CN103751225A - 蛹虫草抗肿瘤活性组分的提取方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种蛹虫草抗肿瘤活性组分的提取方法：蛹虫草子实体超低温粉碎；得到超微粉水煮提取，沉淀再丙酮提取；得到沉淀溶解后过液相色谱，洗脱试剂依次为100%正己烷、25%乙酸乙酯-正己烷、100%乙酸乙酯；选取抗肿瘤活性最强组分过液相色谱，洗脱试剂依次为100%正己烷、10%乙酸乙酯-正己烷、15%乙酸乙酯-正己烷；选取抗肿瘤活性最强组分再过液相色谱，洗脱试剂为100%二氯甲烷，选取抗肿瘤活性最强组分即为本发明目的组分。该方法重复性好，得到的抗肿瘤活性组分可用于制备抗肿瘤药物中。

Description

蛹虫草抗肿瘤活性组分的提取方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物制品加工技术领域，具体涉及一种蛹虫草抗肿瘤活性组分的提取方法，以及该活性组分在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

肿瘤是一种基因病，但并非是遗传的，它是指细胞在致癌因素作用下，基因发生了改变，失去对其生长的正常调控，导致单克隆性异常增生而形成的新生物。2008年，WHO发布的数据显示，中国已经成为世界第二大癌症高发国，中国每年新增220万名癌症患者，约占全球癌症病人总数的20%，尤其是肝癌、胃癌和肺癌成为主要的健康杀手。研究如何消灭癌症、让癌症病人能生活地更好，是医药领域中的研究重点，因此寻找高效、低毒、选择性强的有临床应用价值的理想的新型抗肿瘤药物是一项长期而艰巨的任务，从药食两用的无毒且原料廉价易得的中药里寻找抗肿瘤药物已成为抗肿瘤药物开发的重要方向与希望所在。

冬虫夏草是虫草菌寄生在鳞翅目蝙蝠蛾科幼虫中以其为载体的虫菌复合体，含有丰富的蛋白质、脂肪、虫草酸、核苷类物质和多种氨基酸等活性物质，味道清香，具有滋肺益气、增精补肾、止血化痰、抑制肿瘤、止咳镇静、驱风、散热、驻容美颜、延缓衰老、提高机体免疫力之功效。

蛹虫草(Cordycepsmilitaris)，在分类学上与冬虫夏草同归于虫草属,是一种珍贵的药用真菌，其化学成分和药理作用与冬虫夏草相似，在临床上常替代冬虫夏草入药。由于野生蛹虫草资源极为有限，不能满足日益增加的市场需求，人工栽培蛹虫草成为必需。目前，人工栽培蛹虫草已获成功，并实现了规模化生产。

蛹虫草具有多种与抗肿瘤作用相关的活性物质，有些活性物质如虫草素、虫草多糖等的抗肿瘤作用已研究得比较深入；而有些活性物质如类胡萝卜素、蛋白质等在抗肿瘤方面的研究则较少。蛹虫草活性物质未能最大程度地得到开发与利用，所以研究具有抗肿瘤作用的新的活性物质，不断开拓现有活性物质的新的生理活性和药理作用具有重要意义，能为进一步研究和开发蛹虫草在医药方面的应用提供理论基础和产业化背景。

传统的蛹虫草抗肿瘤活性组分的提取方法，如杜秀菊等发表的“蛹虫草抗肿瘤和免疫活性部位的体外筛选”（食用菌学报.2011.18(1):41-45）中公开了一种蛹虫草子实体提取物制备方法：蛹虫草子实体粉过60目筛后，用氯仿提取2小时，过滤，滤渣风干后用乙酸乙酯提取2小时，过滤，滤渣风干后用95%乙醇提取2小时，过滤，滤渣风干后用30倍100℃蒸馏水提取2小时，400g离心20min后沉淀用15倍100℃3%草酸铵溶液提取2小时，400g离心20min后沉淀用10倍100℃5%NaOH溶液提取2小时，400g离心20min后上清液继续用1mol/L盐酸4℃中和，400g离心20min，对各步得到的滤液或上清液真空浓缩，冷冻干燥，得到各提取物组分。该蛹虫草子实体有效成分的提取分离方法步骤繁杂，而且提取出的活性成分少。另外，采用这种传统的溶剂萃取法进行有效活性组分的提取，批次之间不具有重复性，即无法保证第一批萃取得到的物质组分与第二批萃取得到的物质组分之间的一致性。

