CN113087756B - 具有肿瘤细胞毒活性的三萜类化合物及其制备方法以及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供的具有肿瘤细胞毒活性的三萜类化合物，具有式1、式2或式3所示结构。本发明公开了从喜热灵芝子实体中首次发现的三种新灵芝醇化合物(ganodecalone G、D、E)。化合物ganodecalone G(式1)、ganodecalone D(式2)、ganodecalone E(式3)对人体各类癌细胞具有显著的肿瘤细胞毒活性，其中式1或式2化合物对裸鼠体内肿瘤细胞生长具有一定的抑制活性且无毒副作用，具有开发抗癌药物的应用前景。

Description

具有肿瘤细胞毒活性的三萜类化合物及其制备方法以及应用
技术领域
本发明属于天然药物技术领域，具体涉及三种具有肿瘤细胞毒活性的三萜化合物及其制备方法以及应用。
背景技术
癌症是目前严重危害人类健康的多发病和常见病。据世界卫生组织统计，截止2020年确诊的癌症患者数量达到1930万人，而死于全球确诊的人数增加到1000万。而中国每年新发癌症病例超过350万，死亡病例超过200万。并且，人口老龄化、吸烟酗酒、缺少运动、不合理的膳食习惯、压力、心里紧张等因素可能导致全球癌症人数猛增，已严重危害人类生命和生活质量，因此，寻找有效的抗癌药物是世界医学重要的研究课题。在中国癌症发病率日益提高的背景下，我国具有自主知识产权的抗癌药研发速度趋于滞后，而传统西药化学疗法会进一步破坏骨髓造血功能，导致癌细胞失去免疫控制，加速生长、扩散。传统化疗的巨大毒副作用会造成全身毒性反应，很多病人并不是死于癌症本身，而是死于癌症治疗过程中的毒性反应和免疫功能全面受损。与西药相比，中药具有更高的安全性，中药巨大的资源宝库更是为挖掘抗肿瘤活性分子提供了有利条件，针对现有抗肿瘤药物毒副作用较大且对免疫功能有一定损伤的缺陷，开发一种高效、安全的中药抗肿瘤活性分子对人类健康具有显著的社会和经济效益前景
灵芝是一种我国传统的名贵滋补中药材，受到国内外的普遍关注。对于其药用价值的研究在我国有着悠久的历史。灵芝中含有多糖、三萜、杂萜、生物碱、核苷、甾醇类等化学成分。而多糖和三萜化合物是灵芝的主要有效成分，具有抗肿瘤、抗炎、抗糖尿病、降血糖等重要生物活性。喜热灵芝(Ganoderma calidophilum)为灵芝科灵芝属药用真菌，称为“灵芝王”，因其常生长于竹林下，故海南民间又称之为“竹灵芝”。主产于中国海南，在海南省生物蕴藏量较大，作为一种重要黎药资源在民间具有防癌功效。其在民间具有防癌护肝等多种药用功效，海南黎族人民将其泡酒或煮水口服用于预防胃癌和治疗胃痛。因此，进一步阐明喜热灵芝抗肿瘤作用的药效物质基础，充分挖掘其抗肿瘤活性分子的药理作用机制，对于开发我国自主知识产权抗癌药物具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供具有肿瘤细胞毒活性的三萜类化合物及其制备方法以及应用，本发明提供的三萜类化合物经过生物活性评价发现此类化合物具有良好的肿瘤细胞毒活性，可用于开发抗癌药物。
本发明提供了三种具有肿瘤细胞毒活性的三萜类化合物，具有式1、式2或式3所示结构：
Figure BDA0003012202920000021
本发明还提供了一种上述具有肿瘤细胞毒活性的三萜类化合物的制备方法，包括以下步骤：
A)将干燥粉碎的喜热灵芝子实体的提取物经正相硅胶柱色谱分离，得到组分Fr.1～Fr.11；
B)分离具有式1和式2所示结构的化合物：
B1)将Fr.5经反相ODS色谱柱层析，得到Fr.5-1～Fr.5-6；
B2)取Fr.5-3，经半制备高效液相色谱进行纯化，得到式1所示化合物ganodecalone G；
B3)取Fr.5-4，经半制备高效液相色谱进行纯化，得到式2所示化合物ganodecalone D；
C)分离具有式3所示结构的化合物：
C1)取Fr.6，经反相ODS色谱柱层析，得到Fr.6-1～Fr.6-5；
