CN108398517A - 一种筛查正清风痛宁制剂中潜在致敏组分的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种筛查正清风痛宁制剂中潜在致敏组分的方法,该方法包括构建细胞膜色谱‑‑CMC2、构建CMC‑HPLC/MS系统的具体步骤;正清风痛宁制剂原料或注射剂样品进入CMC系统,致敏组分,会与肥大细胞膜结合,被CMC系统识别并将出峰,其根据其在细胞膜上保留的时间对其保留组分进行接液,接液浓缩;将所得的浓缩液作为新的样品,进入HPLC/MS系统进行化学结构检测,对HPLC/MS分析中的ESI‑MS图谱进行分析,根据其分子离子峰可以判断出浓缩液中的化学成分,即为致敏组分。本发明建立了高效、灵敏的正清风痛宁制剂药物类过敏组分的筛查方法,提高了致敏组分筛选准确率。
Description
技术领域
本发明涉及一种药物中致敏组分筛查方法,特别涉及一种筛查正清风痛宁制剂中潜在致敏组分的方法。
背景技术
在口服或注射某些药物后,一些人会发生一系列与过敏相似的类过敏反应,如皮疹、瘙痒、血压和心率变化等,称之为类过敏反应,此反应为非抗原物质首次与机体接触发生的过敏样反应。这是由于药物激活了肥大细胞,直接导致组胺释放,造成类过敏反应。在这一过程中,肥大细胞上的蛋白质“MRGPRX2”作为受体,起到了关键性作用。
发明内容
本发明目的在于提供一种筛查正清风痛宁制剂中潜在致敏组分的方法,本发明目的是通过如下方法实现的:
一种筛查正清风痛宁制剂中潜在致敏组分的方法,该方法包括如下步骤:
1、构建细胞膜色谱(CMC)
1.1)选择MrgXs受体类型细胞LAD2,RPMC,MPMC,MrgX2-HEK293,MrgX3-HEK293五种,将MRGPRX2受体高表达的细胞悬液于2-6℃,离心,得沉淀为细胞;加入生理盐水清洗,重复1-3次;细胞用2-6℃冰浴超声,并细胞破碎4-8次;然后悬浮液于2-6℃,离心;吸取上清液;再次于2-6℃,离心,吸弃上清液,得到细胞沉淀;细胞沉淀加入生理盐水,得到细胞膜溶液;
1.2)取硅胶,活化;活化硅胶在室温下抽真空冷却至不烫;再于冰上,抽真空冷却;在抽真空状态下,将1.1)制备的细胞膜溶液与活化硅胶混合至均匀;2-6℃条件下磁力震荡,吸出磁子后静置过夜;然后在2-6℃下,离心,弃上清液;生理盐水清洗沉淀,重复1-3次;得到硅胶细胞膜混悬液。
细胞膜色谱柱装柱中加入1.2)所制备硅胶细胞膜混悬液,然后用三蒸水补满色谱柱;以超纯水为流动相,将压力稳定到6~12Mpa后,色谱柱下端有液体滴落时开始计时,计时2-10min,即装填好细胞膜固定相。
2、构建CMC-HPLC/MS系统
将装填好细胞膜固定相的柱芯装入不锈钢柱套中,装入液相色谱仪中,以纯水为流动相,构成CMC系统;
样品进入CMC系统等度洗脱,样品中存在的致敏组分,会与肥大细胞膜结合,被CMC系统识别并将出峰,其余组分则被洗脱。
致敏组分若在细胞膜上有保留,根据其在细胞膜上保留的时间对其保留组分进行接液,接液8-15次后将所得的溶液浓缩;将所得的浓缩液作为新的样品,进入HPLC/MS系统进行化学结构检测,对HPLC/MS分析中的ESI-MS图谱(常规的分子离子保留图谱,也称电喷雾电离质谱)进行分析,根据其分子离子峰判断出浓缩液中的化学成分,即为致敏组分。
本发明筛查正清风痛宁制剂中潜在致敏组分的方法,可以优选为:
1、构建细胞膜色谱(CMC):
1.1)选择MrgXs受体类型细胞LAD2,RPMC,MPMC,MrgX2-HEK293,MrgX3-HEK293五种,将MRGPRX2受体高表达的细胞悬液于4℃,1200rmp离心5min,得沉淀为细胞;加入生理盐水清洗,重复2次;细胞用4℃冰浴超声30min,并用细胞破碎仪破碎5~6次;然后悬浮液于4℃,1200rmp离心10min;吸取上清液;再次于4℃,12000rmp离心30min,吸弃上清液,得到细胞沉淀;细胞沉淀加入5ml生理盐水,得到细胞膜溶液;
1.2)取硅胶0.05g,105℃活化30min;活化硅胶在室温下抽真空冷却至不烫;再于冰上,抽真空冷却;在抽真空状态下,将1.1)制备的细胞膜溶液5ml与活化硅胶混合至均匀;4℃条件下磁力震荡30min,吸出磁子后静置过夜;然后在4℃下,3000rmp离心5min,弃上清液;生理盐水清洗沉淀,重复2次;得到硅胶细胞膜混悬液。
