CN114276398B

CN114276398B - 羊毛脂烷型三萜类化合物、制备方法及其在制备cyp1a2代谢酶抑制剂中的应用

Info

Publication number: CN114276398B
Application number: CN202111597622.3A
Authority: CN
Inventors: 李大伟
Original assignee: First Affiliated Hospital of Dalian Medical University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Dalian Medical University
Priority date: 2021-12-24
Filing date: 2021-12-24
Publication date: 2022-12-30
Anticipated expiration: 2041-12-24
Also published as: CN114276398A

Abstract

本发明公开了羊毛脂烷型三萜类化合物、制备方法及其在制备CYP1A2代谢酶抑制剂中的应用，涉及药物领域；该化合物的结构式如下：

其中，R₁为OH或O，R₂为OH或H。本发明还提供该化合物的制备方法及其在制备CYP1A2代谢酶抑制剂中的应用。本发明提供的羊毛脂烷型三萜类化合物可以有效抑制CYP1A2代谢酶活性，可以作为联合药物在抑制临床药物的肝脏代谢中应用。

Description

羊毛脂烷型三萜类化合物、制备方法及其在制备CYP1A2代谢酶抑制剂中的应用

技术领域

本发明涉及药物领域，特别是涉及羊毛脂烷型三萜类化合物、制备方法及其在制备CYP1A2代谢酶抑制剂中的应用。

背景技术

中药灵芝为多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr.)Karst.或紫芝Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang的干燥子实体。具有补气安神，止咳平喘的功效。主治心神不宁，失眠，惊悸，咳喘痰多，虚劳证等。我国灵芝药用已有2000多年历史，本草学专著《神农本草经》将灵芝列为上品；周朝《列子》记载“朽壤之上，有菌者芝”；《名医别录》、《新修本草》、《本草纲目》等医药学专著描述灵芝具有“滋补强壮、扶正固本”作用。研究表明灵芝中主要含三萜类、多糖类、甾体类、肽类、脂肪酸类等化合物，现代药理学研究灵芝具有神经保护、增进肝脏合成血清蛋白质、镇静、镇痛、降血糖、降血脂、抗肿瘤、防止衰老等功效。

药物代谢酶是影响药物体内代谢的主要因素之一，人体内肝脏是药物代谢的主要器官，在药物代谢中肝微粒体的CYP450酶系起着关键作用，其中药物代谢酶CYP1A2就是CYP450酶系中的重要代谢酶之一。研发药物代谢酶CYP1A2的抑制剂，可以抑制药物的代谢过程，提高药物的生物利用度，增强药物疗效。

发明内容

本发明的目的是提供羊毛脂烷型三萜类化合物、制备方法及其在制备CYP1A2代谢酶抑制剂中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的羊毛脂烷型三萜类化合物可以有效抑制CYP1A2代谢酶活性，可以作为联合药物在抑制临床药物的肝脏代谢中应用。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种羊毛脂烷型三萜类化合物，其特征在于，结构式如下：

其中，R₁为OH或O，R₂为OH或H。

优选地，该羊毛脂烷型三萜类化合物的结构式如下：

优选地，该羊毛脂烷型三萜类化合物的结构式如下：

优选地，该羊毛脂烷型三萜类化合物的结构式如下：

本发明还提供式Ⅰ或式Ⅱ所示羊毛脂烷型三萜类化合物的制备方法，包括以下步骤：

a.将干燥的灵芝粉碎，用乙醇回流提取三次，合并乙醇提取液，之后浓缩得到灵芝浸膏，将灵芝浸膏用水分散，调节pH为2，得到浸膏水分散液，用氯仿对浸膏水分散液进行萃取,得到氯仿萃取液，所述氯仿萃取液经过浓缩得到氯仿萃取物；

b.将氯仿萃取物进行硅胶柱层析，采用石油醚-丙酮洗脱液，依次按石油醚和丙酮体积比为15:1，14:1，13:1，12:1，11:1，10:1，8:1，6:1，4:1，3:1，2:1梯度洗脱，每个梯度收集4个洗脱流份，得到的44个洗脱流份，依次分别记为A1～A44；

