CN103520222A - 北冬虫夏草提取物及其在制备治疗肿瘤药物上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种北冬虫夏草提取物，其中虫草多糖与虫草素的重量比为1－25:1。所述北冬虫夏草提取物选自人工培育北冬虫夏草子实体的提取物、从人工培育北冬虫夏草培养基中得到的提取物，及从人工培育北冬虫夏草培养基中得到的提取物加北冬虫夏草子实体细粉的复合物。本发明还提供北冬虫夏草提取物在制备治疗肿瘤药物上的应用。所述肿瘤包括实体瘤和非实体瘤，例如肝癌、肺癌、乳腺癌和肉瘤中的一种或一种以上或白血病。所述药物还具有增强免疫功能、协同放疗或化疗的治疗作用和降低放疗或化疗药物毒性的作用。

Description

北冬虫夏草提取物及其在制备治疗肿瘤药物上的应用

技术领域

本发明涉及北冬虫夏草的研究，特别涉及北冬虫夏草的活性部位及其制备治疗肿瘤药物的应用。

背景技术

北冬虫夏草，又名蛹虫草，蛹草，北虫草，蛹草菌等，在吉林省首次发现，经鉴定它与冬虫夏草为同一属，故定名为蛹草。分类学上属于真菌门，子囊菌亚门，核菌纲，球壳目，麦角菌科，虫草属。北冬虫夏草作为传统珍贵中药材，我国人民对其药用价值早有认识。李时珍在《本草纲目》中指出，蝉花能主治“小儿天吊惊痫，夜啼，心悸”。据考证，当时的“蝉花”包括了蝉虫草和蛹虫草等多种寄生于虫体或蛹体上的虫草。赵学敏在《本草纲目拾遗》中把虫草类的药用归之为“能治百虚百损”。《新华本草纲要》称，蛹草“全草：味甘，性平。有益肺肾，补精髓，止血化痰的功能”，可见其功效与冬虫夏草近似，故一些医家将其作为冬虫夏草的替代品入药应用。北冬虫夏草人工栽培成功以来，随着人们对北冬虫夏草的滋补保健功效和多种药用价值的认识，其开发利用研究倍受关注。

《中国药事》1985年第14卷第9期报道了人工发酵培养虫草菌成功。中国专利申请201010278624.1和201010278637.9公开了复方发酵虫草菌粉(蝙蝠蛾拟青霉Cs-4菌粉)及其组合药物用于抗衰老、抗疲劳、耐缺氧、提高免疫力、镇静、抗休克、抗光辐射的用途。中国药典2010年版记载有金水宝胶囊和金水宝片，都是由冬虫夏草菌（蝙蝠蛾拟青霉Cs-4）发酵制成。其功效与主治为补肺益肾、秘精益气。用于肺肾两虚，精气不足，久咳虚喘，神疲乏力，不寐健忘，腰膝瘦软，月经不调，阳痿早泄；慢性支气管炎、慢性肾功能不全、高脂血症、肝硬化见上述症候者。

本申请人早先申请的中国专利申请CN 102037854A公开了一种北冬虫夏草子实体的培养方法。该方法将接种后的培养容器排列堆放于可控光培养架上置组培室中培养，在避光培养后通过可控光培养架调控光照强度和光照周期进行光照培养，从而满足了北冬虫夏草正常生长对光照的需求，使出草率提高，生物转化率提高，并通过调节出草管理阶段的光照强度和光照周期使子实体内有效成分含量提高和增加子实体内生物量的积累。

本申请人还对北冬虫夏草子实体和培养基进行了提取精制，对提取物进行了祛邪（抗肿瘤作用）、扶正（增强免疫功能）和减毒作用的药理学研究。因此，本发明的目的是提供北冬虫夏草提取物及其在制备治疗肿瘤药物上的应用。