C2)取Fr.6-5，经半制备高效液相色谱进行纯化，得到式3所示化合物ganodecalone E。
优选的，所述喜热灵芝子实体的提取物按照如下方法进行制备：
将粉碎干燥的喜热灵芝子实体经乙醇加热回流提取，得到乙醇提取液；
将所述乙醇提取液经减压浓缩、加水混悬，然后用乙酸乙酯萃取，萃取液经蒸馏浓缩得到乙酸乙酯总浸膏。
优选的，所述正相硅胶柱色谱分离的洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯，所述石油醚和乙酸乙酯的体积比为10：1～1：2。
优选的，步骤B1)中，反相ODS色谱柱层析的洗脱剂为甲醇-水，所述甲醇和水的体积比为30:1、50:1、80:1、100:1，进行梯度洗脱，每个梯度比洗脱30分钟。
优选的，步骤B2)和步骤B3)中，半制备高效液相色谱的流动相为乙腈和水的混合溶剂。
优选的，步骤C1)中，反相ODS色谱柱层析的洗脱剂为甲醇-水，所述甲醇和水的体积比为20:1、50:1、80:1、100:1，进行梯度洗脱，每个梯度比洗脱30分钟。
优选的，步骤C2)中，半制备高效液相色谱的流动相为乙腈和水的混合溶剂。
本发明还提供了上述具有肿瘤细胞毒活性的三萜化合物在制备用于在抗癌药物中的应用。
优选的，所述癌症为胃癌、肝癌、宫颈癌或白血病。
与现有技术相比，本发明提供的具有肿瘤细胞毒活性的三萜类化合物，具有式1、式2或式3所示结构。本发明公开了从喜热灵芝子实体中首次发现的三种新灵芝醇化合物(ganodecalone G、D、E)。化合物ganodecalone G(式1)、ganodecalone D(式2)、ganodecalone E(式3)对人体各类癌细胞具有显著的肿瘤细胞毒活性，其中式1或式2化合物对裸鼠体内肿瘤细胞生长具有一定的抑制活性且无毒副作用，具有开发抗癌药物的应用前景。
附图说明
图1为ganodecalone G的1H NMR谱图；
图2为ganodecalone G的13CNMR谱图；
图3为ganodecalone G的DEPT谱图；
图4为ganodecalone G的HSQC谱图；
图5为ganodecalone G的HMBC谱图；
图6为ganodecalone G的1H-1H COSY谱图；
图7为ganodecalone G的ROESY谱图；
图8为ganodecalone D的1H NMR谱图；
图9为ganodecalone D的13CNMR谱图；
图10为ganodecalone D的DEPT谱图；
图11为ganodecalone D的HSQC谱图；
图12为ganodecalone D的HMBC谱图；
图13为ganodecalone D的1H-1H COSY谱图；
图14为ganodecalone D的ROESY谱图；
图15为ganodecalone E的1H NMR；
图16为ganodecalone E的13CNMR谱图；
图17为ganodecalone E的DEPT谱图；
图18为ganodecalone E的HSQC谱图；
图19为ganodecalone E的HMBC谱图；
图20为ganodecalone E的1H-1H COSY谱图；
图21为ganodecalone E的ROESY谱图；
图22为给药后裸鼠体重的曲线图；
图23为给药后裸鼠肿瘤重量的对比图；
图24为给药后裸鼠肝脏重量的对比图；
图25为给药后裸鼠脾重量的对比图。
具体实施方式
本发明提供了具有肿瘤细胞毒活性的三萜类化合物，具有式1、式2或式3所示结构：
Figure BDA0003012202920000041
在本发明中，所述具有肿瘤细胞毒活性的三萜类化合物的制备方法，包括以下步骤：
A)将干燥粉碎的喜热灵芝子实体的提取物经正相硅胶柱色谱分离，得到组分Fr.1～Fr.11；
B)分离具有式1和式2所示结构的化合物：
B1)将Fr.5经反相ODS色谱柱层析，得到Fr.5-1～Fr.5-6；
