CN104297404B - 一种用于测定醋酸格拉替雷样品中哌啶杂质含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于测定醋酸格拉替雷样品中哌啶杂质含量的方法。所述方法主要包括：(1)取一定量的醋酸格拉替雷样品，置于气相顶空瓶中；(2)加入一定量碱性溶液溶解样品，压盖密封，并加热；(3)通过气相色谱分析样品中的哌啶含量。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于测定醋酸格拉替雷样品中哌啶杂质含量的方法。
背景技术
醋酸格拉替雷(Glatiramer acetate)是一种合成的肽类化合物，是由以色列药厂TEVA所研发制造的，商品名Copaxone，于1996年获美国FDA核准用於治疗多发性硬化症，药品为白色至灰白色的灭菌冻晶粉末。
哌啶，又名六氢吡啶、一氮六环，英文名称：Piperidine，分子式：C5H11N，分子量为85.15，CAS号：110-89-4。为无色澄清液体，有类似氨的气味。其结构为：
哌啶主要用作溶剂、有机合成中间体、环氧树脂交联剂、缩合催化剂等。医药上用作麻醉剂、杀菌剂等，对眼睛和皮肤有强烈刺激性并是升压剂。小剂量可刺激交感和副交感神经节，大剂量反而有抑制作用，误服后可引起虚弱、恶心、流涎、呼吸困难、肌肉瘫痪和窒息。属于第二类易制毒。
在多肽药物的合成工艺中，哌啶被用作脱保护，所以在终产物中可能会有残留哌啶。能够准确、可靠的分析出醋酸格拉替雷中残留溶剂哌啶的含量，对于药物的生产控制和产品质量控制具有重要的实用价值。
哌啶极性很大，且无紫外吸收，所以不能用一般的高效液相色谱方法进行测定，目前关于哌啶的检测方法报道的不是很多，也不是很成熟，现有的方法主要是依靠阳离子色谱来进行分析，阳离子色谱法虽然能够分离出哌啶并进行检测，但其只能对游离哌啶进行检测，对于以结合形式存在的哌啶是无法进行分离、准确测定的，所以测定结果不能体现出样品中真正的哌啶含量。可见，开发出一种能够检测出所有存在形式的哌啶分析方法是很有必要的，
哌啶沸点为106度，且在高温下化学性质稳定，适合气相色谱分析要求，但一般的气相方法也只能对以游离形式存在的哌啶进行分析，当样品中同时存在结合形式的哌啶时，还是不能进行准确测定。
因此，需要一种更为准确的哌啶检测和定量方法
发明内容
针对上述哌啶检测分析过程中的问题，发明人根据多年的实际工作经验，结合在醋酸格拉替雷制备过程中的相应情况，研发了一种适用于醋酸格拉替雷样品中的哌啶杂质检测分析的新方法。
本发明首先涉及一种醋酸格拉替雷产品中哌啶杂质的检测分析方法，其步骤包括：
(1)取一定量的醋酸格拉替雷样品，置于气相顶空瓶中；
(2)加入一定量碱性溶液溶解样品，压盖密封，并加热；
(3)通过气相色谱分析样品中的哌啶含量。
其中，步骤(1)所述的醋酸格拉替雷样品的量为5～200mg/ml，所述的气相顶空瓶为10～50mL规格，优选为取150mg样品,置于10毫升气相顶空瓶中。
步骤(2)所述的碱性溶液为氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、氢氧化钡溶液、氢氧化钙溶液以及甲醇钠、乙醇钠等有机碱性溶液，其浓度为0.1-10M；制成的样品中含哌啶的浓度为0.1-10000ppm。优选为1M浓度的氢氧化钠溶液，用量为1mL氢氧化钠/50mg醋酸格拉替雷。
步骤(2)所述的加热温度为60～90℃下，加热处理时间为12～48小时，优选为在80℃下，加热处理24小时。
步骤(3)所述的气相色谱的条件为，
1)色谱柱包括但不限于SGE AC-5、DB-5、HP-5、SPB-5、Rtx-5、BP-5等色谱柱，优选为Agilent CP-Sil8CB-Amines；柱长为10～100m，内径：0.2～0.53mm，膜厚：0.25～3.0μm；
2)样品进样方式为直接进样和顶空进样，进样量为1-1000微升。
本发明所述的顶空进样的条件参数为：
1)样品加热温度为40-150度，样品瓶加热时间为10到100分钟；
2)进样口温度为120-300℃，柱温为40-200℃；
3)所用检测器为氢火焰离子化检测器，即FID检测器，检测器温度为150-450℃，分流比为0-100:1；