细胞膜色谱柱装柱中加入1.2)所制备硅胶细胞膜混悬液,然后用三蒸水补满色谱柱;以超纯水为流动相,流速为2.0mL/min,将压力稳定到8~10Mpa后,色谱柱下端有液体滴落时开始计时,计时5min,即装填好细胞膜固定相。
2、构建CMC-HPLC/MS系统;
将装填好细胞膜固定相的柱芯装入不锈钢柱套中,装入液相色谱仪中,以纯水为流动相,构成CMC系统;
样品以0.1~0.2ml/min流速进入CMC系统等度洗脱,样品中存在的致敏组分,会与肥大细胞膜结合,被CMC系统识别并将在20~50min出峰,其余组分则被洗脱。
致敏组分若在细胞膜上有保留,根据其在细胞膜上保留的时间对其保留组分进行接液,接液8-15次后将所得的溶液浓缩;将所得的浓缩液作为新的样品,进入HPLC/MS系统进行化学结构检测,对HPLC/MS分析中的ESI-MS图谱进行分析,根据其分子离子峰可以判断出浓缩液中的化学成分,即为致敏组分。
正清风痛宁注射液是由盐酸青藤碱制成的灭菌水溶液,辅料有乙二胺四醋酸二钠(EDTA-2Na)和亚硫酸氢钠(NaHSO3)。本发明建立了高效、灵敏的正清风痛宁制剂药物类过敏组分的筛查方法,提高了致敏组分筛选准确率。
实施例1
构建细胞膜色谱(CMC)
1.1)选择MrgXs受体类型细胞LAD2,RPMC,MPMC,MrgX2-HEK293,MrgX3-HEK293五种,将MRGPRX2受体高表达的细胞悬液于4℃,1200rmp离心5min,得沉淀为细胞;加入生理盐水清洗,重复2次;细胞用4℃冰浴超声30min,并用细胞破碎仪破碎5~6次;然后悬浮液于4℃,1200rmp离心10min;吸取上清液;再次于4℃,12000rmp离心30min,吸弃上清液,得到细胞沉淀;细胞沉淀加入5ml生理盐水,得到细胞膜溶液;
1.2)取硅胶0.05g,105℃活化30min;活化硅胶在室温下抽真空冷却至不烫;再于冰上,抽真空冷却;在抽真空状态下,将1.1)制备的细胞膜溶液5ml与活化硅胶混合至均匀;4℃条件下磁力震荡30min,吸出磁子后静置过夜;然后在4℃下,3000rmp离心5min,弃上清液;生理盐水清洗沉淀,重复2次;得到硅胶细胞膜混悬液。
细胞膜色谱柱装柱中加入1.2)所制备硅胶细胞膜混悬液,然后用三蒸水补满色谱柱;以超纯水为流动相,流速为2.0mL/min,将压力稳定到8~10Mpa后,色谱柱下端有液体滴落时开始计时,计时5min,即装填好细胞膜固定相。
构建CMC-HPLC/MS系统
将装填好细胞膜固定相的柱芯装入不锈钢柱套中,装入液相色谱仪中,以纯水为流动相,构成CMC系统;
样品以0.1~0.2ml/min流速进入CMC系统等度洗脱,样品中存在的致敏组分,会与肥大细胞膜结合,被CMC系统识别并将在20~50min出峰,其余组分则被洗脱。
致敏组分若在细胞膜上有保留,根据其在细胞膜上保留的时间对其保留组分进行接液,接液8-15次后将所得的溶液浓缩;将所得的浓缩液作为新的样品,进入HPLC/MS系统进行化学结构检测,对HPLC/MS分析中的ESI-MS图谱进行分析,根据其分子离子峰可以判断出浓缩液中的化学成分,即为致敏组分。
潜在致敏组分致敏活性的分析验证:
(1)β-氨基己糖苷酶释放率测定实验
将LAD2细胞悬液稀释为终浓度为5×105个细胞/mL,每孔100μL接种于96孔板(使每孔最终的细胞量为5×104个细胞)。将96孔板置于CO2培养箱中,培养过夜(原代细胞培养2小时),等待细胞贴壁。次日,对于给药组细胞,每孔吸弃原培养基,加入含有不同浓度的致敏组分或含有终浓度为30μg/mL阳性药物C48/80(Compound 48/80,N-甲基-对甲氧基苯乙胺和甲醛缩合产生的聚合物)的100μL TM缓冲溶液,37℃下培养30min后,冰上终止10min,取上清,4℃下1000rpm离心10min,得到给药组细胞培养基上清;
对于未给药的空白细胞,每孔吸弃原培养基,加入100μL TM缓冲溶液,37℃下培养30min后,冰上终止10min,取上清,4℃下1000rpm离心10min,得到空白组细胞培养基上清;吸净未给药空白细胞的培养基上清,再用0.1%TritonX-100裂解空白组细胞5min,冰上终止10min,将裂解液吹打均匀,在4℃下1000rpm离心10min,得到空白组细胞裂解液;