又如朱丽娜等发表的“蛹虫草子实体中N6-（2-羟乙基）-腺苷的分离纯化及抗肿瘤作用”（食用菌学报.2013.20(1):62-65）中公开了一种目标化合物的分离纯化方法，它将蛹虫草子实体粉末加入蒸馏水中100℃提取2小时，重复提取2次，合并提取液，然后以该提取液进行后续目标成分的提取。该方法属于传统的中药有效成分的提取方法，即以水提的上清进行有效成分的提取，而对水提的沉淀却没有进行深入的研究，这有可能导致大量活性组分的丢失，从而阻碍了蛹虫草在抗肿瘤药物开发方面的进展。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对以上现有技术的不足，突破现有中药有效组分提取的限制，提供一种蛹虫草抗肿瘤活性组分的提取方法，该方法以在细胞水平上没有抗肿瘤活性的蛹虫草子实体水提沉淀为原料，经丙酮浸提后再用制备液相色谱技术活性导向分离出强活性抗肿瘤活性组分。

本发明所采用的技术方案为：

一种蛹虫草中抗肿瘤活性组分的提取方法，该方法包括以下步骤：

1、超低温粉碎：

取烘干的蛹虫草子实体为原料，放入超微粉碎机中进行超微粉碎，同时粉碎全过程用2～10℃的水作为超微破碎机内部冷却液，超微粉碎时间为5-20min，得到超微粉。

上述粉碎时间优选为12min。

2、溶剂提取：

2.1水煮：在超微粉中加入超纯水，超纯水的加入量为超微粉质量的8～10倍，100℃加热3～10小时进行提取，离心取沉淀，然后重复1～3次，将得到的沉淀合并，干燥，得到粗品A。

该步是与目前传统的中药有效组分或有效成分提取的最大不同。传统的中药中活性组分或活性成分的提取方法都是以水提的上清为中间原料进行有效成分的提取，中医学上中药饮用也是如此，水煮后取上清液为患者饮用，因为按常规理解，沸水煎煮后药材中的有效成分便溶于液体中，故上清液中包含了所需的有效组分。而恰恰是这种认识的局限性，限制了目前物种中活性组分或活性成分的开发，使得很多有效组分或有效成分被当做废渣倒掉、没有进一步被发现和开发利用。这也并非是因为大多数研究者忽视了废渣中有效组分或有效成分存在的可能性，而是因为废渣在体外可能不具有抗肿瘤活性或活性很弱，如该步得到的粗品A经检测在细胞水平上是没有抗肿瘤活性的，这样的检测结果使得大多数研究者放弃了对其进行进一步分析和研究，从而导致了大量活性组分的丢失。本发明通过申请人的深入研究、分析和实验，发现在细胞水平上没有抗肿瘤活性的水提沉淀具有目的有效组分存在的可能性，从而从水提沉淀、出发，通过大量的实验探索和工艺优化，最后总结出一套即本发明所述的蛹虫草抗肿瘤活性组分的提取方法，最终成功提取到目的有效活性组分。

2.2丙酮沉淀：在粗品A中加入丙酮，丙酮的加入量为粗品A质量的2～4倍，室温下浸提12～36小时，离心后取沉淀，然后重复1～3次，将得到的沉淀合并，干燥，得到粗品B。

上述离心的转速优选为6000rpm。

上述干燥优选为在60℃鼓风干燥箱内进行。

3、色谱分离：

3.1取粗品B用50%乙酸乙酯-正己烷溶液（即乙酸乙酯与正己烷以1：1的体积比配比而成）溶解至浓度为50mg/ml，过0.45μｍ有机微孔滤膜，然后通过制备液相色谱进行分离，洗脱方式为100%正己烷等度洗脱10min，25%乙酸乙酯-正己烷溶液（即乙酸乙酯与正己烷以1：3的体积比配比而成）等度洗脱25min，100%乙酸乙酯等度洗脱15min，检测波长为260nm，得到各组分经体外抗肿瘤活性筛选后，选取活性最强的组分旋蒸浓缩后真空干燥，得到组分A。

该步溶剂的选择非常重要，经过试验，50%乙酸乙酯-正己烷溶液中乙酸乙酯对粗品B能全部溶解，正己烷对粗品B为部分溶解，而选用50%乙酸乙酯-正己烷溶液可以做到使粗品B溶解至50mg/ml，洗脱时采用100%正己烷、25%乙酸乙酯-正己烷溶液、100%乙酸乙酯的洗脱顺序，使粗品B中物质组分被尽量分开，有利于目的有效组分的提取，提高提取率。

3.2取组分A用100%乙酸乙酯50度超声至刚好溶解至浓度为50mg/ml，过0.45μｍ有机微孔滤膜，然后通过制备液相色谱进行分离，洗脱方式为100%正己烷等度洗脱10min，10%乙酸乙酯-正己烷溶液（即乙酸乙酯与正己烷以1：9的体积比配比而成）等度洗脱50min，15%乙酸乙酯-正己烷溶液（即乙酸乙酯与正己烷以3：17的体积比配比而成）等度洗脱20min，检测波长为260nm，得到各组分经体外抗肿瘤活性筛选后，选取活性最强的组分旋蒸浓缩后真空干燥，得到组分B。

