CN111393497A - 一种预防和治疗肺癌的天然产品制备方法及应用 - Google Patents

一种预防和治疗肺癌的天然产品制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明建立了一种预防和治疗肺癌的天然产品制备方法及应用，属于蛹虫草产品开发技术领域。以蛹虫草为原料，提取分离抗肺癌药效成分，并按照一定的配方工艺制作而成的产品。初步毒性、药效等实验结果表明，该产品无毒性、具有治疗肺癌的功效。由于药效成分及辅料均来自蛹虫草提取，本产品对人体无毒副作用，可以安全用于人体预防和治疗肺癌。

Description

一种预防和治疗肺癌的天然产品制备方法及应用
技术领域
本发明涉及蛹虫草开发技术领域，具体涉及一种预防和治疗肺癌的天然产品的开发和应用。
背景技术
恶性肿瘤是严重威胁我国居民健康的一大类疾病。随着我国人口老龄化逐渐加剧、工业化和城镇化进程的不断加快，与慢性感染、不健康生活方式、环境等危险因素的累加，防控形势严峻。根据2019年1月，国家癌症中心发布了最新一期的全国癌症统计数据，肺癌位居我国恶性肿瘤发病首位(2015年，占比20.03％)。所以，全面预防和治疗肺癌，提高国民身体素质变得意义重大。
随着新药研发上市进程加快，肺癌的精准治疗方向越来越明确，靶向治疗、免疫治疗为患者提供更多可能。由于早期诊断方法并不完善，当患者被诊断患有肺癌时，往往处于晚期阶段。因无法及时根治和有限的医疗技术，我国肺癌患者的5年生存率约为16％，疾病的预防是国民身体健康的关键，所以，如果能够开发出预防和治疗肺癌的功能食品或者无毒副作用的药品，也许可以为人类为受肺癌疾病的困扰分忧。
冬虫夏草是虫草菌寄生在鳞翅目蝙蝠蛾科幼虫中以其为载体的虫菌复合体，含有丰富的蛋白质、脂肪、虫草酸、核苷类物质和多种氨基酸等活性物质，味道清香，早在一七五七年《本草从新》中就有“冬虫夏草甘平保肺，益肾，补精髓，止血化痰，已劳咳，治膈症皆良”的记载。中医认为，虫草入肺肾二经，既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚，阳萎遗精，腰膝酸痛，病后虚弱，久咳虚弱，劳咳痰血，自汗盗汗等，是唯一的一种能同时平衡、调节阴阳的中药。目前研究证明蛹虫草具有抑制肿瘤、止咳镇静、驱风、散热、驻容美颜、延缓衰老、提高机体免疫力、镇静催眠等作用。
蛹虫草(Cordyceps militaris)，属于新资源食品(卫生部公告2009年第3号)，在分类学上与冬虫夏草同归于虫草属,是一种珍贵的药用真菌，经本实验室研究证明，蛹虫草与冬虫夏草化学成分70％以上是相似的，药理作用与冬虫夏草相似，在临床上可替代冬虫夏草入药。由于冬虫夏草对生长环境的要求苛刻，导致冬虫夏草资源极为有限而不能满足日益增加的市场需求。目前，人工栽培蛹虫草已获成功，并实现了规模化生产，我们可以用人工栽培蛹虫草代替冬虫夏草入药。
我们选取蛹虫草为原料，通过溶剂提取、色谱分离获得抗失眠有效成分麦角甾醇，再配比虫草素、虫草提取物C3-12等，以期开发一系列绿色、健康的具有预防和治疗肺癌功效的食品或药物，为受肺癌影响生活的大众解决身体健康问题。
发明内容
本发明建立了一种预防和治疗肺癌的天然产品制备方法及应用，本产品对人体无毒副作用，可以安全用于人体预防和治疗肺癌，包括以下步骤：
(1)麦角甾醇(C310-6-2)、虫草素、C3-12的制备
(a)取烘干的蛹虫草子实体，进行超低温粉碎。在超微粉中加入一定量超纯水，加热提取3次，每次3h，合并提取液，浓缩备用。浓缩物用适量水分散，加入95％乙醇至乙醇终浓度为80％，充分混匀后，置4℃冰箱中沉淀过夜，离心，获得上清液和沉淀，浓缩，干燥备用；