发明内容

本发明提供一种北冬虫夏草提取物，其中虫草多糖与虫草素的重量比为1－25:1。

本发明提供的“北冬虫夏草提取物”来自人工培育北冬虫夏草子实体的提取物、从人工培育北冬虫夏草培养基中得到的提取物，以及从人工培育北冬虫夏草培养基中得到的提取物加北冬虫夏草子实体细粉的复合物。

本发明的北冬虫夏草提取物中，虫草多糖与虫草素的重量比可为4-8:1，也可为5-10:1，或为8-20:1。

本发明还提供这种北冬虫夏草提取物在制备治疗肿瘤药物上的应用。

本发明对北冬虫夏草提取物的临床前药理学研究显示：

北冬虫夏草提取物在600、300、150mg/kg三个剂量下，对小鼠肝癌H22、小鼠Lewis肺癌和小鼠S180肉瘤的生长均有不同程度的抑制作用，与化疗药5FU、CDDP、CTX合用显示了一定的相加作用，疗效好于单独用药。北冬虫夏草提取物单用及合并CTX对荷白血病P388小鼠的生命有一定的延长作用。

北冬虫夏草提取物对移植于裸鼠的人体乳腺癌MDA-MB-435、人体肺癌A549成瘤后开始给药，均具有一定的生长抑制作用，量效关系明显。分别与化疗药Taxol和Gemzar合用，显示了一定的相加作用。

北冬虫夏草提取物与放疗合并使用，抑瘤作用也明显强于单独放疗。

北冬虫夏草提取物对荷瘤小鼠的免疫功能有明显的促进作用。

北冬虫夏草提取物对大剂量环磷酰胺引起的小鼠白细胞降低有明显的治疗作用。

因此，本发明提供北冬虫夏草提取物在制备治疗肿瘤药物上的应用，所述肿瘤包括实体瘤和非实体瘤。实体瘤为诸如肝癌、肺癌、乳腺癌和肉瘤中的一种或一种以上。非实体瘤为诸如白血病。

本发明提供的北冬虫夏草提取物在制备治疗肿瘤药物上的应用，除了提供抑制肿瘤细胞的作用外，还具有增强免疫功能、协同放疗或化疗的治疗作用和降低放疗或化疗药物毒性的作用。

本说明书中涉及的比例或百分比，若非特别指出，均为重量比或重量百分比。

附图说明

图1显示三种剂量北冬虫夏草提取物对环磷酰胺引起的白细胞降低的影响。

具体实施方式

以下用实验例对本发明作进一步阐述。本技术领域普通技术人员应当认识到，这些实验例仅仅用于举例说明本发明而不对本发明的范围构成任何限制，对本发明所作的任何改变，只要不违背本发明的精神实质，都将落在权利要求范围内。

实施例1：北冬虫夏草提取物的制备

1）北冬虫夏草子实体提取物的制备

将人工培育的北冬虫夏草子实体干燥、粉碎后用去离子水浸泡20h后过滤，根据情况可重复几次，用水量和浸泡时间渐减。滤液离心后上清液流经732＃阳离子交换树脂柱。将流穿液的pH调节至7.0-7.5，用截留分子量为4000的超滤膜超滤，截留液减压浓缩干燥后得虫草多糖提取物，其中虫草多糖含量为60-85％。树脂柱用1mol/L氨水洗脱至洗脱液几近无色，将洗脱液减压浓缩干燥后得虫草素提取物，其中虫草素含量为15-40％。

将人工培育北冬虫夏草子实体的虫草多糖提取物和虫草素提取物合并，组成人工培育北冬虫夏草子实体的提取物，其中虫草多糖：虫草素＝1－25:1。

2）北冬虫夏草培养基提取物的制备

将人工培育北冬虫夏草后的培养基干燥、粉碎后用去离子水浸泡20h后过滤，根据提取情况可重复几次，用水量和浸泡时间可渐减。滤液离心后上清液流经732＃阳离子交换树脂柱，流速为25ml/min。将流穿液的pH调节至7.0-7.5，用截留分子量为4000的超滤膜超滤，截留液减压缩并干燥后得虫草多糖提取物，其中虫草多糖含量为50-80％。树脂柱用1mol/L氨水洗脱至洗脱液几近无色，将洗脱液减压浓缩干燥后即得虫草素提取物，其中虫草素含量为15-30％。

