CN112979740B - 一种睡茄交酯ⅰ类化合物及其提取方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一种睡茄交酯Ⅰ类化合物及其提取方法和应用，属于中药提取领域，本发明的睡茄交酯I类化合物或其异构体、在药学上可接受的盐或包含该化合物的药物组合物对肝癌细胞有抑制作用，可以用于制备抗肝癌药物。本发明进一步丰富龙珠活性物质的结构多样性，在此基础上，为后续得到的单体化合物进行相关生物活性测试奠定基础，为新药开发提供活性先导化合物，同时也为龙珠药材的深层次研究与开发提供理论依据。

Description

一种睡茄交酯Ⅰ类化合物及其提取方法和应用
技术领域
本发明属于中药提取领域，具体涉及一种从龙珠中分离的睡茄交酯Ⅰ类化合物及其提取方法和在制备抗肝癌的药物中的应用。
背景技术
龙珠(Tubocapsicumanomalum)为茄科龙珠属植物，常生长于山坡密林或山谷中。分布于我国福建、广东、贵州和浙江等地，印度尼西亚、日本、韩国等国亦有分布。《中国中药志要》中记载，龙珠全草入药，用于治疗水肿，疔疮，疮疡肿毒，淋证。根用于痢疾；果实清热解毒，用于恶疮，疖肿(中国药材公司.中国中药资源志要[M].北京：科学出版社,1994,1129.)，国内外学者对龙珠的化学成分以及药理作用的研究较少，仅有少数几篇报道其富含睡茄交酯类化合物(TYPE-A)(L.X.Chen,H.He,F.Qiu,Natural withanolides:anoverview[J].Natural Product Reports.28(2011)705-740.)以及其苷类化合物(KiyotaN,Shingu K,Yamaguchi K,Yoshitake Y,Harano K,Yoshimitsu H,Miyashita H,Ikeda T,Tagawa C,Nohara T.New C28 steroidal glycosides from Tubocapsicumanomalum[J].Chemical&Pharmaceutical Bulletin,2008,56:1038-1040.；Kiyota N,Shingu K,Yamaguchi K,Yoshitake Y,Harano K,Yoshimitsu H,Ikeda T,Nohara T.New C28Steroidal Glycosides from Tubocapsicumanomalum[J].Chemical&PharmaceuticalBulletin,2007,55:34-36.)，并且通过体外细胞实验证明从龙珠植物中分离得到的睡茄交酯类化合物对肿瘤细胞具有细胞毒活性(Hsieh P W,Huang Z Y,Chen J H,Chang F R,WuC C,Yang Y L,Chiang M Y,Yen M H,Chen S L,Yen S H,Lubken T,Hung W C,Wu YC.Cytotoxic withanolides from Tubocapsicumanomalum[J].Journal of NaturalProducts,2007,70:747-753.；Wang S B,Zhu D R,Nie B,Li J,Zhang Y J,Kong LY,Luo JG.Cytotoxic withanolides from the aerial parts of Tubocapsicumanomalum[J].Bioorganic Chemistry,2018,81:396-404.)，以及化合物Tubocapsanolide A通过抑制Skp2的表达发挥抗肺癌细胞增殖作用(Chang H C,Chang F R,Wang Y C,Pan M R,Hung WC,Wu Y C.A bioactive withanolideTubocapsanolide A inhibits proliferation ofhuman lung cancer cells via repressing Skp2 expression[J].Molecular CancerTherapeutics,2007,6(5):1572-1578.)。为了将龙珠的药用价值发挥到最大，对龙珠地上部分进行了系统的成分研究，提取了新的睡茄交酯I类化合物，利用核磁、红外、质谱等手段对化合物的结构进行了确证，并检测其抗肝癌活性。
发明内容
本发明的首要目的是提供一种如睡茄交酯I类化合物。
本发明的第二个目的是提供一种睡茄交酯I类化合物的提取方法。
本发明的第三个目的是提供一种含有睡茄交酯I类化合物的药物组合物。
本发明的第四个目的是提供一种睡茄交酯I类化合物或该化合物的异构体、该化合物在药学上可接受的盐或包含该化合物的药物组合物在制备抗肝癌药物中的应用。
本发明的技术方案概述如下：
一种睡茄交酯I类化合物，其为如通式(I)或(II)所示的化合物或该化合物的异构体、或该化合物在药学上可接受的盐。
所述的通式(I)和(II)分别为：
Figure BDA0002965256940000021
其中：
R1为Cl或OH；
R2为H、OH或Δ12,13双键；
R3为H或OH；
进一步的，所述的睡茄交酯I类化合物，其为如下结构式1～5所示的化合物中的任一种或该化合物的异构体、该化合物在药学上可接受的盐。
Figure BDA0002965256940000031