该步洗脱采用的洗脱剂（10%乙酸乙酯-正己烷溶液、15%乙酸乙酯-正己烷溶液）不同于3.1中，通过洗脱率的不同，将原本被一个浓度洗脱下来的组分进行分开洗脱，有利于后续有效组分的获得。

3.3取组分B用100%二氯甲烷50度超声至刚好溶解至浓度为50mg/ml，过0.45μｍ有机微孔滤膜，然后通过制备液相色谱进行分离，洗脱方式为100%二氯甲烷等度洗脱40min，检测波长为260nm，得到各组分经体外抗肿瘤活性筛选后，选取活性最强的组分，旋蒸浓缩后真空干燥，即为本发明目的抗肿瘤活性组分。

该步只采用二氯甲烷一种洗脱剂进行洗脱就可以完成组分分离目的，因为在实验中我们发现二氯甲烷对组分B的溶解能力不是很强，所以使用该一种洗脱剂就可以把物质组分分离开，这不仅节省了试剂使用，而且更为重要的是，使用单种试剂使在大规模生产过程中单物质循环使用成为可能，这将大大节省制备成本。

上述制备液相色谱的填料优选为粒径10μm的硅胶、大小为150×250mm。

上述体外抗肿瘤活性筛选是指采用实时无标记动态细胞分析技术实时检测加药后人肺癌A549细胞和人肝癌Hep-G2细胞的生长情况，同时可获得药物介导的细胞效应曲线，通过该曲线判断该药物是否抑制癌细胞的生长。与传统方法（MTT）对比优势在于，实验操作简单，步骤少，人为误差小。采用无标记方法，不存在标记效率问题，并且对细胞无损伤，细胞在最接近生理状态下进行检测，结果准确度高。实验结果客观，重复性好，不需设置重复孔。该方法可以很好地判断待测组分的抗肿瘤活性，因为在实验中我们发现，各待测组分对这两种细胞的抑制基本是同步的，即不存在第1号组分对人肺癌A549细胞抑制作用最好而第2组分对人肝癌Hep-G2细胞抑制作用最好的情况，基本上选取的目的组分要么对两种细胞的抑制作用都是最好的，要么对其中一种细胞抑制作用最好、而另一种细胞所有的组分抑制效果都比较差。

本发明还进一步提供上述蛹虫草抗肿瘤活性组分在制备抗肿瘤药物中的应用。该活性组分作为有效成分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂。

与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：

1、本发明采用超微粉碎机进行低温超微粉碎，以破除蛹虫草子实体坚硬的细胞壁，有利于内容物的溶出，有效提高了蛹虫草子实体中抗肿瘤活性组分的提取率；

2、本发明采用制备液相色谱进行物质组分的分离纯化，运用先进的技术对细胞水平上是没有抗肿瘤活性的水提沉淀进行分离纯化，通过对各个分离步骤的试剂选择、工艺条件和工艺参数的优化，以及各个分离步骤之间良好的协同作用，最终成功提取到抗肿瘤活性组分，相对于传统的溶剂萃取法，该抗肿瘤活性组分的提取方法不但稳定性好，重复性好，得到的物质组分批次之间一致性高，而且提取率高，得到的活性组分具有强抗肿瘤活性；

3、本发明通过人肺癌A549细胞生长抑制试验和人肝癌Hep-G2细胞生长抑制试验来判定蛹虫草抗肿瘤活性组分的体外抗肿瘤能力，并设阳性对照，结果直观、易判断；

4、本发明蛹虫草抗肿瘤活性组分的提取方法工艺简单，易于实施，具有快速、高效、重复性好、稳定可控、分离纯化制备量大、适用于工业化大规模生产等特点，所得的蛹虫草抗肿瘤活性组分可用于研发制备抗肿瘤药物，而由于该活性组分抗肿瘤有效成分含量高，使用该活性组分进行制备抗肿瘤药物时有效成分含量高，可以满足不同制剂载体形式对有效成分含量的需求；

5、本发明拓展了抗肿瘤药物或保健食品的原料来源，扩大了蛹虫草子实体的应用范围，使蛹虫草子实体成为抗肿瘤药物的有效组分原料，显著提高了蛹虫草子实体的附加值。

附图说明

图1所示的是实施例1（3）（a）步骤得到的色谱分离图；

图2所示的是实施例1（3）（b）步骤得到的色谱分离图；

图3所示的是实施例1（3）（c）步骤得到的色谱分离图；

图4所示的是实施例1制备的蛹虫草抗肿瘤活性组分抑制人肺癌A549细胞生长的细胞实时检测图，其中C310-6-2为目的组分，hlxa为环磷酰胺；

图5所示的是实施例1制备的蛹虫草抗肿瘤活性组分抑制人肝癌Hep-G2细胞生长的的细胞实时检测图，其中C310-6-2为目的组分，hlxa为环磷酰胺。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。