B2)取Fr.5-3，经半制备高效液相色谱进行纯化，得到式1所示化合物ganodecalone G；
B3)取Fr.5-4，经半制备高效液相色谱进行纯化，得到式2所示化合物ganodecalone D；
C)分离具有式3所示结构的化合物：
C1)取Fr.6，经反相ODS色谱柱层析，得到Fr.6-1～Fr.6-5；
C2)取Fr.6-5，经半制备高效液相色谱进行纯化，得到式3所示化合物ganodecalone E。
在本发明中，以喜热灵芝子实体为制备原料，其中，喜热灵芝(Ganodermacalidophilum)为灵芝科(Ganodermataceae)灵芝属(Ganoderma)药用真菌。灵芝属真菌的化学成分主要包括多糖、三萜类、生物碱、甾醇类化合物、多肽核苷类、氨基酸及微量元素等成分。以三萜类和多糖为主要活性成分，具有抗肿瘤、保肝、抗HIV-4及HIV-4蛋白酶活性、抗组织胺释放、抑制血管紧张素和抗氧化等作用。近年从灵芝属中发现的灵芝三萜化合物是灵芝中一类重要的活性分子，具有抗肿瘤、神经保护和护肝等生物活性。
本发明对喜热灵芝子实体的提取物的提取方法并没有特殊限制，benign与技术人员公知的提取方法即可。具体的，可以按照如下方法进行提取：
本发明将喜热灵芝子实体干燥并粉碎，然后经乙醇加热回流提取，得到乙醇提取液。其中，所述乙醇优选为体积浓度95％的乙醇。
接着，乙醇提取液经减压浓缩、加水混悬，然后用乙酸乙酯萃取，萃取液经蒸馏浓缩得到乙酸乙酯总浸膏，即喜热灵芝子实体的提取物。
具体的，乙醇提取液经减压浓缩、加水混悬，然后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别得到三种的萃取液；取乙酸乙酯萃取液，经蒸馏浓缩得到乙酸乙酯浸膏。
然后将喜热灵芝子实体的提取物经正相硅胶柱色谱分离，得到组分Fr.1～Fr.11。
其中，正相硅胶柱色谱分离的洗脱剂优选为石油醚/乙酸乙酯，所述石油醚和乙酸乙酯的体积比为10：1～1：2，进行梯度洗脱。
在本发明的一些具体实施方式中，用石油醚/乙酸乙酯体系(V:V＝10：1，8：1，6：1，4：1，2：1，1：1，1：2)依次进行梯度洗脱，分段收集，每部分进行薄层层析色谱检测后合并，得到11个组分Fr.1～Fr.11。
然后取Fr.5和Fr.6分别进行进一步的分离。
其中，通过Fr.5可以分离得到具有式1和式2所示结构的化合物，具体步骤为：
将Fr.5经反相ODS色谱柱层析，得到Fr.5-1～Fr.5-6；其中，反相C18柱层析的洗脱剂优选为甲醇/水，所述甲醇和水的体积比为30:1、50:1、80:1、100:1，进行梯度洗脱，每个梯度比洗脱30分钟。
得到Fr.5-1～Fr.5-6后，取Fr.5-3，经半制备高效液相色谱进行纯化，得到式1所示化合物，本发明记为ganodecalone G。
所述半制备高效液相色谱的流动相优选为乙腈和水的混合溶剂。其中，所述流动相进一步优选为V(乙腈):V(水)＝60:40。所述半制备高效液相色谱流动相的流速优选为4mL·min-1。
取Fr.5-4，经半制备高效液相纯化，得到式2所示化合物，本发明记为ganodecalone D。
所述半制备高效液相色谱的流动相优选为乙腈和水的混合溶剂。所述流动相进一步优选为V(乙腈):V(水)＝55:45。所述半制备高效液相色谱流动相的流速优选为4mL·min-1。
其中，通过Fr.6可以分离得到具有式3所示结构的化合物，具体步骤为：
取Fr.6经反相ODS色谱柱层析，得到Fr.6-1～Fr.6-5。
其中，反相C18柱层析的洗脱剂优选为甲醇/水，所述甲醇和水的体积比为20:1、50:1、80:1、100:1，进行梯度洗脱，每个梯度比洗脱30分钟。
得到Fr.6-1～Fr.6-5后，取Fr.6-5，经半制备高效液相纯化，得到式3所示化合物，本发明记为ganodecalone E。