c.将洗脱流份A28经反相ODS中压柱色谱分离，以甲醇-水按照甲醇和水的体积比为(10:90)–(100:0)梯度洗脱，得到30个洗脱流份，将得到的30个洗脱流份依次记为A28-1～A28-30；

d.将洗脱流份A28-7经反相半制备C₁₈色谱柱HPLC分离，得到所述羊毛脂烷型三萜类化合物。

本发明还提供式Ⅲ所示羊毛脂烷型三萜类化合物的制备方法，包括以下步骤：

d.将洗脱流份A28-8和A28-9合并经反相半制备C₁₈色谱柱HPLC分离，得到所述羊毛脂烷型三萜类化合物。

进一步地，所述氯仿萃取物的提取方法具体包括以下步骤：

将干燥的灵芝粉碎，用乙醇回流提取三次，所述乙醇与灵芝的体积质量比为100L：10kg，合并乙醇提取液，减压浓缩得到灵芝浸膏；将所述灵芝浸膏用水分散，所述灵芝浸膏与水的质量比为1：5，调节pH为2，得到浸膏水分散液，浸膏水分散液用氯仿萃取三次，三次氯仿层合并，减压浓缩至无馏分馏出，得到所述氯仿萃取物。

进一步地，所述浸膏水分散液用氯仿萃取时，每次萃取氯仿与所述浸膏水分散液的体积比为1：1。

本发明还提供上述的羊毛脂烷型三萜类化合物在制备CYP1A2代谢酶抑制剂中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明从灵芝中发现并分离出了3种新的羊毛脂烷型三萜类化合物，这3种化合物对CYP1A2代谢酶均有一定的抑制作用，可以作为CYP1A2的高效抑制剂，抑制药物的代谢过程，提高其生物利用度，增强药物疗效。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1化合物1的HRESIMS谱图；

图2为实施例1化合物1的关键¹H-¹H COSY和HMBC相关图；

图3为实施例1化合物1的关键NOESY相关图；

图4为实施例1化合物1的¹H NMR谱图；

图5为实施例1化合物1的¹³C NMR谱图；

图6为实施例1化合物1的HSQC谱图；

图7为实施例1化合物1的HMBC谱图；

图8为实施例1化合物1的¹H-¹H COSY谱图；

图9为实施例1化合物1的NOESY谱图；

图10为实施例1化合物2的HRESIMS谱图；

图11为实施例1化合物2的关键¹H-¹H COSY和HMBC相关图；

图12为实施例1化合物2的关键NOESY相关图；

图13为实施例1化合物2的¹H NMR谱图；

图14为实施例1化合物2的¹³C NMR谱图；

图15为实施例1化合物2的HSQC谱图；

图16为实施例1化合物2的HMBC谱图；

图17为实施例1化合物2的¹H-¹H COSY谱图；

图18为实施例1化合物2的NOESY谱图；

图19为实施例1化合物3的HRESIMS谱图；

图20为实施例1化合物3的关键¹H-¹H COSY和HMBC相关图；

图21为实施例1化合物3的关键NOESY相关图；

图22为实施例1化合物3的¹H NMR谱图；

图23为实施例1化合物3的¹³C NMR谱图；

图24为实施例1化合物3的HSQC谱图；

图25为实施例1化合物3的HMBC谱图；

图26为实施例1化合物3的¹H-¹H COSY谱图；

图27为实施例1化合物3的NOESY谱图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

按照如下步骤进行羊毛脂烷型三萜类化合物的制备：

a.将干燥的灵芝粉碎，用乙醇在78.3℃条件下回流提取三次(乙醇与灵芝的体积质量比为100L：10kg)，合并提取液，减压浓缩(并回收乙醇)至浸膏；将灵芝浸膏用水分散(水与灵芝浸膏的质量比为5：1)，用10％HCl调节pH为2得到浸膏水分散液，浸膏水分散液用氯仿萃取三次(每次萃取氯仿与浸膏水分散液的体积比为1：1)，三次氯仿层合并，减压浓缩至无馏分馏出，得氯仿萃取物；

