CN107082780A - 一种具有吡咯骈异喹啉结构的生物碱及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种具有吡咯骈异喹啉结构的生物碱8‑羟基‑9‑甲氧基‑1，2，3，5，6，10b‑六氢吡咯骈[2，1‑a]异喹啉‑3‑酮及其制备方法与应用，其结构是由理化常数测定和波谱数据分析而确定的，该化合物含有吡咯骈异喹啉的结构，研究显示其具有一定的细胞毒活性，可被开发应用于医药生产工业，用于抗癌方面的疾病治疗。

Description

一种具有吡咯骈异喹啉结构的生物碱及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于天然活性产物技术领域，尤其涉及一种具有吡咯骈异喹啉结构的生物碱及其制备方法和以其为先导化合物在活性化合物的制备与医药方面的应用。

背景技术

玄参科泡桐属植物，全属共有7种，分别是白花泡桐、毛泡桐、兰考泡桐、楸叶泡桐、中国台湾泡桐、川泡桐和南方泡桐，光泡桐是毛泡桐的变种。它们的果实统称为泡桐果。除东北北部、内蒙古、新疆北部、西藏等地区外全国均有分布，栽培或野生。

泡桐作为一种优质木材，它不仅在工农业方面有广泛用途，同时它还是一种常用的中草药，其花、叶、皮、根、果古时就有其药用记载。如《本草纲目》记述：“桐叶主恶蚀疮著阴，皮主五痔，杀三虫。花主傅猪疮，消肿生发。”《药性论》也言：“治五淋，沐发去头风，生发滋润”。《全国中草药汇编》载泡桐果有祛痰止咳平喘作用，中医用于治疗慢性气管炎、气喘等。上世纪70年代，河南省防治慢性气管炎泡桐协作组曾先后在郑州、开封、新乡和商丘等地临床观察泡桐果（煎剂、片剂、注射液）治疗哮喘和慢性支气管炎患者950例，并对部分病例进行通宵同住观察，结果发现泡桐果可显著改善气管炎患者的咳、痰、喘及肺部体征，总有效率为85%~95%，显效以上为45%~72%；通过治疗前后监测病人的心、肝、肾功能，发现泡桐果无明显的毒副作用。动物实验研究表明，泡桐花与果实的提取物对治疗哮喘等支气管炎症具有比较好的效果。

泡桐果中富含碳取代香叶烯基黄酮、木脂素与三萜类化合物，它们表现出多种显著的生物活性，它们具有显著的细胞毒，抗氧化，抗病毒，抗菌，抗炎和抑制乙酰与丁酰胆碱酯酶等生物活性。有关泡桐植物的利用可检索到多份专利申请，但有关从泡桐果中制备泡桐生物碱碱的制备方法及其在药品、保健品或化妆品领域的应用文献或专利申请未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供从泡桐果中得到的一种具有吡咯骈异喹啉结构的生物碱及其制备方法与其在医药领域中的应用，主要包括生物碱的结构确证、分离制备与生物活性研究。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一方面提供一种具有吡咯骈异喹啉结构的生物碱，化学名称为：8-羟基-9-甲氧基-1，2，3，5，6，10b-六氢吡咯骈[2，1-a]异喹啉-3-酮，化学结构式为：

另一方面提供具有吡咯骈异喹啉结构的生物碱的制备方法，包括以下步骤：

a）干燥的楸叶泡桐果实粉碎，吹去种子，取果皮8.5Kg用95%乙醇回流提取3次，每次10L，合并提取液，真空浓缩，得到提取物680g。

b）取提取物600g，加热溶解于5L70%乙醇，静置24h，上清液减压浓缩，浓缩液以适量硅胶拌样，进行硅胶柱层析，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯洗脱，得二氯甲烷提取物198g。

c）将二氯甲烷提取物170g经过硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯溶剂系统梯度洗脱，薄层色谱检测，合并相同组分，4：6洗脱物22g再次经过硅胶柱层析，二氯甲烷-甲醇系统梯度洗脱，99：1洗脱物2.3g经过SephadexLH-20柱层析，甲醇洗脱，采用TLC监测，得到含有化合物1的混合物粗品，其再经过ODS50-75µm柱层析，采用30%～100%甲醇梯度洗脱，甲醇结晶，得到化合物1 23.8mg。

上述具有吡咯骈异喹啉结构的生物碱的制备方法，作为优选，步骤b中采用2kg硅胶柱200-300目层析。

上述具有吡咯骈异喹啉结构的生物碱的制备方法，作为优选，步骤b中采用洗脱剂的体积比是石油醚：二氯甲烷：乙酸乙酯 = 8:15:15。

上述具有吡咯骈异喹啉结构的生物碱的制备方法，作为优选，步骤c中采用1kg硅胶柱200-300目层析。

上述具有吡咯骈异喹啉结构的生物碱的制备方法，作为优选，步骤c中采用石油醚-乙酸乙酯溶剂梯度洗脱的系统为100：0、95：5、9：1、85：15、8：2、7：3、6：4、4：6、3：7、0：100。