所述的在药学上可接受的盐，包括钠盐、钾盐、氨盐、盐酸盐及硫酸盐。
所述的异构体，包括：光学异构体、顺反异构体、外消旋体以及它们的混合物。
本发明还提供了上述睡茄交酯I类化合物1～5的提取方法，包括如下步骤：
(1)以龙珠地上部分为原料，加入原料8～15质量倍的体积浓度60％～80％乙醇水溶液，回流提取2～4次，每次提取2～4小时，合并得到提取液，减压回收溶剂，浓缩后得到总浸膏；其中，所述的原料8～15质量倍，具体指，加入的乙醇水溶液与原料的体积质量比以mL/g计为(8～15):1；
(2)将总浸膏分散到5～10质量倍的水中，依次用5～10质量倍体积的石油醚、乙酸乙酯萃取，回收溶剂，分别得到石油醚萃取浓缩液、乙酸乙酯萃取浓缩液和水相；
(3)乙酸乙酯萃取浓缩液经硅胶柱色谱分离，以体积比为100:1～0:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比50:1的馏分E2、体积比15:1的馏分E4；
(4)浓缩馏分E2，浓缩液经过硅胶柱色谱分离，以体积比为70:1～0:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，进一步纯化得到化合物1；浓缩馏分E4，浓缩液经过硅胶柱色谱分离，以体积比为7:1～0:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，进一步纯化得到化合物2～5。
上述提取方法，其中：
所述步骤(4)中，具体分离纯化过程为：
馏分E2浓缩后经过硅胶柱色谱分离，收集石油醚和丙酮体积比为10:1的馏分，记为E25；馏分E4浓缩后经过硅胶柱色谱分离，收集石油醚和丙酮体积比为5:1和4:1的馏分，分别记为E42和E43；
馏分E25浓缩后经MCI凝胶柱色谱分离，依次以体积比为7:3、8:2、9:1、1:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为7:3的馏分，记为E251；
馏分E251浓缩后经ODS柱色谱分离，依次以体积比为2:8、4:6、5:5、7:3、1:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为5:5的馏分，记为E2513；
馏分E2513室温下析出无色晶体，经过乙酸乙酯反复纯化，在甲醇重结晶中获得化合物1；
馏分E42和E43分别浓缩后经MCI柱色谱分离，依次以体积比为7:3、8:2、1:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，分别收集体积比为7:3的馏分，分别记为E421和E431；
馏分E421浓缩后经ODS柱色谱分离，依次以体积比为2:8、5:5、6:4、1:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为2:8的馏分，记为E4211；
馏分E4211浓缩后经硅胶柱色谱分离，依次以体积比为20:1、10:1、5:1、3:1、2:1、1:1和0:1的二氯甲烷-乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为3:1和2:1的馏分，分别记为E42114和E42115；
馏分E42114浓缩后经ODS柱色谱分离，依次以体积比为1:9、3:7、4:6、6:4、7:3、8:2、1:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比6:4的馏分，记为E421144；
馏分E421144浓缩后经制备型HPLC色谱，以体积比为55:45的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物4；
馏分E42115浓缩后经ODS柱色谱分离，依次以体积比为2:8、3:7、4:6、6:4、7:3、8:2、1:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比7:3的馏分，记为E421155；
馏分E421155浓缩后经制备型HPLC色谱，以体积比为55:45的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物3；
馏分E431浓缩后经硅胶柱色谱分离，依次以体积比为100:1、80:1、60:1、40:1、20:1、15:1和0:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比60:1的馏分，记为E4313；
馏分E4313浓缩后经ODS柱色谱分离，依次以体积比为2:8、3:7、4:6、6:4、7:3、8:2、1:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比7:3的馏分，记为E43135；
馏分E43135浓缩后经制备型HPLC色谱，以体积比为55:45的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物5和2。
包含睡茄交酯I类化合物的龙珠地上部分提取物。
龙珠地上部分提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。
