CN109662972A - 珠子参的活性单体化合物在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

珠子参的活性单体化合物在制备抗肿瘤药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抗肿瘤药物的制备领域，公开了珠子参的活性单体化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述珠子参的活性单体化合物为28‑去糖竹节参皂苷IVa‑6‑甲基酯，实验证明，28‑去糖竹节参皂苷IVa‑6‑甲基酯对胃癌BGC‑823、肠癌HCT‑116、子宫颈癌Hela、肝癌HepG‑2均具有一定的抑制作用，因此可知，本发明所述28‑去糖竹节参皂苷IVa‑6‑甲基酯可以用于制备治疗肿瘤相关疾病的药物，具有重大意义。

Description

珠子参的活性单体化合物在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明涉及抗肿瘤药物的制备领域，具体涉及一种珠子参的活性单体化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
癌症是目前困扰人类健康的最主要疾病之一，在我国，癌症是首要导致死亡的原因并造成了沉重的疾病负担，受生活环境、方式的变化和生存压力的增大等各种客观因素的影响，癌症的发病率不断上升，预计将取代心血管疾病成为全球第一大死亡原因。虽然随着科学技术的发展，出现了一系列治疗癌症的方法，但是手术、放射治疗和化学药物治疗往往会导致患者恶心、呕吐、肝功能损坏、免疫力低下，伸至出现身体机能的衰退等严重的不良反应。近年来，中药在癌症治疗中获得了诸多的临床应用，其中不乏对于珠子参的药理研究。
珠子参又名扣子七、钮子七、珠儿参，系五加科植物珠子参或羽叶三七的干燥串珠状根茎，主要分布在我国陕西、四川、湖北、云南等省。具有补肺、养阴、活络、止血的功效，用于气阴两虚、烦热口渴、虚劳咳嗽、跌扑损伤、关节疼痛、咳血、吐血、外伤出血等。珠子参中的化学成分以三萜皂苷类为主，也含有甾醇及其苷类、黄酮、多糖、氨基酸、有机酸、挥发油、脂肪油、蛋白质、抗菌蛋白、生物碱及微量元素等成分。已有珠子参的药理作用研究表明，其总皂苷具有镇痛、镇静、抗炎和对心血管系统、免疫方面的活性，但相关研究多停留在皂苷类、糖类或提取物等混合物的作用上，对物质基础的深入研究较少，对珠子参中单一化合物的药理活性研究具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种珠子参的活性单体化合物在制备用于抗肿瘤的药物中的应用，所述珠子参的活性单体化合物为如下式所示的28-去糖竹节参皂苷IVa-6-甲基酯：
本发明中所述肿瘤为胃癌、肠癌、子宫颈癌或肝癌。
本发明中所述28-去糖竹节参皂苷IVa-6-甲基酯的提取方法包括如下步骤：
(1)将珠子参干燥根茎用50-95％乙醇超声提取3-5次，过滤、合并提取液，减压浓缩蒸干，得到乙醇浸膏；
(2)将步骤(1)所得的乙醇浸膏用水分散，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇分别萃取3-5次，得到石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏和正丁醇浸膏；
(3)将步骤(2)所得的正丁醇浸膏经MCI柱色谱用甲醇-水混合液梯度洗脱后得到5个馏分(Fr.A-E)，将Fr.A经硅胶柱层析、SephadexLH-20凝胶柱色谱层析得到n个馏分(Fr.A1-Fr.An)，将Fr.A1用乙酸乙酯-正己烷-甲醇-水混合液洗脱后得到馏分Fr.a；
(4)将步骤(3)所得的Fr.a进行硅胶柱层析，采用不同体积比的氯仿-乙酸乙酯-甲醇混合液梯度洗脱，收集经体积比为7：2：1的氯仿-乙酸乙酯-甲醇混合液洗脱所得的洗脱液，纯化后得到28-去糖竹节参皂苷IVa-6-甲基酯。
优选地，步骤(1)中每次所述超声提取过程中，乙醇与珠子参干燥根茎的体积质量比(V/W)为5-10：1，提取时间为1-2h。
优选地，步骤(1)中所述减压浓缩蒸干的温度为55-65℃。
优选地，步骤(4)中所述氯仿-乙酸乙酯-甲醇混合液的体积比为8：2：0、8：2：0.5、7：2：1、6：3：1。
优选地，28-去糖竹节参皂苷IVa-6-甲基酯在药物中的含量为0.1-30wt.％。