实施例1：蛹虫草抗肿瘤活性组分的提取

1、原料、材料：

蛹虫草子实体为本实验室生产。

2、试剂：

超纯水由密立博纯水仪生产；丙酮购自天津市北方天医化学试剂厂；色谱级乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷购自Honeywell公司。

3、仪器设备：

超微粉碎机购自山东三清不锈钢设备有限公司；台式冷冻离心机购自Thermo公司；旋转蒸发仪购自上海亚容生化仪器厂；10μmsilica DAC150购自江苏迪沃特仪器设备科技有限公司。

蛹虫草子实体抗肿瘤活性组分的提取步骤如下：

（1）超低温粉碎：

取烘干的蛹虫草子实体为原料，称取150g烘干的蛹虫草子实体，放入超微粉碎机中进行超微粉碎，同时粉碎全过程用2～10℃的水作为超微破碎机内部冷却液，以降低粉碎温度，确保有效成分的释放和生物活性的稳定，超微粉碎时间为5-20min，经过实践摸索12min为最宜，得到超微粉。

（2）溶剂提取：

（a）水煮：在超微粉中加入超纯水，超纯水的加入量为超微粉质量的8～10倍，100℃加热3～10小时进行提取，6000rpm离心取沉淀，然后重复两次，将三次得到的沉淀合并，在60℃鼓风干燥箱内干燥，得到粗品A。

（b）丙酮沉淀：在粗品A中加入丙酮，丙酮的加入量为粗品A质量的3倍，室温下浸提12～36小时，6000rpm离心后取沉淀，然后重复两次，将三次得到的沉淀合并，在60℃鼓风干燥箱内干燥，得到粗品B。

（3）色谱分离：

（a）取粗品B用50%乙酸乙酯-正己烷溶液溶解至浓度为50mg/ml，过0.45μm有机微孔滤膜，然后通过制备液相色谱进行分离，制备液相色谱的填料为粒径10μm的硅胶（silica）、大小为150×250mm，检测波长为260nm，流速为700ml/min；洗脱方式为100%正己烷等度洗脱10min，25%乙酸乙酯-正己烷溶液25min，100%乙酸乙酯15min，结果如图1所示，得到各组分经体外抗肿瘤活性筛选后，选取活性最强的组分旋蒸浓缩后真空干燥，得到组分C3-10做下一步分离纯化。

（b）取组分C3-10用100%乙酸乙酯50度超声至刚好溶解至浓度为50mg/ml，过0.45μm有机微孔滤膜，然后通过制备液相色谱进行分离，制备液相色谱的填料粒径10μm的硅胶（silica）、大小为150×250mm，检测波长为260nm，流速为700ml/min；洗脱方式为100%正己烷等度洗脱10min，10%乙酸乙酯-正己烷溶液50min，15%乙酸乙酯-正己烷溶液20min，结果如图2所示，得到各组分经体外抗肿瘤活性筛选后，选取活性最强的组分蒸浓缩后真空干燥，得到组分C310-6做下一步分离纯化。

（c）取组分C310-6用100%二氯甲烷50度超声至刚好溶解至浓度为50mg/ml，过0.45μm有机微孔滤膜，然后通过制备液相色谱进行分离，制备液相色谱的填料为粒径10μm的硅胶（silica）、大小为150×250mm，检测波长为260nm，流速为600ml/min；洗脱方式为100%二氯甲烷等度洗脱40min，结果如图3所示，得到各组分经体外抗肿瘤活性筛选后，选取活性最强的组分，蒸浓缩后真空干燥，得到组分C310-6-2，共21g，即为本发明目的抗肿瘤活性组分。

经NMR氢谱、NMR碳谱、质谱等鉴定，C310-6-2主要含有麦角甾醇及其他未知物。

实施例2：抑制人肺癌A549细胞生长试验

主要材料与试剂：

人肺癌A549细胞由艾森生物（杭州）有限公司赠送；F-12K培养基由Gibco公司赠送；环磷酰胺购自天津金世制药有限公司。

空白对照孔：不加药物；

阳性对照孔：加环磷酰胺；

实验孔：加实施例1所得的抗肿瘤活性组分C310-6-2。

细胞培养：

在5%C0₂，37℃，饱和湿度下，用F-12K（10%FBS+1%PS）培养基培养人肺癌A549细胞，选取对数期生长的细胞作为实验细胞。细胞计数后用培养基稀释为约5.7万/mL的细胞悬液。