上述具有吡咯骈异喹啉结构的生物碱的制备方法，作为优选，步骤c中采用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱的系统为100：0、99：1、98：2、95：5、9：1、8：2。

再一方面提供具有吡咯骈异喹啉结构的生物碱在制备抗癌药物或保健品方面的应用。

上述的应用，作为优选，所述的抗癌药物或保健品为用于肺癌A549细胞增殖的抑制药物或保健品。

上述的应用，作为优选，所述抗癌药物或保健品含有药物有效计量的如权利1所述的生物碱和药学上可接受的载体的药物组合物。

本发明的有益效果为：

（1）本发明对泡桐果的化学成分进行了研究，分离得到了一个具有吡咯骈异喹啉结构的新生物碱，结构为8-羟基-9-甲氧基-1，2，3，5，6，10b-六氢吡咯骈[2，1-a]异喹啉-3-酮。

（2）本发明具有吡咯骈异喹啉结构的生物碱，其具有比较好的细胞毒作用，可以作为抗癌的药物或保健品使用，可被开发应用于医药生产工业，用于抗癌方面的疾病治疗。

附图说明

图1是生物碱的结构式及主要的HMBC, ¹H-¹H COSY反应式（其中为HMBC，为¹H-¹HCOSY）；

图2是生物碱(20μM)对肺癌A549细胞周期的影响(，n=3)示意图；

图3是生物碱结构的IR谱图；

图4是生物碱结构的¹H-NMR谱图；

图5是生物碱结构的¹³C-NMR谱图；

图6是生物碱结构的HMQC谱图；

图7是生物碱结构的HMBC谱图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。

实施例1，一种具有吡咯骈异喹啉结构的生物碱，化学名称为：8-羟基-9-甲氧基-1，2，3，5，6，10b-六氢吡咯骈[2，1-a]异喹啉-3-酮，化学结构式如图1：

1）生物碱的结构表征：

生物碱结构母核为吡咯骈异喹啉结构，C-3位氧化为羰基，与N形成一个内酰胺，苯环上C-8与C-9分别被羟基与甲氧基取代，其结构式如图1所示；

生物碱为白色粉末，ESI-MS给出准分子离子峰m/z 234 [M＋H]⁺，说明相对分子量为233，结合¹H-和¹³C-NMR谱，可确定分子式为C₁₃H₁₅NO₃，不饱和度为7。如图3，IR中3298，1681，1594，1514cm^-1的吸收峰表明结构中具有羟基、羰基与苯环结构。如图4，¹H-NMR中显示出14个氢质子，δ 3.82（3H，s）是一个甲氧基信号，δ 6.58（1H，s），6.69（1H，s）为芳香环上对位氢信号，表明苯环为1，2，4，5-四取代形式（占用四个饱和度）。如图5，¹³C-NMR谱中显示13个碳信号，出现在低场的δ 175.92为羰基碳信号，结合IR中1681cm^-1的吸收峰，可推断结构中存在一个酰胺结构。在低场处δ 109.30，116.35，127.18，129.84，146.72，148.59为苯环上的六个碳信号，δ 56.65是一个明显的甲氧基碳信号。此外，结合图6HMQC，δ 28.93，29.01，32.85，38.62为四个亚甲基碳信号，δ 58.59是一个次甲基碳信号，¹H-¹HCOSY显示它们组成了结构中“-CH₂-CH₂-”和“-CH-CH₂-CH₂-”两个结构片段，与酰胺结构满足另外三个不饱和度，三者须形成两个环状结构。在图7HMBC谱中，δ 4.10 (H-5)和δ 58.58 (C-10b)；δ 4.10，3.03 (H₂-5)和δ 175.92 (C-3)；δ 2.57，2.36 (H₂-2)和δ 175.92 (C-3)；δ 4.10 (H-5)和δ127.18 (C-6a)；δ 4.76 (H-10b)和δ 129.84 (C-10a)；δ 2.72 (H₂-2)和δ 129.84 (C-10a)；δ 6.69 (H-10)和δ 58.58 (C-10b)；δ 6.58 (H-7)和δ 29.01 (C-6)之间分别具有明显的远程相关信号，根据这些相关信息，可推断出化合物1的结构为吡咯骈异喹啉（图1）。此外，δ 6.69 (H-10)与δ 146.76显示强相关，与δ 148.52弱相关，而δ 6.58 (H-7)与δ148.52显示强相关，与δ 146.76弱相关，说明C-9和C-8的¹³C-NMR数据分别为δ 148.52和δ146.76。δ 3.82（-OCH₃）和δ 148.52之间的HMBC相关信号确定甲氧基连接到C-9上。因此，该化合物的结构鉴定为8-羟基-9-甲氧基-1，2，3，5，6，10b-六氢吡咯骈[2，1-a]异喹啉-3-酮（图1）。该化合物的碳氢数据与从鹦哥花中得到的一个生物碱非常相似，区别在于二者结构中甲氧基和羟基的位置正好相反。经检索，上述物质为一个新天然产物。