4)样品分析所用载气为高纯氮气、高纯氦气或高纯氢气，优选为高纯氮气；
5)载气流速为0.2到10mL/min。
本发明所述的哌啶含量的计算方法优选为外标法。
附图说明
图1、本发明所述气相色谱方法检测空白溶剂的谱图。
图2、本发明所述气相色谱方法检测醋酸格拉替雷样品中哌啶杂质的谱图。
图3、本发明所述气相色谱方法检测哌啶标准品的谱图。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明作进一步说明：
实施例1：系统适用性试验
为了保证该分析方法的可行性，首先进行了系统适用性试验，结果如下：
称取251.17毫克的哌啶，置于50mL容量瓶中，用50％DMSO水溶液稀释至刻度，作为母液；取1mL母液置于100mL容量瓶中，用1M氢氧化钠溶液稀释至刻度，制成浓度为50.23μg/mL的哌啶对照品溶液，连续进样5针，计算峰面积RSD，其结果为5.12％，可见其结果符合要求。
实施例2：分析方法准确度的测定
具体过程为：
2.1.对照液的配置：
50％浓度水平对照液：取实施例1中的母液0.5mL，置于100mL容量瓶中，用1M氢氧化钠溶液稀释至刻度。
100％浓度水平对照液：取实施例1中的母液1.0mL，置于100mL容量瓶中，用1M氢氧化钠溶液稀释至刻度。
150％浓度水平对照液：取实施例1中的母液1.5mL，置于100mL容量瓶中，用1M氢氧化钠溶液稀释至刻度。
2.2.回收样品溶液的配置：
50％浓度水平的样品溶液：分别称取醋酸格拉替雷样品150.31mg、154.28mg、148.20mg置于10毫升气相顶空瓶中，加入3mL50％浓度水平对照液，压盖。
100％浓度水平的样品溶液：分别称取醋酸格拉替雷样品149.67mg、155.26mg、153.06mg置于10毫升气相顶空瓶中，加入3mL100％浓度水平对照液，压盖。
150％浓度水平的样品溶液：分别称取醋酸格拉替雷样品149.66mg、149.12mg、156.01mg置于10毫升气相顶空瓶中，加入3mL150％浓度水平对照液，压盖。
将以上各回收样品溶液在80℃加热24小时，以实施例1中的对照液，作为对照进行测定，计算回收率。三个浓度水平的平均回收率为98.26％，回收率RSD为1.01％，可见此方法可以对样品中的哌啶进行准确测定。
实施例3：样品中的哌啶含量测定方法一
分别称取样品151.78mg、150.49mg,置于10毫升气相顶空瓶中，加入3mL1M氢氧化钠溶液，压盖，在80℃加热24小时，
色谱条件为：色谱柱为Agilent CP-Sil 8CB,(30m*0.32mm*1.0μm)气相色谱柱。样品进样方式为顶空进样，进样量为1000微升，样品瓶加热温度为90度，样品瓶加热时间为30分钟，进样口温度为180度，起始柱温为150℃，维持5分钟，以每分钟20℃的速率升温至230℃，维持10分钟，所用检测器FID检测器，检测器温度为250度，分流比为20:1，样品分析所用载气为高纯氮气；载气流速为2.0mL/min。
以实施例1中的对照品溶液，作为对照进行测定，测得样品中哌啶含量为0.026％。可见此方法可以对样品中的少量哌啶进行准确测定。
结果见说明书附图：图1为空白溶剂图，图2为样品图谱，图3为对照图谱。
实施例4：样品中的哌啶含量测定方法二
分别称取样品150.22mg、148.37mg,置于10毫升气相顶空瓶中，加入3mL1M氢氧化钠溶液，压盖，在80℃加热15小时，
色谱条件为：色谱柱为Agilent CP-Sil 8CB,(30m*0.32mm*1.0μm)气相色谱柱。样品进样方式为顶空进样，进样量为1000微升，样品瓶加热温度为60度，样品瓶加热时间为20分钟，进样口温度为220度，起始柱温为180℃，维持5分钟，以每分钟20℃的速率升温至230℃，维持10分钟，所用检测器FID检测器，检测器温度为250度，分流比为20:1，样品分析所用载气为高纯氮气；载气流速为2.0mL/min。
以实施例1中的对照品溶液，作为对照进行测定，测得样品中哌啶含量为0.026％。可见此方法可以对样品中的少量哌啶进行准确测定。
实施例5：样品中的哌啶含量测定方法三
分别称取样品149.33mg、152.14mg,置于10毫升气相顶空瓶中，加入3mL1M氢氧化钠溶液，压盖，在80℃加热45小时，
