TWI612963B

TWI612963B - 具抗發炎與抑制肝癌細胞生長的蛹蟲草萃取物及其製備方法

Info

Publication number: TWI612963B
Application number: TW105139022A
Authority: TW
Inventors: 錢佑; 吳永昌; 張芳榮; 張登豪; 吳東穎; 丘錦朋
Original assignee: 錢佑
Priority date: 2016-07-20
Filing date: 2016-07-20
Publication date: 2018-02-01
Also published as: TW201803571A

Abstract

本發明揭露一種由蛹蟲草子實體獲得的醫藥萃取物，其是以水-乙酸乙酯對蛹蟲草子實體乙醇粗萃取物進行分配萃取，獲得乙酸乙酯層，再以正己烷-90%甲醇溶液對乙酸乙酯層進行分配萃取，最終獲得此具抗發炎與抑制肝癌細胞生長的90%甲醇溶液層。該90%甲醇溶液層的活性二級代謝物包括神經醯胺(包括新穎的神經醯胺cordycerebroside A)、腺苷、蟲草素、麥角固醇過氧化物、酵母固醇及麥角固醇。

Description

具抗發炎與抑制肝癌細胞生長的蛹蟲草萃取物及其製備方法

本發明關於一種萃取物及製備方法，尤其本發明關於一種具抗發炎與抑制肝癌細胞生長的蛹蟲草萃取物及其製備方法。

真菌「蟲草屬」(Cordyceps)屬於子囊菌(Ascomycota)門、糞殼菌(Sordariomycetes)綱、肉座菌(Hypocreales)目及麥角菌(Clavicipitaceae)科。目前已鑑定出超過400種的蟲草屬真菌。蟲草屬是寄生性的昆蟲子囊菌，其寄生在鱗翅目蛹(Lepidopteran pupae)的幼蟲或者其他有甲殼類的昆蟲。

以一般人耳熟能詳的冬蟲夏草(Cordyceps sinensis)為例，其寄生在蝙蝠蛾幼蟲，蟲草屬真菌形成了「夏草」的部分，而「冬蟲」則是指蝙蝠蛾幼蟲。冬蟲夏草的形成是蟲草孢子(Spore)侵入蝙蝠蛾幼蟲體內之後菌絲並占據其體腔，以幼蟲的內臟為養分，生長出無數新菌絲體。菌絲體交集在一起形成子實體，稱為「子座」。在秋末冬初時，子座由幼蟲蟲體頭部長出約一公分，然後停止生長，在凍土中過冬。春天雪溶時，子座逐漸生長出地面。至九月下旬時子座逐漸生長約三公分，地下被寄生的「冬蟲」已被吸食殆盡而死亡。夏季來時，從死去的冬蟲頭頂長出「菌座」，露出土面，故名夏草。這就形成了著名的中草藥「冬蟲夏草」。

而蟲草屬中的另一種-蛹蟲草(Cordyceps militaris)，為呈現金黃或桔黃色的溫性藥材，在傳統中醫上具有平喘止咳、補腎等功效。而原產地在長白山的蛹蟲草，更被譽為喜馬拉雅威而鋼(Himalayan Viagra)，西藏高原及中亞原住民使用來治療性慾減退、高血糖、高脂血、心律失常、呼吸、腎臟及肝臟疾病。

天然的蟲草屬真菌價格昂貴，且無穩定的供應源，買賣僅以「子實體」藥材形式進行，使用上被侷限於亞洲及西方的有錢人。而市售常見的蟲草屬真菌保健產品，則多為「菌絲體」為原料，加工後以膠囊、飲食添加物及飲品的方式販賣。但無論是子實體還是菌絲體，其活性成分的研究至目前為止仍不清楚，只有腺苷(adenosine)、蟲草素(cordycepin)被確認為主量成分，其他的活性成分、成分與成分間的活性加成作用也未被釐清。

然而，目前尚未有研究或文獻能將上述蛹蟲草的二級代謝物進行活性導引分離，確定活性成分並調製成適合口服之飲品或藥劑，且在調製成飲品或藥劑後仍保持前述成分的功效。

因此本發明申請人鑑於習知技術中的不足，經過悉心試驗與研究，並一本鍥而不捨之精神，終構思出本發明，能夠克服先前技術的不足，以下為本發明之簡要說明。

為了克服先前技術中蟲草屬真菌的二級代謝物仍屬未知的處女地，且為了確定該二級代謝物的生物活性、將該二級代謝物開發成適合口服之飲品或藥劑並裝填於適當的容器中，本發明使用蛹蟲草子實體為材料，以乙酸乙酯-水對蛹蟲草子實體粗萃取物進行分配萃取，獲得乙酸乙酯層，再以正己烷-90%甲醇溶液對乙酸乙酯層進行分配萃取，獲得90%甲醇溶液層。90%甲醇溶液層顯示出顯著的抗發炎與抑制肝癌細胞生長活性。由該90%甲醇溶液層可分離出8種蛹蟲草二級代謝物，包括3種神經醯胺(腦醯胺(ceramide)衍生物)、2種核苷以及3種固醇。化合物1至8的類別、名稱如下所示。

因此，本發明揭露一種用於抗發炎的醫藥組合物，至少包括神經醯胺化合物1。在一個具體實施例中，醫藥組合物更包括神經醯胺化合物2及/或3。在一個具體實施例中，醫藥組合物更包括化合物4至8中至少其中之一。

本發明揭露一種製備用於抗發炎的醫藥組合物的方法，該醫藥組合物至少包括神經醯胺化合物1，該方法包括：(a)將蛹蟲草(Cordyceps militaris)子實體醇類萃取物濃縮，獲得蛹蟲草子實體粗萃取物；(b)以水及乙酸乙酯對蛹蟲草子實體粗萃取物進行分配萃取，獲得乙酸乙酯層及水層；(c)以正己烷及甲醇溶液對乙酸乙酯層進行分配萃取，獲得正己烷層及甲醇溶液層；以及(d)層析甲醇溶液層，獲得醫藥組合物。

在一個具體實施例中，製備方法步驟(a)的蛹蟲草子實體醇類萃取物是將蛹蟲草子實體以超音波震盪及以醇類萃取而得，醇類可為甲醇或乙醇。

本發明研究經脂多醣(LPS)刺激的RAW264.7巨噬細胞能抑制促進發炎的iNOS(誘導型一氧化碳合成酶)及COX-2(環氧合酶)蛋白質而證實神經醯胺化合物1、2及3的抗發炎活性。本發明由蟲草屬真菌第一次分離出神經醯胺化合物，包括新化合物1。因此，由珍貴及昂貴的蟲草屬真菌所得到的神經醯胺化合物可用於緩解因身體發炎反應引起的慢性疾病(高血壓、高血脂、糖尿病等)，以及治療組織損傷、氣管炎、氣喘及肺氣腫等疾病。