(b)取(a)获得的上清液，加入15％甲醇-水溶解至浓度为200mg/ml，微孔滤膜过滤，用高效液相色谱进行分离，色谱柱为DAC150(150*250mm C1810μm)，洗脱方式为15％甲醇-水等度洗脱70min，紫外检测波长为260nm，收集35-50min馏分，浓缩干燥后即得虫草素样品；
(c)取(a)获得的沉淀，加入丙酮提取，离心后取上清液，用高效液相色谱进行分离，色谱柱为DAC150(150*250mm Silica 10μm)，洗脱45min，依次为100％正己烷10min、25％乙酸乙酯-正己烷25min、100％乙酸乙酯10min，紫外检测波长为260nm，收集18-25min馏分，烘干备用，收集35-45min馏分，浓缩干燥后即得C3-12样品；
(d)取(c)收集的18-25min馏分，加入二氯甲烷溶解至浓度为200mg/ml，微孔滤膜过滤，用高效液相色谱进行分离，色谱柱为DAC150(150*250mm Silica10μm)，洗脱40min，紫外检测波长为260nm，收集18-30min馏分，浓缩干燥后即得麦角甾醇(C310-6-2)样品；
(2)产品制作
本产品以麦角甾醇(C310-6-2)、虫草素、C3-12为原料，麦角甾醇(C310-6-2)质量占比为30％、虫草素质量占比为30％、C3-12质量占比为40％混合制作而成，简称五类混合物或三混合物五类；
根据后期剂型需求不同，麦角甾醇(C310-6-2)、虫草素、C3-12可以以任意比例、再配合其他剂型辅料进一步加工为片剂、胶囊、颗粒剂、冲剂等系列产品。
优选的，所述步骤(1)(a)中的中的超微粉碎处理是将烘干处理后的蛹虫草原料，使用50-80目筛网的粉碎机进行粗粉碎处理，并对粗粉碎处理后的蛹虫草原料，使用超微粉碎机进行粉碎处理(300-500目)，得到所述蛹虫草超微粉。
优选的，所述步骤(1)(a)中的提取操作是指每隔0.5h搅拌一次，提取时间为每次3h，合并提取液，浓缩。
优选的，所述步骤(1)(a)中加入提取溶剂的质量是沉淀物的质量的1.5-2.5倍。
优选的，所述步骤(1)(a)中的离心处理是指将降温处理后的所述浓缩提取液置于离心瓶中，离心温度为8-12℃，离心时间为0.5-1.5h，转速为3000-6000rpm/min。
优选的，所述步骤(1)(b)制备液相使用的色谱柱填料为直径10μm的C18，大小为150mm×250mm，洗脱方式为：15％甲醇-水等度洗脱70min，紫外检测波长为260nm，上样量为200mL，流速为600mL/min。
优选的，所述步骤(1)(c)中制备液相使用的色谱柱填料为直径10μm的Silica，大小为150mm×250mm，洗脱方式为：洗脱45min，依次为100％正己烷10min、25％乙酸乙酯-正己烷25min、100％乙酸乙酯10min，紫外检测波长为260nm，收集18-25min馏分，上样量为200mL，流速为600mL/min。
优选的，所述步骤(1)(c)浓缩干燥处理的温度为60-70℃。
优选的，所述步骤(1)(d)中制备液相使用的色谱柱填料为直径10μm的Silica，大小为150mm×250mm。
优选的，所述步骤(2)中本产品以麦角甾醇(C310-6-2)、虫草素、C3-12为原料，麦角甾醇(C310-6-2)质量占比为30％、虫草素质量占比为30％、C3-12质量占比为40％混合制作而成。
优选的，所述步骤(2)中本产品根据后期剂型需求不同，麦角甾醇(C310-6-2)、虫草素、C3-12可以以任意比例、再配合其他剂型辅料进一步加工为片剂、胶囊、颗粒剂、冲剂等系列产品。
本发明建立了预防和治疗肺癌的天然产品制备方法及应用，属于蛹虫草产品开发技术领域。以蛹虫草为原料，通过溶剂提取、色谱分离获得抗肺癌有效成分麦角甾醇，再配比虫草素、虫草提取物，以期开发一系列绿色、健康的具有预防和治疗肺癌功效的食品或药物，为预防肺癌的发生、受肺癌影响生活的人们解决身体健康问题。