所述半制备高效液相色谱的流动相优选为乙腈和水的混合溶剂。所述流动相进一步优选为V(乙腈):V(水)＝55:45。所述半制备高效液相色谱流动相的流速优选为4mL·min-1。
本发明还提供了一种上述具有肿瘤细胞毒活性的三萜化合物在制备用于在抗癌药物中的应用。
其中，所述药物包括上述具有肿瘤细胞毒活性的三萜化合物以及药学上可以接受的辅料。本发明对所述辅料没有特殊限定，可以为本领域技术人员熟知的适用辅料。
在本发明中，上述具有肿瘤细胞毒活性的化合物或上述药物还可以与其他治疗癌症的药物联用。
在本发明中，所述药物用于治疗的癌症可以为胃癌、肝癌、宫颈癌或白血病。
本发明提供了三种具有肿瘤肿瘤细胞毒活性的化合物，具有式1或式2或式3所示结构。本发明公开了从喜热灵芝中首次发现的三种灵芝三萜新颖化合物。经过生物活性评价发现此类化合物具有显著的肿瘤肿瘤细胞毒活性，其中式1或式2化合物对裸鼠体内肿瘤细胞生长具有一定的抑制活性且无毒副作用，具有开发抗癌药物的应用前景。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的三种具有肿瘤细胞毒活性的三萜化合物及其制备方法以及应用进行说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
实施例1
三萜化合物ganodecalone G、ganodecalone D和ganodecalone E的分离纯化
喜热灵芝粉碎干燥子实体样品(6.5kg)，用95％的乙醇加热回流提取3次，提取液经过减压浓缩合并后得到乙醇粗浸膏(250.0g)。喜热灵芝的乙醇粗浸膏经正相硅胶柱色谱分离，用石油醚-乙酸乙酯体系(V：V＝10：1～1：2，具体为10:1，8：1，6：1，4：1，2：1，1：1，1：2)进行梯度的洗脱，分段收集，用薄层层析色谱检测后合并，获得了11个组分Fr.1～Fr.11。
Fr.5(2.4g)经反相ODS色谱柱，采用甲醇/水洗脱剂(体积比为30:1、50:1、80:1、100:1)进行梯度洗脱，每个梯度比洗脱30分钟。通过高效液相分析且合并相同部分后，得到6个组分Fr.5-1～Fr.5-6。取Fr.5-3(500.0mg)经半制备高效液相，流动相为乙腈-水(V：V＝60：40)体系，流速为4ml/min，分离纯化得到化合物ganodecalone G(5.0mg)。取Fr.5-4(700.0mg)经半制备高效液相，流动相为乙腈-水体系(V：V＝55：45)，流速为4ml/min，分离纯化得到化合物ganodecalone D(5.0mg)。
Fr.6(2.0g)经反相ODS色谱柱，用20％～100％甲醇进行梯度洗脱，通过高效液相分析后合并相同部分，得到6个组分Fr.6-1～Fr.6-5。取Fr.6-5(570.0mg)经半制备高效液相，流动相为乙腈-水体系(V：V＝55：45)，流速为4ml/min，分离纯化得到化合物ganodecalone E(4.0mg)。
实施例2
化合物ganodecalone G、D、E的结构鉴定
对所分离得到的化合物ganodecalone G、D、E分别进行核磁共振、红外、质谱检测等多种现代波谱技术并结合化学方法鉴定了它们的结构。经鉴定，化合物ganodecalone G、D、E为新的灵芝三萜类化合物。
ganodecalone G的结构式如下：
Figure BDA0003012202920000081
ganodecalone D的结构式如下：
Figure BDA0003012202920000082
ganodecalone E的结构式如下：
Figure BDA0003012202920000083