细胞生长情况监测：

将细胞实时监测仪放入5%C0₂，37℃饱和湿度培养箱中。取8孔板，每孔加入150μLF-12K培养基，放入细胞实时监测仪中走基线，走完基线后取出八孔板，每孔加入稀释好的A549细胞悬液345μL，至每孔细胞数约2万，静置3min,在倒置显微镜下观察细胞是否均匀。每孔加入5μL稀释好的药物至终浓度为所需药物浓度，用相同浓度的环磷酰胺作为阳性对照组，含0.1%DMSO的培养基作为空白对照组，放入细胞实时监测仪中检测，检测完毕时拍照记录。实验结果如图4所示，结果表明：本发明提取得到的蛹虫草抗肿瘤活性组分C310-6-2在12.5μg/ml时能达到近100%抑制人肺癌细胞A549的生长。

实施例3：抑制人肝癌Hep-G2细胞生长试验

主要材料与试剂：

人肝癌Hep-G2细胞由天大科技园赠送；MEM培养基由Gibco公司赠送；环磷酰胺购自天津金世制药有限公司。

空白对照孔：不加药物；

阳性对照孔：加环磷酰胺；

实验孔：加实施例1所得的抗肿瘤活性组分C310-6-2。

细胞培养：

在5%C0₂，37℃，饱和湿度下，用MEM（10%FBS、1%PS）培养基人肺癌Hep-G2细胞，选取生长状态良好的细胞作为实验细胞。细胞计数后用培养基稀释为约5.7万/mL的细胞悬液。

细胞生长情况监测：

将细胞实时监测仪放入5%C0₂，37℃饱和湿度培养箱中。取8孔板，每孔加入150μLMEM培养基，放入细胞实时监测仪中走基线，走完基线后取出八孔板，每孔加入稀释好的Hep-G2细胞悬液345μL，至每孔细胞数约4万，静置3min,在倒置显微镜下观察细胞是否均匀。每孔加入5μL稀释好的药物至终浓度为所需要药物浓度，用相同浓度的环磷酰胺作为阳性对照组，含0.1%DMSO的培养基作为空白对照组，放入细胞实时监测仪中检测，检测完毕时拍照记录。实验结果如图5所示，结果表明：本发明提取得到的蛹虫草抗肿瘤活性组分C310-6-2在12.5μg/ml时能达到近100%抑制人肝癌细胞Hep-G2生长。

实施例4：C310-6-2抗Lewis肿瘤实验

主要材料与试剂：

lewis肺癌瘤株（第6代）购自中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)；环磷酰胺片购自天津金世制药有限公司；C57BL/6小鼠（18～22g）（动物许可证号：SCXK（京）2012-0001，合格证号：11400700020779）购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心；吐温80由北京博润莱特科技有限公司分装。

本实施例拟在采用lewis荷瘤小鼠模型考察C310-6-2抗肺癌肿瘤作用。具体步骤如下：

1、小鼠Lewis肺癌荷瘤模型建立

取接种肿瘤8-13天状态良好的荷瘤小鼠脱臼处死，体表酒精消毒，在无菌（超净台）环境下剥离小鼠肿瘤至盛有生理盐水的无菌平皿，剪至小块，将小块肿瘤放入组织匀浆器，按体积比1:3左右加入生理盐水匀浆，匀浆液倒入50ml无菌离心管，备用。用1ml注射器在C57小鼠右腋下注射接种0.2ml，肿瘤细胞混悬液的制备均在无菌条件下（超净工作台中）完成。从取出肿瘤腹水至肿瘤接种完毕在60分钟内完成。

2、药物制备方法

C310-6-2灌胃剂：称取一定重量的C310-6-2样品至研钵中，加入所需溶剂体积2%吐温-80，充分研磨后再加入所需体积的生理盐水，混匀，备用。

环磷酰胺灌胃剂：去掉环磷酰胺片的薄膜衣后进行称取，称取一定重量至研钵中，加入所需体积的生理盐水，充分研磨、混匀，备用。

3、分组及给药方法

将60只实验小鼠共分为6组，每组10只，雌雄各半，分为①混合物低剂量（27mg/kg）组、②混合物中剂量（80mg/kg）组、③混合物高剂量（240mg/kg）组、④环磷酰胺组、⑤模型组、⑥空白组，以上除空白组及模型组外，其余各组在注射肿瘤混悬液后，均每日给药一次，每次每只0.2ml，连续给药10天，空白组及模型组在相同给药时间及给药时长灌胃给予2%吐温-80水溶液，连续灌胃10天。

4、观察指标

4.1大体状态

每日对小鼠进行体重、饮食量的称定并记录，于最后一次计算小鼠除瘤后的体重净重。

4.2瘤重及肿瘤抑制率

每日对小鼠右腋下进行观察，于最后一次给药24h后，解剖并取出肿瘤组织，称取肿瘤重量，按下述公式计算肿瘤生长抑制率。

4.3肺组织重量及癌变肺部转移率

于最后一次给药24h后，解剖并取出肺组织，称取肺组织重量，并观察肺组织是否有变化并统计有肺癌转移的小鼠数量。

5、数据统计

各组别小鼠相应数据均以表示，采用SPSS软件进行统计，各组别采用one-wayANOVA检验。结果如表1所示。

由表1可知，C310-6-2在给予剂量为240mg/kg，服药天数为10天时与Lewis肺癌肿瘤模型小鼠比较有极显著差异（P<0.01），此剂量与环磷酰胺组比较无明显差异。

