S-S-W-S-G-C-S-V-T-C-G 서열번호 20
W-S-S-W-G-S-C-S-V-T-C-G 서열번호 21
W-S-S-W-G-G-C-S-V-T-C-G 서열번호 22
W-S-G-W-S-S-C-S-V-T-C-G 서열번호 23
W-S-G-W-S-G-C-S-V-T-C-G 서열번호 24
W-S-G-W-G-S-C-S-V-T-C-G 서열번호 25
W-S-G-W-G-G-C-S-V-T-C-G 서열번호 26
W-S-S-W-S-S-C-S-R-T-C-G 서열번호 27
W-S-S-W-S-G-C-S-R-T-C-G 서열번호 28
W-S-S-W-G-S-C-S-R-T-C-G 서열번호 29
W-S-S-W-G-G-C-S-R-T-C-G 서열번호 30
W-S-G-W-S-S-C-S-R-T-C-G 서열번호 31
W-S-G-W-S-G-C-S-R-T-C-G 서열번호 32
W-S-G-W-G-S-C-S-R-T-C-G 서열번호 33
W-S-G-W-G-G-C-S-R-T-C-G 서열번호 34
일 구현예에서, 표 1에 기술된 서열번호 3-34 서열의 펩타이드는 선형 펩타이드이거나, 또는 시스테인은 이황화 결합을 형성하지 않는다 (환원된 펩타이드). 다른 구현예에서, 상기 표에 기술된 서열번호 3-34 서열의 펩타이드는 이황화 결합을 형성하도록 산화된 시스테인 2개를 가진다 (산화된 펩타이드). 다른 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 펩타이드 또는 환자에게 전신 경로를 통해 투여되는 펩타이드는 2가지 형태 둘다, 즉 펩타이드 서열이 동일한, 산화된 펩타이드와 선형 펩타이드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 펩타이드 또는 환자에게 전신 경로를 통해 투여되는 펩타이드는 서열번호 3-34의 서열들로부터 선택되는 2종 이상의 서로 다른 펩타이드들의 혼합물을 포함하며, 혼합물은 2종 이상의 선형 펩타이드들로 된 혼합물 또는 2종 이상의 산화된 펩타이드들로 된 혼합물, 또는 예를 들어 동일한 아미노산 서열을 가진, 하나 이상의 선형 펩타이드와 하나 이상의 산화된 펩타이드의 혼합물일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 펩타이드는 아미노산 서열 W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (서열번호 3)로 구성된다. 일 구현예에서, 펩타이드는 선형 펩타이드이거나, 또는 시스테인은 이황화 결합을 형성하지 않는다 (환원된 형태). 다른 구현예에서, 펩타이드는 이황화 결합을 형성하도록 산화된 시스테인 2개를 가진다 (산화된 형태). 다른 구현예에서, 본 발명에서 이용하는 펩타이드 또는 환자에게 전신 경로를 통해 투여하는 펩타이드는 이들 2가지 형태 둘다, 즉 산화된 형태와 환원된 형태를 모두 포함한다.
서열번호 1의 펩타이드에 대한 일 구현예에서,
- X1은 수소 원자 또는 P 또는 A-P 또는 L-A-P 또는 V-L-A-P이고, 및/또는
- X2는 수소 원자 또는 L 또는 L-G 또는 L-G-L 또는 L-G-L-I 또는 L-G-L-I-F이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 하기 아미노산 서열 (표 2)로 구성되거나 또는 이로 필수적으로 구성되는 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다:
표 2:
P-W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G 서열번호 35
A-P-W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G 서열번호 36
L-A-P-W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G 서열번호 37
V-L-A-P-W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G 서열번호 38
W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G-L 서열번호 39
W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G-L-G 서열번호 40
W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G-L-G-L 서열번호 41
W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G-L-G-L-I 서열번호 42
W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G-L-G-L-I-F 서열번호 43
P-W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G-L 서열번호 44
P-W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G-L-G 서열번호 45
P-W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G-L-G-L 서열번호 46
P-W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G-L-G-L-I 서열번호 47
P-W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G-L-G-L-I-F 서열번호 48
A-P-W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G-L 서열번호 49
A-P-W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G-L-G 서열번호 50
A-P-W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G-L-G-L 서열번호 51
A-P-W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G-L-G-L-I 서열번호 52
A-P-W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G-L-G-L-I-F 서열번호 53
L-A-P-W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G-L 서열번호 54
L-A-P-W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G-L-G 서열번호 55
L-A-P-W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G-L-G-L 서열번호 56
L-A-P-W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G-L-G-L-I 서열번호 57
L-A-P-W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G-L-G-L-I-F 서열번호 58
V-L-A-P-W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G-L 서열번호 59
V-L-A-P-W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G-L-G 서열번호 60
V-L-A-P-W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G-L-G-L 서열번호 61
V-L-A-P-W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G-L-G-L-I 서열번호 62
V-L-A-P-W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G-L-G-L-I-F 서열번호 63
일 구현예에서, 표 2에 기술된 서열번호 35-63 서열 또는 표 1 + 2에 기술된 서열번호 3-63 서열의 펩타이드는 선형 펩타이드이거나, 또는 시스테인은 이황화 결합을 형성하지 않는다 (환원된 펩타이드). 다른 구현예에서, 펩타이드는 이황화 결합을 형성하도록 산화된 시스테인 2개를 가진다 (산화된 펩타이드). 다른 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 펩타이드 또는 환자에게 전신 경로를 통해 투여되는 펩타이드는 2가지 형태 둘다, 즉 펩타이드 서열이 동일한, 산화된 펩타이드와 선형 펩타이드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명에서 이용되는 펩타이드 또는 환자에게 전신 경로를 통해 투여되는 펩타이드는 서열번호 35-63 또는 3-63의 서열들로부터 선택되는 2종 이상의 서로 다른 펩타이드들의 혼합물을 포함하며, 혼합물은 2종 이상의 선형 펩타이드들로 된 혼합물 또는 2종 이상의 산화된 펩타이드들로 된 혼합물, 또는 예를 들어 동일한 아미노산 서열을 가진, 하나 이상의 선형 펩타이드와 하나 이상의 산화된 펩타이드의 혼합물일 수 있다.
서열번호 3-63 서열을 가진 펩타이드들은 각각 아세틸화되거나, 또는 아미드화되거나, 또는 아세틸화 및 아미드화될 수 있다.
본 발명에서, 본 발명에서 사용되는 펩타이드 또는 환자에게 전신 경로를 통해 투여되는 펩타이드는 이의 아미노산 서열로 정의된다. 사용되는 펩타이드는 본원에 기술된 펩타이드 하나일 수 있거나, 또는 본원에 기술된 펩타이드 2종 이상의 혼합물일 수 있다. 또한, 혼합물은 아미노산 서열이 동일하거나 또는 상이한, 선형 펩타이드와 산화된 펩타이드의 혼합물을 포괄한다. 100% 순수한 펩타이드를 본 발명에 따라 이용할 수 있다면, 펩타이드는 순도가 >80%, 바람직하게는 >85%, 더 바람직하게는 >90%, 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상이 가능하며, 본 발명에 포함된다. 통상적인 정제 방법, 예를 들어 크로마토그래피에 의한 정제 방법을 이용해, 원하는 펩타이드 화합물을 정제할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 펩타이드 또는 환자에게 전신 경로를 통해 투여되는 펩타이드는 2가지 형태, 즉 산화된 펩타이드 (Op) 및 선형 펩타이드 (Lp)를, 예를 들어 비슷한 함량으로 또는 그렇지 않게, 예를 들어 (개수 %로) Op가 10, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90%이고, 나머지 함량은 Lp인 방식으로 포함한다. 조합될 수 있는 산화된 펩타이드와 선형 펩타이드는 동일한 서열을 가지거나 또는 서로 다른 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 서열번호 3 서열의 펩타이드의 산화된 형태와 선형 형태가 조합된다. 서열번호 4-34 및 35-63 서열의 펩타이드들 중 어느 하나에도 동일하게 적용된다.
본 발명에서 사용되는 약학적 조성물은 활성 성분으로서 전술한 펩타이드 또는 펩타이드 혼합물, 예를 들어, 여러가지 아미노산 조성의 펩타이드 또는 동일한 아미노산 조성의 펩타이드를 산화된 형태 및 선형 형태로 포함하며, 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 비히클, 담체 또는 부형제를 포함한다.
본 발명에 따른 펩타이드 화합물은 약학적 조성물에 또는 의약제의 제조에 이용할 수 있다. 이들 조성물 또는 의약제에서, 활성 성분은 다양한 형태로, 즉 용액 형태, 일반적으로 수성 용액으로, 또는 냉동-건조된 형태, 또는 에멀젼 형태 또는 전신 투여 경로에 적합한 임의의 다른 약제학적 및 생리학적으로 허용가능한 형태로 조성물에 병합될 수 있다.
본 발명의 중요한 특징에 따라, 펩타이드 화합물 또는 이를 함유한 조성물은 전신 경로를 통해 투여한다. 다음과 같은 주사 또는 투여 경로를 특히 언급할 수 있다: 정맥내, 복막내, 비강내, 피하, 근육내, 설하, 경구, 및 이들의 조합.
본 발명에 따라, 투여는 손상 후 또는 손상이 의심된 후 여러 시점에 투여를 수행할 수 있다.
일 구현예에서, 투여는 척수 손상 및/또는 시신경 손상 발생과 근접한 시점에 또는 사고 또는 수술 시점과 근접한 시점에 수행하며, 척수 손상 및/또는 시신경 손상의 의심을 포함한다. 전신 투여 경로는 실제 매우 일찍, 특히 의료 지원이 존재하고 척수 및/또는 시신경의 손상이 진단 또는 의심된 즉시, 1차 투여 또는 치료 개시를 가능하게 한다. 투여는 사고 현장에서 또는 구급차, 헬리콥터 등에서, 또는 수술실이나 병원, 진료소 등에서 착수할 수 있다.
본 발명에 따라, 손상이 종양과 같은 내부 요인으로 인한 외상일 경우, 투여는 외상이 의심되거나, 관찰되거나 또는 발생할 것으로 예상되는 즉시 수행할 수 있다. 일 구현예에서, 종양을 전부 또는 일부 제거하기 위해 수술을 행한다면, 전술한 바와 같이 수술 전 또는 수술 후 또는 수술과 동시에 투여할 수 있다.