化合物ganodecalone G为白色粉末，HR-ESI-MS在m/z 493.3280(理论值为493.3288)处给出[M+Na]+峰，提示分子式为C30H46O4，不饱和度8。13C NMR，DEPT和HSQC谱图显示了30个碳信号(表1)，包括2个酮羰基(δC 216.7，200.3)，1个sp3含氧次甲基(δC 69.4)，1个sp3含氧亚甲基(δC 69.0)，3个双键季碳(δC 160.8，141.3，126.5)，1个双键次甲基(δC134.7)，8个sp3亚甲基，3个sp3次甲基，7个甲基和4个sp3季碳。以上的数据与文献中的ganoderone A的核磁数据非常相似，主要区别是ganoderone A中C-7位上的酮羰基(δC198.3)信号在ganodecalone G中被含氧次甲基(δC/H 69.4/4.50)信号取代，这表明ganoderone A(Niedermeyer,T.H.J.,Lindequist,U.,Mentel,R.,
Figure BDA0003012202920000091
D.,Schmidt,E.,Thurow,K.,Lalk,M.Antiviral Terpenoid Constituents of Ganodermapfeifferi.Journal of Natural Products,2005,68(12):1728.)中C-7位上的酮羰基在ganodecalone G中被还原为羟基(-OH)。1H-1H COSY谱中H-5/H2-6/H-7相关信号以及HMBC谱中H-5与C-6，C-7，C-29和C-30相关，H2-6与C-7，C-5和C-10相关信号证实了以上的推测。除此以外，ganoderone A的C-11位上的sp3亚甲基(δC 24.0)信号在ganodecalone G中酮羰基(δC 200.3)信号取代，这个结构变化可由HMBC谱中H2-12与C-11，C-18，C-13和C-14相关信号进行证实。ROESY谱中H3-27和H-23相关证明了Δ24双键的构型为E。此外，在ROESY图谱存在相关信号H-5/H-7/H3-28、H-12α/H-17/H-30、H3-19/H3-29和H-12β/H3-18，确定了化合物ganodecalone G具有羊毛甾三萜的骨架构型。基于上述，化合物ganodecalone G的结构得以鉴定，经检索发现为一新的三萜类化合物。
ganodecalone D为白色粉末，HR-ESI-MS：m/z 493.3275(理论值为493.3288[M+Na]+)，分子式为C30H46O4，不饱和度8。该化合物的1H NMR和13C NMR与ganoderone A的数据非常相似，暗示它们具有相同的结构骨架。主要的区别是ganodecalone D在C-15位上多了一个羟基(-OH)。以上的推测结论由H2-16与C-15和C-17的HMBC相关信号确定。在ROESY谱图中，H3-27和H2-23相关，证明Δ24双键的构型为E。此外，ganodecalone D具有与ganodecalone G类似的ROESY相关信号，表明化合物ganodecalone D同样具有羊毛甾三萜的立体骨架构型，ROESY图谱中H3-18/H-15β相关信号表明H-15为β取向，因此，基于较确定的羊毛甾三萜立体构型并结合比对NMR数据，化合物ganodecalone D的结构得以鉴定，经检索发现为一新的三萜类化合物。
ganodecalone E为白色粉末，易溶于氯仿。高分辨质谱确定其分子式为C30H46O4，不饱和度8。该化合物1H NMR和13C NMR与ganodecalone G的核磁数据非常相似，因此推测它们具有相同的结构骨架。主要区别是ganodecalone G中C-7位上的氧代次甲基信号被ganodecalone E的sp3亚甲基信号取代，以上推论可由H-5与C-6和C-7的HMBC相关信号和H-6/H-5的COSY相关信号确定。除此之外，ganodecalone G中C-21位的甲基信号被ganodecalone E的氧代亚甲基取代，这个结构变化可由H-20/H-21的COSY相关信号和H-20与C-21相关的HMBC信号得以证明。此外，ganodecalone E具有与ganodecalone G类似的ROESY相关信号，表明化合物ganodecalone E也具有羊毛甾三萜的立体骨架构型，加上比对类似的NMR数据，因此，化合物ganodecalone E的结构得以鉴定，经检索发现为一新的三萜类化合物。