将人工培育北冬虫夏草培养基的虫草多糖提取物和虫草素提取物合并，得到北冬虫夏草培养基提取物其中虫草多糖：虫草素＝1－25:1。

3）北冬虫夏草培养基提取物＋北冬虫夏草子实体细粉混合物的制备

按上述2）制得北冬虫夏草培养基提取物。

将干燥的北冬虫夏草子实体制成80-200目细粉。

将北冬虫夏草培养基提取物和北冬虫夏草子实体细粉均匀混合，其中虫草多糖：虫草素＝1－25:1。

以上三种产品统称北冬虫夏草提取物，其中虫草多糖：虫草素＝1－25:1。

以下实验例中采用的材料和装置：

受试药物均为北冬虫夏草提取物（实施例1的产物，淡棕色粉末,简称提取物，由上海国宝企业发展中心提供北冬虫夏草，上海医药工业研究院中药研究室制备提取物，批号080606），用蒸馏水配至所需浓度。提取物低、中、高剂量组分别为150mg/kg、300mg/kg和600mg/kg。

阳性对照药：金水宝胶囊（江苏济民可信金水宝制药有限公司，号041007，20mg/片），用蒸馏水配至所需浓度；氟尿嘧啶注射液（5FU）（上海华联制药有限公司生产，批号080409，无色澄明液体，0.25g/10ml）、注射用顺铂（CDDP）（锦州九泰药业有限责任公司生产，批号060604，黄色结晶性粉末，20mg/瓶）、环磷酰胺（CTX）（江苏恒瑞医药股份有限公司生产，批号08041521，白色结晶，200mg/瓶）、紫杉醇注射液(Taxol)（浙江海正药业股份有限公司生产，批号071001，液体，30mg/5ml）、注射用盐酸吉西他滨（健择，Gemzar）（Lilly France S.A.生产，批号A404170（2007.06-2010.05），200mg/支），用灭菌生理盐水稀释，其中紫杉醇注射液现配现用。

其它材料：培养基RPMI-1640，Gibco产品，内含15％NBS、巯基乙醇、Hepes等；刀豆球蛋白A(ConA)，中国医药（集团）上海化学试剂公司，50μg/ml；Yac-1细胞；白细胞计数液（3％冰醋酸+数滴龙胆紫）。

实验动物：昆明种小鼠、C57BL/6小鼠、DBA/2小鼠、BALB/C裸鼠（SPF级）,由上海斯莱克实验动物有限责任公司供应，生产许可证号：SCXK（沪）2007-0005，使用许可证号：SYXK（沪）2004-0015。

钴60辐照装置：钴60（Co60）（照射单位：第二军医大学；剂量率：2Gy/min；照射剂量：4Gy）。

全自动酶标仪（Wellscan MK2）：Labsystems。

预实验显示，北冬虫夏草提取物中虫草多糖与虫草素的重量比为1-3:1或4-8:1或5-10:1或8-20:1或10:25:1时均有抗肿瘤、增强免疫功能和减轻化、放疗副作用的效果。以下采取虫草多糖与虫草素的重量比为4-8:1进行药效学试验。

实验例1：北冬虫夏草提取物单用及合并5FU对小鼠肝癌H22生长 的抑制作用

健康昆明种小鼠，19-21g，雌雄兼用，每批试验同一性别，共进行两批试验。

第一批试验取生长良好的小鼠肝癌H22腹水，用生理盐水1:4稀释后（细胞浓度约1～2×10⁷个/ml），每只小鼠（♀）腋皮下接种0.2ml，随机分为：空白对照组、5FU（15mg/kg，ip×5）组、金水宝胶囊（600mg/kg，ig×7）组、提取物低、中、高剂量组，及提取物低、中、高剂量组分别+5FU（给药方案同单独给药）。