本發明揭露一種蛹蟲草飲品容器，包括：蓋體、瓶口部、及瓶體部。瓶口部與蓋體結合，瓶體部與瓶口部一體成形且具有容置空間，其中該容置空間包含蛹蟲草飲品。

在本發明中，瓶體部上貼附一標籤，標籤之材質為塑膠、玻璃紙或紙。在本發明中，瓶口部及瓶體部之材質為塑膠或玻璃，塑膠為半透明塑膠或不透明塑膠，玻璃為透明玻璃、半透明玻璃或不透明玻璃。在本發明中，玻璃之顏色為褐色或綠色。

在本發明中，蓋體的第一螺紋與瓶口部內徑的第二螺紋相互齧合，使蛹蟲草飲品容器內部呈現密封狀態。此外，瓶體部的圓形底部具有複數個凸狀半月形，該複數個凸狀半月形圍繞圓形底部的邊緣而設置。複數個凸狀半月形在圓形底部排成一圈的設計有助於蛹蟲草飲品容器的存放穩定性，不易因碰撞、地震而傾倒。來自蛹蟲草的蛹蟲草飲品包括神經醯胺、腺苷、蟲草素、麥角固醇過氧化物、酵母固醇及麥角固醇。

本文用語「90%甲醇溶液」是指甲醇與水依體積比9：1調和的溶液。本文用語「甲醇溶液」是指甲醇與水依特定體積比調和的溶液，特定體積比並不限於9：1，熟習本技術領域之人士可理解，其他體積比調和出的甲醇溶液均可應用於本發明且落入申請專利範圍。

10‧‧‧方法

12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54‧‧‧方塊

100‧‧‧蛹蟲草飲品容器

110‧‧‧蓋體

120‧‧‧瓶口部

130‧‧‧瓶體部

140‧‧‧容置空間

150‧‧‧蛹蟲草飲品

160‧‧‧標籤

170‧‧‧凸狀半月形

第1圖為本發明由蛹蟲草分離出化合物1至8的流程圖。

第2圖為本發明由劃分層10分離出化合物6、7及8的流程圖。

第3圖為本發明由劃分層12分離出化合物1、2及3的流程圖。

第4圖為本發明化合物1經過甲醇水解作用(methanolysis)將化合物1至3分解成為鏈鹼基(LCB)、脂肪酸鏈(LCA)及葡萄糖苷的示意圖。

第5圖為本發明化合物1至8抑制NO產生的柱狀圖。LPS刺激的巨噬細胞RAW264.7與化合物1至8(1.0、3.0及10.0μM)共同培養。24小時後，收集培養液並分析每毫克細胞蛋白質的亞硝酸鹽量。化合物1至8與控制組(僅以一般食鹽水處理)相較，可降低LPS誘導的NO產生。數據顯示三重複實驗(三個獨立實驗)的平均，誤差槓表示標準差。

第6圖(A)及第6圖(B)為本發明化合物1至3對於RAW264.7巨噬細胞的促進發炎的iNOS及COX-2蛋白質表現的示意圖。控制組的相對強度訂為100%。與LPS刺激的控制組相較有顯著性為(*)p<0.01。

第7圖為本發明化合物2經由RAW264.7細胞之p65次單元的核異位作在LPS誘導的NF-κB轉錄活性。

第8圖(A)為本發明化合物2抑制由LPS刺激的NF-κB螢光活性的示意圖。

第8圖(B)為本發明化合物2以劑量依賴效應抑制p65次單元結合至NF-Kb element的活性的示意圖。

第9圖為本發明的蛹蟲草飲品容器的側視圖。

第10圖為本發明的蛹蟲草飲品容器的仰視圖。

本發明所提出之發明將可由以下的實施例說明而得到充分瞭解，使得所屬技術領域中具有通常知識者可以據以完成之，然而本發明之實施並非可由下列實施例而被限制其實施型態，所屬技術領域中具有通常知識者仍可依據除既揭露之實施例的精神推演出其他實施例，該等實施例皆當屬於本發明之範圍。

1.蛹蟲草(Cordyceps militaris)子實體的培養：

將一塊蛹蟲草子實體培養於18℃下之馬鈴薯葡萄糖洋菜(PDA)平板培養皿中央7天。在培養皿長滿菌絲體後，切下一塊菌絲體並置於生長培養基中。菌絲體在18℃下、1000ml的生長培養基(含有200g馬鈴薯汁、10g葡萄糖、10g蛋白腖、3g的KH₂PO₄、1.5g的MgSO₄、100mg維生素B₁、5g酵母萃取物及1000ml水)發酵14天(150rpm)。蛹蟲草固態發酵的接種物製備是在瓶中藉由將真菌接種於15ml生米以及10ml培養基(含有10g葡萄糖、10g蛋白腖、100mg維生素B₁、5g酵母萃取物、1000ml水及15~20g洋菜)中而進行，且在接種後於暗處、18℃下培養7天。接著，在連續螢光燈照射下移動瓶子。在40℃下的烘箱中乾燥蛹蟲草子實體24小時，且儲存在4℃。

2.蛹蟲草二級代謝物的活性導引分離：

第1圖為本發明由蛹蟲草子實體分離出化合物1至8的方法流程圖。在第1圖的方法10中，將新鮮的蛹蟲草子實體乾燥72小時，且精確地秤重蛹蟲草粉末(4kg，方塊12)。在室溫下以超音波震盪120分鐘並加入以20L之95%(V/V)乙醇溶液連續抽取蛹蟲草子實體粉末三次。接著倒出黃色膏狀物的乙醇萃取物(方塊14)，真空過濾，使用旋轉蒸發器進行濃縮而得到粗萃取物(663.9g，方塊16)。由多種藥理活性平台評估、篩選，確認粗萃取物具有抗發炎、及抑制癌細胞生長的活性，其中又以肝癌細胞株的抑制效果最佳。由正相矽膠管柱層析法(NP-Chromatography)和薄層色層分析法(NP-TLC)結果得知，乙醇萃取物的成分極性由低至高分佈極廣，主量成分為高極性的醣類、核酸類和神經醯胺，以及低極性的固醇類和脂肪酸(結果未示出)。

接著，以乙酸乙酯：水(1：1,V/V)對粗萃取物進行分配萃取，獲得乙酸乙酯層(109.6g，方塊18)及水層(方塊20)。由核磁共振光譜分析法(NMR)結果得知，乙酸乙酯層的主量成分為脂肪酸類化合物。

為了去除脂肪酸等一般常見成分，選擇正己烷、甲醇和水為溶媒，進行分配萃取。以正己烷：90%甲醇溶液(1：1,V/V)對乙酸乙酯層進行分配萃取，獲得正己烷層(方塊22)及90%甲醇溶液層(31.0g，又稱為水摻甲醇層，方塊24)。

進行粗萃取物(方塊16)、乙酸乙酯層(方塊18)、水層(方塊20)、正己烷層(方塊22)及90%甲醇溶液層(方塊24)的藥理活性比較，結果顯示90%甲醇溶液層具有最佳的抗發炎活性，且在給藥濃度20μg/ml時對於肝癌細胞株HepG2的生長抑制百分率為99.36%、Hep3B的生長抑制百分率為98.90%，確認90%甲醇溶液層為蛹蟲草的活性層。