b.将氯仿萃取物进行硅胶柱层析，采用石油醚-丙酮洗脱液，依次按石油醚和丙酮体积比为15:1，14:1，13:1，12:1，11:1，10:1，8:1，6:1，4:1，3:1，2:1梯度洗脱，每个梯度收集4个洗脱流份，每个洗脱流份为1L，将依次得到的44个洗脱流份，分别记为A1～A44；

c.将洗脱流份A28经反相ODS中压柱色谱分离，以甲醇-水(甲醇和水体积比10:90–100:0)梯度洗脱(0.03％三氟乙酸v/v)，流速15mL/min，洗脱6h，得到30个洗脱流份，每个洗脱流份为420mL，将依次得到的30个洗脱流份依次记为A28-1～A28-30；

d.将洗脱流份A28-7经反相半制备C₁₈色谱柱HPLC分离，乙腈：水＝40：60，加0.03％三氟乙酸v/v，流速3.0mL/min，检测波长210nm和254nm得到单体化合物1和2。

e.将洗脱流份A28-8和A28-9合并经反相半制备C₁₈色谱柱HPLC分离，甲醇：水＝55：45，加0.03％三氟乙酸v/v，流速3.0mL/min，检测波长210nm和254nm得到单体化合物3。

一、化合物的结构测定：

化合物1为白色粉末。

化合物1的HRESIMS谱图、H-¹H COSY和HMBC相关谱图、NOESY相关谱图、¹H NMR谱图、¹³C NMR谱图、HSQC谱图、HMBC谱图、¹H-¹H COSY谱图及NOESY谱图分别如图1～图9所示。

化合物1的核磁共振氢谱和碳谱数据如表1所示。

表1

注：¹H-NMR(600MHz，CD₃OD)，¹³C-NMR(150MHz，CD₃OD)

根据[α]²⁰ _D+17.7(c 0.38，甲醇)，(+)-HRESIMS m/z m/z 533.3118[M+H]⁺(计算值C₃₀H₄₅O₈ ⁺，533.3109)结合核磁共振数据以及9个不饱和度确定其分子式为C₃₀H₄₄O₈。化合物1的¹H NMR谱显示存在六个甲基质子[δ_H0.99(s，H₃-18)，1.24(s，H₃-19)，0.72(s，H₃-29)，1.37(s，H₃-30)，0.97(d，J＝6.6Hz，H₃-21)，1.17(d，J＝7.2Hz，H₃-27)]，两个连氧的次甲基质子[δ_H 3.59(dd，J＝12.0，4.8Hz，H-3)，4.89(t，J＝8.4Hz，H-7)]，两个连氧的亚甲基质子[δ_H3.52(d，J＝10.8Hz，H-28)]和[δ_H 3.32(d，J＝10.8Hz，H-28)](表1)。¹³C NMR谱显示存在30个碳信号，包括三个酮羰基碳信号[δ_C 200.4(C-11)，218.4(C-15)，210.8(C-23)]，一个羧基碳信号[δ_C 179.5(C-26)]，两个烯碳信号[δ_C 159.0(C-8)，144.0(C-9)]，三个连氧碳信号[δ_C 72.3(C-3)，67.5(C-7)，66.0(C-28)](表1)。以上波谱数据结合该化合物10％硫酸乙醇显色呈紫红色，提示该化合物是一个羊毛脂烷型三萜类化合物，并通过HSQC、¹H-¹H COSY、HMBC及NOESY等分析技术手段，确定了该化合物如下所示结构：

并命名为ganoderica B。

化合物2为白色粉末。

化合物2的HRESIMS谱图、H-¹H COSY和HMBC相关谱图、NOESY相关谱图、¹H NMR谱图、¹³C NMR谱图、HSQC谱图、HMBC谱图、¹H-¹H COSY谱图及NOESY谱图分别如图10～图18所示。

化合物2的核磁共振氢谱和碳谱数据如表2所示。

表2

注：¹H-NMR(600MHz，CD₃OD)，¹³C-NMR(150MHz，CD₃OD)