接种次日起按以上方案开始给药，连续给药7天，给药体积为0.5ml/20g体重。接种第10天处死动物，称体重后解剖取瘤块并称重，根据以下公式计算抑瘤率：

合并用药的效应根据金氏公式计算Q值：

Q=Ea+b/(Ea+Eb－Ea×Eb)

Ea+b为合并用药的抑瘤率，Ea和Eb分别为A药和B药的抑瘤率。如Q值0.85～1.15为相加（＋），>1.15为增强（＋＋）。

试验结果：

第一批试验中，提取物高、中、低剂量组的抑瘤率分别为47.07、40.04、32.44%；15mg/kg剂量的5FU连续腹腔注射5次抑瘤率为52.60%；高、中、低剂量提取物分别合并5FU抑瘤率为63.64、60.95、58.78%,Q值均大于0.85，有相加作用。结果见表1。

表1.北冬虫夏草提取物单用及合并5FU对小鼠肝癌H22的抑瘤作用

与空白对照组比较：*P<0.05，**P<0.01。

第二批试验用雄性小鼠，高、中、低剂量组的抑瘤率分别为43.39、36.89、31.16%。

两批试验的结果重复性好，均呈现明显的量效关系。统计分析表明，提取物各剂量组的抑瘤作用与对照组之间差异非常显著(P<0.01)。

结论：北冬虫夏提取物对小鼠肝癌H22实体瘤生长有一定的抑制作用，与化疗药5FU合用有相加作用。

实验例2：北冬虫夏草提取物单用及合用CDDP对小鼠Lewis肺癌 生长的抑制作用

取生长良好的Lewis肺癌瘤块，用生理盐水匀浆制备成细胞悬液(细胞浓度约1～2×10⁷个/ml)，给每只C57BL/6小鼠（♂，18-20g）腋皮下接种0.2ml后，随机分组为：空白对照组、顺铂（CDDP）（2mg/kg，ip×5）、金水宝胶囊（600mg/kg，ig×10）、提取物低、中、高剂量组（ig×10）及提取物低、中、高剂量组分别+CDDP（给药方案同单独给药）。

接种次日起按以上方案开始给药，连续给药10天，给药体积为0.5ml/20g体重。接种第12天处死动物，称体重后解剖取瘤块并称重，根据以下公式计算抑瘤率：

试验结果

第一批试验中，提取物高、中、低剂量组的抑瘤率分别为43.86、38.09、15.41%；2mg/kg剂量CDDP连续腹腔注射5次抑瘤率为55.11%；高、中、低剂量提取物分别合并CDDP抑瘤率分别为64.61、64.50、59.43%；Q值均大于0.85，有相加作用。结果见表2。

表2.北冬虫夏草提取物对小鼠Lewis肺癌的抑瘤作用

与空白对照组比较：*P<0.05，**P<0.01。

第二批试验结果亦呈现明显的量效关系，重复性好。统计分析表明，提取物各剂量组的抑瘤作用与对照组之间差异非常显著(P<0.01)。

结论：北冬虫夏草提取物对小鼠Lewi s肺癌的生长有一定的抑制作用，与CDDP合用有相加作用。

实验例3：北冬虫夏草提取物单用及合并CTX对小鼠S180肉瘤生 长的抑制作用

健康昆明种小鼠，雌雄兼用，每批试验同一性别，进行两批试验。

每批试验取生长良好的S180腹水，用生理盐水1:4稀释后（细胞浓度约1～2×10⁷个/ml），每只小鼠腋皮下接种0.2ml，随机分组为：空白对照组、CTX（30mg/kg，ip×7）组、CTX（20mg/kg，ip×2）组、金水宝胶囊（600mg/kg，ig×7）组、提取物低、中、高剂量组（ig×7），及提取物低、中、高剂量组分别+CTX（20mg/kg，ip×2）（给药方案同单独给药）。