将给药组细胞培养基上清、空白组细胞培养基上清及空白组细胞裂解液各50μL分别加入空白96孔板,每孔加入底物1mmol/L的β-氨基己糖50μL,置于37℃培养箱内孵育90min,孵育完成后,每孔加入150μL 0.1mol/L Na2CO3/NaHCO3终止液终止反应;将96孔板置于室温摇床上摇晃混匀2min,在酶标仪上405nm下检测吸光度值(OD);β-氨基己糖苷酶释放率的计算方法:
β-氨基己糖苷酶释放率(%)=给药组细胞上清吸光度(OD)/(空白细胞上清吸光度(OD空白胞外)+空白细胞裂解液吸光度(OD空白胞内))×100。
(2)LC-ESI-MS/MS法测定组胺:
将LAD2细胞悬液稀释为终浓度为5×105个细胞/mL,每孔100μL接种于96孔板(使每孔最终的细胞量为5×104个细胞);将96孔板置于CO2培养箱中,培养过夜(原代细胞培养2小时),等待细胞贴壁;次日,对于给药组细胞,每孔吸弃原培养基,加入含有不同浓度的致敏组分或含有终浓度为30μg/mL阳性药物C48/80的100μL TM缓冲溶液,37℃下培养30min后,冰上终止10min,取上清,4℃下1000rpm离心10min,得到给药组细胞培养基上清;
对于未给药的空白细胞,每孔吸弃原培养基,加入100μL TM缓冲溶液,37℃下培养30min后,冰上终止10min,取上清,4℃下1000rpm离心10min,得到空白组细胞培养基上清;
样品前处理:向样品中加入2倍体积的乙腈溶液(溶解有内标),混匀,10000rpm,4℃离心10min,取上清;样品处理过程、转移在冰上操作或保持低温;用LC-ESI-MS/MS法测组胺的释放量。
实施例2、100μmol/L注射用盐酸青藤碱原料药的致敏组分筛查
构建细胞膜色谱(CMC):
本发明选择MrgXs受体类型细胞包括LAD2,RPMC,MPMC,MrgX2-HEK293,MrgX3-HEK293五种,将MRGPRX2受体高表达的细胞悬液于4℃,1200rmp离心5min,得沉淀为细胞,并加入生理盐水清洗,重复2次。细胞用4℃冰浴超声30min,并用细胞破碎仪破碎5~6次,然后悬浮液于4℃,1200rmp离心10min,吸取上清液。再次于4℃,12000rmp离心30min,吸弃上清液,得到细胞沉淀。加入5ml生理盐水,得到细胞膜溶液。
取硅胶0.05g,于干燥的25ml具支试管中,105℃活化30min。
取出活化硅胶0.05g,塞上塞子,在室温下抽真空冷却至不烫;再于冰上,抽真空冷却;在抽真空状态下,用5ml注射器将细胞膜溶液竖直加入具支试管中,旋涡使其混合均匀。4℃条件下磁力震荡30min,吸出磁子后静置过夜。第二天在4℃下,3000rmp离心5min,弃上清液,生理盐水清洗,重复2次,得到硅胶细胞膜混悬液。
清洗细胞膜色谱柱装柱机管路,将柱子装入柱套,拧上,加入所制备硅胶细胞膜混悬液,然后用三蒸水补满,将上部螺丝拧紧,以超纯水为流动相,流速为2.0mL/min,将压力稳定到8~10Mpa后,下端有液体滴落时开始计时,计时5min,即装填好细胞膜固定相。
构建CMC-HPLC/MS系统:
将装填好细胞膜固定相的柱芯装入不锈钢柱套中,装入液相色谱仪中,构成CMC系统。取0.4ml注射用盐酸青藤碱原料药溶于10ml容量瓶中,加入甲醇定容,溶解,摇匀,过滤。采用岛津LC-20A高效液相色谱仪自动进样,发现盐酸青藤碱在MRGPRX2细胞构建的CMC模型上有保留行为发生,提示盐酸青藤碱可能为潜在的致敏组分。
表.1注射用青藤碱原料药细胞膜色谱筛选保留结果
注-:无保留;+:tR<5min;++:5<tR<10min
+++:10<tR<15min
潜在致敏组分致敏活性分析:
1、β-氨基己糖苷酶释放率测定实验
将LAD2细胞悬液稀释为终浓度为5×105个细胞/mL,每孔100μL接种于96孔板(使每孔最终的细胞量为5×104个细胞)。将96孔板置于CO2培养箱中,培养过夜(原代细胞培养2小时),等待细胞贴壁。次日,对于给药组细胞,每孔吸弃原培养基,加入100μmol/L注射用盐酸青藤碱原料药或含有终浓度为30μg/mL阳性药物C48/80的100μL TM缓冲溶液,37℃下培养30min后,冰上终止10min,取上清,4℃下1000rpm离心10min,得到给药组细胞培养基上清;对于未给药的空白细胞,每孔吸弃原培养基,加入100μL TM缓冲溶液,37℃下培养30min后,冰上终止10min,取上清,4℃下1000rpm离心10min,得到空白组细胞培养基上清;吸净未给药空白细胞的培养基上清,再用0.1%Triton X-100裂解空白组细胞5min,冰上终止10min,将裂解液吹打均匀,在4℃下1000rpm离心10min,得到空白组细胞裂解液。
