CN103399112A - 一种盐酸二甲双胍含量的测定方法 - Google Patents

一种盐酸二甲双胍含量的测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种二甲双胍在细胞内/外和线粒体内/外的检测，检测二甲双胍在肿瘤细胞的药物浓度，以及检测二甲双胍是否能够进入到肿瘤细胞线粒体,动态地观察细胞内外和线粒体内外药物浓度的变动情况,验证了二甲双胍能够进入肿瘤细胞内及其线粒体内，对研究药物浓度,细胞生理参数和环境理化性质之间的动态变化规律具有重要意义，为进一步研究二甲双胍抗肿瘤作用的机制奠定了一定基础。

Description

一种盐酸二甲双胍含量的测定方法
技术领域
本发明属于盐酸二甲双胍含量的测定领域，特别涉及一种细胞及线粒体内/外的盐酸二甲双胍含量的测定方法。
背景技术
二甲双胍在治疗2型糖尿病中的卓越地位已为世人所瞩目，近年来，其适应症也随各项研究的不断开展而进一步延伸。最新研究显示，二甲双胍能够抑制体外培养的乳腺癌细胞，胰腺癌细胞、黑色素瘤细胞以及前列腺癌细胞的增殖。
然而更令人瞩目的是在临床研究中观察到，二甲双胍对肿瘤患者有一定程度的保护作用，使用二甲双胍的患者患乳腺癌，肝癌等肿瘤风险降低，并且肿瘤相关死亡率也降低。这一现象近期已得到了部分基础研究的证实，有关二甲双胍抗肿瘤作用的临床研究和动物试验的证据日益增多，同时最近的研究发现，二甲双胍能够抑制体外培养的乳腺癌细胞，胰腺癌细胞、黑色素瘤细胞以及前列腺癌细胞的增殖。
临床研究观察到，二甲双胍对肿瘤患者有一定程度的保护作用，使用二甲双胍的患者其患乳腺癌，肝癌等肿瘤风险降低。除了临床回顾性和观察性研究提供的证据之外，动物试验也证实了二甲双胍具有抗肿瘤作用。2009年研究人员发现，低剂量二甲双胍可抑制细胞转化，选择性杀死4种不同类型乳腺癌的肿瘤干细胞在化疗的同时让实验鼠服用糖尿病治疗药物二甲双胍，可抑制实验鼠体内的乳腺癌扩散。
综上所述，二甲双胍为经典的抗糖尿病药物，影响细胞的糖代谢，糖代谢中起重要作用的线粒体同时又是诱导细胞凋亡与坏死的中心。二甲双胍可抑制肿瘤细胞内线粒体的电子转移，从而抑制细胞的氧化磷酸化，致使细胞凋亡，阻断细胞内的蛋白合成，细胞生长停滞，促进细胞凋亡。
目前，尚未见二甲双胍在线粒体内的检测，探究线粒体内是否会有二甲双胍的相关文献报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种盐酸二甲双胍含量的测定方法,本发明的测定方法可动态地观察细胞内外药物浓度的变动情况，能有效检测二甲双胍是否能够进入肿瘤细胞及其线粒体。
本发明的发明目的主要通过以下技术方案实现：
本发明的目的在于提供一种细胞内/外盐酸二甲双胍含量的测定方法，包括:
1）将盐酸二甲双胍固体脂质纳米粒通过细胞给药后，分离细胞和细胞外液；
2）采用反复冻融法，将细胞样品在-80℃中冷冻后，于37℃融化，经4-6次冻融周期，两次离心，合并上清液；
或将步骤1）所得细胞外液经离心后，取上清液；
3）将步骤2）处理所得的样品，按所建立HPLC法进样，测定二甲双胍的含量。
所述的细胞内/外盐酸二甲双胍含量的测定方法,具体包括如下步骤:
1)细胞样品的制备
a.将肿瘤细胞接种于培养基进行细胞培养，并用所述培养基和盐酸二甲双胍固体脂质纳米粒配置浓度为0.4-10mM的盐酸二甲双胍溶液，微孔滤膜过滤除菌；
b.将培养后的细胞弃去细胞外液，加入步骤a）配置的盐酸二甲双胍溶液及空白对照组，药物作用3-5h后，终止培养；
c.收集步骤b）培养的细胞，分离细胞和细胞外液，收集细胞外液于-20℃保存备用；细胞经清洗后，加入生理盐水配成细胞密度为106个/ml的悬浮液，放入-20℃冰箱保存；