치료는 손상 후 첫날 (예, 동일한 날 또는 일주일 이내) 또는 수주일 (예 1-8주) 또는 수개월 (예, 2-6개월) 내에 수행하거나 또는 착수할 수 있다.
일 구현예에서, 치료 또는 1차 투여는 손상 발생, 손상 의심 또는 예측된 후 빨리, 예를 들어 10분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간 이내에 이루어진다.
다른 구현예에서, 치료 또는 1차 투여는 손상 발생, 손상 의심 또는 예측된 후 12시간, 24시간, 36시간 또는 48시간의 기간 이내에 이루어진다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 치료는 신경아교증을 저해 또는 감소시키는 의약제로 치료받은, 치료 중인 또는 치료받을 예정인 환자에게 수행된다.
환자 체중 (kg) 당 펩타이드 중량으로 표시되는 투여량은 약 1 ㎍/kg 내지 약 1 g/kg, 특히 약 10 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg, 예를 들어 약 50 ㎍/kg 내지 약 50 mg/kg일 수 있다.
투여 용법은 1회 투여 또는 반복 투여를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 반복 투여는 치료 1일 당 1회 투여, 예를 들어 치료 기간 동안 매일 또는 2일 간격 또는 3일 간격으로 1회 투여를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 반복 투여는 치료 1일 당 2회 투여, 예를 들어 치료 기간 동안 1일 당 2회, 3회 또는 그보다 많은 횟수의 투여를 포함할 수 있다. 이들 구현예에서, 치료 기간은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일 또는 11일 이상일 수 있다.
일 구현예에서, 투여는 관류에 의해 투여된다. 관류는 하루에 수분, 수십분, 수시간 및 최대 24시간 동안 지속될 수 있다.
본 발명에 따른 용도 및 본 발명의 치료 방법은 본 발명에 따른 펩타이드 화합물을 소정량 전달할 수 있으며, 손상, 특히 척수 및/또는 시신경에 대한 한가지 이상의 손상의 유해 효과를 저해하는 측면에서, 일차 및/또는 이차 손상에 대해 우호적인 효과를 달성하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이러한 우호적인 효과는 하기를 포함할 수 있다:
- 일차 신경 세포 사멸 및/또는 축삭돌기 변성의 저해 또는 감소;
- 일차 뉴런 세포 사멸 및/또는 축삭돌기 변성의 저해 또는 감소;
- 일차 세포 사멸로 인한 독성의 감소 또는 저해;
- 손상으로 인한 이차적인 결과의 감소 또는 저해;
- 뉴런 세포 및/또는 축삭돌기 및/또는 마이엘린초 (myelin sheath)의 재생 측면에서의 이점 달성;
- 환자의 기능적인 회복 측면에서의 이점 달성.
일 구현예에서, 용도 또는 치료 방법은 신경 세포 사멸 및/또는 축삭돌기 변성, 및/또는 괴사 (일차 손상), 이차 손상에 대해 저해 또는 감소 (특히 이차적인 신경 세포 사멸 및/또는 축삭돌기 변성의 저해 또는 감소) 효과를 가진다.
일 구현예에서, 용도 또는 치료 방법은 신경 통로 (neural path)의 회복 또는 재생을 유도하거나 또는 유리한 효과를 가진다.
일 구현예에서, 용도 또는 치료 방법은 기능 회복을 돕거나 또는 유도하는 효과를 가지며, 이는 환자가 손상의 결과로서 완전한 또는 일부 기능 상실을 회복하는 것을 의미한다.
일 구현예에서, 용도 또는 치료 방법은 손상으로 인한 기능 상실을 중단 또는 저해하는 효과를 가진다.
또한, 본 발명은 전신 경로를 통해 환자에게 펩타이드(들)를 전달하는 척수병증에서 재수초화에 이용하기 위한 본원에 기술된 하나 이상의 펩타이드(들) 또는 본원에 기술된 약학적 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본원에 기술된 하나 이상의 펩타이드(들) 또는 본원에 기술된 약학적 조성물을 유효량 또는 충분량으로 환자에게 전신 경로를 통해 투여하는 것을 포함하는, 필요한 환자에서 척수병증을 치료하는 방법 또는 재수초화 방법에 관한 것이다. 척수병증의 치료 방법은 재수초화를 포함한다.
일 구현예에서, 척수병증은 척수 손상 또는 시신경 손상이다. 다른 구현예에서, 척수병증은 특히 외상성 뇌 손상, 다발성 경화증, 백신접종 후 척수병증, 감염성 척수병증, 바이러스성 척수병증 등의 척수 또는 CNS와 관련한 다른 형태의 척수병증이다.
전술한 투여 용법, 투여 경로, 펩타이드 선택 및 유용한 특징들은 이들 마지막 과제 2종에도 적용가능하다.
또한, 본 발명은 뉴런의 수초화를 시험관내 또는 생체내에서 유도하기 위한, 이들 펩타이드의 용도 또는 이들 펩타이드를 이용한 치료 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명에 따른 펩타이드의 전신 투여는 수초화 또는 재수초화에 유익한 효과를 가진다. 이러한 효과는 공지된 방법을 이용해, 특히 환자 또는 동물 모델에서 병변 부위에서 마이엘린 결합 단백질 (MBP)의 수준 및/또는 환자 또는 동물 모델에서 병변 부위에서 Olig2-양성 전구 세포의 동원 및 Olig2-양성 세포의 생성 수준을 측정할 수 있는 방법을 이용해 측정할 수 있다.
일 구현예에서, 환자 또는 동물 모델에서 병변 부위에서 마이엘린 결합 단백질 (MBP)의 수준은 항체를 이용한 MBP 면역염색으로 측정할 수 있다 (방법 및 항체는 실시예 4 참조). 본 발명에 따른 펩타이드 없이 비히클을 이용한 대조군을 이용하거나 또는 미리 결정된 값과 비교하는 것도 가능하다.
다른 구현예에서, 환자 또는 동물 모델에서 병변 부위에서 Olig2-양성 전구 세포의 동원 및 Olig2-양성 세포의 생성 수준은, 예를 들어 항체를 이용해 Olig2 세포 양 또는 밀도 측정을 이용해 측정할 수 있다 (항체 및 방법에 대해서는 실시예 4 참조). 본 발명에 따른 펩타이드 없이 비히클을 이용한 대조군을 이용하거나 또는 기결정된 값과 비교하는 것도 가능하다.
다른 구현예에서, 이들 2가지 방법을 수행한다.
또한, 본 발명은 펩타이드를 이용한 치료와 이러한 측정 방법에 기반한 재수초화 측정을 조합하는 것을 제시한다.
실시예 1: NX 펩타이드의 합성
서열번호 1, 2 또는 서열번호 3-63 중 어느 하나의 서열을 가진 펩타이드, NX210 (서열번호 3)과 같이 특히 실시예 파트에서 사용되는 펩타이드의 제조 공정은, 펩타이드 조립에서 빌딩 블럭으로서 N-α-Fmoc (측쇄) 보호된 아미노산을 이용한 고상 펩타이드 합성을 기초로 한다. 채택한 프로토콜은 MBHA 수지 상에서 MPPA 링커에 결합된 C-말단 글리신 N-α-Fmoc-보호된 아미노산의 커플링과, 후속적인 Fmoc 커플링/서열 탈보호로 이루어진다. 수지 상에서 펩타이드를 조립한 후, 수지로부터 펩타이드 절단과 아미노산 측쇄의 탈보호를 동시에 수행하는 단계를 수행한다.
펩타이드 조산물을 석출, 여과 및 건조하였다. 펩타이드를 분취용 역상 크로마토그래피에 의해 정제하기 전에, 아세토니트릴 함유 수용액에 용해하였다. 정제한 펩타이드 용액을 농축한 다음 이온 교환 단계를 수행하여 아세테이트 염 형태로 펩타이드를 수득하였다.
당업자는 합성에 대한 추가적인 상세 설명은 US 6,995,140 및 WO2018146283을 참조하고, 본원에 기술된 펩타이드 산화된 형태에 대해서는 WO 2017/051135를 참조할 수 있으며, 이들 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
당업자는 추가적으로 N-말단 및 C-말단 변형된 또는 보호된 펩타이드를 비롯해 본 발명에 기술된 임의의 펩타이드를 제조하기 위한 표준 방법을 입수할 수 있다. 당업자는, 펩타이드의 N-말단 및 C-말단 각각에서의 아세틸화 및/또는 아미드화와 관련하여, 표준 기법, 예를 들어 Biophysical Journal Volume 95 November 2008 4879-4889에 기술된 방법을 참조할 수 있으며, 이 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
실시예 2: 등쪽 반측절단 (척수 손상) 후 NX210 치료 마우스의 기능 회복
재료 & 방법
약물 투여
SCO-스폰딘 유래 펩타이드 (NX210)를 비히클 (주사용수)에 용해하였다. NX210 펩타이드의 투여는 DO에 시작하며 복막내 (i.p.)로 수행하였다:
- 손상 후 10분 및 8 mg/kg으로 7주간 매주 2회 반복.
- 손상 후 4시간 및 4, 8 또는 16　mg/kg으로 10주간 매주 2회 반복.
수술 절차
동물
체중 ~18-20 g의 6-8주령 C57Bl/6 암컷 마우스를 물과 음식물에 자유롭게 접근가능하게 사육하였다. 동물은 온도 및 습도 제어되는 동물 시설 (온도 22℃, 상대 습도 52%)에서 명/야 주기 12h/12h 하에 두었다. 마우스는 귀 태그로 번호를 표시하였다.
척수 T8 등쪽 반측절단 :
경막에 적정 위치에서 30G 니들을 사용해 양측으로 천공을 만든다 (Geoffroy CG. Et al. J Neurosci. 2015 Apr 22;35(16):6413-28). 그런 후, 초미세 홍채 절제 가위 한쌍을 사용해 척수를 절단한다: 등쪽 반측절단을 위해 척수에 0.8 mm 깊이로 등쪽 절반. 마지막으로, 미세 깃털 안과용 메스를 사용해 병변을 따라 따라가 완전성을 확보하였다. 근육을 5.0 봉합사로 봉합하고, 피부는 5.0 봉합사로 고정하였으며, Dermabond을 사용해 피부를 접착시켰다.