色谱条件为：色谱柱为Agilent HP-5(30m*0.32mm*0.25μm)气相色谱柱。样品进样方式为顶空进样，进样量为1000微升，样品瓶加热温度为120度，样品瓶加热时间为85分钟，进样口温度为250度，起始柱温为60℃，维持5分钟，以每分钟20℃的速率升温至230℃，维持10分钟，所用检测器FID检测器，检测器温度为250度，分流比为10:1，样品分析所用载气为高纯氮气；载气流速为2.0mL/min。
以实施例1中的对照品溶液，作为对照进行测定，测得样品中哌啶含量为0.026％。可见此方法可以对样品中的少量哌啶进行准确测定。
实施例6：样品中哌啶含量的测定方法四
分别称取样品148.71mg、150.55mg,置于10毫升气相顶空瓶中，加入3mL1M氢氧化钠溶液，压盖，在80℃加热24小时，
色谱条件为：色谱柱为Agilent DB-5(30m*0.53mm*1.50μm)气相色谱柱。样品进样方式为顶空进样，进样量为1000微升，样品瓶加热温度为80度，样品瓶加热时间为30分钟，进样口温度为200度，起始柱温为40℃，维持5分钟，以每分钟20℃的速率升温至230℃，维持10分钟，所用检测器FID检测器，检测器温度为250度，分流比为20:1，样品分析所用载气为高纯氮气；载气流速为5.0mL/min。
以实施例1中的对照品溶液，作为对照进行测定，测得样品中哌啶含量为0.027％。可见此方法可以对样品中的少量哌啶进行准确测定。
Claims (11)
1.一种醋酸格拉替雷产品中哌啶杂质的检测分析方法，其步骤包括：
(1)取一定量的醋酸格拉替雷样品，置于气相顶空瓶中；
(2)加入一定量碱性溶液溶解样品，压盖密封，并加热；
(3)通过气相色谱分析样品中的哌啶含量；
其中，步骤(2)中加热温度为60～90℃下，加热处理时间为12～48小时。
2.根据权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于，步骤(1)所述的醋酸格拉替雷样品的量为5～200mg/ml，所述的气相顶空瓶为10～50mL规格。
3.根据权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于，取醋酸格拉替雷样品150mg，置于10毫升气相顶空瓶中。
4.根据权利要求1至3任一所述的检测分析方法，其特征在于，步骤(2)所述的碱性溶液选自氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、氢氧化钡溶液、氢氧化钙溶液、甲醇钠或乙醇钠，其浓度为0.1-10M；制成的样品中含哌啶的浓度为0.1-10000ppm。
5.根据权利要求4所述的检测分析方法，其特征在于，步骤(2)所述碱性溶液为1M浓度的氢氧化钠溶液，用量为1mL氢氧化钠/50mg醋酸格拉替雷。
6.根据权利要求1至3任一所述的检测分析方法，其特征在于，步骤(2)的加热温度为在80℃下，加热处理24小时。
7.根据权利要求1至3任一所述的检测分析方法，其特征在于，步骤(3)所述的气相色谱的条件为，
1)色谱柱选自SGE AC-5、DB-5、HP-5、SPB-5、Rtx-5、BP-5；柱长为10～100m，内径：0.2～0.53mm，膜厚：0.25～3.0μm；
2)样品进样方式为直接进样和顶空进样，进样量为1-1000微升。
8.根据权利要求7所述的检测分析方法，其特征在于，所述色谱柱为Agilent CP-Sil 8CB-Amines。
9.根据权利要求7所述的检测分析方法，其特征在于，所述的顶空进样的条件参数为：
1)样品加热温度为40-150℃，样品瓶加热时间为10到100分钟；
2)进样口温度为120-300℃，柱温为40-200℃；
3)所用检测器为氢火焰离子化检测器，即FID检测器，检测器温度为150-450℃，分流比为0-100:1；
4)样品分析所用载气选自高纯氮气、高纯氦气或高纯氢气；
5)载气流速为0.2到10mL/min。
10.根据权利要求9所述的检测分析方法，其特征在于，所述样品分析所用载气为高纯氮气。
11.根据权利要求9所述的检测分析方法，其特征在于，所述的哌啶含量的计算方法优选为外标法。
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