一种药物组合物，其包括所述的睡茄交酯I类化合物、该化合物的异构体、该化合物在药学上可接受的盐中的一种或多种；还包括药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂中的一种或它们的组合。所述药物组合物的给药途径为口服或注射给药，剂型包括：片剂、胶囊剂、粉剂、糖浆剂和针剂。
本发明还提供了所述的睡茄交酯I类化合物、该化合物的异构体、该化合物在药学上可接受的盐或所述的药物组合物在制备抗肝癌药物中的应用。
本发明的优点：
本发明的睡茄交酯I类化合物或其异构体、在药学上可接受的盐或包含该化合物的药物组合物对肝癌细胞有抑制作用，可以用于制备抗肝癌药物。本发明进一步丰富龙珠活性物质的结构多样性，在此基础上，为后续得到的单体化合物进行相关生物活性测试奠定基础，为新药开发提供活性先导化合物，同时也为龙珠药材的深层次研究与开发提供理论依据。
附图说明
图1本发明实施例3中提取到的睡茄交酯I类化合物1～5对Hep3B细胞的抑制率。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行进一步描述。
实施例1
龙珠中睡茄交酯I类化合物1～5的提取方法，包括如下步骤：
(1)以总干重为20kg的龙珠地上部分为原料，加入原料8质量倍的体积浓度75％乙醇水溶液(160L)，回流提取2次，每次提取2小时，合并得到提取液，减压回收溶剂，浓缩后得到2815g总浸膏；
(2)将得到的总浸膏分散到5质量倍的水(14L)中，依次用5质量倍体积的石油醚、乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩回收溶剂，分别得到石油醚萃取浓缩液、乙酸乙酯萃取浓缩液(296g)和水相；
(3)乙酸乙酯萃取浓缩液经硅胶柱色谱分离，依次以体积比为100:1、50:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1和0:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，分别收集体积比50:1的馏分E2和体积比15:1的馏分E4；
(4)浓缩馏分E2得到25.6g浓缩液，浓缩液经过硅胶柱色谱分离，依次以体积比为70:1、50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、1:1和0:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，进一步纯化得到88.2mg化合物1；浓缩馏分E4得到37.2g浓缩液，浓缩液经过硅胶柱色谱分离，依次以体积比为7:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1和0:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，进一步纯化得到4.0mg化合物2、7.8mg化合物3、17.7mg化合物4和6.8mg化合物5。具体分离纯化过程为：
馏分E2浓缩后经过硅胶柱色谱分离，收集石油醚和丙酮体积比为10:1的馏分，记为E25；馏分E4浓缩后经过硅胶柱色谱分离，收集石油醚和丙酮体积比为5:1和4:1的馏分，分别记为E42和E43；
馏分E25浓缩后得到3.7g浓缩液，经MCI凝胶柱色谱分离，依次以体积比为7:3、8:2、9:1、1:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为7:3的馏分，记为E251；
馏分E251浓缩后得到2.3g的浓缩液，经ODS柱色谱分离，依次以体积比为2:8、4:6、5:5、7:3、1:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为5:5的馏分，记为E2513；
馏分E2513浓缩后得到1.4g浓缩液，浓缩液室温下经过乙酸乙酯反复纯化，在甲醇重结晶中获得88.2mg化合物1；
馏分E42和E43浓缩后得分别得到12.3g和7.2g的浓缩液，经MCI柱色谱分离，依次以体积比为7:3、8:2、1:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，分别收集体积比为7:3的馏分，分别记为E421和E431；
馏分E421浓缩后得到6.5g浓缩液，经ODS柱色谱分离，依次以体积比为2:8、5:5、6:4、1:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为2:8的馏分，记为E4211；
馏分E4211浓缩后得到4.1g浓缩液，经硅胶柱色谱分离，依次以体积比为20:1、10:1、5:1、3:1、2:1、1:1和0:1的二氯甲烷-乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为3:1和2:1的馏分，分别记为E42114和E42115；
馏分E42114浓缩后得到830mg浓缩液，经ODS柱色谱分离，依次以体积比为1:9、3:7、4:6、6:4、7:3、8:2、1:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比6:4的馏分，记为E421144；