在肺转移方面，各组均出现20%-50%的肺转移现象，但无统计学意义。

在净体重变化方面，C310-6-2各给药组及环磷酰胺组均出现体重下降现象，且各组与模型组及空白组比较均有极显著差异（P<0.01）。

在给药治疗期间，C310-6-2各给药组小鼠体重均出现先下降、后波动上升继而维持平稳的状态；环磷酰胺组则为先下降后维持在低体重状态；模型组与空白则均为波动上升后维持在一定体重水平。

在给药治疗期间，C310-6-2各给药组小鼠平均饮食量均表现出给药中期较高，首尾期较低的表现；环磷酰胺组饮食量一直保持在较低水平；空白组饮食量一直保持在较高水平；模型组则表现为饮食量逐渐减少。

综上所述，推测C310-6-2在给药剂量为240mg/kg、服药剂量为10天时，其对小鼠Lewis肺癌模型具有较好的疗效，但服药机体可能会出现体重下降现象，但其引起的不良反应强度要小于环磷酰胺。

实施例5：C310-6-2抗小鼠H₂₂肿瘤实验

主要材料与试剂：

H₂₂肝癌瘤株（第4代）购自购自中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)；环磷酰胺片购自天津金世制药有限公司；KM小鼠（18～22g）（动物许可证号：SCXK（京）2012-0001，合格证号：11400700020779）购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心；吐温80由北京博润莱特科技有限公司分装。

本实施例拟在采用H₂₂荷瘤小鼠模型考察C310-6-2抗肝癌肿瘤作用。具体如下：

1、小鼠H₂₂肝癌荷瘤模型建立

取接种肿瘤8-13天状态良好的荷瘤小鼠脱臼处死，体表酒精消毒，在无菌（超净台）环境下剥离小鼠肿瘤至盛有生理盐水的无菌平皿，剪至小块，将小块肿瘤放入组织匀浆器，按体积比1:3左右加入生理盐水匀浆，匀浆液倒入50ml无菌离心管，备用。用1ml注射器在KM小鼠右腋下注射接种0.2ml，肿瘤细胞混悬液的制备均在无菌条件下（超净工作台中）完成。从取出肿瘤至肿瘤接种完毕在60分钟内完成。

2、药物制备方法

C310-6-2灌胃剂：称取一定重量的C310-6-2样品至研钵中，加入所需溶剂体积2%吐温-80，充分研磨后再加入所需体积的生理盐水，混匀，备用。

环磷酰胺灌胃剂：去掉环磷酰胺片的薄膜衣后进行称取，称取一定重量至研钵中，加入所需体积的生理盐水，充分研磨、混匀，，备用。

3、分组及给药方法

将60只试验小鼠共分为6组，每组10只，雌雄各半，分为①C310-6-2低剂量（27mg/kg）组、②C310-6-2中剂量（80mg/kg）组、③C310-6-2高剂量（240mg/kg）组、④环磷酰胺组、⑤模型组、⑥空白组，以上各组除模型组及空白组外在注射肿瘤混悬液后，均每日给药一次，每次每只0.3ml，连续给药10天；模型组与空白组每日灌胃等体积2%吐温80水溶液，连续10天。

4、观察指标

4.1大体状态

每日对小鼠进行体重、饮食量的称定并记录，于最后一次计算小鼠除瘤后的体重净重。

4.2瘤重及肿瘤抑制率

每日对小鼠右腋下进行观察，于最后一次给药24h后，解剖并取出肿瘤组织，称取肿瘤重量，按下述公式计算肿瘤生长抑制率。

4.3肝组织重量及癌变肝部转移率

于最后一次给药24h后，解剖并取出肝组织，称取肝组织重量，并观察肝组织是否有变化并统计有肝癌转移的小鼠数量。

5、数据统计

各组别小鼠相应数据均以

表示，采用SPSS软件进行统计，各组别采用one-wayANOVA检验。结果如表3所示。

由表2实验结果可知，C310-6-2在给予剂量为240mg/kg，服药天数为10天时与H₂₂肝癌肿瘤模型小鼠比较有显著差异（P<0.05），且在剂量为240mg/kg及80mg/kg时肝癌肿瘤有较高的抑制率（>40%）；环磷酰胺组与模型组比较有显著差异（P<0.05），剂量为240mg/kg及80mg/kg时与环磷酰胺组比较肿瘤抑制率无明显差异。