优选地，所述药物组合物中还含有药学上可接受的载体。
本发明中所述药物可以制备成任何可药用的剂型，优选为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、散剂、浸膏剂或口服液。
本发明的中药制剂，在制备成药剂时可选择性的加入适合的药物可接受的载体，所述药物可接受的载体选自：甘露醇、山梨醇、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、纤维素及其衍生物、明胶、甘油、土温80、琼脂、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β－环糊精、滑石粉、硬脂酸镁等。
通过上述技术方案，本发明具有以下优点：
本发明对珠子参乙醇提取液进行有效的萃取分离纯化分离，得到28-去糖竹节参皂苷IVa-6-甲基酯，通过对该化合物的抗肿瘤作用实验，表明28-去糖竹节参皂苷IVa-6-甲基酯对胃癌BGC-823、肠癌HCT-116、子宫颈癌Hela、肝癌HepG-2均具有一定的抑制作用，从而为这四种肿瘤的治疗提供了新的可能，为28-去糖竹节参皂苷IVa-6-甲基酯在癌症防治中的临床应用提供重要的参考资料和新的理论依据。
附图说明
图1是化合物28-去糖竹节参皂苷IVa-6-甲基酯的氢谱图；
图2是化合物28-去糖竹节参皂苷IVa-6-甲基酯的碳谱图；
图3是化合物28-去糖竹节参皂苷IVa-6-甲基酯的DEPT谱图；
图4是化合物28-去糖竹节参皂苷IVa-6-甲基酯的1H-1H COSY图；
图5是化合物28-去糖竹节参皂苷IVa-6-甲基酯的HSQC谱图；
图6是化合物28-去糖竹节参皂苷IVa-6-甲基酯的HMBC谱图。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明提供了一种珠子参的活性单体化合物在制备用于抗肿瘤的药物中的应用，所述珠子参的活性单体化合物为如下式所示的28-去糖竹节参皂苷IVa-6-甲基酯：
本发明中所述肿瘤为胃癌、肠癌、子宫颈癌或肝癌。
本发明中所述28-去糖竹节参皂苷IVa-6-甲基酯的提取方法包括如下步骤：
(1)将珠子参干燥根茎用50-95％乙醇超声提取3-5次，过滤、合并提取液，减压浓缩蒸干，得到乙醇浸膏；
(2)将步骤(1)所得的乙醇浸膏用水分散，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇分别萃取3-5次，得到石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏和正丁醇浸膏；
(3)将步骤(2)所得的正丁醇浸膏经MCI柱色谱用甲醇-水混合液梯度洗脱后得到5个馏分(Fr.A-E)，将Fr.A经硅胶柱层析、SephadexLH-20凝胶柱色谱层析得到n个馏分(Fr.A1-Fr.An)，将Fr.A1用乙酸乙酯-正己烷-甲醇-水混合液洗脱后得到馏分Fr.a；
(4)将步骤(3)所得的Fr.a进行硅胶柱层析，采用不同体积比的氯仿-乙酸乙酯-甲醇混合液梯度洗脱，收集经体积比为7：2：1的氯仿-乙酸乙酯-甲醇混合液洗脱所得的洗脱液，纯化后得到28-去糖竹节参皂苷IVa-6-甲基酯。
本发明中，柱层析硅胶可以为80-100目、100-200目或200-300目，MCI柱为70-150μm。
优选地，步骤(1)中每次所述超声提取过程中，乙醇与珠子参干燥根茎的体积质量比(V/W)为5-10：1，提取时间为1-2h。
优选地，步骤(1)中所述减压浓缩蒸干的温度为55-65℃。
优选地，28-去糖竹节参皂苷IVa-6-甲基酯在药物中的含量为0.1-30wt.％。
优选地，所述药物组合物中还含有药学上可接受的载体。
本发明中所述药物可以制备成任何可药用的剂型，优选为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、散剂、浸膏剂或口服液。