동물의 무작위 추출
비-관찰자가 마우스를 각 케이지 (케이지 당 최대 n = 5마리)에서 무작위 추출하였다. 외과의에는 내용물을 알 수 없는 익명 표시된 시린지를 제공하였다. 동물은 무작위 이중 맹검 방식으로 실험하였다: 모든 행동 검사는 관찰자가 약물 치료에 대해 맹검으로 수행하고, 또한 여러 관찰자들이 약물 치료 군에 대해 맹검으로 평가하였다.
사망률 / 동물 관찰
동물의 건강을 매일 확인하였다. 동물의 전체적인 사항과 행동을 매일 모니터링하였으며, 체중은 매주 1회 모니터링하였다. 급성 또는 지연성 사망을 확인하였다.
거동 검사
오픈 필드 - BMS
BMS 스코어 (Basso Mouse Scale, 널리 사용되는 랫 BBB 스코어 평가 시스템, Basso DM. et al. J Neurotrauma . 2006 May;23(5) :635- 59)의 경우, 마우스를 오픈 필드에 배치하고, 관찰자 2명이 맹검으로 5분간 관찰하였다 (Geoffroy et al., 2015). 발목 움직임 (ankle movement), 스테핑 패턴 (stepping pattern), 빈도 (frequency), 협응 (coordination), 발 배치 (paw placement), 몸통 불안정성 (trunk instability) 및 꼬리 자세 (tail position) 등의 여러가지 측면들에 주목하였다. BMS 스코어를 0 (움직임 없음) - 9 (정상적인 움직임) 범위로 계산하였다. 마우스에서 오픈 필드-BMS를 매주 검사하였다.
로타로드
로타로드 검사를 위해, 마우스를 3분간 5 rpm부터 50 rpm까지 일정한 가속으로 회전하는 막대 위에 두었다. 세션 당 2번의 시도로 낙하 대기 시간 (초)을 측정하고 평균값을 구하였다. 마우스는 부상 1주일 전에 먼저 5일간 검사에 적응시켰으며 (세션 2회), 부상 하루 전에 부가적인 세션 (베이스라인)을 수행하였다. 로타로드 분석으로 마우스를 매주 검사하였다 (Geoffroy et al., 2015).
활동 챔버
마우스를 수평 X축과 Y축에 광선 어레이가 장착된 오픈 필드 영역에 배치하여 운동 활동을 기록하였다. 하드웨어로 동물에 의해 막힌 빔 경로를 감지하고, 케이지 안의 설치류 위치를 결정하였다. 이 챔버는 챔버 내 마우스의 전체적인 활동 정보를 제공해준다 (즉, 전체 움직임 횟수). 마우스는 검사하기 전 2번 훈련하였으며, -1일에 검사한 다음 매주 검사하였다. 마우스의 활동은 각 세션별 10분간 기록하였다.
안락사 및 조직 샘플 채취
56일 (실험 1) 또는 73일 (실험 2)에 동물을 희생시켰다. 마우스에 Fatal plus (펜토바르비탈)를 치사량으로 투여하고, PBS-헤파린 (10,000 unit/L, 20 ml, 5 ml/min)을 경심 (transcardial) 관류한 다음 4% 파라포름알데하이드 (30-40 ml/마우스, 5 ml/min)를 관류시켰다. 척수를 취한 후, 조직을 동일한 고정 용액에서 밤새 4℃에서 고정하였다. 조직을 저온-보호를 위해 30% 슈크로스에서 3일간 인큐베이션하였다. 척수의 여러 분절 (등쪽 반측절단 군의 경우 상해부에 대해 앞 4 mm 및 후미측 4 mm, 아울러 상해부 위 4 mm 분절)을 OCT 화합물로 포매 처리하고, 드라이아이스에서 급속 냉동하였다. 추가적인 처리를 위해 크라이오스탯 (Thermofisher, Microm HM550)을 사용해 척수를 25 ㎛ 두께로 잘라, 동결 방지액 (30% 수크로스, 에틸렌 글리콜, PBS)에 넣어 -20℃에서 보관하였다. 관찰자는 조직 처리, 염색 및 정량 분석 모두, 군 처리에 대해 맹검인 상태로 수행하였다.
분석
면역조직화학
상해부를 중심으로 연속적인 일련의 부유성 시상 절단 단편 (floating consecutive serial sagittal section)을 5% 말 혈청이 첨가된 PBS-Tx-0.4%에서 2시간 동안 실온에서 차단 처리한 다음, 단일클론 랫 항-MBP (밤새 인큐베이션, MAB386 Millipore)를 사용해 마이엘린 염기성 단백질 (MBP)을 염색하였다. 다음날, 단편을 헹군 다음 이차 항-랫 Alexa fluor 488 (1:500, A-11006, Thermofisher)을 첨가하여 실온에서 1시간 동안 두었다. PBS로 여러번 헹군 다음 단편들 모두 DAPI로 염색한 후 Fluoromount-G (Southern Biotech)로 커버-슬립으로 덮었다.
면역반응성 측정
상처 크기, MBP 음성 면적 및 상처부의 최대 깊이를 측정해 병변의 중증도를 결정하였다. 상해부로부터 앞뒤 여러 길이 간격에서 MBP 염색 강도를 측정하여, 마이엘린초에 대한 효과를 평가하였다. MBP를 면역염색한 후, 척수의 전체 등배 축을 망라하는 100 ㎛ 폭의 일련의 직사각형들을 시상 절단 단편 위에, 상처부에서 시작해 상처부의 후미측 방향으로 1.0 mm까지 겹쳐 배치하였다. MBP 강도는 백그라운드를 제한 후 ImageJ를 이용해 모든 직사각형에서 측정하고, 상해부로부터 1.0 mm 떨어진 위치에서 강도를 표준화하였다. 이 비율을 염색 강도 비율로 취하였으며, 상해부까지의 거리에 대한 함수로 도표를 작성하였다. 각 동물에서 척수 단편 3개의 평균을 구하였다.
통계학적 분석
모든 값들은 평균 ± S.E.M.으로 나타내었다. 통계학적 분석은 거동에 대한 이원식 ANOVA 및 후속적인 본페로니의 사후 검정을 이용해 여러가지 조건에서 수행하였다. p　<　0.05 값은 통계학적으로 유의한 것으로 간주하였다.
결과
척수 손상 모델 - T8 등쪽 반측절단 - 실험 1
마우스에 T8 등쪽 반측절단을 수행한 후, NX210 펩타이드 (8 mg/kg)를 복막내 (i.p.) 경로를 통해 주당 2회로 투여하였으며, 1차 주사는 손상 후 10분 경과시 수행하였다. NX210-처리 마우스 또는 비히클-처리 마우스에서 운동 기능을 BMS (Basso Mouse Scale) 오픈 필드 검사로 매주 평가하고 ( 표 1, 2 & 3 - 도 1 & 2 ), 로타로드 검사를 수행하여 강제 운동 수행성을 분석하였다 ( 표 4 ). 또한 면역염색 (특히, MBP 표지, 표 5 & 도 3)으로 사후 분석을 수행하였다.
BMS 오픈 필드 검사를 이용한 운동 활동 분석에서 비히클-주사 마우스와 비교해 NX210-처리 마우스에서 회복이 현저하게 증가된 것으로 확인되었다 ( 표 1 & 도 1) . BMS 스코어는 7일부터 실험 종료시 (손상 후 42일)까지 NX210-처리 마우스에서 현저하게 더 높았다.
비슷한 결과는 BMS 스코어에서 명백하지 않을 수 있는 미세한 운동 차이를 검출할 수 있는 BMS 서브스코어에서 달성되었다 ( 표 2 & 도 2 ).
BMS 스코어가 5점 이상인 마우스 %는 발바닥 스텝핑 (plantar stepping) 및 일부 협응에 해당한다. 흥미롭게도, 모든 NX210-처리 마우스 (100%)는 실험 종료시 (손상 후 42일) 기능 회복을 의미하는 BMS 스코어 5점 이상인데 반해, 비히클-처리 마우스는 37.5%에 불과하였다 ( 표 3 ).
로타로드 검사를 이용한 운동 활동 분석에서는 NX210 투여가 막대 위에서의 체류 시간 및 낙하 대기 시간을 연장하는 것으로 입증되었다 ( 표 4 ).
척수 손상, 특히 2차 손상 단계 동안의 척수 손상은 병변의 전후 축 전체에 현저한 탈수초화를 유도한다. 손상 후 8주차에, 척수 단편 (손상부의 전방 1000 ㎛ 및 후미측 1000 ㎛)을 마이엘린 단백질 및 마이엘린초를 검출하는 마이엘린 염기성 단백질 (MBP)로 염색하였다. MBP 면역염색을 통해, 정량한 후, 병변 부위와 앞뒤 1000 ㎛ 길이 전체에서 MBP 강도 수준의 증가가 비히클 처리 마우스 대비 NX210-처리 마우스에서 확인되었다 (표 5 및 도 3).
요컨대, 이러한 운동 및 조직학적 데이터는 기능적 및 생물학적 회복 개선을 부각시키며, 척수 손상 후 SCO-스폰딘 유래 펩타이드인 NX210의 투여 이점을 입증해준다.
비히클 NX210
8 mg /kg
BMS 스코어 BMS 스코어
평균 SEM n 평균 SEM n
D-1 9.00 0.00 8 9.00 0.00 7
D2 0.25 0.13 8 0.71 0.34 7
D7 0.69 0.41 8 3.57*** 0.69 7
D14 3.50 0.70 8 6.00** 0.52 7
D21 4.06 0.73 8 5.43 0.34 7
D28 4.69 0.53 8 5.50 0.15 7
D35 4.31 0.49 8 6.21* 0.38 7
D42 3.94 0.56 8 5.93* 0.28 7
표 1: 비히클 처리 마우스 (n=8) 및 NX210 처리 마우스 (n= 7)에서 BMS 스코어로 나타낸, 오픈 필드 운동 검사를 이용한 T8 등쪽 반측절단 (척수 손상) 후 하지 기능 회복 평가. *: p<0.05, **: p<0.01, ***: p<0.001. 이원식 ANOVA 및 후속적인 본페로니의 사후 검정.