2)细胞样品的处理及测定
a.取步骤1）制备的细胞样品于37℃水浴中解冻，室温放置1h，放入-80℃冰箱冷冻1h，反复冻融4-6次，将细胞破碎；
b.取冻融后的细胞样品，加入与之1:1v/v的乙腈，离心后吸取上清液；向第一次离心残余物中加入与之1:1v/v的乙腈，重复上述操作，吸取上清；
c.合并两次离心上清液，氮气吹干，超纯水复溶，混匀，离心，取上清进样，按所建立HPLC法记录峰面积，外标法定量。
或3)细胞外液样品的处理及测定
a.取步骤1）收集的细胞外液，加入与之1:1v/v的乙腈，离心；
b.离心后吸取上清，液氮气吹干，超纯水复溶，混匀，离心，取上清进样，按所建立HPLC法记录峰面积，外标法定量。
本发明的另一目的在于提供一种线粒体内/外的盐酸二甲双胍含量的测定方法,包括：
1）取盐酸二甲双胍固体脂质纳米粒配置浓度为0.4-10mM的盐酸二甲双胍溶液，通过细胞给药后，收集细胞样品；
2）加入线粒体分离试剂，悬浮细胞，匀浆，离心，保留底部残余物，取上清；再次离心，去除上清，此次离心沉淀即为分离得到的细胞线粒体，合并此次离心的上清液与前一次离心的底部残余物，为线粒体外成分；
3）向线粒体滴加线粒体裂解液，按所建立HPLC法进行测量，测定二甲双胍的含量。
所述的线粒体内/外的盐酸二甲双胍含量的测定方法，具体包括如下步骤：
1)线粒体样品的制备
a.将肿瘤细胞接种于培养基进行细胞培养，并用所述培养基和盐酸二甲双胍固体脂质纳米粒配置浓度为0.4-10mM的盐酸二甲双胍溶液，微孔滤膜过滤除菌；
b.将培养后的细胞弃去细胞外液，加入步骤a）配置的盐酸二甲双胍溶液及空白对照组，药物作用3-5h后，终止培养，离心，弃去上清液；
c.加入线粒体分离试剂，悬浮细胞，冰浴放置15min，匀浆，离心，保留底部残余物；将上清液再次离心，合并此次离心的上清液与前一次离心的底部残余物，为线粒体外成分，-20℃保存；此次离心沉淀即为分离得到的细胞线粒体，向细胞线粒体滴加线粒体裂解液-20℃保存；
2）线粒体内液样品的处理和测定
a.取步骤1）制备的线粒体样品于37℃水浴中解冻，加入乙腈，离心后吸取上清液；向第一次离心残余物中加入乙腈，再次离心，吸取上清液；
b.合并两次离心上清液，氮气吹干，超纯水复溶，混匀，离心，取上清进样，按所建立HPLC法记录峰面积，外标法定量；
或3)线粒体外成分的处理和测定
a.取步骤1）制备的线粒体外成分样品于37℃水浴中解冻，加入乙腈，离心后吸取上清液；向第一次离心残余物中加入乙腈，再次离心，吸取上清液；
b.合并两次离心上清液，氮气吹干，超纯水复溶，混匀，离心，取上清进样，按所建立HPLC法记录峰面积，外标法定量。
所述的肿瘤细胞为MCF-7人源乳腺癌细胞。
所述的盐酸二甲双胍固体脂质纳米粒，制备方法如下：
1）以蒸馏水作为内水相；将单硬脂酸甘油酯与大豆卵磷脂按质量比3-4:1溶于乙酸乙酯和二氯甲烷的混合溶剂中，充分溶解，作为有机相；以浓度为1.0%（质量体积比w/v）聚乙烯醇作为外水相；
2)内水相在超声冰浴中逐滴加入有机相形成初乳，随后将初乳滴加入外水相中，超声乳化得W/O/W复乳，旋转蒸发除去有机溶剂，制得带有蓝色乳光的盐酸二甲双胍脂质纳米粒乳液；
3）将纳米粒乳液于2000rpm/min离心30min，取上清，于12000rpm/min离心30min，取沉淀，将沉淀用超纯水复溶，冻干，制得盐酸二甲双胍固体脂质纳米粒。
所述的HPLC检测条件为：流动相采用体积比甲醇∶0.015mol/L磷酸二氢钾溶液=52∶48；色谱柱：C18色谱柱；检测波长：232nm；流速1mL/min；进样量：20μL。