肝重方面进行比较，C310-6-2在剂量为80mg/kg时小鼠肝重与环磷酰胺组比较有极显著差异（P<0.01），在剂量为27mg/kg时，小鼠肝重与环磷酰胺组比较有显著差异（P<0.05），环磷酰胺组与模型组比较有极显著差异（P<0.01）。

净体重变化方面进行比较，各给药组体重涨幅均较小，且环磷酰胺组小鼠净体重涨幅最小，给药剂量为240mg/kg时与模型组及空白组比较均呈现显著差异（P<0.05）；环磷酰胺组与模型组及空白组比较均呈现极显著差异（P<0.01）。

各组别小鼠均未出现癌细胞肝转移现象。

在给药治疗期间，C310-6-2各给药组小鼠体重均出现波动上升继而维持平稳的状态；环磷酰胺组则维持在低体重状态；模型组与空白组体重增长幅度要高于其他组别。

在给药治疗期间，C310-6-2各给药组小鼠平均饮食量均表现出给药前期维持平稳，后期饮食量则与给药剂量成反比；环磷酰胺组饮食量一直保持在较低水平；空白组及模型组饮食量则一直保持在较高水平。

综上所述，推测C310-6-2在给药剂量为80mg/kg、服药剂量为10天时，其对小鼠H22肝癌肿瘤模型具有显著疗效（抑瘤率41.1%），其效果与环磷酰胺无明显差异；且可能与环磷酰胺相同，具有防止肝脏肿大的疗效。但由于此给药剂量下，小鼠净体重变化（除瘤后体重与初始体重比较）较小，与环磷酰胺作用相似，推测可能对机体体重及饮食量有一定程度的抑制作用，其抑制作用可能与给药量成正比关系。在给药剂量为240mg/kg时，其肿瘤抑制率（抑瘤率64.4%）甚至优于环磷酰胺（抑瘤率52.9%）。

实施例6：C310-6-2急性毒性实验

1、实验目的：

考察C310-6-2的急性毒性。

2、药品及试剂：

受试样品C310-6-2纯度100%，保存方法4℃冷藏，配制方法为研磨后2%吐温80混合，添加剂吐温80由北京博润莱特科技有限公司分装。

3、实验动物：

KM小鼠（18～25g，雌雄各半）（动物许可证号：SCXK（京）2012-0001，合格证号：11400700020779），动物来源（中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，SCXK（军）2012-0004），饲料来源（中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，SCXK（军）2007-001），饲养环境：普通级，室温21℃，常规饲喂。

4、实验方法：

4.1分组及给药方法

将40只实验小鼠共分为4组，每组10只，雌雄各半，分为①C310-6-2高剂量组（7.80g/kg）、②C310-6-2中剂量组（4.16g/kg）、③C310-6-2低剂量组（2.11g/kg）、④空白组（2%吐温80生理盐水），以上各组在空腹12h后，按各组别给药剂量灌胃给药一次。

4.2观察指标

每日对各组小鼠进行称重、饮食量计算、是否有死亡现象及按附表观察是否有中毒反应的发生（标准参考附表），并进行记录，于第14天对各组小鼠进行解剖观测。

5、实验结果

实验统计结果如表3所示，由表3可以初步推测，C310-6-2在给药剂量为2.11g/kg-7.80g/kg范围内，采用口服给药方式，其对小鼠的体重及饮食方面的影响表现为，低剂量组与其他组别比较其体重增长幅度略大、饮食量略高。

各给药组别存活率均为100%，无死亡现象。

在不良反应方面，在给药剂量为2.11g/kg-7.80g/kg范围内出现不同程度的中毒反应，包括竖毛、困倦现象，涉及到自主神经系统及睡眠中枢系统，均为可逆反应；中毒反应随着给药量的减少其发生率降低或持续时间缩短。

在灌胃给药后14天对存活的小鼠进行大体解剖，对机体的主要脏器（心、肝、肺、胃、肾、脑）进行观测，并未发现有明显的器官改变。

根据本实验结果及C310-6-2物质本身性质，C310-6-2对小鼠的最大给药量为7.80g/kg。

附：急性毒性试验的一般观察结果与可能涉及的组织、器官、系统如表4所示。

由于蛹虫草本身就可食用，所以其具有无毒、安全等特点，由本发明蛹虫草抗肿瘤活性组分可以得到有效的抗肿瘤新药和/或抗肿瘤保健品，具有高效、无毒且原料相对冬虫夏草廉价易得的特点。C310-6-2体外试验表明：在浓度为12.5μg/ml时能到到达到100%抑制人肺癌细胞A549和人肝癌细胞Hep-G2的生长。C310-6-2体内试验表明：在给药剂量为240mg/kg，其对H₂₂荷瘤小鼠肿瘤抑制率（抑瘤率44.59%）与环磷酰胺组（抑瘤率46.29%）无显著差异，其引起的不良反应强度要小于环磷酰胺。在给药剂量为240mg/kg时，其对lewis荷瘤小鼠肿瘤抑制率（抑瘤率64.4%）甚至优于环磷酰胺（抑瘤率52.9%），急毒实验表明，C310-6-2对小鼠的最大给药量为7.80g/kg。这显示了C310-6-2在进一步开发有效的抗肿瘤单体药物方面的潜力。接下来我们将进行对活性组分C310-6-2大规模制备，争取获得抗肿瘤强活性单体化合物，开发出强活性抗肿瘤单体药物，为人类的健康奉献我们微薄的力量。