根据[α]²⁰ _D+21.7(c 0.28，甲醇)，(+)-HRESIMS m/z 547.2944[M+H]⁺(计算值C₃₀H₄₃O₉ ⁺，547.2902)结合核磁共振数据以及9个不饱和度确定其分子式为C₃₀H₄₂O。

化合物2的¹H NMR谱显示存在六个甲基质子[δ_H0.88(s，H₃-18)，1.38(s，H₃-19)，0.97(s，H₃-29)，1.47(s，H₃-30)，1.12(d，J＝6.0Hz，H₃-21)，1.17(d，J＝7.2Hz，H₃-27)]，两个连氧的次甲基质子[δ_H 4.93(tJ＝8.4Hz，H-7)，4.44(s，H-12)]，两个连氧的亚甲基质子[δ_H 3.64(d，J＝10.8Hz，H-28)]和[δ_H 3.36(d，J＝10.8Hz，H-28)](表2)。¹³C NMR谱显示存在30个碳信号，包括四个酮羰基碳信号[δ_C218.1(C-3)，201.5(C-11)，218.4(C-15)，211.1(C-23)]，一个羧基碳信号[δ_C 179.6(C-26)]，两个烯碳信号[δ_C 159.6(C-8)，142.0(C-9)]，三个连氧碳信号[δ_C 66.7(C-7)，79.8(C-12)，67.6(C-28)](表2)。以上波谱数据结合该化合物10％硫酸乙醇显色呈紫红色，提示该化合物是一个羊毛脂烷型三萜类化合物，并通过HSQC、¹H-¹H COSY、HMBC及NOESY等分析技术手段，确定了该化合物如下所示结构：

并命名为ganoderica C。

化合物3为白色粉末。

化合物3的HRESIMS谱图、H-¹H COSY和HMBC相关谱图、NOESY相关谱图、¹H NMR谱图、¹³C NMR谱图、HSQC谱图、HMBC谱图、¹H-¹H COSY谱图及NOESY谱图分别如图19～图27所示。

化合物3的核磁共振氢谱和碳谱数据如表3所示。

表3

注：¹H-NMR(600MHz，CD₃OD)，¹³C-NMR(150MHz，CD₃OD)

根据[α]²⁰ _D+10.8(c 0.11，甲醇)，(+)-HRESIMS m/z 545.2768[M+H]⁺(计算值C₃₀H₄₁O₉ ⁺，545.2745)结合核磁共振数据以及11个不饱和度确定其分子式为C₃₀H₄₀O₉。化合物3的¹H NMR谱显示存在六个甲基质子[δ_H0.85(s，H₃-18)，1.37(s，H₃-19)，0.97(s，H₃-29)，1.53(s，H₃-30)，2.30(s，H₃-21)，1.17(d，J＝7.2Hz，H₃-27)]，一个三取代双键质子[δ_H 6.33(s，H-22)]，两个连氧的次甲基质子[δ_H 4.96(t，J＝8.4Hz，H-7)，4.56(s，H-12)]，两个连氧的亚甲基质子[δ_H 3.64(d，J＝10.8Hz，H-28)]和[δ_H 3.36(d，J＝10.8Hz，H-28)](表3)。¹³CNMR谱显示存在30个碳信号，包括四个酮羰基碳信号[δ_C217.9(C-3)，201.1(C-11)，217.2(C-15)，200.9(C-23)]，一个羧基碳信号[δ_C 179.8(C-26)]，四个烯碳信号[δ_C 159.7(C-8)，142.1(C-9)，157.4(C-20)，126.3(C-22)]，三个连氧碳信号[δ_C 66.6(C-7)，79.4(C-12)，67.6(C-28)](表3)。以上波谱数据结合该化合物10％硫酸乙醇显色呈紫红色提示该化合物是一个羊毛脂烷型三萜类化合物，并通过HSQC、¹H-¹H COSY、HMBC及NOESY等分析技术手段，确定了该化合物如下所示结构：