表1ganodecalone G、D、E(1-3)的13C NMR(500MHz)和1H NMR(125MHz)数据，溶剂CDCl3
Figure BDA0003012202920000101
Figure BDA0003012202920000111
化合物ganodecalone G、D、E(1-3)的表征如下：
Ganodecalone G为白色粉末，易溶于氯仿；[α]25D＝+143(c 1.0,MeOH)；UV-vis(MeOH)λmax[logε(L·mol-1·cm-1)]：255(2.8),214(2.2)nm；1H-NMR(CDCl3，500MHz)和13C-NMR(CDCl3，125MHz)数据见表1；IR(KBr)νmax：3441，2926，2851，1710，1638，1447，1381，and1163cm-1；HRESIMS calcd for C30H34NaO10[M+Na]+493.3275，found 493.3288。
Ganodecalone D为白色粉末，易溶于氯仿；[α]25D＝+143(c 1.0,MeOH)；UV-vis(MeOH)λmax[logε(L·mol-1·cm-1)]：253(2.8),218(2.4)nm；1H-NMR(CDCl3，500MHz)和13C-NMR(CDCl3，125MHz)数据见表1；IR(KBr)νmax：3436，2932，2853，2373，1454，1380，and1057cm-1；HRESIMS calcd for C30H34NaO10[M+Na]+493.3280，found 493.3288。
Ganodecalone E为白色粉末，易溶于氯仿；[α]25D＝+201(c 1.0,MeOH)；UV-vis(MeOH)λmax[logε(L·mol-1·cm-1)]：253(2.8),225(2.6)nm；1H-NMR(CDCl3，500MHz)和13C-NMR(CDCl3，125MHz)数据见表1；IR(KBr)νmax：3463,2930,2849,1635,1382,1138,and1064cm-1。
Ganodecalone A为与Ganodecalone G、D、E结构类似的灵芝醇化合物，是从喜热灵芝中分离得到的已知化合物。其波谱表征：HR-ESI-MS m/z 454.3[M+H]+，分子式为C30H46O3；1H-NMR(CDCl3,500MHz)δ:0.84(3H,s,H-18),1.13(3H,s,H-19),0.90(3H,d,J＝6.4Hz,H-21),5.39(1H,t,J＝7.1Hz,H-24),4.00(2H,s,H-26),1.66(3H,s,H-27),1.12(3H,s,H-28),1.08(3H,s,H-29),1.14(3H,s,H-30)；13C-NMR(CDCl3,126MHz)δ:35.2(C-1),34.4(C-2),218.4(C-3),47.1(C-4),51.8(C-5),18.8(C-6),29.3(C-7),164.5(C-8),138.3(C-9),37.1(C-10),199.2(C-11),51.7(C-12),47.0(C-13),51.8(C-14),31.2(C-15),27.2(C-16),50.3(C-17),17.0(C-18),19.2(C-19),36.1(C-20),18.5(C-21),35.8(C-22),24.6(C-23),126.6(C-24),134.7(C-25),69.1(C-26),13.8(C-27),27.9(C-28),20.7(C-29),25.9(C-30)。
ganodecalone A的结构式如下：
Figure BDA0003012202920000121
实施例3