接种次日起按以上方案开始给药，连续给药7天，给药体积为0.5ml/20g体重。接种第10天处死动物，称体重后解剖取瘤块并称重，根据以下公式计算抑瘤率：

试验结果

第一批试验中，高、中、低剂量提取物的抑瘤率分别为40.48、27.62、22.15%。

第二批试验中，高、中、低剂量提取物的抑瘤率分别为42.21、32.81、23.92%。20md/kg剂量CTX腹腔注射2次抑瘤率为45.08%，高、中、低剂量提取物合并CTX抑瘤率分别为56.54、53.80、50.43%，Q值分别为0.828、0.853、0.866，有相加作用。结果见表3。

两批试验的结果重复性好，均呈现明显的量效关系。

表3.北冬虫夏草提取物对小鼠S180肉瘤的抑瘤作用，♀

与空白对照组比较：*P<0.05，**P<0.01。

结论：北冬虫夏草提取物对小鼠S180肉瘤的生长有一定的抑制作用。与CTX合用有相加作用。

实验例4：提取物单用及合并CTX对荷白血病P388小鼠的生命延 长作用

取生长良好的P388腹水，用生理盐水1：4稀释(细胞浓度约1～2×10⁷个/ml)，每只DBA/2小鼠（18-20g）腋皮下接种0.2ml，随机分组为：空白对照组、CTX（30mg/kg，iv×6）组、金水宝胶囊（600mg/kg，ig×7）组、提取物低、中、高剂量组（ig×10），及提取物低、中、高剂量组分别+CTX（给药方案同单独给药）。

接种次日起按以上方案开始给药，连续给药10天，给药体积为0.5ml/20g体重。每天观察动物情况，记录动物死亡情况，根据以下公式计算生命延长率：

试验结果

试验一：30mg/kg CTX连续静脉注射6次的生命延长率为50.82%，提取物高、中、低剂量，生命延长率分别为21.31、11.48、6.56%，合用CTX的生命延长率分别为88.52、85.25、55.74%。Q值分别为1.444、1.510、1.031。

试验二：30mg/kg CTX连续静脉注射6次的生命延长率为60.00%，提取物高、中、低剂量，生命延长率分别为28.00、14.00、6.00%，合用CTX的生命延长率分别为94.00、86.00、68.00%。Q值分别为1.320、1.311、1.090。结果见表4。

表4.提取物对荷白血病小鼠生命延长作用

与空白对照组比较：*P<0.05，**P<0.01。

结论：北冬虫夏草提取物对荷白血病P388的小鼠有一定的生命延长作用，与CTX合用有显著的增效作用。

实验例5；北冬虫夏草提取物单用及合并Taxol对移植于裸鼠的人 体乳腺癌MDA-MB-435的疗效

取生长良好的人乳腺癌MDA-MB-435瘤块，无菌条件下切割成2-3mm大小的均匀小块，用套管针给每只雌性BALB/C裸鼠（SPF级，18-20g），右腋皮下接种一块，随机分组为：空白对照组、Taxol（25mg/kg，ip×5）组、金水宝胶囊（600mg/kg，ig×7）组、提取物低、中、高剂量组（ig×10），及提取物低、中、高剂量组分别+Taxol（给药方案同单独给药）。