说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例。
附图说明
图1所示的是图1所示的是本发明实施例1与实施例2得到天然预防和治疗肺癌的产品制备的流程图；
图2所示的是本发明天然预防和治疗肺癌的产品(五类混合物)的急性毒性实验结果。a.各组小鼠体重变化，b.各组小鼠的饮食变化；
图3所示的是本发明天然预防和治疗肺癌的产品(五类混合物)的急性毒性实验中各组动物死亡情况。a.混合物低剂量组(1g/kg)，b.混合物中剂量组(2g/kg)，c.混合物高剂量组(4g/kg)；
图4所示的是本发明天然预防和治疗肺癌的产品(五类混合物)的急性毒性实验，本产品对小鼠各主要脏器(心、肝、肺、肾、脑)的影响；
图5所示的是本发明天然预防和治疗肺癌的产品(五类混合物)抗Lewis肿瘤实验小鼠平均瘤重(g)；
图6所示的是本发明天然预防和治疗肺癌的产品(五类混合物)抗Lewis肿瘤实验小鼠平均肺重(g)；
图7所示的是本发明天然预防和治疗肺癌的产品(五类混合物)抗Lewis肿瘤实验小鼠净重平均变化量(g)；
图8所示的是本发明天然预防和治疗肺癌的产品(五类混合物)抗Lewis肿瘤实验小鼠肿瘤组织；
图9所示的是本发明天然预防和治疗肺癌的产品(五类混合物)抗Lewis肿瘤实验Lewis小鼠肺组织。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
本发明提供了一种预防和治疗肺癌的天然产品制备方法，具体包括以下步骤：
(1)买角甾醇(C310-6-2)、虫草素、C3-12的制备
(a)取烘干的蛹虫草子实体，进行超低温粉碎。在超微粉中加入一定量超纯水，加热提取3次，每次3h，合并提取液，浓缩备用。取浓缩物用适量水分散，加入95％乙醇至乙醇终浓度为80％，充分混匀后，置4℃冰箱中沉淀过夜，离心，获得上清液和沉淀，浓缩，干燥备用。
(b)取(a)获得的上清液，加入15％甲醇-水溶解至浓度为200mg/ml，微孔滤膜过滤，用高效液相色谱进行分离，色谱柱为DAC150(150*250mm C1810μm)，洗脱方式为15％甲醇-水等度洗脱70min，紫外检测波长为260nm，收集35-50min馏分，浓缩干燥后即得虫草素样品。
(c)取(a)获得的沉淀，加入丙酮提取，离心后取上清液，用高效液相色谱进行分离，色谱柱为DAC150(150*250mm Silica 10μm)，洗脱45min，依次为100％正己烷10min、25％乙酸乙酯-正己烷25min、100％乙酸乙酯10min，紫外检测波长为260nm，收集18-25min馏分，烘干备用，收集35-45min馏分，浓缩干燥后即得C3-12样品。
(d)取(c)收集的18-25min馏分，加入二氯甲烷溶解至浓度为200mg/ml，微孔滤膜过滤，用高效液相色谱进行分离，色谱柱为DAC150(150*250mm Silica10μm)，洗脱40min，紫外检测波长为260nm，收集18-30min馏分，浓缩干燥后即得麦角甾醇(C310-6-2)样品。
(2)产品制作
本产品由麦角甾醇(C310-6-2)、虫草素、C3-12为原料，麦角甾醇(C310-6-2)质量占比为30％、虫草素质量占比为30％、C3-12质量占比为40％混合制作而成。
根据后期剂型需求不同，麦角甾醇(C310-6-2)、虫草素、C3-12可以以任意比例、再配合其他剂型辅料进一步加工为片剂、胶囊、颗粒剂、冲剂等系列产品。
实施实例1：本产品(五类混合物)对小鼠的急性毒性实验
考察五类混合物的急性毒性
【药品及试剂】
受试样品：五类混合物样品(批号：20130930、纯度：100％、保存方法：4℃冷藏、配制方法：研磨后2％吐温80混合)