비히클 NX210
8 mg /kg
BMS 서브스코어 BMS 서브스코어
평균 SEM n 평균 SEM n
D-1 11.00 0.00 8 11.00 0.00 7
D2 0.25 0.25 8 0.00 0.00 7
D7 0.13 0.13 8 1.14 0.46 7
D14 1.63 0.73 8 5.00** 1.27 7
D21 2.13 0.83 8 2.57 0.84 7
D28 2.75 0.94 8 3.43 0.57 7
D35 1.63 0.63 8 4.86** 0.96 7
D42 1.25 0.70 8 4.43* 0.87 7
표 2: 비히클 처리 마우스 (n=8) 및 NX210 처리 마우스 (n= 7)에서 BMS 서브스코어로 나타낸, 오픈 필드 운동 검사를 이용한 T8 등쪽 반측절단 (척수 손상) 후 하지 기능 회복 평가. *: p<0.05, **: p<0.01. 이원식 ANOVA 및 후속적인 본페로니의 사후 검정.
비히클 NX210
8 mg /kg
BMS ≥ 5 n BMS ≥ 5 n
D7 0.00% 8 28.57% 7
D14 12.50% 8 85.71% 7
D21 50.00% 8 71.43% 7
D28 62.50% 8 100.00% 7
D35 62.50% 8 85.71% 7
D42 37.50% 8 100.00% 7
표 3: 비히클 처리 마우스 (n=8) 및 NX210 처리 마우스 (n= 7)에서 오픈 필드 운동 검사를 이용한 T8 등쪽 반측절단 (척수 손상) 후 하지 기능 회복 평가. BMS 스코어 ≥5인 마우스의 % .
비히클 NX210
8 mg /kg
로타로드 시간 (초) 로타로드 시간 (초)
평균 SEM n 평균 SEM n
D-1 66.38 6.54 8 65.64 4.39 7
D2 6.38 1.23 8 19.29 4.73 7
D7 24.92 5.79 8 26.95 7.23 7
D14 19.58 3.60 8 31.19 6.31 7
D21 23.33 3.72 8 42.33 8.56 7
D28 21.29 4.14 8 35.05 7.61 7
D35 15.54 3.52 8 29.95 5.60 7
D42 17.33 5.31 8 22.52 4.84 7
표 4: 비히클 처리 마우스 (n=8) 및 NX210 처리 마우스 (n= 7)에서 로타로드 검사를 이용한 T8 등쪽 반측절단 (척수 손상) 후 운동 성능 ( 로타로드 체류 시간). 이원식 ANOVA 및 후속적인 본페로니의 사후 검정
비히클 NX210
8 mg /kg
MBP 강도 MBP 강도
평균 SEM n 평균 SEM n
1000-800 1190.97 258.29 3 1861.63 202.67 5
800-600 1198.86 262.65 3 1859.43 194.95 5
600-400 1221.73 243.61 3 1928.08 224.14 5
400-200 1100.70 192.42 3 1780.76 235.42 5
200-0 756.78 96.57 3 1229.59 153.51 5
0-200 701.71 146.17 3 1292.41 168.39 5
200-400 778.41 179.12 3 1633.44 193.53 5
400-600 794.82 193.89 3 1945.87 214.97 5
600-800 829.76 206.61 3 1987.64 189.21 5
800-1000 907.40 229.69 3 1892.23 145.30 5
표 5: 비히클 처리 마우스 (n=3) 및 NX210 처리 마우스 (n=5)에서 면역형광을 이용한 손상부의 1000 ㎛ 전방 및 1000 ㎛ 후방에서 8 등쪽 반측절단 (척수 손상) 후 마이엘린 염기성 단백질 (MBO)의 염색 강도 평가.
척수 손상 모델 - T8 등쪽 반측절단 - 실험 2
마우스에 T8 등쪽 반측절단을 수행한 후, NX210 펩타이드를 여러가지 용량 (4, 8 및 16 mg/kg)으로 복막내 (i.p.) 경로를 통해 주 2회 투여하였으며, 1차 주사는 반측절단 후 4시간 경과시 수행하였다 (마우스에서 손상 후 4시간은 인간에서의 1일 내지 수일의 치료 기간을 나타낼 수 있음). NX210-처리 마우스 또는 비히클-처리 마우스에서 운동 기능을 BMS (Basso Mouse Scale) 오픈 필드 검사로 매주 평가하였으며 (표 6, 7 & 8 - 도 4 & 5) , 강제 운동 성능을 분석하기 위한 로타로드 검사 (표 8) 와 자발적인 운동 활성을 조사하기 위한 활동 챔버 검사 (표 10 & 11) 를 수행하였다. 사후 분석 역시 면역염색을 이용해 수행하였다.
BMS 오픈 필드 검사를 이용한 운동 활동 분석 결과, 비히클-주사 마우스와 비교해 NX210 처리 마우스의 회복이 현저하게 개선된 것으로 드러났으며 (표 6 & 도 6) , BMS 스코어는 NX210 8 mg/kg 또는 16 mg/kg 처리 마우스에서 7일 또는 21일부터 실험 종료시 (손상 후 56일)까지 각각 현저하게 더 높았다. 또한, 4 mg/kg 처리 마우스 역시 비히클-주사 마우스에 비해 더 높은 BMS 스코어를 나타내었다.
아울러, BMS 서브스코어는 8 mg/kg 또는 16 mg/kg NX210-처리 군에서 21일부터 실험 종료시 (손상 후 56일)까지 현저하게 우수하였다 (표 7 & 도 7) . 4 mg/kg 처리 마우스 역시 비히클-주사 마우스에 비해 더 높은 BMS 서브스코어를 나타내었다.
비히클-처리 마우스의 이십오% (25%)는 실험 종료시 (손상 후 56일) BMS 점수가 ≥5인 반면, NX210-처리 마우스 (8 mg/kg)는 86%가 빠르게는 손상 후 21일에 BMS 점수가 ≥5이고 실험 종료시까지 유지되었는데, 이는 상당한 기능 회복을 의미한다 (표 7) . NX210 4 mg/kg 또는 16 mg/kg 처리 마우스는 44% 및 75%가 BMS 스코어 ≥5에 도달하였다.
로타로드 검사를 이용한 운동 활동 분석 결과, NX210 8 mg/kg 투여는 로드 위에서의 체류 시간을 현저하게 연장하였으며, 빠르게는 손상 후 8일에 현저하게 개선되어, 실험 종료시 (손상 후 57일)까지 유지되었다 (표 9) . NX210 16 mg/kg 처리 마우스 역시 비히클-처리 마우스와 비교해 로드 위에서의 체류 시간을 연장하였다.
자발적인 운동 활동을 활동 챔버 검사를 이용해 매주 평가하였다. NX210-처리 마우스 (특히 8 및 16 mg/kg 군)는 NX210-처리 동물의 기능 회복으로 추가적으로 입증된 바와 같이 비히클-처리 마우스와 비교해 총 이동 거리 및 평균 속도가 현저하게 개선되었다 (표 10 & 11) .
NX210-처리 마우스는 체중이 손상 후 2일부터 증가해, 20일 내지 27일 사이에 손상 전 수준에 도달하여 실험 종료시까지 증가를 유지한 반면, 비히클-처리 마우스는 체중이 27일부터 단순 증가 (느리게)해 실험 종료시 (손상 후 58일)에도 손상 전 수준에 도달하지 못하였으며, 또한 마우스는 다시 빠르게 체중을 회복해 전반적으로 더 건강해 보였다 (데이터 도시 안함 ).
요컨대, 이들 데이터는 척수 손상 후 SCO-스폰딘 유래 펩타이드인 NX210가 투여 후 기능 회복을 상당히 개선함을 입증해준다.
비히클 NX210
4 mg /kg 		NX210
8 mg /kg 		NX210
16 mg /kg
평균 SEM n 평균 SEM n 평균 SEM n 평균 SEM N
D-1 9.00 0.00 8 9.00 0.00 9 8.57 0.43 7 9.00 0.00 8
D2 1.19 0.60 8 1.39 0.68 9 3.50 1.12 7 2.31 0.73 8
D7 1.94 0.71 8 2.56 0.88 9 5.07** 0.70 7 4.13 0.82 8
D14 2.25 0.71 8 4.11 0.72 9 5.50** 0.49 7 4.63 0.72 8
D21 2.50 0.73 8 4.28 0.64 9 5.57** 0.58 7 5.44** 0.89 8
D28 2.81 0.81 8 5.22* 0.64 9 5.86** 0.61 7 5.56* 0.89 8
D35 3.00 0.73 8 4.61 0.55 9 5.93* 0.66 7 5.38 0.67 8
D42 3.13 0.60 8 4.50 0.40 9 6.14* 0.46 7 5.75* 0.75 8
D49 2.88 0.71 8 4.50 0.49 9 6.29** 0.50 7 6.00** 0.56 8
D56 3.13 0.70 8 4.67 0.47 9 6.29** 0.34 7 5.81* 0.77 8
표 6: 비히클 처리 마우스 (n=8) 및 4 mg/kg (n=9), 8 mg/kg (n=7) 및 16 mg/kg (n=8) 처리 마우스에서 BMS 스코어로 나타낸, 오픈 필드 운동 검사를 이용한 T8 등쪽 반측절단 (척수 손상) 후 하지 기능 회복 평가. *: p<0.05, **: p<0.01. 이원식 ANOVA 및 후속적인 본페로니의 사후 검정.
비히클 NX210
4 mg /kg 		NX210
8 mg /kg 		NX210
16 mg /kg
BMS 서브스코어 BMS 서브스코어 BMS 서브스코어 BMS 서브스코어
평균 SEM n 평균 SEM n 평균 SEM n 평균 SEM n
D-1 11.00 0.00 8 11.00 0.00 9 10.43 0.57 7 11.00 0.00 8
D2 0.13 0.13 8 0.33 0.17 9 2.14 1.39 7 0.13 0.13 8
D7 1.13 0.99 8 1.89 1.16 9 4.29 1.46 7 3.75 1.41 8
D14 0.88 0.88 8 2.33 1.07 9 4.86 1.28 7 3.75 1.35 8
D21 1.00 0.76 8 2.44 1.02 9 5.29* 1.06 7 5.50* 1.36 8
D28 1.25 0.98 8 4.00 1.22 9 6.14** 1.26 7 5.63* 1.40 8
D35 1.00 1.00 8 3.00 1.09 9 5.86** 1.20 7 5.25* 1.26 8
D42 1.25 0.73 8 2.56 0.87 9 5.57* 1.17 7 5.50* 1.39 8
D49 1.38 0.89 8 2.67 0.87 9 6.86** 0.99 7 5.38* 1.25 8
D56 1.38 0.98 8 3.00 0.90 9 6.43** 1.04 7 5.63* 1.34 8
표 7: 비히클 처리 마우스 (n=8) 및 4 mg/kg (n=9), 8 mg/kg (n=7) 및 16 mg/kg (n=8) 처리 마우스에서 BMS 서브스코어로 나타낸, 오픈 필드 운동 검사를 이용한 T8 등쪽 반측절단 (척수 손상) 후 하지 기능 회복 평가. *: p<0.05, **: p<0.01. 이원식 ANOVA 및 후속적인 본페로니의 사후 검정.