馏分E421144浓缩后得到53.8mg浓缩液，经制备型HPLC色谱，以体积比为55:45的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到17.7mg化合物4；
馏分E42115浓缩后得到1.3g浓缩液，经ODS柱色谱分离，依次以体积比为2:8、3:7、4:6、6:4、7:3、8:2、1:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比7:3的馏分，记为E421155；
馏分E421155浓缩后得到128.8mg浓缩液，经制备型HPLC色谱，以体积比为55:45的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到7.8mg化合物3；
馏分E431浓缩后得到5.0g浓缩液，经硅胶柱色谱分离，依次以体积比为100:1、80:1、60:1、40:1、20:1、15:1和0:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比60:1的馏分，记为E4313；
馏分E4313浓缩后得到1.9g浓缩液，经ODS柱色谱分离，依次以体积比为2:8、3:7、4:6、6:4、7:3、8:2、1:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比7:3的馏分，记为E43135；
馏分E43135浓缩后得到176.3mg浓缩液，经制备型HPLC色谱，以体积比为55:45的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到6.8mg化合物5和4.0mg化合物2。
对提取到的睡茄交酯I类化合物1～5进行结构鉴定，具体的物理化学数据如下：
化合物1：无色针状结晶，
Figure BDA0002965256940000071
-262.0(c＝0.30,CH3OH)；HR-ESI-MS(positive)m/z:543.1895[M+K]+(calcd for C28H37ClKO6,543.1910)，分子式C28H37ClO6；1H-NMR(400MHz,Pyridine-d5)和13C-NMR(100MHz,Pyridine-d5)数据见表1。
化合物2：白色无定型粉末，
Figure BDA0002965256940000072
-405.5(c＝0.20,CH3OH)；HR-ESI-MS(negative)m/z:485.2558[M-H]-(calcd for C28H37O7,485.2545)，分子式C28H38O7；1H-NMR(400MHz,Pyridine-d5)和13C-NMR(100MHz,Pyridine-d5)数据见表2。
化合物3：白色无定型粉末，
Figure BDA0002965256940000073
-204.0(c＝0.5,CH3OH)；HR-ESI-MS(positive)m/z:517.2789[M+H]+(calcd for C29H41O8,517.2796)，分子式C29H40O8；1H-NMR(600MHz,Pyridine-d5)和13C-NMR(150MHz,Pyridine-d5)数据见表3。
化合物4：白色无定型粉末，
Figure BDA0002965256940000074
-473.5(c＝0.20,CH3OH)；HR-ESI-MS(positive)m/z:539.2591[M+Na]+(calcd for C29H40NaO8,539.2615)，分子式C29H40O8；1H-NMR(400MHz,Pyridine-d5)和13C-NMR(100MHz,Pyridine-d5)数据见表4。
化合物5：白色无定型粉末，
Figure BDA0002965256940000075
-452.0(c＝0.20,CH3OH)；HR-ESI-MS(positive)m/z:501.2837[M+H]+(calcd for C29H41O7,501.2847)，分子式C29H40O7；1H-NMR(400MHz,Pyridine-d5)和13C-NMR(100MHz,Pyridine-d5)数据见表5。
表1化合物1的碳谱和氢谱数据
Figure BDA0002965256940000076
Figure BDA0002965256940000081
表2化合物2的碳谱和氢谱数据
Figure BDA0002965256940000082
表3化合物3的碳谱和氢谱数据
Figure BDA0002965256940000091
表4化合物4的碳谱和氢谱数据
Figure BDA0002965256940000092
Figure BDA0002965256940000101
表5化合物5的碳谱和氢谱数据
Figure BDA0002965256940000102
通过理化数据和现代波谱学手段(HRESIMS和NMR)，结合公开文献相关数据，鉴定上述化合物的结构，确定化合物1～5均为未见文献报道的新化合物。
实施例2
龙珠中睡茄交酯I类化合物1～5的提取方法，包括如下步骤：
(1)以总干重为15kg的龙珠地上部分为原料，加入原料10质量倍的体积浓度为60％乙醇水溶液(150L)，回流提取2次，每次提取2小时，合并得到提取液，减压回收溶剂，浓缩后得到2250g总浸膏；