添加剂：吐温80(北京博润莱特科技有限公司分装)。
【实验动物】
KM小鼠(18～22g，雌雄各半)(动物许可证号：SCXK(京)2012-0001，合格证号：11400700020779)，动物来源(中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，SCXK(军)2012-0004)，饲料来源(中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，SCXK(军)2007-001)，饲养环境：普通级，室温21℃，常规饲喂。
【实验方法】
1.分组及给药方法
将40只实验小鼠共分为4组，每组10只，雌雄各半，分为①混合物高剂量组(4g/kg)、②混合物中剂量组(2g/kg)、③混合物低剂量组(1g/kg)、④空白组(2％吐温80生理盐水)，以上各组在空腹12h后，按各组别给药剂量灌胃给药一次。
2.观察指标
每日对各组小鼠进行称重、饮食量计算、是否有死亡现象及按附表观察是否有中毒反应的发生(标准参考附表)，并进行记录，于第14天对各组小鼠进行解剖观测。
【实验结果】
根据表1的结果，可以初步推测，五类混合药物在给药剂量为1g/kg-4g/kg范围内，采用口服给药方式，其对小鼠的体重及饮食方面无影响(具体参见图2)。在高剂量(4g/kg)时存活率可达80％，且死亡时间均为给药后1天(具体参见图3，除死亡时间较长脏器发生自溶现象不易进行观测外，可观测到的小鼠脏器可见其盲肠较为庞大，推测其死亡可能与饮食过量有关)。在不良反应方面，在给药剂量为1g/kg-4g/kg范围内出现不同程度的中毒反应，包括竖毛、口周毛潮湿、困倦、便软及多泪现象，涉及到自主神经系统及睡眠中枢系统(具体参见表2)。
在给药后14天对仍存活的小鼠进行解剖，对机体的主要脏器进行观测，并未发现有明显的器官改变(具体参见图4)。
根据本实验结果，应用Bliss方法计算五类混合药物LD50，其结果为LD50＝57.94g/kg。
表1五类混合物急性毒性实验结果
Figure BDA0002410699310000071
Figure BDA0002410699310000081
附表急性毒性试验的一般观察结果与可能涉及的组织、器官、系统
Figure BDA0002410699310000082
Figure BDA0002410699310000091
Figure BDA0002410699310000101
实施实例2：本产品(三混合五类物质)抗Lewis肿瘤实验采用lewis荷瘤小鼠模型考察三混合五类物质抗肺癌肿瘤作用。
【药品及试剂】
lewis肺癌瘤株(第5代)、五类混合物样品(20131028)、三混合五类样品、环磷酰胺片(天津金世制药有限公司，20130101)、吐温80(北京博润莱特科技有限公司分装)。
【试验动物】
C57BL/6小鼠(18～22g)(动物许可证号：SCXK(京)2012-0001，合格证号：11400700020779)
【器材及仪器】
注射器、无菌平皿、离心管、手术器械、超净工作台、组织匀浆器。
【步骤】
1.小鼠Lewis肺癌荷瘤模型建立
取接种肿瘤8-13天状态良好的荷瘤脱臼处死，体表酒精消毒，在无菌(超净台)环境下剥离小鼠肿瘤至盛有生理盐水的无菌平皿，剪至小块，将小块肿瘤放入组织匀浆器，按体积比1:3左右加入生理盐水匀浆，匀浆液倒入50ml无菌离心管，备用。用1ml注射器在C57小鼠右腋下注射接种0.2ml，肿瘤细胞混悬液的制备均在无菌条件下(超净工作台中)完成。从取出肿瘤腹水至肿瘤接种完毕在60分钟内完成。
2.药物制备方法