表1.生物碱的¹H-和¹³C-NMR数据

生物碱：白色粉末，C₁₃H₁₅NO₃，UV(CH₃OH) λ_max = 286nm； 2838，2449，1681，1594，1514，1426，1270，1233，1207，1106cm^-1；HR-ESI-MSm/z234.1051[M＋H]⁺（计算值234.2052），ESI-MSm/z233.8[M＋H]⁺；¹H-和¹³C-NMR数据见表1。

2）该生物碱的制备方法

干燥的楸叶泡桐果实粉碎，吹去种子，取果皮（8.5Kg）用95%乙醇回流提取3次，每次10L，合并提取液，真空浓缩，得到提取物（680g）。取提取物600g，加热溶解于5L70%乙醇，静置24h，上清液减压浓缩，浓缩液以适量硅胶拌样，进行硅胶（200-300目，2kg）柱层析，依次用石油醚（8L）、二氯甲烷（15L）、乙酸乙酯（15L）洗脱，得二氯甲烷提取物198g。将二氯甲烷提取物（170g）经过硅胶（200-300目，1kg）柱层析，用石油醚-乙酸乙酯（100：0、95：5、9：1、85：15、8：2、7：3、6：4、4：6、3：7、0：100）溶剂系统梯度洗脱，薄层色谱检测，合并相同组分，4：6洗脱物22g再次经过硅胶柱层析，二氯甲烷-甲醇（100：0、99：1、98：2、95：5、9：1、8：2）梯度洗脱，99：1洗脱物（2.3g）经过SephadexLH-20柱层析，甲醇洗脱，采用TLC监测，得到含有化合物1的混合物粗品，其再经过ODS（50-75µm）柱层析，30%→100%甲醇梯度洗脱，甲醇结晶，得到化合物1（23.8mg）。

3)生物碱的活性筛选

用MTT法检测了该生物碱对体外培养的肺癌A549细胞增殖的抑制作用，结果表明此化合物的细胞毒作用比较显著，其IC₅₀为16.51μM。以20μM的浓度作用A549细胞24小时后，可使G₁期细胞的比例明显增大，比空白对照增加约12%（图2），表明该化合物可把A549细胞阻滞于细胞周期G₁期。

以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种具有吡咯骈异喹啉结构的生物碱，化学名称为：8-羟基-9-甲氧基-1，2，3，5，6，10b-六氢吡咯骈[2，1-a]异喹啉-3-酮，化学结构式为：

。

2.根据权利要求1所述的具有吡咯骈异喹啉结构的生物碱的制备方法，包括以下步骤：

a）干燥的楸叶泡桐果实粉碎，吹去种子，取果皮8.5Kg用95%乙醇回流提取3次，每次10L，合并提取液，真空浓缩，得到提取物680g；

b）取提取物600g，加热溶解于5L70%乙醇，静置24h，上清液减压浓缩，浓缩液以适量硅胶拌样，进行硅胶柱层析，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯洗脱，得二氯甲烷提取物198g；

c）将二氯甲烷提取物170g经过硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯溶剂系统梯度洗脱，薄层色谱检测，合并相同组分，4：6洗脱物22g再次经过硅胶柱层析，二氯甲烷-甲醇系统梯度洗脱，99：1洗脱物2.3g经过SephadexLH-20柱层析，甲醇洗脱，采用TLC监测，得到含有化合物1的混合物粗品，其再经过ODS50-75µm柱层析，采用30%～100%甲醇梯度洗脱，甲醇结晶，得到化合物1 23.8mg。

3.根据权利要求2所述的具有吡咯骈异喹啉结构的生物碱的制备方法，其特征在于，步骤b中采用2kg硅胶柱200-300目层析。

4.根据权利要求2所述的具有吡咯骈异喹啉结构的生物碱的制备方法，其特征在于，步骤b中采用洗脱剂的体积比是石油醚：二氯甲烷：乙酸乙酯=8:15:15。

5.根据权利要求2所述的具有吡咯骈异喹啉结构的生物碱的制备方法，其特征在于，步骤c中采用1kg硅胶柱200-300目层析。

6.根据权利要求2所述的具有吡咯骈异喹啉结构的生物碱的制备方法，其特征在于，步骤c中采用石油醚-乙酸乙酯溶剂梯度洗脱的系统为100：0、95：5、9：1、85：15、8：2、7：3、6：4、4：6、3：7、0：100。

7.根据权利要求2所述的具有吡咯骈异喹啉结构的生物碱的制备方法，其特征在于，步骤c中采用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱的系统为100：0、99：1、98：2、95：5、9：1、8：2。

8.如权利要求1所述的具有吡咯骈异喹啉结构的生物碱在制备抗癌药物或保健品方面的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的抗癌药物或保健品为用于肺癌A549细胞增殖的抑制药物或保健品。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抗癌药物或保健品含有药物有效计量的如权利1所述的生物碱和药学上可接受的载体的药物组合物。