接种后12日（试验二13日），全部动物接种部位可见一小肿块，根据肿瘤大小重新分组，淘汰肿瘤过大和过小的动物，每组肿瘤平均体积基本一致，开始按以上方案开始给药，给药体积为0.5ml/20g体重。并用游标卡尺每4天测瘤块的长径（a）、短径（b），肿瘤体积（tumorvolume,TV）计算公式为：TV=1/2×a×b²，相对肿瘤体积（relative tumorvolume,RTV）计算公式为：RTV=Vt/Vo，Vo为分笼时（即do）测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖抑制率(%)＝（1-TRTV/CRTV）×100%，并进行T检验。接种后26天（试验二28天）处死动物，解剖取瘤块，称瘤重，计算抑瘤率。

试验结果

试验一：北冬虫夏草提取物高、中、低剂量组，见瘤后连续给药14天，对移植于裸鼠的人体乳腺癌MDA-MB-435的抑瘤率分别为42.62、37.98、29.52%，Taxol一次腹腔注射25mg/kg抑瘤率为48.92%，提取物高、中、低剂量合并Taxol的抑瘤率分别为61.53、59.37、56.38%，Q值均大于0.85，统计分析表明，提取物各剂量组的抑瘤作用与空白对照组之间差异非常显著(P<0.01)。结果见表5。

表5.提取物单用及合并Taxol对移植于裸鼠的

人体乳腺癌MDA-MB-435的疗效

与空白对照组比较：*P<0.05,**P<0.01。

试验二：北冬虫夏草提取物高、中、低剂量组，见瘤后连续给药14天，对移植于裸鼠的人体乳腺癌MDA-MB-435的抑瘤率分别为33.76、25.25、19.63%，Taxol一次腹腔注射25mg/kg抑瘤率为49.10%，提取物高、中、低剂量分别合并Taxol抑瘤率为58.98、55.79、50.93%，Q值均大于0.85，统计分析表明，提取物各剂量组的抑瘤作用与空白对照组之间差异非常显著(P<0.01)。

结论：北冬虫夏草提取物口服给药对移植于裸鼠的人体乳腺癌MDA-MB-435的生长有明显的抑制作用，与Taxol合用有相加作用。

实验例6:北冬虫夏草提取物对移植于裸鼠的人体肺癌A549生长 的抑制作用

取生长良好的人体肺癌A549瘤块，无菌条件下切割成2-3mm大小的均匀小块，用套管针给每只雌性BALB/C裸鼠（SPF级，18-20g）右腋皮下接种一块，随机分组为：空白对照组、Gemzar（100mg/kg，ip×1）组、金水宝胶囊（600mg/kg，ig×7）组、提取物低、中、高剂量组（ig×10），及提取物低、中、高剂量组分别+Gemzar（给药方案同单独给药）。

接种后12日（试验二13日），全部动物接种部位可见一小肿块，根据肿瘤大小重新分组，淘汰肿瘤过大和过小的动物，每组肿瘤平均体积基本一致，开始按以上方案开始给药，给药体积为0.5ml/20g体重，并用游标卡尺每4天测瘤块的长径（a）、短径（b），肿瘤体积（tumorvolume,TV）计算公式为：TV=1/2×a×b²，相对肿瘤体积（relative tumorvolume,RTV）计算公式为：RTV=Vt/Vo，Vo为分笼时（即do）测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖抑制率(%)＝（1-TRTV/CRTV）×100%，并进行T检验。接种后29天处死动物，解剖取瘤块，称瘤重，计算抑瘤率。

试验结果

试验一：北冬虫夏草提取物高、中、低剂量组小鼠见瘤后连续给药14天，对移植于裸鼠的人体肺癌A549的抑瘤率分别为43.01、31.75、19.72%，100mg/kg剂量Gemzar腹腔注射一次抑瘤率为58.70%，提取物高、中、低剂量合并Gemzar抑瘤率分别为66.30、64.98、62.17%，Q值均大于0.85，统计分析表明，提取物各剂量组的抑瘤作用与空白对照组之间差异非常显著(P<0.01)。结果见表6。