三混合五类物质灌胃剂：称定一定重量的三混合无类物质样品至研钵中，加入所需溶剂体积2％吐温-80，充分研磨后再加入所需体积的生理盐水，混匀后，备用。
环磷酰胺灌胃剂：去掉环磷酰胺片的薄膜衣后进行称取，称取一定重量至研钵中，加入所需体积的生理盐水，充分研磨、混匀后备用。
3.分组及给药方法
将60只实验小鼠共分为6组，每组10只，雌雄各半，分为①混合物低剂量(67mg/kg)组、②混合物中剂量(200mg/kg)组、③混合物高剂量(600mg/kg)组、④环磷酰胺组、⑤模型组、⑥空白组，以上除空白组外，其余各组在注射肿瘤混悬液后，均每日给药一次，每次每只0.2ml，连续给药10天，空白组在相同给药时间及给药时长灌胃给予2％吐温-80水溶液，连续灌胃10天。
4.观察指标
4.1大体状态
每日对小鼠进行体重、饮食量的称定并记录，于最后一次计算小鼠除瘤后的体重净重。
4.2瘤重及肿瘤抑制率
每日对小鼠右腋下进行观察，于最后一次给药24h后，解剖并取出肿瘤组织，称取肿瘤重量，按下述公式计算肿瘤生长抑制率。
Figure BDA0002410699310000121
4.3肺组织重量及癌变肺部转移率
于最后一次给药24h后，解剖并取出肺组织，称取肺组织重量，并观察肺组织是否有变化并统计有肺癌转移的小鼠数量。
5.数据统计
各组别小鼠相应数据均以表示，采用SPSS软件进行统计，各组别采用one-wayANOVA检验。
【结果】
由表2、图5～图9实验结果可知，三混合五类物质在给予剂量为600mg/kg，服药天数为10天时与Lewis肺癌肿瘤模型小鼠比较有极显著差异(P<0.01)，此剂量与环磷酰胺组比较无明显差异，但肿瘤抑制率优于环磷酰胺。
在肺转移方面，除环磷酰胺组与模型组未出现转移外，其余各组均出现10％-20％的肺转移现象，但无统计学意义。
在净体重变化方面，环磷酰胺组出现体重下降，且与模型组比较有显著差异(P<0.05)；600mg/kg剂量组体重出现下降，与67mg/kg剂量组比较有显著差异(P<0.05)；67mg/kg剂量组体重增长，且与环磷酰胺组比较有极显著差异(P<0.01)。
综上所述，推测三混合五类物质在给药剂量为600mg/kg、服药剂量为10天时，其对小鼠Lewis肺癌模型具有较好的疗效，疗效优于环磷酰胺，但服药机体可能会出现体重下降现象。三混合五类物质对服药机体体重有一定程度的影响，与给药剂量呈现正比关系。
表2抗肿瘤试验结果
Figure BDA0002410699310000122
Figure BDA0002410699310000131
注：与模型组比较**p<0.01、*p<0.05；与环磷酰胺组比较△△p<0.01；与低剂量组比较°p<0.05。

Claims (10)

1.一种预防和治疗肺癌的天然产品制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)麦角甾醇(C310-6-2)、虫草素、C3-12的制备
(a)取烘干的蛹虫草子实体，进行超低温粉碎。在超微粉中加入一定量超纯水，加热提取3次，每次3h，合并提取液，浓缩备用,取浓缩物用适量水分散，加入95％乙醇至乙醇终浓度为80％，充分混匀后，置4℃冰箱中沉淀过夜，离心，获得上清液和沉淀，浓缩，干燥备用；
(b)取(a)获得的上清液，加入15％甲醇-水溶解至浓度为200mg/ml，微孔滤膜过滤，用高效液相色谱进行分离，色谱柱为DAC150(150*250mm C18 10μm)，洗脱方式为15％甲醇-水等度洗脱70min，紫外检测波长为260nm，收集35-50min馏分，浓缩干燥后即得虫草素样品；
(c)取(a)获得的沉淀，加入丙酮提取，离心后取上清液，用高效液相色谱进行分离，色谱柱为DAC150(150*250mm Silica 10μm)，共洗脱45min，依次为100％正己烷10min、25％乙酸乙酯-正己烷25min、100％乙酸乙酯10min，紫外检测波长为260nm，收集18-25min馏分，烘干备用，收集35-45min馏分，浓缩干燥后即得C3-12样品；