進一步以矽膠管柱層析法純化90%甲醇溶液層，以極性漸增的二氯甲烷(DCM)及甲醇的混合物(40：1,30：1,20：1,15：1,10：1,5：1)進行沖提，獲得13個劃分層。第1圖僅示出劃分層1、2、10、12及13(分別為方塊26、28、30、32及34)。熟習本技術領域之人士均理解劃分層的數量並不限於13，可為少於或多於13個劃分層，且可由這些劃分層中的一些劃分層分離出化合物1至8。

以Sephadex LH-20管柱(2.5×55cm)對劃分層10(280.8mg，方塊30)進行層析，使用丙酮：甲醇(1：1,V/V)做為沖提液，獲得3個子劃分層10-1至10-3(第2圖，方塊42、44及46)。以逆相HPLC(RI detector,SUPELCO C-18,250mm×10mm i.d.,5μm)純化子劃分層10-2(方塊44)，並以平衡移動相(甲醇：水=80：20)、流速2ml/min沖提，獲得化合物6、7及8(方塊36)，分別為麥角固醇過氧化物(ergosterol peroxide，化合物6，13.9mg，t _R 13.4min)、酵母固醇(cerevisterol，化合物7，18.9mg，t _R 15.4min)及麥角固醇(ergosterol，化合物8，8.9mg，t _R 18.4min)。

劃分層12(890.32mg，方塊32)為富含神經醯胺的劃分層。以溶媒系統(二氯甲烷：甲醇=5：1，V/V)顯色的薄層層析(TLC)片上，噴上10%H₂SO₄溶液並在加熱板上加熱後顯現清晰的紫色斑點。然而，劃分層12在¹H NMR圖譜上顯現複雜的訊號。接著，在Sephadex LH-20管柱(2.5×55cm)上進行層析，使用丙酮：甲醇(1：1，V/V)作為沖提液，產生6個子劃分層12-1至12-6(第3圖)。第3圖僅示出子劃分層12-1、12-2及12-6(分別為方塊48、50及52)。熟習本技術領域之人士均理解子劃分層的數量並不限於6，可為少於或多於6個子劃分層，且可由這些子劃分層中的一或多個劃分層分離出化合物1至3。

接著，以逆相管柱層析法(RP-Chromatography)技術、使用95%甲醇溶液作為沖提液對子劃分層12-2(393.2mg，方塊50)進行層析，獲得主要分餾物(方塊54)。以逆相HPLC(RI detector；SUPELCO C-18,250mm×10mm i.d.,5μm；甲醇：水=9：1；流速2ml/mim)純化該主要分餾物(173.4mg)，獲得化合物1、2及3(方塊38)，分別為新穎的神經醯胺化合物1(命名為cordycerebroside A，10.8mg，t _R 21.2min)、大豆神經醯胺I(soyacerebroside I，化合物2，54.8mg，t _R 22.7min)及葡萄糖神經醯胺(glucocerebroside，化合物3，201.8mg，t _R 24.1min)。與過去被文獻發表的已知化合物相較，cordycerebroside A(化合物1)為一新穎的神經醯胺化合物。

在Sephadex LH-20管柱(2.5×55cm)上、使用丙酮：甲醇(1：1)為沖提液，分離劃分層13(2.5g)，獲得化合物4、5(第1圖，方塊40)，分別為腺苷(adenosine，化合物4，340.4mg)及蟲草素(cordycepin，化合物5，895.4mg)。

3.蛹蟲草二級代謝物的化學結構證明：

由蛹蟲草子實體的90%甲醇溶液層分離出新穎的神經醯胺化合物1(cordycerebroside A)、以及化合物2(大豆神經醯胺I)、3(葡萄糖神經醯胺)、4(腺苷)、5(蟲草素)、6(麥角固醇過氧化物)、7(酵母固醇)及8(麥角固醇)。化合物1至3為神經醯胺衍生物，化合物4及5為核苷，化合物6至8為固醇類。化合物1至8的化學結構式、光譜實驗數據如後所述，且與文獻資料比對而確定。