(2)将总浸膏分散到6质量倍的水中(13.5L)，依次用6质量倍体积的石油醚、乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩回收溶剂，分别得到石油醚萃取浓缩液、乙酸乙酯萃取浓缩液(254g)和水相；
(3)乙酸乙酯萃取浓缩液经硅胶柱色谱分离，依次以体积比为100:1、50:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1和0:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比50:1的馏分E2、体积比15:1的馏分E4；
(4)浓缩馏分E2得到21.9g浓缩液，浓缩液经过硅胶柱色谱分离，依次以体积比为70:1、50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、1:1和0:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，进一步纯化得到75.5mg化合物1；浓缩馏分E4得到32.1g浓缩液，浓缩液经过硅胶柱色谱分离，依次以体积比为7:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1和0:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，进一步纯化得到3.5mg化合物2、6.8mg化合物3、15.3mg化合物4和5.8mg化合物5。具体分离纯化过程同实施例1。
实施例3
龙珠中睡茄交酯I类化合物1～5的提取方法，包括如下步骤：
(1)以总干重为22kg的龙珠地上部分为原料，加入原料15质量倍的体积浓度为80％乙醇水溶液(330L)，回流提取4次，每次提取3小时，合并得到提取液，减压回收溶剂，浓缩后得到3094g总浸膏；
(2)将总浸膏分散到8质量倍的水中(24.8L)，依次用8质量倍体积的石油醚、乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩回收溶剂，分别得到石油醚萃取浓缩液、乙酸乙酯萃取浓缩液(327g)和水相；
(3)乙酸乙酯萃取浓缩液经硅胶柱色谱分离，依次以体积比为100:1、50:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1和0:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比50:1的馏分E2、体积比15:1的馏分E4；
(4)浓缩馏分E2得到28.5g浓缩液，浓缩液经过硅胶柱色谱分离，依次以体积比为70:1、50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、1:1和0:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，进一步纯化得到97.9mg化合物1；浓缩馏分E4得到41.1g浓缩液，浓缩液经过硅胶柱色谱分离，依次以体积比为7:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1和0:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，进一步纯化得到4.4mg化合物2、8.6mg化合物3、19.5mg化合物4和7.4mg化合物5。具体分离纯化过程同实施例1。
上述提取得到的睡茄交酯I类化合物1～5对人肝癌Hep3B细胞抗增殖活性的影响研究，具体如下：
(1)细胞培养
人肝癌Hep3B细胞培养于10％胎牛血清(上海中乔新舟生物科技有限公司提供)的高糖培养基，37℃，5％CO2的恒温培养箱中孵育生长。
(2)CCK8法检测化合物1～5对Hep3B细胞存活率的影响
1.原理：Cell Counting Kit-8(简称CCK8)试剂中含有WST-8，能在细胞线粒体中电子载体的作用下被细胞中的脱氢酶还原成黄色甲瓒产物，颜色越深甲瓒数量越多，生成甲瓒的数量与活细胞数成正比，可用多功能酶标仪在450nm下测定紫外吸收，根据OD值计算活细胞的数目。
2.方法：用DMSO溶解睡茄交酯I类化合物1～5，使其浓度为50mM的母液待用，细胞消化成细胞悬液，计数后以每孔100μL培养基，6000个细胞体系接种于96孔板中，放置在37℃、5％CO2培养箱中过夜，待细胞贴壁后将培养基换成含有20μM化合物的DMEM培养基继续培养24小时，弃去原培养基，每孔加入100μL含10％CCK8的培养基(现用现配，4℃避光保存)，37℃孵箱中孵育1h后，用酶标仪450nm下检测OD值。计算睡茄交酯I类化合物1～5处理组的抑制率(％)以评价抗增殖活性。结果如图1所示。
结果如图1所示：从图中可以发现，化合物1对人肝癌细胞Hep3B细胞的抑制率超过50％，显示出较强的细胞毒性，化合物2和5也有明显效果，而化合物3和4的虽有效果，但相比化合物1、2和5较差，表明本发明的化合物具有较强的体外抗肝癌细胞增殖效应。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其中心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护。