(d)取(c)收集的18-25min馏分，加入二氯甲烷溶解至浓度为200mg/ml，微孔滤膜过滤，用高效液相色谱进行分离，色谱柱为DAC150(150*250mm Silica 10μm)，洗脱40min，紫外检测波长为260nm，收集18-30min馏分，浓缩干燥后即得麦角甾醇(C310-6-2)样品；
(2)产品制作
本产品以麦角甾醇(C310-6-2)、虫草素、C3-12为原料，麦角甾醇(C310-6-2)质量占比为30％、虫草素质量占比为30％、C3-12质量占比为40％混合制作而成。简称五类混合物或三混合五类；
根据后期剂型需求不同，麦角甾醇(C310-6-2)、虫草素、C3-12可以以任意比例、再配合其他剂型辅料进一步加工为片剂、胶囊、颗粒剂、冲剂等系列产品。
2.根据权利要求1所述的以蛹虫草为原料，提取分离抗肺癌药效成分的方法，其特征在于：所述步骤(1)(a)中的中的超微粉碎处理是将烘干处理后的蛹虫草原料，使用50-80目筛网的粉碎机进行粗粉碎处理，并对粗粉碎处理后的蛹虫草原料，使用超微粉碎机进行粉碎处理(300-500目)，得到所述蛹虫草超微粉。
3.根据权利要求1所述的以蛹虫草为原料，提取分离抗肺癌药效成分的方法，其特征在于：所述步骤(1)(a)中的提取操作是指每隔0.5h搅拌一次，提取时间为每次3h，合并提取液，浓缩。
4.根据权利要求1所述的以蛹虫草为原料，提取分离抗肺癌药效成分的方法，其特征在于：所述步骤(1)(a)中加入提取溶剂的质量是沉淀物的质量的1.5-2.5倍。
5.根据权利要求1所述的以蛹虫草为原料，提取分离抗肺癌药效成分方法，其特征在于：所述步骤(1)(a)中的离心处理是指将降温处理后的所述浓缩提取液置于离心瓶中，离心温度为8-12℃，离心时间为0.5-1.5h，转速为3000-6000rpm/min。
6.根据权利要求1所述的以蛹虫草为原料，提取分离抗肺癌药效成分的方法，其特征在于：所述步骤(1)(b)制备液相使用的色谱柱填料为直径10μm的C18，大小为150mm×250mm，洗脱方式为：15％甲醇-水等度洗脱70min，紫外检测波长为260nm，上样量为200mL，流速为600mL/min。
7.根据权利要求1所述的以蛹虫草为原料，提取分离抗肺癌药效成分的方法，其特征在于：所述步骤(1)(c)中制备液相使用的色谱柱填料为直径10μm的Silica，大小为150mm×250mm，洗脱方式为：洗脱45min，依次为100％正己烷10min、25％乙酸乙酯-正己烷25min、100％乙酸乙酯10min，紫外检测波长为260nm，收集18-25min馏分，上样量为200mL，流速为600mL/min。
8.根据权利要求1所述的以蛹虫草为原料，提取分离抗肺癌药效成分的方法，其特征在于：所述步骤(1)(d)中制备液相使用的色谱柱填料为直径10μm的Silica，大小为150mm×250mm。
9.根据权利要求1所述预防和治疗肺癌的产品制作方法，其特征在于：麦角甾醇(C310-6-2)质量占比为30％、虫草素质量占比为30％、C3-12质量占比为40％混合制作而成。
10.根据权利要求1所述预防和治疗肺癌的产品制作方法，其特征在于：本产品以麦角甾醇(C310-6-2)、虫草素、C3-12为原料，根据后期剂型需求不同，麦角甾醇(C310-6-2)、虫草素、C3-12可以以任意比例、再配合其他剂型辅料进一步加工为片剂、胶囊、颗粒剂、冲剂等系列产品。
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