通过测定细胞内外药物的浓度而验证盐酸二甲双胍对细胞和线粒体摄取药物的促进作用。建立了一种细胞内/外和线粒体内/外二甲双胍的检测方法,动态地观察细胞内外和线粒体内外药物浓度的变动情况,验证了二甲双胍能够进入肿瘤细胞内及其线粒体内，对研究药物浓度,细胞生理参数和环境理化性质之间的动态变化规律具有重要意义，为进一步研究二甲双胍抗肿瘤作用的机制奠定了一定基础。
有益效果
盐酸二甲双胍为水溶性药物，难以穿透细胞膜脂质双分子层，本发明将二甲双胍制备成纳米粒，由于纳米颗粒的粘附性和小的粒径，增加对细胞膜的穿透能力，有利于调高局部用药的滞留性，也有利于增加药物与靶位点的接触时间与接触面积，提高药物吸收的生物利用度。
采用线粒体分离试剂盒方法，操作简便快捷，同时分离获得的线粒体纯度较高，得到的线粒体的活性强，并且绝大部分分离获得的线粒体都含有完整的内膜和外膜，具有线粒体的生理功能，可将对线粒体完整性的伤害降至最小。
通过高效液相色谱法测定细胞内外及线粒体内外药物的浓度，对比细胞对纳米粒与原药的摄取，考察纳米粒剂型对细胞摄取的影响。
附图说明
图1为盐酸二甲双胍固体脂质纳米粒粒径分布；
图2为细胞内液中盐酸二甲双胍的浓度；
图3为细胞外液中盐酸二甲双胍的浓度；
图4为线粒体内液中盐酸二甲双胍的浓度；
图5为线粒体外液中盐酸二甲双胍的浓度。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
1.本实施例的HPLC的相关实验参数如下:
盐酸二甲双胍的高效液相色谱检测条件为：流动相采用甲醇∶0.015mol/L磷酸二氢钾溶液(含0.001mol/L十二烷基磺酸钠，pH4.8)=52∶48；色谱柱：C18色谱柱(200mm×4.6mm,5μm,Dikma,Technologies)；检测器：SPD-20A紫外/可见检测器；岛津LC-20AT高效液相色谱仪；检测波长：232nm；流速1mL/min；进样量：20μL。
在此条件下，分离效果好，峰形对称，出峰时间短，保留时间稳定。
2.相关实验试剂信息如下：
MTT：西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司
胰蛋白酶：法国Biowest公司
RPMI-1640培养基：法国Biowest公司
PBS：法国Biowest公司
MCF-7肿瘤细胞株：购于中科院上海细胞生物所
线粒体分离试剂盒：碧云天生物技术研究所
盐酸二甲双胍：石家庄普力制药有限公司（批号110405，纯度≥98.5%）
聚乙烯醇(PVA)：89.0(mol/mol)，CPS：4.6-5.4）阿拉丁试剂公司
二氯甲烷：分析纯，国药化学试剂有限公司
乙酸乙酯：分析纯，国药化学试剂有限公司
大豆卵磷脂：国药集团化学试剂有限公司
单硬脂酸甘油酯：国药集团化学试剂有限公司
实施例1
固体脂质纳米粒的制备
取300μL蒸馏水，构成内水相。称取50mg单硬脂酸甘油酯和15mg大豆卵磷脂，溶于0.5mL乙酸乙酯0.5mL二氯甲烷的混合溶剂中，充分溶解，为有机相，配制浓度1.0%聚乙烯醇（PVA）为外水相。内水相在超声冰浴中逐滴加入有机相（功率100W，超声0.5min），随后用注射器将初乳滴加入外水相中，探头超声乳化（功率100W，超声3min）得W/O/W复乳。旋转蒸发除去有机溶剂，得带有蓝色乳光的盐酸二甲双胍脂质纳米粒乳液。将纳米粒乳液在12000rpm/min离心30min，取沉淀，将沉淀用超纯水复溶，冻干机冻干，得固体脂质纳米粒冻干粉。
如图1所示，利用复乳溶剂挥发法制备的盐酸二甲双胍纳米粒粒径分布集中，平均粒径为(102.3±4.16)nm，多分散系数为0.195±0.014。
细胞内外盐酸二甲双胍浓度的检测
1.细胞样品的制备