本发明的中药制剂，在制备成药剂时可选择性的加入适合的药物可接受的载体，所述药物可接受的载体选自：甘露醇、山梨醇、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、纤维素及其衍生物、明胶、甘油、土温80、琼脂、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β－环糊精、滑石粉、硬脂酸镁等。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例中，紫外光谱仪为美国惠普公司生产、型号为8452A UV-vis；红外光谱仪为德国布鲁克公司生产，型号为Bruker Tensor 27；核磁共振仪为美国安捷伦公司生产，型号为Agilent DD2-500MHz；柱层析硅胶购于青岛海洋化工厂；MCI柱购于日本三菱公司；扣子七购买于湖南省石门县，经湖南中医药大学中药化学教研室王炜教授鉴定为五加科人参属植物扣子七的干燥串珠状根茎；胃癌BGC-823、肠癌HCT-116、子宫颈癌Hela、肝癌HepG-2细胞株购于中南大学湘雅中心实验室细胞库；改良型的DMEM高葡萄糖培养基购买于Hyclone公司，胎牛血清胰蛋白酶来自Gibco公司，四甲基偶氮唑盐(MTT)和其他化学物质采购来自中国SolarBio公司。
制备例1
(1)取土家族药物珠子参干燥根茎900g，用95％乙醇超声提取3次，每次超声提取中95％乙醇用量为5L、提取时间为2h，过滤收集提取液，在60℃条件下减压浓缩蒸干，得到乙醇浸膏256.57g；
(2)将乙醇浸膏用1.6L蒸馏水分散后，依次用1.6L石油醚、1.6L氯仿、1.6L乙酸乙酯和1.6L正丁醇分别进行3次萃取，得到石油醚浸膏5.05g、乙酸乙酯浸膏13.04g、正丁醇浸膏161.23g；
(3)将正丁醇浸膏经MCI柱色谱甲醇-水混合液(体积比为0:100-100：0)梯度洗脱后得到5个馏分(Fr.A-E)，将Fr.A经硅胶柱层析、SephadexLH-20凝胶柱色谱层析得到馏分Fr.A1(2.84g)，将Fr.A1用乙酸乙酯-正己烷-甲醇-水混合液(体积比为12：8：4：1)洗脱后得到馏分Fr.a(330mg)；
(4)将Fr.a进行硅胶柱层析，用氯仿-乙酸乙酯-甲醇混合液进行梯度洗脱，体积比为8：2：0、8：2：0.5、7：2：1、6：3：1，将经体积比为7：2：1的氯仿-乙酸乙酯-甲醇混合液洗脱得到的提取液纯化，得到8.8mg的28-去糖竹节参皂苷IVa-6-甲基酯。
制备所得的28-去糖竹节参皂苷IVa-6-甲基酯为白色无定形粉末(甲醇)，5％香草醛-浓硫酸TLC显色反应为紫红色，通过NMR对其结构进行鉴定，NMR光谱图如图1-图6所示。结合1H-NMR，13C-NMR，DEPT，HSQC和HMBC谱图确定化合物的结构，在1H-NMR谱中显示出有7个角甲基单峰质子信号[δH 0.83，0.87，0.93，0.96，0.97，1.07，1.18(各3H，s)]，1个甲基质子信号[δH 3.79(s，3H)]，1个烯基质子信号[5.26(t，J＝3.7Hz，1H)]以及1个糖端基质子信号[4.40(d，J＝7.8Hz，1H)]。
在13C-NMR谱中显示出共有37个碳信号，结合DEPT谱、HSQC谱可知其中包括7个角甲基碳信号(δC 27.4，15.6，14.5，16.3，25，32.2，23.1)，1个甲基碳(δC 51.4)，1对内烯碳信号(δC122.2，143.8)，1个糖端基碳信号(δC105.6)，1个羰基碳信号(δC180.5)，骨架上的羰基碳信号未显示，已通过质谱确认，并对其碳信号进行了归属。
结合1H-NMR和13C-NMR谱中特征信号可推断知化合物的骨架为齐墩果酸型三萜皂苷，所连的糖为葡萄糖醛酸，除此之外还有1个甲基个碳信号，结合1H-1H COSY可知取代基为甲基，其分子式为C37H58O9。结合HMBC谱可知1个糖端基质子[δH4.40(H-1')]与齐墩果酸骨架上的碳[δC 89.7(C-3)]远程相关；甲基质子[δH 3.79(H-1″″)]与葡萄糖醛酸的羰基碳[δC170(C-6')]远程相关。
28-去糖竹节参皂苷IVa-6-甲基酯的光谱特性为：1H NMR(600MHz，Methanol-d4)δH：0.83(s，3H，H-25)，0.87(s，3H，H-30)，0.93(s，3H，H-29)，0.96(s，3H，H-24)，0.97(s，3H，H-26)，1.07(s，3H，H-27)，1.18(s，3H，H-23)，3.79(s，3H，H-1″)，4.40(d，J＝7.8Hz，1H)，5.26(t，J＝3.7Hz，1H)；13C