并命名为ganoderica F。

二、三萜成分抑制CYP1A2代谢酶活性测定具体方法如下：

反应体系总体积为200μL，体系内辅因子与磷酸盐缓冲液如表4所示。将底物(Phenacetin O-deethylation)、抑制剂辅因子、缓冲液加入1.5mL EP管内，最后加入人肝微粒体，混匀后于37℃下预孵3min。预孵3min后在混合孵育体系中加入NADP⁺启动反应。37℃孵育30min后，加入100μL甲醇终止反应，20000g离心20min，上清液LC-MS分析，计算得到化合物对CYP1A2代谢酶抑制率。

分别将实施例1制备得到的化合物1-3作为抑制剂，检测其对CYP1A2代谢酶的抑制率，结果如表5所示。

表4

表5

从表5中可以看出，化合物1-3对CYP1A2代谢酶具有抑制作用。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种羊毛脂烷型三萜类化合物，其特征在于，结构式为：

2.一种根据权利要求1所述的羊毛脂烷型三萜类化合物的制备方法，其特征在于，结构式为

的羊毛脂烷型三萜类化合物的制备方法包括以下步骤：

a1.将干燥的灵芝粉碎，用乙醇回流提取三次，合并乙醇提取液，之后浓缩得到灵芝浸膏，将灵芝浸膏用水分散，调节pH为2，得到浸膏水分散液，用氯仿对浸膏水分散液进行萃取，得到氯仿萃取液，所述氯仿萃取液经过浓缩得到氯仿萃取物；

b1.将氯仿萃取物进行硅胶柱层析，采用石油醚-丙酮洗脱液，依次按石油醚和丙酮体积比为15:1，14:1，13:1，12:1，11:1，10:1，8:1，6:1，4:1，3:1，2:1梯度洗脱，每个梯度收集4个洗脱流份，得到的44个洗脱流份，依次分别记为A1～A44；

c1.将洗脱流份A28经反相ODS中压柱色谱分离，以甲醇-水按照甲醇和水的体积比为(10:90)–(100:0)梯度洗脱，得到30个洗脱流份，将得到的30个洗脱流份依次记为A28-1～A28-30；

d1.将洗脱流份A28-7经反相半制备C₁₈色谱柱HPLC分离，得到结构式为

的羊毛脂烷型三萜类化合物；

结构式为

的羊毛脂烷型三萜类化合物的制备方法包括以下步骤：

a2.将干燥的灵芝粉碎，用乙醇回流提取三次，合并乙醇提取液，之后浓缩得到灵芝浸膏，将灵芝浸膏用水分散，调节pH为2，得到浸膏水分散液，用氯仿对浸膏水分散液进行萃取，得到氯仿萃取液，所述氯仿萃取液经过浓缩得到氯仿萃取物；

b2.将氯仿萃取物进行硅胶柱层析，采用石油醚-丙酮洗脱液，依次按石油醚和丙酮体积比为15:1，14:1，13:1，12:1，11:1，10:1，8:1，6:1，4:1，3:1，2:1梯度洗脱，每个梯度收集4个洗脱流份，得到的44个洗脱流份，依次分别记为A1～A44；

c2.将洗脱流份A28经反相ODS中压柱色谱分离，以甲醇-水按照甲醇和水的体积比为(10:90)–(100:0)梯度洗脱，得到30个洗脱流份，将得到的30个洗脱流份依次记为A28-1～A28-30；

d2.将洗脱流份A28-8和A28-9合并经反相半制备C₁₈色谱柱HPLC分离，得到结构式为

的羊毛脂烷型三萜类化合物。

3.根据权利要求2所述的羊毛脂烷型三萜类化合物的制备方法，其特征在于，在步骤a1和a2中，所述氯仿萃取物的提取方法具体包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的羊毛脂烷型三萜类化合物的制备方法，其特征在于，所述浸膏水分散液用氯仿萃取时，每次萃取氯仿与所述浸膏水分散液的体积比为1：1。

5.一种根据权利要求1所述的羊毛脂烷型三萜类化合物在制备CYP1A2代谢酶抑制剂中的应用。