ganodecalone G、D、E的肿瘤细胞毒活性测定
本实施例将实施例1的化合物ganodecalone G、D、E进行肿瘤细胞毒活性的测定，采用参考文献(Chen,C.,Liang,F.,Chen,B.,Sun,Z.Y.,Xue,T.D.,Yang,R.L.,Luo,D.Q.,Identification of demethylincisterol A3 as a selective inhibitor of proteintyrosine phosphatase Shp2.Eur J Pharmacol.2017,795,124–133.)的MTT法测定。
从液氮罐中取出保存的4种癌细胞系为Hela、SGC-7901、K562和Bel培养，用含10％胎小牛血清的培养液配制单个细胞悬液，在对数生长期以每孔4500～5000个细胞数接种于96孔板上，每孔100μL细胞悬液。将96孔板于37℃、5％CO2培养箱中培养细胞约18h左右，在显微镜下观察细胞生长状态，细胞生长稳定后，加药处理。用DMSO溶解待测化合物，配制9个不同浓度梯度(100，75，50，25，12.5，6.25，3.125，和1.5625μmol.L-1)，每个处理设3组重复，阳性对照为顺铂。在药物处理48h，避光条件下每孔加入20μL的MTT溶液，置于CO2培养箱中孵育4h后，每孔加入100μL的10％SDS-HCl溶液，置于CO2培养箱中过夜孵育。在波长570nm处测定OD值，依据检测结果并计算IC50值。试验结果见表2(Mean±SD)。
表2 ganodecalone G、D、E与对比例ganodecalone A的体外抗肿瘤活性IC50(μmol.L-1)
Figure BDA0003012202920000122
Figure BDA0003012202920000131
综上所述，化合物ganodecalone G、D和E显示了比ganodecalone A更好的肿瘤细胞毒活性,其中化合物ganodecalone G、D和E对人髓性白血病细胞K562具有肿瘤细胞毒活性；化合物ganodecalone G和E对人胃癌和人肝癌细胞Bel具有肿瘤细胞毒活性；化合物ganodecalone D对人宫颈癌细胞Hela具有肿瘤细胞毒活性，以上化合物具有制备抗肿瘤药物的应用前景。
实施例4
化合物ganodecalone G和ganodecalone D对裸鼠体内肿瘤细胞生长抑制活性
本实施例将实施例1富集的化合物ganodecalone G和ganodecalone D按一下方法评价其对裸鼠体内肿瘤细胞生长的抑制活性：
1、试验动物：三周龄BALB/cA-nu免疫缺陷型裸鼠64只，购自海南医学院，雌雄各半，平均体重16～18g。
2、试验环境：裸鼠饲养与SPF级环境中，使用独立通气笼具系统(IVC)雌雄分笼饲养，饲养温度23℃左右，温差不超过3℃，饲养湿度35～65％，换气次数≥15次/时，光照条件12h光照与12h无光照交替。裸鼠适应性饲养一周。
3、裸鼠试验
(1)肿瘤细胞的富集：选取ganodecalone G和D体外抑制活性较好的人胃癌细胞SGC-7901培养。当细胞融合率达到80％时，显微镜下计数，当细胞计数约为7000万个细胞，用PBS将细胞稀释107个/mL，将富集细胞置于冰上1h后接种于裸鼠体内。
(2)裸鼠-人胃异位移值瘤接种：取裸鼠右侧腹背部进行异位接瘤，因该位置不易发生摩擦，有效防止肿瘤被磨破。106个/100μL的量进行接种，使用注射器将细胞悬液接种于裸鼠皮下，每只鼠接种100μL。接瘤后，每天称量裸鼠体重并记录健康状况。
4、荷瘤裸鼠体内抑制试验