将给药组细胞培养基上清、空白组细胞培养基上清及空白组细胞裂解液各50μL分别加入空白96孔板,每孔加入底物1mmol/L的β-氨基己糖50μL,置于37℃培养箱内孵育90min,孵育完成后,每孔加入150μL 0.1mol/L Na2CO3/NaHCO3终止液终止反应。将96孔板置于室温摇床上摇晃混匀2min,在酶标仪上405nm下检测吸光度值(OD)。β-氨基己糖苷酶释放率的计算方法:
β-氨基己糖苷酶释放率(%)=给药组细胞上清吸光度(OD)/(空白细胞上清吸光度(OD空白胞外)+空白细胞裂解液吸光度(OD空白胞内))×100。
表2LAD2细胞β-氨基己糖苷酶释放率的测定(%)
表2显示,注射用盐酸青藤碱原料药作用于LAD2,可以使β-氨基己糖苷酶释放量增加,给药剂量为100μM时,释放量为50.37%±1.13。
2、LC-ESI-MS/MS法测定组胺:
将细胞悬液稀释为终浓度为5×105个细胞/mL,每孔100μL接种于96孔板(使每孔最终的细胞量为5×104个细胞)。将96孔板置于CO2培养箱中,培养过夜(原代细胞培养2小时),等待细胞贴壁。次日,对于给药组细胞,每孔吸弃原培养基,加入100μmol/L注射用盐酸青藤碱原料药或含有终浓度为30μg/mL阳性药物C48/80的100μL TM缓冲溶液,37℃下培养30min后,冰上终止10min,取上清,4℃下1000rpm离心10min,得到给药组细胞培养基上清;对于未给药的空白细胞,每孔吸弃原培养基,加入100μL TM缓冲溶液,37℃下培养30min后,冰上终止10min,取上清,4℃下1000rpm离心10min,得到空白组细胞培养基上清。样品前处理:向样品中加入2倍体积的乙腈溶液(溶解有内标),混匀,10000rpm,4℃离心10min,取上清(注:整个样品处理过程、转移在冰上操作或保持低温)。直接测定,或-80℃保存处理好的样品。用已建立的方法测组胺的释放量。
表3LAD2细胞组胺释放量的测定(ng/μl)
注射用盐酸青藤碱原料药作用于LAD2细胞,可以使组胺的释放量增加,给药剂量为100μM时释放量达到196.12±2.67ng/μl。因此可以得出,盐酸青藤碱会引起LAD2细胞产生脱颗粒反应。
实施例3、100μmol/L正清风痛宁注射液的致敏组分筛查
构建细胞膜色谱(CMC)
本发明选择MrgXs受体类型细胞包括LAD2,RPMC,MPMC,MrgX2-HEK293,MrgX3-HEK293五种,将MRGPRX2受体高表达的细胞悬液于4℃,1200rmp离心5min,得沉淀为细胞,并加入生理盐水清洗,重复2次。细胞用4℃冰浴超声30min,并用细胞破碎仪破碎5~6次,然后悬浮液于4℃,1200rmp离心10min,吸取上清液。再次于4℃,12000rmp离心30min,吸弃上清液,得到细胞沉淀。加入5ml生理盐水,得到细胞膜溶液。
取硅胶0.05g,于干燥的25ml具支试管中,105℃活化30min。
取出活化硅胶0.05g,塞上塞子,在室温下抽真空冷却至不烫;再于冰上,抽真空冷却;在抽真空状态下,用5ml注射器将细胞膜溶液竖直加入具支试管中,旋涡使其混合均匀。4℃条件下磁力震荡30min,吸出磁子后静置过夜。第二天在4℃下,3000rmp离心5min,弃上清液,生理盐水清洗,重复2次,得到硅胶细胞膜混悬液。
清洗细胞膜色谱柱装柱机管路,将柱子装入柱套,拧上,加入所制备硅胶细胞膜混悬液,然后用三蒸水补满,将上部螺丝拧紧,以超纯水为流动相,流速为2.0mL/min,将压力稳定到8~10Mpa后,下端有液体滴落时开始计时,计时5min,即装填好细胞膜固定相。
构建CMC-HPLC/MS系统:
将装填好细胞膜固定相的柱芯装入不锈钢柱套中,装入液相色谱仪中,构成CMC系统。取0.4ml正清风痛宁注射液溶于10ml容量瓶中,加入甲醇定容,溶解,摇匀,过滤。采用岛津LC-20A高效液相色谱仪自动进样,发现盐酸青藤碱在MRGPRX2细胞构建的CMC模型上有保留行为发生,而注射液辅料EDTA-2Na和NaHSO3则无明显保留。提示正清风痛宁制剂中盐酸青藤碱可能为其潜在的致敏组分。