비히클 NX210
4 mg /kg 		NX210
8 mg /kg 		NX210
16 mg /kg
BMS ≥ 5 n BMS ≥ 5 n BMS ≥ 5 n BMS ≥ 5 n
D7 12.5% 8 22.2% 9 57.1% 7 37.5% 8
D14 12.5% 8 55.6% 9 71.4% 7 62.5% 8
D21 25.0% 8 55.6% 9 85.7% 7 75.0% 8
D28 25.0% 8 55.6% 9 85.7% 7 75.0% 8
D35 12.5% 8 55.6% 9 85.7% 7 75.0% 8
D42 12.5% 8 44.4% 9 100.0% 7 75.0% 8
D49 12.5% 8 44.4% 9 85.7% 7 75.0% 8
D56 25.0% 8 44.4% 9 85.7% 7 75.0% 8
표 8: 비히클 처리 마우스 (n=8) 및 4 mg/kg (n=9), 8 mg/kg (n=7) 및 16 mg/kg (n=8) 처리 마우스에서 오픈 필드 운동 검사를 이용한 T8 등쪽 반측절단 (척수 손상) 후 하지 기능 회복 평가. BMS 스코어 ≥5인 마우스 %.
비히클 NX210
4 mg /kg 		NX210
8 mg /kg 		NX210
16 mg /kg
로타로드 시간 (초) 로타로드 시간 (초) 로타로드 시간 (초) 로타로드 시간 (초)
평균 SEM n 평균 SEM n 평균 SEM n 평균 SEM n
D-1 82.54 7.12 8 93.89 5.45 9 87.95 7.03 7 92.21 4.05 8
D2 15.12 5.50 8 19.30 4.12 9 28.00 7.56 7 28.42 7.20 8
D8 20.88 4.76 8 35.56 6.74 9 53.90* 9.20 7 38.08 7.73 8
D15 20.79 6.55 8 38.30 7.84 9 61.29*** 8.85 7 47.08 8.00 8
D22 18.21 4.84 8 30.78 7.38 9 52.33** 10.46 7 34.54 6.19 8
D29 17.17 4.41 8 32.78 7.07 9 54.29** 7.33 7 42.12 4.68 8
D36 21.25 5.50 8 33.37 7.10 9 54.76** 9.00 7 48.25 5.50 8
D43 16.71 4.83 8 35.85 10.38 9 55.90** 11.50 7 40.42 8.47 8
D50 18.33 5.94 8 42.81 10.09 9 52.38** 7.41 7 40.79 7.88 8
D57 16.21 4.24 8 28.93 4.50 9 49.71** 8.34 7 38.29 9.26 8
표 9: 비히클 처리 마우스 (n=8) 및 4 mg/kg (n=9), 8 mg/kg (n=7) 및 16 mg/kg (n=8) 처리 마우스에서 로타로드 검사를 이용한 T8 등쪽 반측절단 (척수 손상) 후 운동 성능 (막대에서의 체류 시간). *: p<0.05, **: p<0.01, ***: p<0.001. 이원식 ANOVA 및 후속적인 본페로니의 사후 검정.
비히클 NX210
4 mg /kg 		NX210
8 mg /kg 		NX210
16 mg /kg
총 이동 거리 (m) 총 이동 거리 (m) 총 이동 거리 (m) 총 이동 거리 (m)
평균 SEM n 평균 SEM n 평균 SEM n 평균 SEM n
D-1 37.20 3.77 8 35.14 2.03 9 34.76 1.70 7 37.89 2.19 8
D2 19.88 1.42 8 24.11 2.01 9 25.92 1.86 7 23.94 1.97 8
D8 28.34 2.36 8 30.48 1.72 9 34.33 2.11 7 35.19 2.18 8
D15 28.16 2.29 8 28.73 1.79 9 32.76 1.33 7 32.33 2.09 8
D22 28.19 2.51 8 29.27 2.56 9 39.26 3.17 7 34.82 2.65 8
D29 28.47 2.31 8 33.15 3.93 9 40.01* 4.03 7 37.55 2.52 8
D36 29.98 2.50 8 33.67 2.65 9 40.48 5.72 7 40.03 2.44 8
D43 23.88 2.00 8 33.73 3.98 9 36.19* 3.68 7 36.70* 3.51 8
D50 29.49 2.27 8 32.38 1.99 9 41.65* 5.65 7 42.02* 3.37 8
D57 25.56 2.59 8 31.84 3.09 9 34.79 5.05 7 38.18* 4.53 8
표 10: 비히클 처리 마우스 (n=8) 및 4 mg/kg (n=9), 8 mg/kg (n=7) 및 16 mg/kg (n=8) 처리 마우스에서 오픈 필드 검사 (활동 챔버)를 이용한 T8 등쪽 반측절단 후 총 이동 거리 (m). *p<0.05. 이원식 ANOVA 및 후속적인 본페로니의 사후 검정.
비히클 NX210
4 mg /kg 		NX210
8 mg /kg 		NX210
16 mg /kg
평균 속도 (m/min) 평균 속도 (m/min) 평균 속도 (m/min) 평균 속도 (m/min)
평균 SEM n 평균 SEM n 평균 SEM n 평균 SEM n
D-1 4.95 0.38 8 4.60 0.18 9 4.52 0.13 7 4.85 0.14 8
D2 3.09 0.14 8 3.32 0.14 9 3.46 0.14 7 3.37 0.10 8
D8 3.75 0.14 8 3.88 0.16 9 4.15 0.20 7 4.18 0.18 8
D15 3.75 0.16 8 3.74 0.16 9 4.26 0.17 7 3.95 0.18 8
D22 3.68 0.17 8 3.99 0.17 9 4.67* 0.25 7 4.31 0.20 8
D29 3.69 0.18 8 4.18 0.31 9 4.64 0.35 7 4.52 0.19 8
D36 3.72 0.18 8 4.02 0.23 9 4.69* 0.52 7 4.52 0.24 8
D43 3.43 0.15 8 4.12 0.33 9 4.32 0.32 7 4.42* 0.30 8
D50 3.65 0.19 8 4.00 0.15 9 4.72* 0.52 7 4.82** 0.34 8
D57 3.40 0.18 8 3.92 0.21 9 4.19 0.46 7 4.48* 0.35 8
표 11: 비히클 처리 마우스 (n=8) 및 4 mg/kg (n=9), 8 mg/kg (n=7) 및 16 mg/kg (n=8) 처리 마우스에서 오픈 필드 검사 (활동 챔버)를 이용한 T8 등쪽 반측절단 후 평균 속도 (m/min). *p<0.05, **p<0.01. 이원식 ANOVA 및 후속적인 본페로니의 사후 검정.
실시예 3: 랫 일차 피질 뉴런의 글루타메이트 -유발성 흥분 독성에 대한 NX210 및 NX218에 의한 보호
글루타메이크 흥분 독성에 의한 뉴런 사멸은 SCI에서 공통적인 병리학적 특징이다. NX210 및 NX218 (NX210 펩타이드의 산화된 또는 고리 형태)의 신경보호 잠재성을 조사하기 위해, 글루타메이트의 공동-처리 실험을 시험관내 배양한 랫 피질 뉴런에서 수행하였으며, 뉴런 생존 및 신경돌기 네트워크를 면역조직화학으로 평가하였다.
랫 뉴런의 일차 배양:
피질 뉴런을 종래에 기술된 바와 같이 배양하였다 (Callizot N, Combes M, Steinschneider R, Poindron P (2013) Operational dissection of β-amyloid cytopathic effects on cultured neurons. J Neurosci Res 91:706-716). 간략하게는, Wistar 랫에서 임신 15일차에 태아를 분리하여, 즉시 2% 페니실린 (10,000 U/mL) 및 스트렙토마이신 (10 mg/mL)(PS) 용액과 1% 소 혈청 알부민 (Dutscher)이 첨가된 빙랭한 L15 Leibovitz 배지에 넣었다. 조직을 0.05% 트립신 및 0.02% 에틸렌 다이아민 테트라아세트산 (Dutscher)을 이용해 20분간 37℃에서 효소적으로 분해 처리하였다. 둘베코의 변형된 이글스 배지, 4.5 g/L 글루코스, 0.5 mg/ml DNAse I grade II 및 10% 소 태아 혈청 (FCS; Dutscher)이 첨가된 신선한 배양 배지를 첨가하여 트립신의 작용을 중화하였다. 그런 후, 세포를 10 mL 팁을 통해 강제로 3회 통과시켜 기계적으로 파쇄한 다음 515 g에서 10분간 4℃에서 원심분리하였다. 펠릿을 2% B27 첨가제 (Fisher Scientific), 2 mM L-글루타민 (Dutscher), 2% PS 용액 및 10 ng/mL 뇌-유래 신경영양 인자 (Dutscher)가 첨가된 NeurobasalTM 배지에 재현탁하였다. 마지막으로 뉴런을 미리 폴리-L-라이신으로 코팅된 96웰 플레이트에 25,000 세포/웰 밀도로 접종해, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 배지를 2일 간격으로 교체하였다. 배양 13일에, 뉴런을 20 μM 글루타메이트 (Sigma-Aldrich) 및 비히클 (세포 배양용 멸균수; Dutscher), NX210 또는 NX218 100, 250 또는 500 ㎍/mL에 20분간 동시에 노출시켰다.
랫 피질 뉴런의 면역형광 :
글루타메이트에 노출한 후 48시간 경과시, 뉴런을 차가운 에탄올 (95%) 및 아세트산 (5%) 용액에서 5분간 -20℃에서 고정하고, 포스페이트 완충화된 염수 (PBS; Dutscher) 중의 0.1% 사포닌 (VWR) 함유 용액을 사용해 투과화 하였다. 그런 후, 뉴런을, 1% FCS 및 0.1% 사포닌 함유 PBS에 희석한 마우스 단일클론 항-미소관 관련 단백질-2 (MAP-2, 1/400; Sigma-Aldrich) 일차 항체와 함께 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다.