1）细胞接种：选取对数生长期的MCF-7人源乳腺癌细胞107个/皿培养于含10%胎牛血清RPMI-1640培养基中，置于培养箱中培养，条件为37℃，5%CO2；
2）样品溶液制备：用培养基配制成浓度为0.4mM、2mM、10mM的盐酸二甲双胍溶液，0.22μm的微孔滤膜过滤除菌；
3）细胞给药：过夜后，弃去细胞外液，分别加入用1640培养基配制成浓度为0.4mM、2mM、10mM的盐酸二甲双胍溶液及空白对照组，药物作用4h后终止培养；
4）样品收集：PBS液冲洗细胞3次后，胰蛋白酶消化细胞，吸取细胞悬液，1000r/min离心10min，分离细胞和培养液（细胞外液），收集细胞外液于-20℃冰箱保存备用；细胞用生理盐水反复清洗3次，弃去洗涤液，再加入适量的生理盐水配成细胞密度为106个/ml的悬浮液，放入-20℃冰箱保存；
2.细胞样品的处理
1）取细胞样品于37℃水浴中解冻，室温放置1h，放入-80℃冰箱冷冻1h，反复冻融5次，可将细胞破碎；
2）取冻融后的细胞样品0.5ml，加入0.5ml乙腈，涡旋1min，15000r/min离心15min，离心后吸取0.8ml上清液;
3）向第一次离心残余物中加入0.5ml乙腈，涡旋1min，15000r/min离心15min，吸取0.6ml上清；
4）合并两次离心上清液于EP管中，氮气吹干，超纯水100μL复溶，混匀，15000r/min离心15min，取上清进样，记录峰面积，外标法定量；
3.细胞外液样品的预处理
1）取细胞外液0.5ml于离心管中，加入0.5ml乙腈，涡旋1min，15000r/min离心15min；
2）吸取0.8ml上清液于EP管中，氮气吹干，超纯水100μL复溶，混匀，15000r/min离心15min，取上清进样，记录峰面积，外标法定量。
由图2和图3可知，纳米粒组盐酸二甲双胍的细胞外液浓度为0.11084mM,0.43856Mm,1.61091mM,远小于原药组，推测较之原药组，有更多的药物被摄取入。同时由于药物浓度的增加，纳米粒中载体材料也随之增多，在药物溶解除菌的过程中存在一定的损失也有一定的关联。纳米粒组细胞内的盐酸二甲双胍浓度为0.005121mM,0.01585mM,0.040895mM,高于原药组的0.000354mM,0.002465mM,0.005351mM,，分别提高了14.46倍，6.43倍，7.64倍，直观地表明盐酸二甲双胍纳米粒促进细胞对药物的摄取，随着药浓度的增大，纳米粒的促摄取作用有所降低。
实施例2
线粒体内外盐酸二甲双胍含量的测定
1.线粒体样品的制备
1）细胞接种：选取对数生长期的MCF-7人源乳腺癌细胞107个/皿培养于含10%胎牛血清RPMI-1640培养基中，置于培养箱中培养，条件为37℃，5%CO2；
2）样品溶液制备：用培养基配制成浓度为0.4mM、2mM、10mM的盐酸二甲双胍溶液，0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，现配现用；
3）细胞给药：过夜后，弃去细胞外液，分别加入用1640培养基配制成浓度为0.4mM、2mM、10mM的盐酸二甲双胍溶液及空白对照组，药物作用4h后终止培养，1000r/min离心10min，弃去上清液
4）消化细胞：用PBS洗三遍，胰蛋白酶消化细胞，1000r/min离心10min收集细胞，用冰浴预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀，取少量细胞用于计数，剩余细胞600g（重力加速度，
也相当于转速单位rcf），4℃离心5分钟沉淀细胞，弃上清；
5）预处理：加入1ml线粒体分离试剂，轻轻悬浮细胞，冰浴放置15min,15min后把细胞悬液转移到一玻璃匀浆器中，匀浆10次；