化合物1(Cordycerebrosid eA)：

化合物1被分離為白色非晶向粉末。化合物1的高解析電噴灑游離質譜(HR-ESI-MS)顯示出在m/z 726.5508[M+H]⁺(C₄₁H₇₈O₉N，計算為726.5515)。化合物1的¹H NMR及¹³C NMR圖譜數據如表1所示。與¹³C數據合併的質量資訊顯示，化合物1的分子式為C₄₁H₇₈O₉N。遠紅外線光譜顯示二級醯胺(1672及1647cm^-1)、羥基(3500及3300cm^-1)及亞甲基(2925及2846cm^-1)基團。¹H NMR圖譜(pyridine-d ₅)顯示特徵共振訊號：醯胺質子雙重態在δ _H 8.35(1H,d,J=8Hz)、脂肪酸長亞甲基鏈質子在δ _H 1.25、糖變旋異構質子(sugar anomeric proton)在δ _H 4.92以及兩個甲基基團訊號在δ _H 0.86(6H,t,J=6.6Hz,H-18及H-16')，表明出鞘糖脂(glycosphingolipid)骨架。在¹H NMR圖譜中，糖的質子共振出現在δ _H 4.92(1H,H-1")、4.03(1H,H-2")、4.26(1H,H-3")、4.24(1H,H-4")、3.91(1H,H-5")、4.35(1H,d,J=11.4Hz,H-6"a)及4.52(1H,d,J=11.4及4.8Hz,H-6"b)。在¹³C NMR圖譜中，出現在δ _c 62.6(CH₂)、75.1(CH)、78.4(CH)、71.5(CH)、78.5(CH)及105.6(CH)的碳共振顯示出存在著β-葡萄哌喃糖苷(β-glucopyranoside)。從H-1"到C-1(δ _C 69.9)的HMBC相關性以及在δ _H 4.92(d,J=7.8Hz；δ _C=105.6)的變旋異構質子的耦合常數進一步確定了C1-葡萄糖單元的β構型。在δ _H 1.25-1.39的強烈訊號以及在δ _H 0.86的兩個末端甲基訊號(6H,t,J=6.6,H-18及H-16')表明化合物1中存在著兩個長脂肪鏈。在δ _C 54.5的三級碳訊號證實了存在著附接於氮的碳，且在δ _C 173.8的四級碳證實了醯胺羰功能性。HSQC圖譜顯示出烯烴訊號在δ _H 5.99(1H,dd,J=15.7,6.0,Hz,H-4)/δ _C 132.3(C-4)及δ _H 5.89(1H,dt,J=15.7,6.0Hz,H-5)/δ _C 131.8(C-5)，其歸因於神經胺醇(sphingosine)的典型△⁴雙鍵。這些烯烴質子的高鄰位耦合常數(J=15.7Hz)清楚地表明雙鍵的E構型。所推測的基團連接性是以主COSY訊號H₂-1(δ _H 4.71,dd,J=12.0,3.6Hz及δ _H 4.26,dd,J=10.8,6.0Hz)/H-2(δ _H 4.79,1H,m)的分析達成，且H-2/C-3(δ _C 72.3)及H-3(δ _H 4.80,1H,m)/C-2(δ _C 54.5)的HMBC關聯性表明存在著2-胺基-1,3-二氧化部分(2-amino-1,3-dioxygenated fragment)。此外，從H-3至C-4及C-5的主HMBC關聯性以及從H-19至C-8、C-9及C-10的主HMBC關聯性幫助了雙鍵及神經胺醇骨架的定位。C-2在δ _C 54.5及C-3在δ _C 72.3的化學偏移證實了在C-2及C-3的D-立體化學(D-erythro stereochemistry)，其與合成的D-腦醯胺(δ 55.2及73.6)及D-葡萄糖苷基-D-腦醯胺(δ 53.8及72.6)的化學偏移一致。C-1(δ 69.9)、C-2(δ 54.5)及C-3(δ 72.3)的相對組態與其他(2S,3R)-神經胺醇部分的相對組態一致。基於前述數據，一個羥基作用尚待其他脂肪鏈來確定。為了確定兩條脂肪鏈的結構，化合物1經過甲醇水解作用(methanolysis)且以GC-MS分析。如第4圖所示，神經醯胺化合物1在0.1N氫氯酸(其溶解於甲醇水溶液)中被酸性水解。一旦酸性水解，神經醯胺化合物1轉換為長鏈鹼基(LCB，化合物1b)、脂肪酸鏈(LCA，化合物1a)及葡萄糖苷(化合物1c)。該溶液接著以正己烷：水混合物(1：1)進行分配萃取，使LCA進入正己烷層。接著，以乙醚進一步分配萃取水層。LCB被集中(或濃縮)在乙醚層。剩下的水層在真空下濃縮，以獲得葡萄糖苷。葡萄糖苷由甲醇經由結晶作用獲得無色片狀物，旋光度為-21(c 0.10,MeOH)。葡萄糖部分的絕對組態被推論為D型。GC-MS分析表明了：LCA為長鏈的methyl 2-oxohexadecanoate，其分子式為類似於化合物1的C₁₇H₃₄O₃(m/z 284.0[M+H]⁺)。在從化合物1的分子量推論糖部分的1c及1a之後來確定LCB的分子量。質子H-3'(δ 5.67)/H-4'(δ 5.69)對碳位置C-2'(δ 72.4)的HMBC相關性暗示：LCA的雙鍵部分位在C-3'及C-4'之間(結果未示出)。化合物1a的旋光性(-21,MeOH)表明了在C-2'為R組態。基於這些數據，脂肪酸部分被推論為methyl 2R-hydroxyhexadecamoate。由此確定，本發明由蛹蟲草分離出新神經醯胺化合物1。

上述化合物1整理如下。

化合物1外觀為半透明的蠟狀物質。遠紅外線(IR)圖譜在1672-1674cm^-1有二級醯胺(-NH)的訊號，在3500-3300cm^-1有羥基(-OH)的訊號，在2925-2846cm^-1有亞甲基(CH₃)的訊號。由ESI-MS測得其分子離子峰為[M+H]⁺。再由HRESIMS(發現726.5508 m/z[M+H]⁺，計算為726.5515)得知分子式為C₄₁H₇₈O₉N。¹H NMR(C₅D₅N,500MHz)：δ _H 8.35(1H,d,J=8.0Hz,NH),δ _H 4.71(1H,dd,J=12.0,3.6Hz,H-1a),δ _H 4.26(1H,dd,J=10.8,6.0Hz,H-1b),δ _H 4.79(1H,m,H-2),δ _H 4.80(1H,m,H-3),δ _H 5.99(2H,dd,J=15.7,6.0,H-4),δ _H 5.89(2H,dd,J=15.7,6.0,H-5),δ _H 2.16(1H,m,H-6),δ _H 2.18(1H,m,H-7),δ _H 5.25(t,J=7.0,H-8),δ _H 2.02(1H,t,H-10),δ _H 1.25~1.39(14H,m,H-11~H-17),δ _H 0.86(3H,t,J=6.6,CH ₃ -18),δ _H 1.62(3H,s,CH ₃ -19),δ _H 4.74(1H,m,H-2'),δ _H 5.67(2H,dd,J=15.0,6.0,H-3'),δ _H 5.69(2H,dd,J=15.0,6.0,H-4'),δ _H 1.25-1.39(20H,m,H-5'~H-15'),δ _H 0.86(3H,t,J=6.6,H-16'),δ _H 4.92(1H,d,J=7.8,H-1"),δ _H 4.03(1H,m,H-2"),δ _H 4.26(1H,m,H-3"),δ _H 4.24(1H,dd,J=8.4,7.8,H-4"),δ _H 3.91(1H,m,H-5"),δ _H 4.52,4.35(1H,dd,J=11.4,4.8,H-6")和δ _H 4.35(1H,bd,J=11.4,H-6")。'³C NMR(C₅D₅N,125MHz)：δ _c 69.9(C-1),δ _c 54.5(C-2),δ _c 72.3(C-3),δ _c 132.3(C-4),δ _c 131.8(C-5),δ _c 28.5(C-6),δ _c 32.7(C-7),δ _c 131.0(C-8),δ _c 125.0(C-9),δ _c 32.7(C-10),δ _c 22.9~32.6(C-11~C-17),δ _c 13.9(C-18),δ _c 16.3(C-19),δ _c 173.8(C-1'),δ _c 72.4(C-2'),δ _c 131.3(C-3'),δ _c 136.4(C-4'),δ _c 33.9(C-5'~C-15'),δ _c 14.0(C-16'),δ _c 105.6(C-1"),δ _c 75.1(C-2"),δ _c 78.4(C-3"),δ _c 71.5(C-4"),δ _c 78.5(C-5"),δ _c 62.6(C-6")。

含有LCB及LCA雙鏈脂質的神經醯胺為高度斥水性結構。神經醯胺分子機制已被確定是作用為調節慢性發炎症狀。因此，由蛹蟲草分離的新神經醯胺化合物將對此真菌的治療價值有所幫助。