表.4正清风痛宁注射液细胞膜色谱筛选保留结果
注-:无保留;+:tR<5min;++:5<tR<10min
+++:10<tR<15min
潜在致敏组分致敏活性分析:
1、β-氨基己糖苷酶释放率测定实验:
将LAD2细胞悬液稀释为终浓度为5×105个细胞/mL,每孔100μL接种于96孔板(使每孔最终的细胞量为5×104个细胞)。将96孔板置于CO2培养箱中,培养过夜(原代细胞培养2小时),等待细胞贴壁。次日,对于给药组细胞,每孔吸弃原培养基,加入100μmol/L正清风痛宁注射液或含有终浓度为30μg/mL阳性药物C48/80的100μL TM缓冲溶液,37℃下培养30min后,冰上终止10min,取上清,4℃下1000rpm离心10min,得到给药组细胞培养基上清;对于未给药的空白细胞,每孔吸弃原培养基,加入100μL TM缓冲溶液,37℃下培养30min后,冰上终止10min,取上清,4℃下1000rpm离心10min,得到空白组细胞培养基上清;吸净未给药空白细胞的培养基上清,再用0.1%Triton X-100裂解空白组细胞5min,冰上终止10min,将裂解液吹打均匀,在4℃下1000rpm离心10min,得到空白组细胞裂解液。
将给药组细胞培养基上清、空白组细胞培养基上清及空白组细胞裂解液各50μL分别加入空白96孔板,每孔加入底物1mmol/L的β-氨基己糖50μL,置于37℃培养箱内孵育90min,孵育完成后,每孔加入150μL 0.1mol/L Na2CO3/NaHCO3终止液终止反应。将96孔板置于室温摇床上摇晃混匀2min,在酶标仪上405nm下检测吸光度值(OD)。β-氨基己糖苷酶释放率的计算方法:
β-氨基己糖苷酶释放率(%)=给药组细胞上清吸光度(OD)/(空白细胞上清吸光度(OD空白胞外)+空白细胞裂解液吸光度(OD空白胞内))×100。
表5LAD2细胞β-氨基己糖苷酶释放率的测定(%)
表5显示,100μmol/L正清风痛宁注射液作用于LAD2,可以使β-氨基己糖苷酶释放量增加,给药剂量为100μM时,释放量为52.19%±1.31。
2、LC-ESI-MS/MS法测定组胺:
将细胞悬液稀释为终浓度为5×105个细胞/mL,每孔100μL接种于96孔板(使每孔最终的细胞量为5×104个细胞)。将96孔板置于CO2培养箱中,培养过夜(原代细胞培养2小时),等待细胞贴壁。次日,对于给药组细胞,每孔吸弃原培养基,加入100μmol/L正清风痛宁注射液或含有终浓度为30μg/mL阳性药物C48/80的100μL TM缓冲溶液,37℃下培养30min后,冰上终止10min,取上清,4℃下1000rpm离心10min,得到给药组细胞培养基上清;对于未给药的空白细胞,每孔吸弃原培养基,加入100μL TM缓冲溶液,37℃下培养30min后,冰上终止10min,取上清,4℃下1000rpm离心10min,得到空白组细胞培养基上清。样品前处理:向样品中加入2倍体积的乙腈溶液(溶解有内标),混匀,10000rpm,4℃离心10min,取上清(注:整个样品处理过程、转移在冰上操作或保持低温)。直接测定,或-80℃保存处理好的样品。用已建立的方法测组胺的释放量。
表6LAD2细胞组胺释放量的测定(ng/μl)
100μmol/L正清风痛宁注射液作用于LAD2细胞,可以使组胺的释放量增加,给药剂量为100μM时释放量达到216.12±3.74ng/μl。因此可以得出,盐酸青藤碱会引起LAD2细胞产生脱颗粒反应。
实施例4、50μmol/L正清风痛宁注射液的致敏组分筛查
构建细胞膜色谱(CMC):
本发明选择MrgXs受体类型细胞包括LAD2,RPMC,MPMC,MrgX2-HEK293,MrgX3-HEK293五种,将MRGPRX2受体高表达的细胞悬液于4℃,1200rmp离心5min,得沉淀为细胞,并加入生理盐水清洗,重复2次。细胞用4℃冰浴超声30min,并用细胞破碎仪破碎5~6次,然后悬浮液于4℃,1200rmp离心10min,吸取上清液。再次于4℃,12000rmp离心30min,吸弃上清液,得到细胞沉淀。加入5ml生理盐水,得到细胞膜溶液。
取硅胶0.05g,于干燥的25ml具支试管中,105℃活化30min。