6）取出细胞匀浆600g，4℃离心10min，保留底部残余物;小心把上清转移到另一离心管中，11,000g，4℃离心10min，小心去除上清（此次离心沉淀即为分离得到的细胞线粒体），合并此次离心的上清液与前一次离心的底部残余物，为线粒体外成分，向线粒体滴加200μL线粒体裂解液，两部分均-20℃保存；
2.线粒体内液样品的处理和测定
1）取线粒体样品于37℃水浴中解冻，取冻融后的细胞样品，加入0.8ml乙腈，涡旋1min，15000r/min离心15min，吸取0.8ml上清液；
2）向第一次离心底部残余物中加入0.5ml乙腈，涡旋1min，15000r/min离心15min，吸取0.6ml上清液；
3）合并2次上清液于EP管中，氮气吹干，超纯水100μL复溶，混匀，15000r/min离心15min，取上清进样，记录峰面积，外标法定量。
3.线粒体外液样品的处理和测定
1)取线粒体样品于37℃水浴中解冻，取冻融后的细胞样品，加入0.8ml乙腈，涡旋1min，15000r/min离心15min，吸取0.8ml上清液；
2)向第一次离心底部残余物中加入0.5ml乙腈，涡旋1min，15000r/min离心15min，吸取0.4ml上清液；
3)合并2次上清液于EP管中，氮气吹干，超纯水100μL复溶，混匀，15000r/min离心15min，取上清进样，记录峰面积，外标法定量。
如图4和图5所示，纳米粒组二甲双胍的含量高于原药组盐酸二甲双胍的含量，表明纳米粒可促进线粒体对药物的摄取。细胞膜和线粒体膜均具有类脂结构，主要由脂质、蛋白质和糖类等物质组成。本研究制备盐酸二甲双胍脂质纳米粒，据相似相溶原理，脂溶性的药物易溶于类脂膜，可透过细胞膜。而盐酸二甲双胍为水溶性药物，制备成纳米粒后，大大提高其脂溶性，促进细胞对药物的摄取。
虽然本发明已将较佳实施例揭示如上，然其并非用以限定本发明的内容，任何熟悉此技艺者，在不脱离本发明的主要精神和内容范围内，当可作各种更动与润饰，因此发明的保护范围应以申请专利的实际权利要求范围为准。

Claims (7)

1.一种细胞内/外盐酸二甲双胍含量的测定方法，包括:
1）将盐酸二甲双胍固体脂质纳米粒通过细胞给药后，分离细胞和细胞外液；
2）采用反复冻融法，将细胞样品在-80℃中冷冻后，于37℃融化，经4-6次冻融周期，两次离心，合并上清液；
或将步骤1）所得细胞外液经离心后，取上清液；
3）将步骤2）处理所得的样品，按所建立HPLC法进样，测定二甲双胍的含量。
2.根据权利要求1所述的一种细胞内/外盐酸二甲双胍含量的测定方法，其特征在于：所述的细胞内/外盐酸二甲双胍含量的测定方法,具体包括如下步骤:
1）细胞样品的制备
a.将肿瘤细胞接种于培养基进行细胞培养，并用所述培养基和盐酸二甲双胍固体脂质纳米粒配置浓度为0.4-10mM的盐酸二甲双胍溶液，微孔滤膜过滤除菌；
b.将培养后的细胞弃去细胞外液，加入步骤a）配置的盐酸二甲双胍溶液及空白对照组，药物作用3-5h后，终止培养；
c.收集步骤b）培养的细胞，分离细胞和细胞外液，收集细胞外液于-20℃保存备用；细胞经清洗后，加入生理盐水配成细胞密度为106个/ml的悬浮液，放入-20℃冰箱保存；
2)细胞样品的处理及测定
a.取步骤1）制备的细胞样品于37℃水浴中解冻，室温放置1h，放入-80℃冰箱冷冻1h，反复冻融4-6次，将细胞破碎；
b.取冻融后的细胞样品，加入与之1:1v/v的乙腈，离心后吸取上清液；向第一次离心残余物中加入与之1:1v/v的乙腈，重复上述操作，吸取上清；
c.合并两次离心上清液，氮气吹干，超纯水复溶，混匀，离心，取上清进样，按所建立HPLC法记录峰面积，外标法定量。