MAP-2-양성 뉴런의 수를 측정해 뉴런 생존성을 평가하였으며, MAP-2-양성 신경돌기의 누적 길이를 측정해 신경돌기 네트워크를 평가하였다. 그 결과를 아래 표 12 및 도 6에 나타낸다.
뉴런 생존성 신경 돌기 길이
평균 SEM n 평균 SEM n
대조군 100 2.08 6 100 4.56 6
글루타메이트 ( glu ) 20 μM 70.6 2.31 5 63.07 0.89 6
glu + NX210　100 ㎍/mL 72.78 3.13 5 67.28 2.66 6
glu + NX218　100 ㎍/mL 77.5 1.91 5 85.17 1.95 6
glu + NX210　250 ㎍/mL 78.18 3.66 6 77.5 1.757 6
glu + NX218　250 ㎍/mL 85.28 3.17 6 94.88 5.365 5
glu + NX210　500 ㎍/mL 81 1.9 6 74.34 3.37 5
glu + NX218　500 ㎍/mL 82.92 3.83 6 85.34 3.11 5
표 12: NX210 및 NX218 펩타이드는 시험관내에서 랫 피질 뉴런을 글루타메이트-유발성 흥분 독성으로부터 보호한다.
NX218은 250 및 500 ㎍/mL에서 글루타메이트-유발된 뉴런 사멸로부터 랫 피질 뉴런을 보호하였으며 (세포 사멸, glu-처리 뉴런의 경우 29.40% vs 250 ㎍/mL NX218/glu-처리 뉴런의 경우 14.72%, p=0.0101), 사용 용량에서 신경돌기 네트워크를 완전히 회복시켰다 (총 신경돌기 네트워크 길이, glu-처리 뉴런의 경우 -36.93% vs 250 ㎍/mL NX218/glu-처리 뉴런의 경우 -5.12%, p=0.0002). NX210은 신경돌기 네트워크에 어떠한 보호 효과도 발휘하지 못하였지만 (glu-처리 뉴런 및 100, 250 및 500 ㎍/mL NX210/glu-처리 뉴런 간에 p=0.6602, 0.0617 및 0.1487), 최고 용량은 뉴런 생존성을 개선하였다 (세포 사멸, glu-처리 뉴런의 경우 29.40% vs NX210/glu-처리 뉴런의 경우 19.00%, p=0.0498). 즉, 100 및 250 ㎍/mL에서 NX218이 NX210보다 신경돌기 네트워크를 현저하게 더 잘 보존하였다 (NX210 또는 NX218 100, 250 및 500 ㎍/mL에 각각 노출된 glu-처리 뉴런들 간의 p=0.0071, 0.0467 및 0.1419).
실시예 4: 마우스에서 뇌량내 국소 병변 후 백색질 재수초화에 대한 NX210 및 NX218의 효과
C57BL/6J 수컷 마우스 성체에서 자기 공명 영상 (MRI) 및 면역조직화학 분석을 이용하여, 뇌량 (CC)의 국소 병변 후 백색질 병변 발생 및 재수초화에 대한, 교련밑기관 (subcommissural organ, SCO)-스폰딘 유래 펩타이드, 즉 NX210 및 이의 고리형 NX218의 처리 후 치료학적 효과를 평가하였다.
우측 CC의 국소 단측 병변 (focal unilateral lesion)을 C57BL/6J 수컷 마우스 성체에서 리소레시틴 (LPC)의 정위 주사에 의해 유도하였다. 이 모델에서 LPC는 축삭의 탈수초화를 유도해, 마우스에서 21일 이상 지속되는 재현가능한 병변을 유발한다 (Leonetti et al. Molecular Neurodegeneration, 2017, 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 새로운 희소돌기신경교 전구 세포 (OPC)가 증식, 이동, 성숙한 희소돌기신경교로의 분화로 진행되고, 병변 영역이 재수초화됨에 따라, 탈수초화된 용적이 시간 경과에 따라 점진적으로 감소하였다.
NX210 및 NX218은 2일 (D2)부터 D21 까지 2일 간격으로 투여량 5 mg/kg으로 복막내 투여하였다. 마우스 7-8 마리/군에서 병변의 용적을 종방향 자기 공명 영상 (MRI) 검사를 통해 측정하였으며, D1, D3, D7, D14 및 D21에 획득하였다. 치료 개시 전 D1에, 전체 군 및 하위 군의 평균 병변 용적은 비슷하였으며, 0.8 mm3에 가까웠다. LPC 주사 후 1주 동안 비히클-처리 군에서 평균 병변 용적은 적어도 D7까지 증가하였으며, NX210-처리 군의 경우 D3까지만 증가한 반면 , NX218-처리 군의 경우 D3까지 안정적으로 유지된 다음 D3부터 D7까지 감소하였다: 7일에, NX218 또는 NX210 처리 동물에서 평균 병변 용적은 각각 0.73 mm3 및 0.75 mm3인 반면, 비히클-처리 마우스는 0.84 mm3이었다. 1주 후, 평균 병변 용적은 모든 군들에서 D21까지 계속 감소하였다 (표 13 & 도 7).
비히클 NX210 ( 5 mg /kg) NX218 ( 5 mg /kg)
병변 용적
(mm3 - MRI)		 병변 용적
(mm3 - MRI)		 병변 용적
(mm3 - MRI)
평균 SEM n 평균 SEM n 평균 SEM n
D1 0.770 0.047 7 0.775 0.073 8 0.769 0.071 8
D3 0.835 0.051 7 0.829 0.053 8 0.766 0.036 8
D7 0.840 0.072 7 0.746 0.069 8 0.726 0.052 8
D14 0.698 0.062 7 0.635 0.079 8 0.623 0.060 8
D21 0.448 0.049 7 0.521 0.084 8 0.401 0.038 8
표 13: 비히클-처리 마우스 (n=7) 및 5 mg/kg NX210 (n=8) 또는 NX218 (n=8) 처리 마우스에서 자기 공명 이미징 (MRI)을 이용한 리소레시틴 주사 후 병변 용적 추적. 이원식 ANOVA 및 후속적인 본페로니의 사후 검정.
D1에 비히클 마우스 3마리와 D3, D7, D14 및 D21에 동물 3마리/군에 대해 마이엘린 결합 단백질 (MBP)의 면역조직화학 (상기 Leonetti 문헌에 기술된 방법과 항체를 이용함)을 수행하여 마이엘린을 가시화하고, 병변 용적을 측정하였다. 병변 영역에서 희소돌기신경교 전사 인자 2 (Olig2) 표지성 양성 세포의 수를 또한 D7에 동물 3마리/군에서 측정하였다.
MBP 면역염색을 이용한 병변 면적 (동측 CC의 %)과 관련하여, 시간적인 변화는 MRI 병변 변화에서 관찰되는 바와 유사하였으며, 병변 면적은 비히클-처리 군에서 D7까지 증가한 반면, NX218-처리 군의 경우 D3 이후 이미 감소하였다. NX218-처리 동물들에서 병변 면적이 점차 작아지는 경향이 관찰되었다. 시간별 분석시, D7에 병변 면적은 비히클-처리 군과 비교해 NX218-처리 군이 현저하게 더 작았으며 (t-검정; p=0.0104), 이는 MRI에서 관찰되는 경향이 검증되었다 (표 14 & 도 8).
처리 전 비히클 NX210 ( 5 mg /kg) NX218 ( 5 mg /kg)
MBP 병변 면적
(동측 CC의 %)		 MBP 병변 면적
(동측 CC의 %)		 MBP 병변 면적
(동측 CC의 %)		 MBP 병변 면적
(동측 CC의 %)
평균 SEM n 평균 SEM n 평균 SEM n 평균 SEM n
27.6 4.6 3 　 　 　 　 　 　 　 　 　
　 　 　 26.0 2.1 3 28.6 3.1 3 24.4 2.6 2
　 　 　 33.7 1.4 3 34.3 1.1 3 20.7* 6.4 3
　 　 　 25.6 1.8 3 32.7 2.3 3 24.4 0.3 3
　 　 　 19.3 3.2 3 24.6 5.1 3 17.2 3.3 3
표 14: 비히클-처리 마우스 (시기별 n=3) 및 5 mg/kg NX210 (시기별 n=3) 또는 NX218 (시기별 n=3) 처리 마우스에서 마이엘린 결합 단백질 (MBP) 면역염색을 이용한 리소레시틴 주사 후 병변 면적 평가. 병변 면적은 동측 뇌량 (CC)의 %로 나타낸다. *: p<0.05, t-검정.
Olig2-양성 세포에 대한 분석을 또한 상기 Leonetti 문헌에 기술된 방법 및 시약을 사용해 수행하였다.
D7일, Olig2 -양성 세포의 밀도는 비히클 동물과 비교해 (t-검정, p=0.028) NX218 동물의 병변에서 현저하게 더 높았으며, 평균 밀도/mm2는 각각 8085.9 ± 933.9 및 5007.2 ± 618.4 (평균 ± SEM)이었는데, 이는 비히클-처리 동물과 비교해 NX218-처리 동물들에서 병변에서의 Olig2 전구 세포의 동원율이 더 높다는 것을 의미한다. 이들 데이터는, NX218이 CC의 탈수초화 후 OPC 동원 또는 증식을 유도하거나 또는 병변 영역으로의 이동을 촉진한다는 것을, 시사해준다. NX210은 이러한 파라미터 (평균 밀도/mm2 = 7699.9 ± 2026.6)가 비히클과 비교해 개선되는 경향을 나타내었다. 또한, 전체 동측-CC 또는 반대측 CC에서 Olig2 세포 밀도와 관련하여, 비히클, NX210 및 NX218 간에 유의한 차이는 없었다 (표 15 & 도 9).
비히클 NX210 ( 5 mg /kg) NX218 ( 5 mg /kg)
Olig2 세포 밀도/mm2 Olig2 세포 밀도/mm2 Olig2 세포 밀도/mm2
평균 SEM n 평균 SEM n 평균 SEM n
CC 동측 5401.5 822.9 3 6426.8 866.5 3 5359.0 1233.1 3
병변 5007.2 618.4 3 7699.9 2026.6 3 8085.9* 933.9 3
CC 반대측 5651.4 521.9 3 8050.6 1921.0 3 7964.2 923.2 3
표 15: 비히클-처리 마우스 (시기별 n=3) 및 5 mg/kg NX210 (시기별 n=3) 또는 NX218 (시기별 n=3) 처리 마우스에서 Olig2 면역염색을 이용한 리소레시틴 주사 후 뇌량 (CC)에서의 Olig2-양성 세포의 밀도 평가. *: p<0.05, t-검정.