NMR(151MHz，MeOD)δC：38.3(C-1)，25.6(C-2)，89.7(C-3)，39.2(C-4)，55.6(C-5)，17.9(C-6)，32.4(C-7)，38.8(C-8)，47.5overlap(C-9)，36.5(C-10)，22.6(C-11)，122.2(C-12)，143.8(C-13)，41.5(C-14)，27.1(C-15)，22.7(C-16)，46.2(C-17)，41.3(C-18)，45.9(C-19)，30.2(C-20)，33.5(C-21)，32.6(C-22)，27.4(C-23)，15.6(C-24)，14.5(C-25)，16.3(C-26)，25(C-27)，180.5(C-28)，32.2(C-29)，23.1(C-30)，105.6(C-1')，73.9(C-2')，76.1(C-3')，71.8(C-4')，75.2(C-5')，170(C-6')，51.4(C-1″)。
制备例2
(1)土家族药物珠子参干燥根茎900g，用50％乙醇超声提取4次，每次超声提取中50％乙醇用量为7.2L、提取时间为1.5h，过滤收集提取液，在55℃条件下减压浓缩蒸干，得到乙醇浸膏260.78g；
(2)将乙醇浸膏用1.6L蒸馏水分散，依次用1.7L石油醚、1.7L氯仿、1.7L乙酸乙酯和1.7L正丁醇分别萃取4次，得到石油醚浸膏5.6g、乙酸乙酯浸膏14.04g、正丁醇浸膏165.23g；
(3)正丁醇浸膏经MCI柱色谱甲醇-水混合液(体积比为0:100-100：0)梯度洗脱后得到5个馏分(Fr.A-E)，将Fr.A经硅胶柱层析、SephadexLH-20凝胶柱色谱层析得到馏分Fr.A1(3.1g)，将Fr.A1用乙酸乙酯-正己烷-甲醇-水混合液(体积比为12：8：4：1)洗脱后洗脱后得到馏分Fr.a(325mg)；
(4)将Fr.a进行硅胶柱层析，用氯仿-乙酸乙酯-甲醇混合液进行梯度洗脱，体积比为8：2：0、8：2：0.5、7：2：1、6：3：1，将经体积比为7：2：1的氯仿-乙酸乙酯-甲醇混合液洗脱得到的提取液纯化，得到8.0mg的28-去糖竹节参皂苷IVa-6-甲基酯。
制备例3
(1)土家族药物珠子参干燥根茎900g，用75％乙醇超声提取5次，每次超声提取中75％乙醇用量为9L、提取时间为1h，过滤收集提取液，在65℃条件下减压浓缩蒸干，得到乙醇浸膏257.8g；
(2)将乙醇浸膏用1.6L蒸馏水分散，依次用1.5L石油醚、1.5L氯仿、1.5L乙酸乙酯和1.5L正丁醇分别萃取5次，得到石油醚浸膏4.95g、乙酸乙酯浸膏12.04g、正丁醇浸膏145.80g；
(3)正丁醇浸膏经MCI柱色谱甲醇-水混合液(体积比为0:100-100：0)梯度洗脱后得到5个馏分(Fr.A-E)，将Fr.A经硅胶柱层析、SephadexLH-20凝胶柱色谱层析得到馏分Fr.A1(2.72g)，将Fr.A1用乙酸乙酯-正己烷-甲醇-水混合液(体积比为12：8：4：1)洗脱后洗脱后得到馏分Fr.a(312mg)；
(4)将Fr.a进行硅胶柱层析，用氯仿-乙酸乙酯-甲醇混合液进行梯度洗脱，体积比为8：2：0、8：2：0.5、7：2：1、6：3：1，将经体积比为7：2：1的氯仿-乙酸乙酯-甲醇混合液洗脱得到的提取液纯化，得到7.8mg的28-去糖竹节参皂苷IVa-6-甲基酯。
实施例1
(1)将肿瘤细胞株胃癌BGC-823加入1ml胎牛血清胰蛋白酶，消化3min，加入DMEM高葡萄糖培养基2ml，吹匀打散，细胞计数后加入DMEM高葡萄糖培养基稀释成为细胞悬液，将细胞悬液加入96孔培养板，100μL/孔，置于温度为37℃、CO2浓度为5％的培养箱中培养24h；
(2)加入28-去糖竹节参皂苷IVa-6-甲基酯的工作液，使培养液中28-去糖竹节参皂苷IVa-6-甲基酯的终浓度为2.5，5.0，7.5，10.0，12.5，15.0，17.5，20.0μM(n＝3)，工作液加入作用48h后弃去培养液，每孔加入100μL含0.5mg/mL MTT的培养基，置于培养箱中继续培养4h后；
(3)终止培养，弃去孔内培养液，每孔加入100μL二甲基亚砜(DMSO)，常温下震荡10min，使蓝色结晶完全溶解，利用酶标仪测定每孔溶液在490nm处的吸光度值。
实验同时设置空白对照组和阳性对照组，对照组中不添加28-去糖竹节参皂苷IVa-6-甲基酯的工作液，阳性对照组中添加紫杉醇为阳性对照药。
(4)按照如下公式计算细胞增殖抑制率：
细胞增殖抑制率(％)＝(对照组OD值－给药组OD值)/对照组OD值×100％，28-去糖竹节参皂苷IVa-6-甲基酯对BGC-823细胞的抑制作用，计算结果见表1。