化合物2(大豆神經醯胺I)：

化合物2外觀為半透明的蠟狀物質。IR圖譜在1672-1674cm^-1有二級醯胺(-NH)的訊號，在3500-3300cm^-1有羥基(-OH)的訊號，在2925-2846cm^-1有亞甲基(CH₃)的訊號。由ESI-MS測得其分子離子峰為[M+H]⁺。再由HRESIMS(發現714.5518 m/z[M+H]⁺，計算為714.5515)得知分子式為C₄₀H₇₆O₉N。¹H NMR(C₅D₅N,500MHz)：δ _H 8.37(1H,d,J=10.0Hz,NH),δ _H 4.71(1H,dd,J=12.0,3.6Hz,H-1a),δ _H 4.23(1H,dd,J=10.8,6.0Hz,H-1b),δ _H 4.74(1H,m,H-2),δ _H 4.78(1H,m,H-3),δ _H 5.98(2H,dd,J=16.0,5.8,H-4),δ _H 5.92(2H,dt,J=16.0,5.8,H-5),δ _H 2.14(1H,m,H-6),δ _H 2.20(1H,m,H-7),δ _H 5.28(t,J=7.0,H-8),δ _H 5.50(1H,m,H-9),δ _H 2.17(1H,m,H-10),δ _H 1.25~1.36(14H,m,H-11~H-16),δ _H 1.27(1H,m,H-17),δ _H 0.86(3H,t,J=6.0,CH ₃ -18),δ _H 4.74(1H,m,H-2'),δ _H 2.14,2.02(2H,m,H-3'),δ _H 1.79,1.70(2H,m,J=15.0,6.0,H-4'),δ _H 1.25-1.39(20H,m,H-5'~H-15'),δ _H 0.86(3H,t,J=6.6,H-16'),δ _H 4.93(1H,d,J=7.5,H-1"),δ _H 3.91(1H,s,H-2"),δ _H 4.26(1H,m,H-3"),δ _H 4.24(1H,dd,J=8.4,7.8,H-4"),δ _H 3.92(1H,m,H-5"),δ _H 4.51,4.35(1H,dd,J=11.4,4.8,H-6")和δ _H 4.35(1H,bd,J=11.4,H-6")。¹³C NMR (C₅D₅N,125MHz)：δ _c 70.1(C-1),δ _c 54.5(C-2),δ _c 71.4(C-3),δ _c 132.3(C-4),δ _c 131.0(C-5),δ _c 29.5(C-6),δ _c 32.7(C-7),δ _c 131.9(C-8),δ _c 129.9(C-9),δ _c 40.0(C-10),δ _c 33.0(C-11~C-17),δ _c 14.2(C-18),δ _c 175.6(C-1'),δ _c 72.5(C-2'),δ _c 33.9(C-3'~C-15'),δ _c 14.0(C-16'),δ _c 105.6(C-1"),δ _c 75.1(C-2"),δ _c 78.4(C-3"),δ _c 71.5(C-4"),δ _c 78.5(C-5"),δ _c 62.6(C-6")。

化合物3(葡萄糖神經醯胺)：

化合物3外觀為半透明的蠟狀物質。IR圖譜在1672-1674cm^-1有二級醯胺(-NH)的訊號，在3500-3300cm^-1有羥基(-OH)的訊號，在2925-2846cm^-1有亞甲基(CH₃)的訊號。由ESI-MS測得其分子離子峰為[M+H]⁺。再由HRESIMS(發現728.5662 m/z[M+H]⁺，計算為728.5671)得知分子式為C₄₁H₇₈O₉N。¹H NMR(C₅D₅N,500MHz)：δ _H 8.33(1H,d,J=8.0Hz,NH),δ _H 4.71(1H,dd,J=12.0,3.6Hz,H-1a),δ _H 4.23(1H,dd,J=10.8,6.0Hz,H-1b),δ _H 4.88(1H,m,H-2),δ _H 4.89(1H,m,H-3),δ _H 5.98(2H,dd,J=15.7,6.0,H-4),δ _H 5.96(2H,dd,J=15.7,6.0,H-5),δ _H 2.14(1H,m,H-6),δ _H 2.14(1H,m,H-7),δ _H 5.28(t,J=7.0,H-8),δ _H 2.00(1H,t,H-10),δ _H 1.25~1.37(14H,m,H-11~H-17),δ _H 0.86(3H,t,J=6.6,CH ₃ -18),δ _H 1.61(3H,s,CH ₃ -19),δ _H 4.56(1H,m,H-2'),δ _H 2.14,2.02(2H,m,H-3'),δ _H 1.79,1.70(2H,m,H-4'),δ _H 1.25-1.36(20H,m,H-5'~H-15'),δ _H 0.86(3H,t,J=6.6,H-16'),δ _H 4.89(1H,d,J=7.5,H-1"),δ _H 4.00(1H,m,H-2"),δ _H 4.19(1H,m,H-3"),δ _H 4.22(1H,dd,J=8.4,7.8,H-4"),δ _H 3.87(1H,s, H-5"),δ _H 4.45,4.35(1H,dd,J=11.4,4.8, H-6")。¹³C NMR(C₅D₅N,125MHz)：δ _c 70.1(C-1),δ _c 54.5(C-2),δ _c 72.3(C-3),δ _c 132.3(C-4),δ _c 131.8(C-5),δ _c 28.3(C-6),δ _c 33.0(C-7),δ _c 131.8(C-8),δ _c 124.1(C-9),δ _c 39.9(C-10),δ _c 29.5~32.6(C-11~C-17),δ _c 14.1(C-18),δ _c 16.1(C-19),δ _c 175.6(C-1'),δ _c 71.2(C-2'),δ _c 35.6(C-3'),δ _c 25.9(C-4'),δ _c 29.5~32.1(C-5'~C-15'),δ _c 14.7(C-16'),δ _c 105.6(C-1"),δ _c 75.0(C-2"),δ _c 78.4(C-3"),δ _c 71.5(C-4"),δ _c 78.5(C-5"),δ _c 62.6(C-6")。

化合物4(腺苷)：

化合物4外觀為白色粉狀物質。¹H NMR(C₅D₅N,500MHz)：δ _H 6.99(NH ₂),δ _H 8.58(1H,H-2),δ _H 8.35(1H,H-8),δ _H 6.68(1H,H-1'),δ _H 5.49(1H,H-2'),δ _H 5.05(1H,H-3'),δ _H 4.76(1H,H-4'),δ _H 4.16(1H,H-5a'),δ _H 4.17(1H,H-5b')。¹³C NMR(C₅D₅N,125MHz)：δ _c 152.9(C-2),δ _c 156.1(C-4),δ _c 121.7(C-5),δ _c 140.2(C-6),δ _c 140.3(C-8),δ _c 90.8(C-1'),δ _c 63.1(C-2'),δ _c 61.3(C-3'),δ _c 87.4(C-4'),δ _c 43.9(C-5')。

化合物5(蟲草素)：

化合物5外觀為白色粉狀物質。¹H NMR(C₅D₅N,500MHz)： δ _H 6.97(NH ₂),δ _H 8.66(1H,H-2),δ _H 8.32(1H,H-8),δ _H 6.59(1H,H-1'),δ _H 3.61(1H,H-2'),δ _H 2.76(1H,H-3'),δ _H 4.31(1H,H-4'),δ _H 3.95(1H,H-5a'),δ _H 3.97(1H,H-5b')。¹³C NMR(C₅D₅N,125MHz)：δ _c 153.3(C-2),δ _c 149.6(C-4),δ _c 121.0(C-5),δ _c 157.4(C-6),δ _c 139.7(C-8),δ _c 93.1(C-1'),δ _c 75.9(C-2'),δ _c 34.5(C-3'),δ _c 82.2(C-4'),δ _c 63.5(C-5')。