실시예 5: 동물에서의 약동학
예비 시험관내 실험은 NX210이 랫 혈장에서 산화에 의해 NX218로 빨리 변환됨을 보여준다. 이에, 동물에서 NX210 PK를 이의 고리 형태 NX218을 측정함으로써 추적하였다. 먼저, 혈장내 NX218 검출 방법을 검증하기 위해 랫에서 예비 PK 실험을 수행한 다음 반복적인 실험으로 보다 상세한 PK 실험을 수행함으로써 원숭이로 이동하였다. 모든 PK 실험은 비히클로서 NaCl 0.9%를 이용해 수행하였다.
랫 예비 PK 실험:
검사 랫 4마리에서, NX218은 빠르게 농도 감소하였으며, NX210 49 mg/kg IV 볼루스 서행 주사 후 3시간 경과 후부터 정량할 수 없게 되었다 (데이터 도시 안함). 이 실험은 동물 혈장에서 NX218를 식별하는 것이 가능함을 입증해준다.
원숭이 PK 실험:
검사 원숭이 3마리에서, 데이터는 NX210 10 mg/kg을 볼루스 IV 주사한 후 여러 날 (D22, D37 및 D51)에 반복 검사하였을 때 재현가능하였다. NX218 농도는 주사 후 30분까지 급격하게 감소하였다 (도 10). 반감기는 약 12분으로 확인되었으며 (표 16), 즉 랫 및 개에서 관찰된 바와 동일한 범위였으며 (데이터 도시 안함), 반복 투여시 높은 일관성을 보였다.
표 16: 원숭이에서 NX210 IV 주사 후 PK 데이터
실험 데이터 C max T max AUC 0 -t AUC 0 -inf CL t 1/2 V ss
(ng/㎖) (분) (min*ng/㎖) (min*ng/㎖) (㎖/min/kg) (분) (㎖/kg)
22 (4300), 37 (4301 및 4302) 또는 51 (4300, 4301 및 4302) 19300 0 57600 63900 190 12.7 93.6
AUC : 곡선 하 면적, CL: 총 소실 (total clearance), Cmax : 최고 농도, t1/2: 최종 소실 반감기, Tmax: Cmax 도달 시간, Vss: 정상 상태에서의 분포 부피
NX218 ( 이용가능할 경우, ± 표준 편차)에 대한 평균 원숭이 혈장 PK 파라미터에 대한 통계 요약
실시예 6: 인간 일차 피질 뉴런의 글루타메이트 -유발성 흥분 독성에 대한 NX218에 의한 보호
NX218 (NX210 펩타이드의 산화된 또는 고리 형태)이 인간 피질 뉴런에 대해 신경보호 잠재성을 가지는 지를 검증하기 위해, 글루타메이트를 이용한 공동-처리 실험을 인간 뉴런 세포 배양물에 대해 수행하였으며, 뉴런 생존과 신경돌기 네트워크를 여러가지 분석을 이용해 평가하였다. 결과를 아래 표 17-19에 나타낸다.
재료 및 방법:
인간 피질 뉴런의 일차 배양: 배아 인간 피질 뉴런 (Sciencell Research Laboratories)을 미리 1 mg/mL 폴리-L-라이신 (Sigma-Aldrich)으로 코팅된 96웰 플레이트에 30,000 세포/웰 밀도로 접종하여, 2% B27 첨가제 (ThermoFisher)가 첨가된 NeurobasalTM 배지에서 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 다음날, 배양 배지를 교체해 남아있는 다이메틸 설폭사이드 (Sigma-Aldrich)와 비-부착 세포를 제거하였다. 그 후, 배양 배지를 2일 간격으로 7일간 시험관내 교체 (div)하였다. 8 div에, 뉴런을 B27 첨가제가 결여된 배양 배지에서 100 μM 글루타메이트 (Sigma-Aldrich) 및 비히클 또는 100, 250 또는 500 ㎍/mL NX218에 15분간 노출시켰다. 여러개의 배양 플레이트를 사용해 후술한 바와 같이 한편으로 락테이트 데하이드로게나제 (LDH) 및 뉴런-특이적인 클래스 III 베타-튜불린 (Tuj1) 면역염색과, 다른 한편으로 WST-8 분석 및 카스파제 3/7 염색을 수행하였다.
WST -8 분석: 글루타메이트 노출 후 24시간 경과시, WST-8의 포르마잔 (Sigma-Aldrich)으로의 환원을 측정하여 인간 뉴런의 생존성을 평가하였다. 이를 위해, 뉴런을 CCK-8 시약 (WST-8) 10 ㎕와 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 다음 Synergy II 마이크로플레이트 리더를 사용해 450 nm에서 흡광도를 정량하였다. 데이터를 비히클 대조군의 세포 층 흡광도에 대한 %로 나타내었다.
LDH 분석: 글루타메이트 노출 후 24시간 경과시, 배양 상층액에서 LHD 분비를 "세포독성 검출 키트 (LDH)" (Roche)로 측정하여 인간 뉴런의 원형질막 온전성을 평가하였다. 이를 위해, 뉴런을 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 수소 (NADH)의 존재 하에 피루브산나트륨과 인큐베이션하였다. 피루브산을 유리 LDH에 의해 락트산으로 촉매 반응을 진행하였으며, 동시에 NADH가 NAD+로 산화되었다. NADH에서 NAD+로의 산화율을 Synergy II 마이크로플레이트 리더를 사용해 490 nm에서 측정하였다. 데이터는 비히클 대조군의 배양액내 LDH 함량에 대한 %로 나타내었다.
인간 뉴런의 면역형광 : 글루타메이트 노출 후 24시간 경과시, 뉴런을 PBS 중의 4% 파라포름알데하이드 (Sigma-Aldrich)로 고정하였다. 그 후, 비-특이 부위를 PBS (Santa Cruz) 중의 3% BSA로 차단 처리하였다. 세포를 차단 완충제에 희석한 마우스 항-Tuj1 항체 (1/1000; Abcam)와 1시간 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 세포를 수회 헹군 후, 0.5% BSA/PBS에 희석한 항-마우스 Alexa fluor-488 접합된 2차 항체 (1/100; Abcam)와 1시간 동안 RT에서 인큐베이션하였다. CellInsight CX7 형광 현미경 (ThermoFisher)을 사용해 10x 배율로 각 조건에서 웰 당 사진을 4회 촬영하였다. 이미지 분석을 Cellomics 분석기 시스템 (ThermoFisher)으로 수행하여 신경돌기의 평균 길이, 기저부 (root) 및 말단 가지 (extremity)의 수 등의 여러가지 신경돌기 성장 파라미터를 측정하였다. 데이터를 비히클 대조군에 대한 %로 나타내었다.
카스파제 3/7 분석: 글루타메이트 노출 후 24시간 경과시, 카스파제 3/7의 형광성 기질을 배양 배지에 첨가하여 카스파제 3 및 7의 활성화를 확인하였다 (세포 현상 파스파제 3/7 녹색 검출 키트; ThermoFisher). 수회 헹군 후, CellInsight CX7 형광 현미경을 10x 배율에서 사용해 웰 당 사진을 4회 촬영하고, Cellomics 분석기 시스템으로 분석하였다. 데이터를 핵 총 수에 대한 카스파제 3/7-양성 뉴런의 %로 나타내었다.
뉴런 생존율 (A) 뉴런 사멸율 (B)
평균 SEM n 평균 SEM n
대조군 100 1,745 6 100 2,55 6
글루타메이트 ( glu ) 100 μM 77,41 ### 1,735 6 202,5 ### 8,416 6
glu + NX218　100 ㎍/mL 76,71 1,431 6 169,1** 2,094 6
glu + NX218　250 ㎍/mL 85,88 2,01 6 149,8*** 5,85 6
glu + NX218　500 ㎍/mL 96,94*** 4,234 6 160,8*** 7,599 6
뉴런 세포자살 (C) 신경돌기 길이 (D)
평균 SEM n 평균 SEM n
대조군 14,27 0,9454 6 100 6,638 6
글루타메이트 ( glu ) 100 μM 27,83 ### 1,458 6 36,84 ### 7,698 6
glu + NX218　100 ㎍/mL 18,77*** 1,221 6 63,27* 5,873 6
glu + NX218　250 ㎍/mL 12,84*** 1,323 6 73,27** 1,597 6
glu + NX218　500 ㎍/mL 11,03*** 1,054 6 51,82 5,746 6
신경돌기 기저부 (E) 신경 돌기 말단 가지 (F)
평균 SEM n 평균 SEM n
대조군 100 6,082 6 100 7,017 6
글루타메이트 ( glu ) 100 μM 44,41 ### 5,151 6 35,15 ### 5,182 6
glu + NX218　100 ㎍/mL 69,27* 5,216 6 59,25 8,638 6
glu + NX218　250 ㎍/mL 80,18*** 1,547 6 67,51* 0,584 5
glu + NX218　500 ㎍/mL 61,69 6,099 6 47,79 6,611 6
표 17- 19: 8일에 시험관내에서 글루타메이트 (glu, 100 μM), 및 비히클 또는 NX218 (100, 250, 500 ㎍/mL)에 15분간 공동-노출 후 2일 경과시, 일차 인간 피질 뉴런 배양물에서의 뉴런 생존율, 사멸 및 세포자살과 신경돌기 네트워크에 대한 평가. 인간 태아로부터 분리한 일차 피질 뉴런에 글루타메이트 (glu, 100 μM)와 비히클 (대조군) 또는 NX218 (100, 250, 500 ㎍/mL)을 15분간 8일에 시험관내 공동-처리하였다 (div). 1일 후, 배양물에 대해 생화학적 분석 (세포 층에 대해 WST-8, 배양 배지에 대해 락테이트 데하이드로게나제 (LDH)), 또는 뉴런 마커 뉴런-특이 클래스 III β-투불린 (Tuj1) 및 카스파제 3 및 7 (세포자살 마커) 염색을 수행하였다. A. 뉴런 생존율을 세포 층에서 WST-8 생화학 분석으로 평가하였다. B. 뉴런 사멸을 배양물내 LDH를 측정함으로써 평가하였다. C. 세포자살 세포의 수를 카스파제 3 및 7의 활성화를 측정함으로써 평가하였다. 결과는 총 핵 개수에 대한 세포자살 뉴런의 %로 나타내었다. D-F. 신경돌기 성장을 신경돌기의 평균 길이 (D)와, Tuj1-양성 뉴런의 기저부 (E) 및 말단 가지 (F)의 수를 측정하여 평가하였다. A-F. 데이터를 중앙값 및 4분위 범위로 나타내었다. 일원식-ANOVA 및 후속적인 Tukey의 다중 비교 검정: ###p<0.001 대조군 vs glu; ***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05 glu vs NX218/glu, n=6 (A-E) 및 n=5-6 (F).