表1、28-去糖竹节参皂苷IVa-6-甲基酯对BGC-823细胞的抑制率
实施例2
按照实施例1的方法进行抗肿瘤活性测定，不同的是，肿瘤细胞株为肠癌HCT-116，28-去糖竹节参皂苷IVa-6-甲基酯对HCT-116细胞的抑制作用，计算结果见表2。
表2、28-去糖竹节参皂苷IVa-6-甲基酯对HCT-116细胞的抑制率
实施例3
按照实施例1的方法进行抗肿瘤活性测定，不同的是，肿瘤细胞株为子宫颈癌Hela，28-去糖竹节参皂苷IVa-6-甲基酯对Hela细胞的抑制作用，计算结果见表3。
表3、28-去糖竹节参皂苷IVa-6-甲基酯对Hela细胞的抑制率
实施例4
按照实施例1的方法进行抗肿瘤活性测定，不同的是，肿瘤细胞株为肝癌HepG-2，28-去糖竹节参皂苷IVa-6-甲基酯对HepG-2细胞的抑制作用，计算结果见表4。
表4、28-去糖竹节参皂苷IVa-6-甲基酯对HepG-2细胞的抑制率
从表1-表4的实验数据可以看出，28-去糖竹节参皂苷IVa-6-甲基酯处理BGC-823、HCT-116、Hela、HepG-2后，均显示较强的增殖抑制作用，与对照组比较差异有显著性(P<0.01)。28-去糖竹节参皂苷IVa-6-甲基酯对肿瘤细胞株BGC-823、HCT-116、Hela、HepG-2的IC50分别为17.12μM，19.25μM，18.96μM，12.70μM，其中，28-去糖竹节参皂苷IVa-6-甲基酯对肝癌HepG-2细胞的抑制作用最强，其IC50<15μM。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.珠子参的活性单体化合物在制备用于抗肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述珠子参的活性单体化合物为如下式所示的28-去糖竹节参皂苷IVa-6-甲基酯：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为胃癌、肠癌、子宫颈癌或肝癌。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述28-去糖竹节参皂苷IVa-6-甲基酯的提取方法包括如下步骤：
(1)将珠子参干燥根茎用50-95％乙醇超声提取3-5次，过滤、合并提取液，减压浓缩蒸干，得到乙醇浸膏；
(2)将步骤(1)所得的乙醇浸膏用水分散，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇分别萃取3-5次，得到石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏和正丁醇浸膏；
(3)将步骤(2)所得的正丁醇浸膏经MCI柱色谱用甲醇-水混合液梯度洗脱后得到5个馏分(Fr.A-E)，将Fr.A经硅胶柱层析、SephadexLH-20凝胶柱色谱层析得到n个馏分(Fr.A1-Fr.An)，将Fr.A1用乙酸乙酯-正己烷-甲醇-水混合液洗脱后得到馏分Fr.a；
(4)将步骤(3)所得的Fr.a进行硅胶柱层析，采用不同体积比的氯仿-乙酸乙酯-甲醇混合液梯度洗脱，收集经体积比为7：2：1的氯仿-乙酸乙酯-甲醇混合液洗脱所得的洗脱液，纯化后得到28-去糖竹节参皂苷IVa-6-甲基酯。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)中每次所述超声提取过程中，乙醇与珠子参干燥根茎的体积质量比(V/W)为5-10：1，提取时间为1-2h。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)中所述减压浓缩蒸干的温度为55-65℃。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(4)中所述氯仿-乙酸乙酯-甲醇混合液的体积比为8：2：0、8：2：0.5、7：2：1、6：3：1。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，28-去糖竹节参皂苷IVa-6-甲基酯在所述药物中的含量为0.1-30wt.％。
8.根据权利要求1或7所述的应用，其特征在于，所述药物还含有药学上可接受的载体。
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