化合物6(麥角固醇過氧化物)：

化合物6外觀為白色粉狀物質。¹H NMR(C₅D₅N,500MHz)：δ _H 1.56,1.03(2H,H-1),δ _H 1.72,1.47(2H,H-2),δ _H 3.17(1H,H-3),δ _H 1.87,1.62(2H,H-4),δ _H 6.50(1H,H-6),δ _H 6.21(2H,H-7),δ _H 1.52(1H,H-9),δ _H 1.52,1.27(2H,H-11),δ _H 1.56,1.31(2H,H-12),δ _H 1.04(1H,H-14),δ _H 1.55,1.30(2H,H-15),δ _H 5.48(1H,H-16),δ _H 1.51(1H,H-17),δ _H 1.04(1H,H-18),δ _H 1.04(1H,H-19),δ _H 2.23(1H,H-20),δ _H 1.11(1H,H-21),δ _H 5.48(1H,H-22),δ _H 1.60,1.35(2H,H-23),δ _H 2.38(1H,H-24),δ _H 1.86(1H,H-25),δ _H 0.91(3H,H-26),δ _H 0.91(3H,H-27),δ _H 1.11(3H,H-28),¹³C NMR(C₅D₅N,125MHz)：δ _c 34.8(C-1),δ _c 31.5(C-2),δ _c 66.9(C-3),δ _c 37.0(C-4),δ _c 88.8(C-5),δ _c 135.4(C-6),δ _c 132.4(C-7),δ _c 85.3(C-8),δ _c 49.2(C-9),δ _c 37.5(C-10),δ _c 21.0(C-11),δ _c 35.1(C-12),δ _c 43.5(C-13),δ _c 46.5(C-14),δ _c 29.2(C-15),δ _c 26.8(C-16),δ _c 52.0(C-17),δ _c 18.5(C-18),δ _c 17.5(C-19),δ _c 40.5(C-20),δ _c 20.3(C-21),δ _c 135.2(C-22),δ _c 132.5(C-23),δ _c 42.9(C-24),δ _c 33.5(C-25),δ _c 20.8(C-26),δ _c 20.5(C-27),δ _c 19.0(C-28)。

化合物7(酵母固醇)：

化合物7外觀為白色粉狀物質。¹H NMR(C₅D₅N,500MHz)：δ _H 1.56,1.31(2H,H-1),δ _H 1.72,1.46(2H,H-2),δ _H 3.02(1H,H-3),δ _H 1.83,1.58(2H,H-4),δ _H 3.76(1H,H-6),δ _H 5.37(2H,H-7),δ _H 1.93(1H,H-9),δ _H 1.42,1.17(2H,H-11),δ _H 1.34,1.09(2H,H-12),δ _H 2.14(1H,H-14),δ _H 1.64,1.39(2H,H-15),δ _H 1.60,1.35(1H,H-16),δ _H 1.51(1H,H-17),δ _H 0.63(1H,H-18),δ _H 1.04(1H,H-19),δ _H 2.33(1H,H-20),δ _H 1.11(1H,H-21),δ _H 5.48(1H,H-22),δ _H 5.48(2H,H-23),δ _H 2.33(1H,H-24),δ _H 1.86(1H,H-25),δ _H 0.91(3H,d,H-26),δ _H 0.91(3H,d,H-27),δ _H 1.11(3H,H-28)。¹³C NMR(C₅D₅N,125MHz)：δ _c 31.8(C-1),δ _c 31.5(C-2),δ _c 67.4(C-3),δ _c 40.9(C-4),δ _c 78.8(C-5),δ _c 74.0(C-6),δ _c 120.4(C-7),δ _c 141.5(C-8),δ _c 43.6(C-9),δ _c 38.1(C-10),δ _c 21.6(C-11),δ _c 39.9(C-12),δ _c 42.1(C-13),δ _c 55.2(C-14),δ _c 23.8(C-15),δ _c 27.5(C-16),δ _c 56.5(C-17),δ _c 12.5(C-18),δ _c 17.0(C-19),δ _c 40.5(C-20),δ _c 21.3(C-21),δ _c 135.7(C-22),δ _c 132.1(C-23),δ _c 42.9(C-24),δ _c 33.1(C-25),δ _c 20.8(C-26),δ _c 20.5(C-27),δ _c 17.8(C-28)。

化合物8(麥角固醇)：

化合物8外觀為白色粉狀物質。¹H NMR(C₅D₅N,500MHz)：δ _H 1.38,1.13(2H,H-1),δ _H 1.56,1.31(2H,H-2),δ _H 3.25(1H,H-3),δ _H 2.23,1.98(2H,H-4),δ _H 5.68(1H,H-6),δ _H 5.68(2H,H-7),δ _H 2.12(1H,H-9),δ _H 1.42,1.17(2H,H-11),δ _H 1.34,1.09(2H,H-12),δ _H 2.17(1H,H-14),δ _H 1.65,1.40(2H,H-15),δ _H 1.60,1.35(1H,H-16),δ _H 1.49(1H,H-17),δ _H 1.03(1H,H-18),δ _H 1.30(1H,H-19),δ _H 2.33(1H,H-20),δ _H 1.12(1H,H-21),δ _H 5.57(1H,H-22),δ _H 5.38(2H,H-23),δ _H 2.35(1H,H-24),δ _H 1.84(1H,H-25),δ _H 0.87(3H,d,H-26),δ _H 0.89(3H,d,H-27),δ _H 1.13(3H,H-28)。¹³C NMR(C₅D₅N,125MHz)：δ _c 37.9(C-1),δ _c 31.8(C-2),δ _c 71.7(C-3),δ _c 41.9(C-4),δ _c 139.8(C-5),δ _c 119.8(C-6),δ _c 116.4(C-7),δ _c 141.5(C-8),δ _c 46.3(C-9),δ _c 37.3(C-10),δ _c 21.3(C-11),δ _c 39.6(C-12),δ _c 43.6(C-13),δ _c 54.2(C-14),δ _c 23.8(C-15),δ _c 26.5(C-16),δ _c 56.3(C-17),δ _c 14.3(C-18),δ _c 16.3(C-19),δ _c 40.2(C-20),δ _c 20.3(C-21),δ _c 135.2(C-22),δ _c 132.5(C-23),δ _c 42.9(C-24),δ _c 33.0(C-25),δ _c 20.8(C-26),δ _c 20.5(C-27),δ _c 17.8(C-28)。