取出活化硅胶0.05g,塞上塞子,在室温下抽真空冷却至不烫;再于冰上,抽真空冷却;在抽真空状态下,用5ml注射器将细胞膜溶液竖直加入具支试管中,旋涡使其混合均匀。4℃条件下磁力震荡30min,吸出磁子后静置过夜。第二天在4℃下,3000rmp离心5min,弃上清液,生理盐水清洗,重复2次,得到硅胶细胞膜混悬液。
清洗细胞膜色谱柱装柱机管路,将柱子装入柱套,拧上,加入所制备硅胶细胞膜混悬液,然后用三蒸水补满,将上部螺丝拧紧,以超纯水为流动相,流速为2.0mL/min,将压力稳定到8~10Mpa后,下端有液体滴落时开始计时,计时5min,即装填好细胞膜固定相。
构建CMC-HPLC/MS系统:
将装填好细胞膜固定相的柱芯装入不锈钢柱套中,装入液相色谱仪中,构成CMC系统。取0.2ml正清风痛宁注射液溶于10ml容量瓶中,加入甲醇定容,溶解,摇匀,过滤。采用岛津LC-20A高效液相色谱仪自动进样,发现盐酸青藤碱在MRGPRX2细胞构建的CMC模型上有保留行为发生,而注射液辅料EDTA-2Na和NaHSO3则无明显保留。提示正清风痛宁制剂中盐酸青藤碱可能为其潜在的致敏组分。
表7正清风痛宁注射液细胞膜色谱筛选保留结果
注-:无保留;+:tR<5min;++:5<tR<10min
+++:10<tR<15min
潜在致敏组分致敏活性分析:
1、β-氨基己糖苷酶释放率测定实验
将LAD2细胞悬液稀释为终浓度为5×105个细胞/mL,每孔100μL接种于96孔板(使每孔最终的细胞量为5×104个细胞)。将96孔板置于CO2培养箱中,培养过夜(原代细胞培养2小时),等待细胞贴壁。次日,对于给药组细胞,每孔吸弃原培养基,加入50μmol/L正清风痛宁注射液或含有终浓度为30μg/mL阳性药物C48/80的100μL TM缓冲溶液,37℃下培养30min后,冰上终止10min,取上清,4℃下1000rpm离心10min,得到给药组细胞培养基上清;对于未给药的空白细胞,每孔吸弃原培养基,加入100μL TM缓冲溶液,37℃下培养30min后,冰上终止10min,取上清,4℃下1000rpm离心10min,得到空白组细胞培养基上清;吸净未给药空白细胞的培养基上清,再用0.1%Triton X-100裂解空白组细胞5min,冰上终止10min,将裂解液吹打均匀,在4℃下1000rpm离心10min,得到空白组细胞裂解液。
将给药组细胞培养基上清、空白组细胞培养基上清及空白组细胞裂解液各50μL分别加入空白96孔板,每孔加入底物1mmol/L的β-氨基己糖50μL,置于37℃培养箱内孵育90min,孵育完成后,每孔加入150μL 0.1mol/L Na2CO3/NaHCO3终止液终止反应。将96孔板置于室温摇床上摇晃混匀2min,在酶标仪上405nm下检测吸光度值(OD)。β-氨基己糖苷酶释放率的计算方法:
β-氨基己糖苷酶释放率(%)=给药组细胞上清吸光度(OD)/(空白细胞上清吸光度(OD空白胞外)+空白细胞裂解液吸光度(OD空白胞内))×100。
表8LAD2细胞β-氨基己糖苷酶释放率的测定(%)
表8显示,50μmol/L正清风痛宁注射液作用于LAD2,可以使β-氨基己糖苷酶释放量增加,给药剂量为50μM时,释放量为45.56%±5.96。
2、LC-ESI-MS/MS法测定组胺
将细胞悬液稀释为终浓度为5×105个细胞/mL,每孔100μL接种于96孔板(使每孔最终的细胞量为5×104个细胞)。将96孔板置于CO2培养箱中,培养过夜(原代细胞培养2小时),等待细胞贴壁。次日,对于给药组细胞,每孔吸弃原培养基,加入50μmol/L正清风痛宁注射液或含有终浓度为30μg/mL阳性药物C48/80的100μL TM缓冲溶液,37℃下培养30min后,冰上终止10min,取上清,4℃下1000rpm离心10min,得到给药组细胞培养基上清;对于未给药的空白细胞,每孔吸弃原培养基,加入100μL TM缓冲溶液,37℃下培养30min后,冰上终止10min,取上清,4℃下1000rpm离心10min,得到空白组细胞培养基上清。样品前处理:向样品中加入2倍体积的乙腈溶液(溶解有内标),混匀,10000rpm,4℃离心10min,取上清(注:整个样品处理过程、转移在冰上操作或保持低温)。直接测定,或-80℃保存处理好的样品。用已建立的方法测组胺的释放量。
表9LAD2细胞组胺释放量的测定(ng/μl)
50μmol/L正清风痛宁注射液作用于LAD2细胞,可以使组胺的释放量增加,给药剂量为50μM时释放量达到230.67±13.34ng/μl。因此可以得出,盐酸青藤碱会引起LAD2细胞产生脱颗粒反应。