本发明实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合生物制品加工的普通市售产品。

以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

表1：抗肺癌肿瘤试验结果

注：与模型组比较^**p<0.01、^*p<0.05；与空白组比较^※※p<0.01、^※p<0.0

表2：抗肝癌肿瘤试验结果

注：与模型组比较^**p<0.01，^*p<0.05；与空白组比较^※※p<0.01，^※p<0.05；与环磷酰胺组

比较^○○p<0.01，^○p<0.05

表3：C310-6-2急性毒性实验结果

表4：急性毒性试验的一般观察结果与可能涉及的组织、器官、系统

Claims (8)

1.一种蛹虫草抗肿瘤活性组分的提取方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）超低温粉碎：

取烘干的蛹虫草子实体为原料，放入超微粉碎机中进行超微粉碎，同时粉碎全过程用2～10℃的水作为超微破碎机内部冷却液，超微粉碎时间为5-20min，得到超微粉；

（2）溶剂提取：

水煮：在超微粉中加入超纯水，超纯水的加入量为超微粉质量的8～10倍，100℃加热3～10小时进行提取，离心取沉淀，然后重复1～3次，将得到的沉淀合并，干燥，得到粗品A；

丙酮沉淀：在粗品A中加入丙酮，丙酮的加入量为粗品A质量的2～4倍，室温下浸提12～36小时，离心后取沉淀，然后重复1～3次，将得到的沉淀合并，干燥，得到粗品B；

（3）色谱分离：

取粗品B用50%乙酸乙酯-正己烷溶液溶解至浓度为50mg/ml，然后通过制备液相色谱进行分离，洗脱方式为100%正己烷等度洗脱10min，25%乙酸乙酯-正己烷溶液等度洗脱25min，100%乙酸乙酯等度洗脱15min，检测波长为260nm，得到各组分经体外抗肿瘤活性筛选后，选取活性最强的组分旋蒸浓缩后真空干燥，得到组分A；

取组分A用100%乙酸乙酯50度超声至刚好溶解至浓度为50mg/ml，然后通过制备液相色谱进行分离，洗脱方式为100%正己烷等度洗脱10min，10%乙酸乙酯-正己烷溶液等度洗脱50min，15%乙酸乙酯-正己烷溶液等度洗脱20min，检测波长为260nm，得到各组分经体外抗肿瘤活性筛选后，选取活性最强的组分旋蒸浓缩后真空干燥，得到组分B；

取组分B用100%二氯甲烷50度超声至刚好溶解至浓度为50mg/ml，然后通过制备液相色谱进行分离，洗脱方式为100%二氯甲烷等度洗脱40min，检测波长为260nm，得到各组分经体外抗肿瘤活性筛选后，选取活性最强的组分，旋蒸浓缩后真空干燥，即为本发明目的抗肿瘤活性组分。

2.根据权利要求1所述的蛹虫草抗肿瘤活性组分的提取方法，其特征在于：所述步骤（1）中粉碎时间为12min。

3.根据权利要求1所述的蛹虫草抗肿瘤活性组分的提取方法，其特征在于：所述步骤（2）中离心的转速为6000rpm。

4.根据权利要求1所述的蛹虫草抗肿瘤活性组分的提取方法，其特征在于：所述步骤（2）中干燥在60℃鼓风干燥箱内进行。

5.根据权利要求1所述的蛹虫草抗肿瘤活性组分的提取方法，其特征在于：所述步骤（3）中制备液相色谱的填料为粒径10μm的硅胶、大小为150×250mm。

6.根据权利要求1所述的蛹虫草抗肿瘤活性组分的提取方法，其特征在于：所述步骤（3）中溶解液在进行制备液相色谱之前先用0.45μm有机膜抽滤。

7.根据权利要求1所述的蛹虫草抗肿瘤活性组分的提取方法，其特征在于：所述步骤（3）中体外抗肿瘤活性筛选是指进行抑制人肺癌A549细胞生长试验和抑制人肝癌Hep-G2细胞生长试验。

8.权利要求1所述的蛹虫草抗肿瘤活性组分在制备抗肿瘤药物中的应用。

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