4.一氧化氮/亞硝酸鹽之測定：

一氧化氮(NO)的產生是以測量培養基及血清中亞硝酸鹽含量而間接地估計(J.Nat.Prod.2012,75,870-875，其併入本文做為參考)。將所有純化合物1~8(0、1、5及10μM)與細胞預先培養1小時，接著在37℃以100ng/ml LPS共同處理24小時。之後，將每一收集到的培養液(100μl)與相同體積的格利士試劑(Griess reagent，含1%胺苯磺醯胺 (sulfanilamide)、0.1%萘乙二胺二鹽酸鹽(naphthyl ethylenediamine dihydrochloride)及5%磷酸)混合，並在室溫培養10分鐘。以Micro-Reader(Molecular Devices,Sunnyvale,CA,USA)測量在540nm的混合物吸光值。以蒸餾水連續稀釋均質化的組織樣本4次，且藉由加入1/20倍體積的硫酸鋅(300mg/ml)到最終濃度15mg/ml而進行去蛋白質作用。在室溫下以10000g離心5分鐘後，將上清液(100μl)加入微定量板，接著加入格利士試劑(100μl)。在室溫下呈色10分鐘後，以Micro-Reader測量吸光值。使用硝酸鈉產生標準曲線，以540mm測量硝酸鹽濃度。

5.轉染作用及報導者基因試驗法：

RAW264.7巨噬細胞(小鼠巨噬細胞株，獲自美國菌種中心ATCC)培養於37℃、5%CO₂濕潤環境下、添加10%胎牛血清(FBS)、盤尼西林(100units/ml)、鏈黴素(100units/ml)的DMEM。將0.8mg螢光素酶質體及0.4mg β-半乳糖苷酶表現載體共同轉染至RAW264.7細胞。RAW264.7細胞在12孔盤生長至80%滿，並在第二天以Lipofectamine 2000(LF2000；Invitrogen)進行轉染作用。將DNA及LF2000預先混合20分鐘，再加至細胞中。轉染作用24小時後將細胞與指示試劑一同培養。培養24小時後，移除培養基，以冷PBS清洗細胞一次。為了製備溶菌產物(lysate)，將100μl的報導者裂解緩衝液(reporter lysis buffer,Promega,Madison,WI,USA)加至每一孔洞，從細胞培養盤刮下細胞。以13,000rpm離心2分鐘後收集上清液。將含有等量蛋白質(20~30mg)的細胞溶菌產物部分(20μl)加入不透明黑色96孔洞盤的孔洞中。加入等體積的螢光素酶受質至所有樣本中，在微盤光度計測量冷光。以共同轉染的β-半乳糖苷酶表a現載體所偵測的轉染效率來標準化螢光素酶活性數值。

6.染色質免疫沈澱試驗：

染色質免疫沈澱分析如J.Immunol.2009,183,2785-2792.所揭露內容來進行，其併入本文做為參考。以anti-p65來免疫沈澱DNA，並以酚-氯仿純化及萃取DNA。以PCR擴增經純化之DNA片狀沈澱物。PCR產物再以1.5%洋菜糖膠體電泳解析，並在紫外光下觀察。以SEQ ID NO.1的引子(COX-2啟動子前向引子，5’→3’為：59-CAAGACATGC CAAAGTGCTG-39)及SEQ ID NO.2的引子(COX-2啟動子反向引子，5’→3’為：59-TTGAGACTCA TGGGAAAATC C-39)擴增含有NF-κB結合位的人類COX-2啟動子區域。以SEQ ID NO.3的引子(iNOS啟動子前向引子，5’→3’為59-GAACTGACCT GACTTACATA-39)及SEQ ID NO.4的引子(iNOS啟動子反向引子，5’→3為：59-TTGAGACTCA TGGGAAAATC C-39)擴增含有NF-κB結合位的人類iNOS啟動子區域。

統計：結果以平均±標準差(SD)表示。每一實驗的比較是以非成對學生t試驗(unpaired Student’s t-test)進行，且p值小於0.05被認為具有統計上的顯著性。

7.純化合物產生一氧化氮(NO)的效果：

為了評估化合物1至8對於在巨噬細胞RAW264.7產生NO的影響，將LPS刺激RAW264.7細胞，且使用格利士反應來分析NO的產生。受刺激的RAW264.7細胞將過量的亞硝酸鹽釋放至培養基中，實驗組為在24小時內每公克蛋白質為104.9±22.5nmol亞硝酸鹽，未受刺激的對照組則為每公克蛋白質為19.4±4.5nmol亞硝酸鹽。將不同濃度(1.0、3.0及10.0μM)的所有化合物1至8評估它們對於經LPS刺激的RAW264.7細胞的NO產生的抑制效果。結果顯示，所有化合物1至8以藥效與劑量(Dose-Dependent)成正相關，降低了經LPS刺激的RAW264.7細胞的NO產生(第5圖)，其中化合物2及4對NO產生的IC₅₀分別為8.4及8.7μg/mL。其他化合物的IC₅₀大於10μg/mL。再者，化合物2從LPS刺激的RAW264.7細胞的NO產生顯示出顯著的抑制效果(第5圖)。基於神經醯胺化合物1至3的試驗結果，化合物1至3被選擇用於研究抗發炎機制。

8.神經醯胺在iNOS及COX-2蛋白質表現的效果：

LPS刺激RAW264.7巨噬細胞將誘導促進發炎的iNOS及COX-2蛋白質的累積，導致增加的NO產生。結果顯示，化合物1至3在iNOS及COX-2蛋白質表現上具有抑制效果，化合物2則是有最高的抑制效果(第6圖)。

9.化合物2抑制巨噬細胞的NF-κB活化磷酸化：

發炎細胞激素及發炎反應的調節是在轉錄時受到NF-κB轉錄因子的控制。p65(NF-κB的次單元)的轉錄可調控NF-κB的活化作用。此轉錄因子透過結合到DNA參與了與發炎相關之基因的調節，以誘導發炎調節因子。在本發明中，LPS刺激作用增加了p65磷酸化作用，而化合物2以劑量依賴方式抑制p65磷酸化作用(第7圖)。這些結果證實，化合物2經由NF-κB依賴性機制抑制一部分的iNOS及COX-2表現。

NF-κB在調節iNOS表現及COX-2扮演重要角色。NF-κB活化作用更可由分析NF-κB螢光素酶活性來評估。化合物2以藥效與劑量(Dose-Dependent)成正相關的方式抑制了LPS刺激的NF-κB活化作用(第8圖(A))。接著，再研究在LPS刺激後，p65是否結合至iNOS及COX-2啟動子上的NF-κB element。在試管實驗中，由染色質免疫沈澱試驗確定p65結合至iNOS及COX-2啟動子。在試管試驗中，在LPS刺激後，p65結合至iNOS及COX-2啟動子的NF-κB element。化合物2以劑量依賴方式減弱了p65藉由LPS而結合至NF-κB element的能力(第8圖(B))。