接种瘤一周后，按体重随机分组，分别为空白对照组、阳性药组(5-氟尿嘧啶，35mg/kg)、低剂量ganodecalone G(GDA-C)给药组(35mg/kg)、中剂量ganodecalone G(GDA-C)给药组(75mg/kg)、高剂量ganodecalone G(GDA-C)给药组(180mg/kg)、中剂量ganodecalone D(GDA-D)给药组(75mg/kg)、低剂量ganodecalone D(GDA-D)给药组(35mg/kg)、高剂量ganodecalone D(GDA-D)给药组(180mg/kg)。各组每日腹腔注射给药1次，连续10天。末次给药24h后采用断颈脱臼处死动物，称体重(图22)，解剖瘤块称重(图23)，解剖肝脏(图24)和脾称重(图25)。所有计量数据均表示为平均值±标准差(Mean±SD)，评估给药对裸鼠产生的影响。
由以上图(图22～25)结果可知，荷裸鼠在给药后，阳性对照组与给药组裸鼠肿瘤的体积均小于对照组；剥离肿瘤后，阳性对照组与给药组裸鼠肿瘤的重量、解剖的肝脏和脾均低于对照组。其中ganodecalone G给药组对裸鼠体内肿瘤细胞生长的抑制活性要强与ganodecalone D给药组；荷瘤裸鼠在给药后，各组裸鼠的体重和进食量未发生明显的差异变化，解剖各组裸鼠后，未发现裸鼠的脏器有异常，各组裸鼠的肝、脾重量亦无显著性差异。由此可见，化合物ganodecalone G和D对裸鼠毒性较低，有药用开发价值。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.具有肿瘤细胞毒活性的三萜类化合物在制备用于抗癌药物中的应用，其特征在于，所述具有肿瘤细胞毒活性的三萜类化合物具有式1或式3所示结构：
Figure FDA0003606307880000011
所述应用为所述具有式1或式3所示结构的化合物在制备用于抗白血病药物、抗胃癌或抗肝癌药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的具有肿瘤细胞毒活性的三萜类化合物的制备方法包括以下步骤：
A)将干燥粉碎的喜热灵芝子实体的提取物经正相硅胶柱色谱分离，得到组分Fr.1～Fr.11；
B)分离具有式1所示结构的化合物：
B1)将Fr.5经反相ODS色谱柱层析，得到Fr.5-1～Fr.5-6，所述反相ODS色谱柱层析的洗脱剂为甲醇-水，所述甲醇和水的体积比为30:1、50:1、80:1、100:1，进行梯度洗脱，每个梯度比洗脱30分钟；
B2)取Fr.5-3，经半制备高效液相色谱进行纯化，得到式1所示化合物ganodecalone G；
C)分离具有式3所示结构的化合物：
C1)取Fr.6，经反相ODS色谱柱层析，得到Fr.6-1～Fr.6-5，所述反相ODS色谱柱层析的洗脱剂为甲醇-水，所述甲醇和水的体积比为20:1、50:1、80:1、100:1，进行梯度洗脱，每个梯度比洗脱30分钟；
C2)取Fr.6-5，经半制备高效液相色谱进行纯化，得到式3所示化合物ganodecalone E。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述喜热灵芝子实体的提取物按照如下方法进行制备：
将粉碎干燥的喜热灵芝子实体经乙醇加热回流提取，得到乙醇提取液；
将所述乙醇提取液经减压浓缩、加水混悬，然后用乙酸乙酯萃取，萃取液经蒸馏浓缩得到乙酸乙酯总浸膏。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述正相硅胶柱色谱分离的洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯，所述石油醚和乙酸乙酯的体积比为10：1～1：2。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤B2)和步骤B3)中，半制备高效液相色谱的流动相为乙腈和水的混合溶剂。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤C2)中，半制备高效液相色谱的流动相为乙腈和水的混合溶剂。
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