Claims (2)
1.一种筛查正清风痛宁制剂中潜在致敏组分的方法,该方法包括如下步骤:
构建细胞膜色谱—CMC:
1.1)选择MrgXs受体类型细胞LAD2,RPMC,MPMC,MrgX2-HEK293,MrgX3-HEK293五种,将MRGPRX2受体高表达的细胞悬液于2-6℃,离心,得沉淀为细胞;加入生理盐水清洗,重复1-3次;细胞用2-6℃冰浴超声,并细胞破碎4-8次;然后悬浮液于2-6℃,离心;吸取上清液;再次于2-6℃,离心,吸弃上清液,得到细胞沉淀;细胞沉淀加入生理盐水,得到细胞膜溶液;
1.2)取硅胶,活化;活化硅胶在室温下抽真空冷却至不烫;再于冰上,抽真空冷却;在抽真空状态下,将1.1)制备的细胞膜溶液与活化硅胶混合至均匀;2-6℃条件下磁力震荡,吸出磁子后静置过夜;然后在2-6℃下,离心,弃上清液;生理盐水清洗沉淀,重复1-3次;得到硅胶细胞膜混悬液;
细胞膜色谱柱装柱中加入1.2)所制备硅胶细胞膜混悬液,然后用三蒸水补满色谱柱;以超纯水为流动相,将压力稳定到6~12Mpa后,色谱柱下端有液体滴落时开始计时,计时2-10min,即装填好细胞膜固定相。
构建CMC-HPLC/MS系统:
将装填好细胞膜固定相的柱芯装入不锈钢柱套中,装入液相色谱仪中,以纯水为流动相,构成CMC系统;样品进入CMC系统等度洗脱,样品中存在的致敏组分,会与肥大细胞膜结合,被CMC系统识别并将出峰,其余组分则被洗脱;致敏组分在细胞膜上有保留,根据其在细胞膜上保留的时间对其保留组分进行接液,接液8-15次后将所得的溶液浓缩;将所得的浓缩液作为新的样品,进入HPLC/MS系统进行化学结构检测,对HPLC/MS分析中的ESI-MS图谱进行分析,根据其分子离子峰判断出浓缩液中的化学成分,即为致敏组分。
2.如权利要求1所述的筛查正清风痛宁制剂中潜在致敏组分的方法,该方法包括如下步骤:
构建细胞膜色谱—CMC:
1.1)选择MrgXs受体类型细胞LAD2,RPMC,MPMC,MrgX2-HEK293,MrgX3-HEK293五种,将MRGPRX2受体高表达的细胞悬液于4℃,1200rmp离心5min,得沉淀为细胞;加入生理盐水清洗,重复2次;细胞用4℃冰浴超声30min,并用细胞破碎仪破碎5~6次;然后悬浮液于4℃,1200rmp离心10min;吸取上清液;再次于4℃,12000rmp离心30min,吸弃上清液,得到细胞沉淀;细胞沉淀加入5ml生理盐水,得到细胞膜溶液;
1.2)取硅胶0.05g,105℃活化30min;活化硅胶在室温下抽真空冷却至不烫;再于冰上,抽真空冷却;在抽真空状态下,将1.1)制备的细胞膜溶液5ml与活化硅胶混合至均匀;4℃条件下磁力震荡30min,吸出磁子后静置过夜;然后在4℃下,3000rmp离心5min,弃上清液;生理盐水清洗沉淀,重复2次;得到硅胶细胞膜混悬液;
细胞膜色谱柱装柱中加入1.2)所制备硅胶细胞膜混悬液,然后用三蒸水补满色谱柱;以超纯水为流动相,流速为2.0mL/min,将压力稳定到8~10Mpa后,色谱柱下端有液体滴落时开始计时,计时5min,即装填好细胞膜固定相。
构建CMC-HPLC/MS系统:
将装填好细胞膜固定相的柱芯装入不锈钢柱套中,装入液相色谱仪中,以纯水为流动相,构成CMC系统;样品以0.1~0.2ml/min流速进入CMC系统等度洗脱,样品中存在的致敏组分,会与肥大细胞膜结合,被CMC系统识别并将在20~50min出峰,其余组分则被洗脱;致敏组分若在细胞膜上有保留,根据其在细胞膜上保留的时间对其保留组分进行接液,接液8-15次后将所得的溶液浓缩;将所得的浓缩液作为新的样品,进入HPLC/MS系统进行化学结构检测,对HPLC/MS分析中的ESI-MS图谱进行分析,根据其分子离子峰可以判断出浓缩液中的化学成分,即为致敏组分。
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Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102680272A (zh) * | 2012-05-29 | 2012-09-19 | 烟台渤海制药集团有限公司 | 一种海胆多糖的提取、纯化及鉴定方法 |
CN103399112A (zh) * | 2013-07-24 | 2013-11-20 | 上海交通大学 | 一种盐酸二甲双胍含量的测定方法 |