或3)细胞外液样品的处理及测定
a.取步骤1）收集的细胞外液，加入与之1:1v/v的乙腈，离心；
b.离心后吸取上清，液氮气吹干，超纯水复溶，混匀，离心，取上清进样，按所建立HPLC法记录峰面积，外标法定量。
3.一种线粒体内/外的盐酸二甲双胍含量的测定方法,包括：
1）取盐酸二甲双胍固体脂质纳米粒配置浓度为0.4-10mM的盐酸二甲双胍溶液，通过细胞给药后，收集细胞样品；
2）加入线粒体分离试剂，悬浮细胞，匀浆，离心，保留底部残余物，取上清；再次离心，去除上清，此次离心沉淀即为分离得到的细胞线粒体，合并此次离心的上清液与前一次离心的底部残余物，为线粒体外成分；
3）向线粒体滴加线粒体裂解液，按所建立HPLC法进行测量，测定二甲双胍的含量。
4.根据权利要求3所述的一种线粒体内/外的盐酸二甲双胍含量的测定方法，其特征在于：
所述的线粒体内/外的盐酸二甲双胍含量的测定方法，具体包括如下步骤：
1）线粒体样品的制备
a.将肿瘤细胞接种于培养基进行细胞培养，并用所述培养基和盐酸二甲双胍固体脂质纳米粒配置浓度为0.4-10mM的盐酸二甲双胍溶液，微孔滤膜过滤除菌；
b.将培养后的细胞弃去细胞外液，加入步骤a）配置的盐酸二甲双胍溶液及空白对照组，药物作用3-5h后，终止培养，离心，弃去上清液；
c.加入线粒体分离试剂，悬浮细胞，冰浴放置15min，匀浆，离心，保留底部残余物；将上清液再次离心，合并此次离心的上清液与前一次离心的底部残余物，为线粒体外成分，-20℃保存；此次离心沉淀即为分离得到的细胞线粒体，向细胞线粒体滴加线粒体裂解液-20℃保存；
2）线粒体内液样品的处理和测定
a.取步骤1）制备的线粒体样品于37℃水浴中解冻，加入乙腈，离心后吸取上清液；向第一次离心残余物中加入乙腈，再次离心，吸取上清液；
b.合并两次离心上清液，氮气吹干，超纯水复溶，混匀，离心，取上清进样，按所建立HPLC法记录峰面积，外标法定量；
或3)线粒体外成分的处理和测定
a.取步骤1）制备的线粒体外成分样品于37℃水浴中解冻，加入乙腈，离心后吸取上清液；向第一次离心残余物中加入乙腈，再次离心，吸取上清液；
b.合并两次离心上清液，氮气吹干，超纯水复溶，混匀，离心，取上清进样，按所建立HPLC法记录峰面积，外标法定量。
5.根据权利要求2或4所述的测定方法，其特征在于：所述的肿瘤细胞为MCF-7人源乳腺癌细胞。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的测定方法,其特征在于：所述的盐酸二甲双胍固体脂质纳米粒，制备方法如下：
1）以蒸馏水作为内水相；将单硬脂酸甘油酯与大豆卵磷脂按质量比3-4:1溶于乙酸乙酯和二氯甲烷的混合溶剂中，充分溶解，作为有机相；以浓度为1.0%（w/v）聚乙烯醇作为外水相；
2)内水相在超声冰浴中逐滴加入有机相形成初乳，随后将初乳滴加入外水相中，超声乳化得W/O/W复乳，旋转蒸发除去有机溶剂，制得带有蓝色乳光的盐酸二甲双胍脂质纳米粒乳液；
3）将纳米粒乳液于2000rpm/min离心30min，取上清，于12000rpm/min离心30min，取沉淀，将沉淀用超纯水复溶，冻干，制得盐酸二甲双胍固体脂质纳米粒。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的测定方法,其特征在于：所述的HPLC检测条件为：流动相采用体积比甲醇∶0.015mol/L磷酸二氢钾溶液=52∶48；色谱柱：C18色谱柱；检测波长：232nm；流速1mL/min；进样量：20μL。
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