NX218의 신경보호 효과가 글루타메이트에 노출된 인간 피질 뉴런에서 검증되었다. 실제, WST-8 비색 분석법을 통해, NX218이 500 ㎍/mL에서 뉴런 생존성을 완전히 보존한다는 것이 입증되었다 (뉴런 생존성, glu-처리 뉴런 -22.59% vs NX218/glu-처리 뉴런 -3.06%, p<0.0001; 대조군 처리 뉴런과 NX218/glu-처리 뉴런 간에 p=0.9009). 아울러, 사용 용량들에서 글루타메이트와 NX218로 공동-처리된 뉴런에 의해 방출된 LDH가, 글루타메이트 단독과 비교해 현저히 적었다 (250 ㎍/mL에서 glu-처리 뉴런 대비 NX218/glu-처리 뉴런에서의 LDH -52.70%, p<0.0001). NX218의 괴사에 대한 유익한 작용으로, 세포자살 세포는 정상적인 기저 수준이었으며 (세포자살 세포 %, 대조군 뉴런의 경우 14.27% vs glu-처리 뉴런의 경우 27.83% 및 250 ㎍/mL NX218/glu-처리 뉴런의 경우 12.84%, 대조군과 glu-처리 뉴런 간에 p<0.0001, glu-처리 뉴런과 NX218/glu-처리 뉴런 간에 p<0.0001, 대조군 뉴런과 NX218/glu-처리 뉴런 간에 p=0.9170), 이는 인간 피질 뉴런에서 괴사 및 세포자살에 대한 NX218의 강력한 신경보호 효과를 입증해준다.
<110> AXOLTIS PHARMA <120> Systemic administration of peptides for the treatment of spinal cord injury <130> BET 19L3763 <160> 63 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide compound <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Xaa is absent or 1 to 6 amino acids <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) <223> Xaa is 1 to 5 amino acids <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7) <223> Xaa is 1 to 5 amino acids <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(11) <223> Xaa is 1 to 5 amino acids <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14) <223> Xaa is absent or is 1 to 6 amino acids <400> 1 Xaa Trp Ser Xaa Trp Ser Xaa Cys Ser Xaa Xaa Cys Gly Xaa 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide compound <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) <223> Xaa is 1 to 5 amino acids <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> Xaa is 1 to 5 amino acids <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(10) <223> Xaa is 1 to 5 amino acids <400> 2 Trp Ser Xaa Trp Ser Xaa Cys 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Ser Arg Ser Cys Gly 1 5 10 <210> 37 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide compound <400> 37 Leu Ala Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly 1 5 10 15 <210> 38 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide compound <400> 38 Val Leu Ala Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly 1 5 10 15 <210> 39 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide compound <400> 39 Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Leu 1 5 10 <210> 40 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide compound <400> 40 Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Leu Gly 1 5 10 <210> 41 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide compound <400> 41 Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Leu Gly Leu 1 5 10 15 <210> 42 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide compound <400> 42 Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Leu Gly Leu Ile 1 5 10 15 <210> 43 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide compound <400> 43 Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Leu Gly Leu Ile 1 5 10 15 Phe <210> 44 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide compound <400> 44 Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Leu 1 5 10 <210> 45 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide compound <400> 45 Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Leu Gly 1 5 10 15 <210> 46 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide compound <400> 46 Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Leu Gly Leu 1 5 10 15 <210> 47 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide compound <400> 47 Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Leu Gly Leu 1 5 10 15 Ile <210> 48 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide compound <400> 48 Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Leu Gly Leu 1 5 10 15 Ile Phe <210> 49 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide compound <400> 49 Ala Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Leu 1 5 10 15 <210> 50 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide compound <400> 50 Ala Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Leu Gly 1 5 10 15 <210> 51 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide compound <400> 51 Ala Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Leu Gly 1 5 10 15 Leu <210> 52 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide compound <400> 52 Ala Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Leu Gly 1 5 10 15 Leu Ile <210> 53 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide compound <400> 53 Ala Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Leu Gly 1 5 10 15 Leu Ile Phe <210> 54 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide compound <400> 54 Leu Ala Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Leu 1 5 10 15 <210> 55 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide compound <400> 55 Leu Ala Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Leu 1 5 10 15 Gly <210> 56 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide compound <400> 56 Leu Ala Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Leu 1 5 10 15 Gly Leu <210> 57 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide compound <400> 57 Leu Ala Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Leu 1 5 10 15 Gly Leu Ile <210> 58 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide compound <400> 58 Leu Ala Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Leu 1 5 10 15 Gly Leu Ile Phe 20 <210> 59 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide compound <400> 59 Val Leu Ala Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly 1 5 10 15 Leu <210> 60 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide compound <400> 60 Val Leu Ala Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly 1 5 10 15 Leu Gly <210> 61 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide compound <400> 61 Val Leu Ala Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly 1 5 10 15 Leu Gly Leu <210> 62 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide compound <400> 62 Val Leu Ala Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly 1 5 10 15 Leu Gly Leu Ile 20 <210> 63 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide compound <400> 63 Val Leu Ala Pro Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly 1 5 10 15 Leu Gly Leu Ile Phe 20

Claims (21)

  1. 척수 손상 및/또는 시신경 손상과 같은 뇌를 제외한 신경계 손상을 치료하는데 사용하기 위한, 환자에게 전신 경로를 통해 투여되는, 하기 아미노산 서열의 펩타이드:
    X1-W-S-A1-W-S-A2-C-S-A3-A4-C-G-X2 (서열번호 1)
    서열번호 1에서,
    - A1, A2, A3 및 A4는 아미노산 1-5개로 이루어진 아미노산 서열로 구성되고,
    - X1 및 X2는 아미노산 1-6개로 이루어진 아미노산 서열이거나, 또는 X1 및 X2는 생략되며,
    - N-말단 아미노산은 아세틸화되거나, C-말단 아미노산은 아미드화되거나, 또는 N-말단 아미노산은 아세틸화되고 C-말단 아미노산은 아미드화될 수 있음.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드가 하기 아미노산 서열인, 펩타이드:
    W-S-A1-W-S-A2-C-S-A3-A4-C-G (서열번호 2)
    상기 서열번호 2에서,
    A1, A2, A3 및 A4는 아미노산 1-5개로 이루어진 아미노산 서열로 구성됨.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 펩타이드가 선형 펩타이드, 또는 서열번호 1 및 2의 펩타이드 식에서 시스테인이 이황화 결합을 형성하는 산화된 펩타이드, 또는 선형 펩타이드와 산화된 펩타이드의 혼합물인, 펩타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    - A1은 G, V, S, P 및 A로부터 선택되고, 바람직하게는 G, S로부터 선택되고,
    - A2는 G, V, S, P 및 A로부터 선택되고, 바람직하게는 G, S로부터 선택되고,
    - A3는 R, A 및 V로부터 선택되고, 바람직하게는 R, V로부터 선택되고, 및/또는
    - A4는 S, T, P 및 A로부터 선택되고, 바람직하게는 S, T로부터 선택되는, 펩타이드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    A1 및 A2가 독립적으로 G 및 S로부터 선택되거나, 및/또는 A3-A4는 R-S 또는 V-S 또는 V-T 또는 R-T로부터 선택되는, 펩타이드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 펩타이드가 서열번호 3-63의 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열인, 펩타이드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 펩타이드는 피하, 정맥내, 복막내, 비강내, 피하, 근육내, 설하 또는 경구 경로를 통해 환자에게 투여되는, 펩타이드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 손상이 외상 손상 또는 종양과 같은 주변 세포의 생장으로 인한 손상인, 펩타이드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    신경 세포 사멸 및/또는 축삭돌기 변성, 및/또는 괴사 (일차 손상), 이차 손상의 저해 또는 감소 (특히 이차 신경 세포 사멸 및/또는 축삭돌기 변성의 저해 또는 감소)를 유도하는, 펩타이드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    수초화 (myelination)를 유도하는, 펩타이드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    기능 회복을 유도하는, 펩타이드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    환자 또는 동물 모델에서 예를 들어 MBP를 항체로 면역염색하여 측정한 바에 따라 병변 부위에 마이엘린 결합 단백질 (MBP)의 수준 증가를 유도하는, 펩타이드.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    Olig2-양성 전구 세포 동원 및/또는 Olig2-양성 세포 생성의 증가를 유도하는, 펩타이드.
  14. 치료학적 함량의 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드와 약제학적으로 허용가능한 비히클 또는 부형제를 전신 경로를 통해 개체에 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 척수 손상 및/또는 시신경 손상과 같은 뇌를 제외한 신경계 손상을 치료하는 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    신경 세포 사멸 및/또는 축삭돌기 변성, 및/또는 괴사 (일차 손상), 이차 손상의 저해 또는 감소 (특히 이차 신경 세포 사멸 및/또는 축삭돌기 변성의 저해 또는 감소)를 유도하는, 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    기능 회복을 유도하는, 방법.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    환자 또는 동물 모델에서, 예를 들어 MBP를 항체로 면역염색하여 측정한 바에 따라 병변 부위에 마이엘린 결합 단백질 (MBP)의 수준 증가를 유도하는, 방법.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    Olig2-양성 전구 세포 동원 및/또는 Olig2-양성 세포 생성의 증가를 유도하는, 방법.
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    수초화 또는 재수초화를 유도하는, 방법.
  20. 펩타이드(들)를 전신 경로를 통해 환자에 투여하는, 척수병증에서 재수초화에 이용하기 위한 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드.
  21. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 유효량 또는 충분량으로 전신 경로를 통해 환자에 투여하는 것을 포함하는, 필요한 환자에서 척수병증을 치료하는 방법.
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