Claims (2)

1.一种睡茄交酯I类化合物的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以龙珠地上部分为原料，加入原料8～15质量倍的体积浓度为60％～80％乙醇水溶液，回流提取2～4次，每次提取2～4小时，合并得到提取液，减压回收溶剂，浓缩后得到总浸膏；
(2)将总浸膏分散到5～10质量倍的水中，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩回收溶剂，分别得到石油醚萃取浓缩液、乙酸乙酯萃取浓缩液和水相；
(3)乙酸乙酯萃取浓缩液经硅胶柱色谱分离，以体积比为100:1～0:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比50:1的馏分E2、体积比15:1的馏分E4；
(4)浓缩馏分E2，浓缩液经过硅胶柱色谱分离，以体积比为70:1～0:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，进一步纯化得到化合物1；浓缩馏分E4，浓缩液经过硅胶柱色谱分离，以体积比为7:1～0:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，进一步纯化得到化合物2～5；
所述的化合物1、化合物2～5对应如下结构式1～5所示睡茄交酯I类化合物：
Figure FDA0003594450040000011
2.根据权利要求1所述的睡茄交酯I类化合物的提取方法，其特征在于，所述步骤(4)中对馏分E2和E4的具体分离纯化过程为：
馏分E2浓缩后经过硅胶柱色谱分离，收集石油醚和丙酮的体积比为10:1的馏分，记为E25；馏分E4浓缩后经过硅胶柱色谱分离，收集石油醚和丙酮的体积比为5:1和4:1的馏分，分别记为E42和E43；
馏分E25浓缩后经MCI凝胶柱色谱分离，依次以体积比为7:3、8:2、9:1、1:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为7:3的馏分，记为E251；
馏分E251浓缩后经ODS柱色谱分离，依次以体积比为2:8、4:6、5:5、7:3、1:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为5:5的馏分，记为E2513；
馏分E2513室温下析出无色晶体，经过乙酸乙酯反复纯化，在甲醇重结晶中获得化合物1；
馏分E42和E43分别浓缩后经MCI柱色谱分离，依次以体积比为7:3、8:2、1:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，分别收集体积比为7:3的馏分，分别记为E421和E431；
馏分E421浓缩后经ODS柱色谱分离，依次以体积比为2:8、5:5、6:4、1:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为2:8的馏分，记为E4211；
馏分E4211浓缩后经硅胶柱色谱分离，依次以体积比为20:1、10:1、5:1、3:1、2:1、1:1和0:1的二氯甲烷-乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为3:1和2:1的馏分，分别记为E42114和E42115；
馏分E42114浓缩后经ODS柱色谱分离，依次以体积比为1:9、3:7、4:6、6:4、7:3、8:2、1:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比6:4的馏分，记为E421144；
馏分E421144浓缩后经制备型HPLC色谱，以体积比为55:45的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物4；
馏分E42115浓缩后经ODS柱色谱分离，依次以体积比为2:8、3:7、4:6、6:4、7:3、8:2、1:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比7:3的馏分，记为E421155；
馏分E421155浓缩后经制备型HPLC色谱，以体积比为55:45的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物3；
馏分E431浓缩后经硅胶柱色谱分离，依次以体积比为100:1、80:1、60:1、40:1、20:1、15:1和0:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比60:1的馏分，记为E4313；
馏分E4313浓缩后经ODS柱色谱分离，依次以体积比为2:8、3:7、4:6、6:4、7:3、8:2、1:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比7:3的馏分，记为E43135；
馏分E43135浓缩后经制备型HPLC色谱，以体积比为55:45的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物5和2。
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