10.具抗發炎與抑制肝癌細胞生長的蛹蟲草飲品：

由活性導引的實驗設計，確認90%甲醇溶液層為蛹蟲草的活性層，進一步的二級代謝物分離純化、化學結構證明、藥理活性機轉探討，確認神經醯胺衍生物(化合物1至3)、核苷(化合物4及5)、固醇類(化合物6至8)組合物為蛹蟲草抗發炎與抑制肝癌細胞生長的活性來源。根據化合物1至3的COX-2及iNOS抗發炎實驗結果，在LCA的不飽和程度增加以及在LCB的取代基團將導致蛋白質表現量降低。再者，化合物2 藉由阻斷NO產生以及NF-κB(p65)訊息路徑而改善了iNOS及COX-2表現。相對於化合物1至3，腺苷(化合物4)、蟲草素(化合物5)及固醇(化合物6至8)的抗發炎活性雖然較弱，但蟲草素可抑制LPS活化的巨噬細胞的Akt、p38、TNF-α及IκBα，並透過抑制NO產生及促進發炎的細胞激素(例如IL1β、IL6)而抑制RAW264.7細胞中iNOS及COX-2表現。麥角固醇過氧化物(化合物6)可在LPS刺激的THP-1細胞抑制MyD88及VCAM-1表現，以及促進發炎介質(IL-1β、IL-6及TNF-α細胞激素)的產生。麥角固醇(化合物8)能抑制由LPS引起的BV2小神經膠質細胞中的NO產生。

具有化合物1至8組合物的萃取物，除了保有蛹蟲草適合入菜、藥膳的風味外，在嗅覺、味覺上更有一種蛹蟲草風味經濃縮後的獨特滋味，適合開發為飲食添加物、飲品等保健食品或藥劑。

11.蛹蟲草飲品容器：

請參閱第9圖，其為本發明的蛹蟲草飲品容器的側視圖。在第9圖中，蛹蟲草飲品容器100包括蓋體110、瓶口部120及瓶體部130。瓶口部120與蓋體110結合，瓶體部130與瓶口部120一體成形且具有容置空間140。容置空間含有蛹蟲草飲品150。

請繼續參閱第9圖，蛹蟲草飲品容器100的瓶體部130上可貼附材質為塑膠、玻璃紙或紙的標籤160。瓶體部130的曲線設計也有利於使用者方便抓取與持握。而瓶口部120及瓶體部130之材質為塑膠或玻璃，其中塑膠可為半透明、不透明塑膠，玻璃為透明玻璃、半透明玻璃或不透明玻璃。進一步而言，玻璃之顏色可為褐色或綠色。

請繼續參閱第9圖，蓋體110的第一螺紋與瓶口部120的內徑的第二螺紋相互齧合，使蛹蟲草飲品容器100內部呈現密封狀態。儲存於蛹蟲草飲品容器100內的蛹蟲草飲品150是來自蛹蟲草，且包括神經醯胺、腺苷、蟲草素、麥角固醇過氧化物、酵母固醇及麥角固醇。

其中，神經醯胺為如前述式I所示的神經醯胺，R為-CH₃、-H或-CH₃。當R為-CH₃且△^3’,4’時，式I的神經醯胺為cordycerebroside A，當R為-H時，式I的神經醯胺為大豆神經醯胺I(soyacerebroside I)，當R為-CH₃時，式I的神經醯胺為葡萄糖神經醯胺(glucocerebroside)。

請參閱第10圖，其為本發明的蛹蟲草飲品容器的仰視圖。在第10圖中，蛹蟲草飲品容器100的圓形底部被設計為具有複數個凸狀半月形170圍繞圓形底部的邊緣排成一圈的結構，此有助於蛹蟲草飲品容器100的存放穩定性，不易因碰撞、地震而傾倒。

綜合上述，本發明的蛹蟲草飲品容器100中的一體成形之瓶體部130與瓶口部120可使得容置空間140能儲存包括神經醯胺、腺苷、蟲草素、麥角固醇過氧化物、酵母固醇及麥角固醇而因此具抗發炎與抑制肝癌細胞生長的蛹蟲草飲品150，且蛹蟲草飲品容器100底部的凸狀半月形170有助於蛹蟲草飲品容器100的存放穩定性。

本發明實屬難能的創新發明，深具產業價值，援依法提出申請。此外，本發明可以由所屬技術領域中具有通常知識者做任何修改，但不脫離如所附申請專利範圍所要保護的範圍。

<110> 錢佑

<120> 用於抗發炎的醫藥組合物及其製備方法

<160> 4

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> COX-2啟動子前向引子

<300>

<400> 1

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> COX-2啟動子反向引子

<300>

<400> 1

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> iNOS啟動子前向引子

<300>

<400> 1

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> iNOS啟動子反向引子

<300>

<400> 1

10‧‧‧方法

12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40‧‧‧方塊

Claims

一種用於抗發炎的醫藥組合物，包括如下所示的神經醯胺：
如申請專利範圍第1項所述的醫藥組合物，更包括大豆神經醯胺I(soyacerebroside I)及葡萄糖神經醯胺(glucocerebroside)至少其中之一。
如申請專利範圍第1項所述的醫藥組合物，更包括一化合物，該化合物選自腺苷、蟲草素、麥角固醇過氧化物、酵母固醇、麥角固醇及其組合所組成的群組其中之一。
如申請專利範圍第1項所述的醫藥組合物，其中該神經醯胺是由蛹蟲草(Cordyceps militaris)分離。
一種製備用於抗發炎的醫藥組合物的方法，該醫藥組合物包括如下所示的神經醯胺：該方法包括步驟：(a)將一蛹蟲草(Cordyceps militaris)子實體醇類萃取物濃縮，獲得一蛹蟲草子實體粗萃取物；(b)以水及乙酸乙酯對該蛹蟲草子實體粗萃取物進行分配萃取，獲得一乙酸乙酯層及一水層；(c)以正己烷及甲醇溶液對該乙酸乙酯層進行分配萃取，獲得一正己烷層及一甲醇溶液層；以及(d)層析該甲醇溶液層，獲得該醫藥組合物。
如申請專利範圍第5項所述的方法，其中該蛹蟲草子實體醇類萃取物是將一蛹蟲草子實體以超音波震盪及以一醇類萃取而得。
如申請專利範圍第6項所述的方法，其中該醇類為甲醇或乙醇其中之一。
一種用於抗發炎、抑制肝癌細胞生長的蛹蟲草萃取物的製備方法，包括：(a)將一蛹蟲草(Cordyceps militaris)子實體乙醇萃取物濃縮，獲得一蛹蟲草子實體粗萃取物；(b)以水及乙酸乙酯對該蛹蟲草子實體粗萃取物進行分配萃取，獲得一乙酸乙酯層及一水層；以及(c)以正己烷及甲醇溶液對該乙酸乙酯層進行分配萃取，獲得一正己烷層及一甲醇溶液層，該甲醇溶液層為該蛹蟲草萃取物，其中該蛹蟲草萃取物包括如下所示的神經醯胺：
如申請專利範圍第8項所述的製備方法，其中該蛹蟲草萃取物更包括大豆神經醯胺I、葡萄糖神經醯胺、腺苷、蟲草素、麥角固醇過氧化物、酵母固醇及麥角固醇。