US20140178305A1 (en) * | 2012-12-20 | 2014-06-26 | California Institute Of Technology | Identification and use of anxiolytic compounds |
CN106568879A (zh) * | 2016-11-02 | 2017-04-19 | 西安交通大学 | 用于识别复杂样品中微量目标组分的细胞膜色谱柱及其制备方法及目标组分的识别鉴定方法 |
CN106754731A (zh) * | 2017-02-23 | 2017-05-31 | 西安交通大学 | MrgprX2高表达的重组细胞及MrgprX2高表达膜受体固定相及制备方法和应用 |
CN107002087A (zh) * | 2014-08-01 | 2017-08-01 | 约翰·霍普金斯大学 | 检测假性过敏药物反应和鉴别阻断剂以预防不良反应的基于mrgprx2/mrgprb2表达细胞的试验 |
CN107661328A (zh) * | 2017-11-15 | 2018-02-06 | 西安交通大学 | 呋喃香豆素类化合物在制备抗过敏药物中的应用 |
-
2018
- 2018-02-11 CN CN201810140937.7A patent/CN108398517A/zh active Pending
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102680272A (zh) * | 2012-05-29 | 2012-09-19 | 烟台渤海制药集团有限公司 | 一种海胆多糖的提取、纯化及鉴定方法 |
US20140178305A1 (en) * | 2012-12-20 | 2014-06-26 | California Institute Of Technology | Identification and use of anxiolytic compounds |
CN103399112A (zh) * | 2013-07-24 | 2013-11-20 | 上海交通大学 | 一种盐酸二甲双胍含量的测定方法 |
CN107002087A (zh) * | 2014-08-01 | 2017-08-01 | 约翰·霍普金斯大学 | 检测假性过敏药物反应和鉴别阻断剂以预防不良反应的基于mrgprx2/mrgprb2表达细胞的试验 |
CN106568879A (zh) * | 2016-11-02 | 2017-04-19 | 西安交通大学 | 用于识别复杂样品中微量目标组分的细胞膜色谱柱及其制备方法及目标组分的识别鉴定方法 |
CN106754731A (zh) * | 2017-02-23 | 2017-05-31 | 西安交通大学 | MrgprX2高表达的重组细胞及MrgprX2高表达膜受体固定相及制备方法和应用 |
CN107661328A (zh) * | 2017-11-15 | 2018-02-06 | 西安交通大学 | 呋喃香豆素类化合物在制备抗过敏药物中的应用 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
YING GUO 等: ""Screening of allergic components mediated by H1R in homoharringtonine injection through H1R/CMC-HPLC/MS"", 《BIOMED. CHROMATOGR.》 * |
YUANYUAN LIN 等: ""Isosalvianolic acid C-induced pseudo-allergic reactions via the mast cell specific receptor MRGPRX2"", 《INTERNATIONAL IMMUNOPHARMACOLOGY》 * |
韩省力等: "RBL-2H3/CMC-HPLC/MS联用法筛选红花中抗过敏成分", 《中国化学会首届全国质谱分析学术研讨会会议论文集》 * |
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