表6.北冬虫夏草提取物对移植于裸鼠的人体肺癌A549的疗效

与空白对照组比较：*P<0.05,**P<0.01。

试验二：北冬虫夏草提取物在剂量600、300、150mg/kg，见瘤后连续给药14天，对移植于裸鼠的人体肺癌A549的抑瘤率分别为40.76、27.57、15.95%，100mg/kg剂量Gemzar腹腔注射一次抑瘤率为52.38%，提取物高、中、低剂量合并Gemzar的抑瘤率分别为64.00、59.70、55.68%，Q值均大于0.85，统计分析表明，提取物各剂量组的抑瘤作用与空白对照组之间差异非常显著(P<0.01)。

结论：北冬虫夏草提取物口服给药对移植于裸鼠的人体肺癌A549的生长有明显的抑制作用。与Gemzar合用有相加作用。

实验例7：北冬虫夏草提取物合并钴60辐照对小鼠肝癌H22的作用

将生长良好的小鼠肝癌H22腹水用生理盐水1:4稀释后，每只小鼠（昆明种,19-21g，雄性）腋皮下接种0.2ml，随机分组为：空白对照组、Co60（剂量率2Gy/min，照射剂量4Gy）组、提取物低、中、高剂量组（ig×7），及提取物低、中、高剂量组分别+Co60（给药方案同单独给药）。

接种次日起按以上方案开始给药，接种第3天第2、6、7、8组小鼠接受Co60照射(2Gy/min×2)，接种10日脱颈处死动物后，称体重，解剖取瘤块称重，计算抑瘤率和Q值。

试验结果

4Gy的Co60照射一次后对小鼠肝癌H22的抑瘤率为45.91%，北冬虫夏草提取物高、中、低剂量组的抑瘤率分别为42.11、34.47、23.18%。分别与4Gy的Co60合并使用后的抑瘤率分别为57.85、53.55、47.16%，作用明显强于单独使用。实验结果见表7。

表7.提取物合并放疗对小鼠肝癌H22的作用

与空白对照组比较：**P<0.01。

实验例8：北冬虫夏草提取物对荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖、NK细 胞活性、IL-2分泌的影响

C57BL/6小鼠（18-20g，雄性）36只，每鼠腋皮下接种Lewis肺癌细胞悬液，随机分为6组，每组6只，即提取物150、300、600mg/kg(ig×14),金水宝胶囊600mg/kg(ig×14)，荷瘤对照组，另设一组正常对照组。给药结束后次日处死动物，无菌条件下取脾，制备脾细胞悬液，计数脾细胞，调整每组细胞浓度为5×10⁷个/ml。

1）提取物对脾淋巴细胞增殖的影响

96孔培养板上每孔加5×10⁷个/ml浓度的脾细胞悬液100μl，ConA50μl，37℃，5％CO2条件下培养72小时，每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μl，继续培养4小时后,每孔加入溶解液100μl，置37℃培养箱，次日用全自动酶标仪测570nm处OD值，各用药组与荷瘤对照组比较。结果见表8-1。

表8-1.提取物对荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖的影响

与荷瘤组比较：*P<0.05，**P<0.01。

2）提取物对NK细胞活性的影响

96孔培养板上每孔加1×10⁷个/ml浓度的脾细胞悬液50μl作效应细胞，另取对数生长期Yac-1细胞，调整细胞浓度为1×10⁵个/ml，每孔加入50μl作为靶细胞，靶细胞与效应细胞之比为1：100，37℃，5％CO2条件下培养24小时后，每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μl，继续培养4小时后,每孔加入溶解液100μl，置37℃培养箱，次日用全自动酶标仪测570nm处OD值，各用药组与荷瘤对照组比较。结果见表8-2。

表8-2.提取物对荷瘤小鼠NK细胞活性的影响

与荷瘤组比较：*P<0.05，**P<0.01。

3）提取物对IL-2分泌的影响

24孔培养板上每孔加5×107个/ml浓度的脾细胞悬液1500ul，ConA150μl，37℃，5％CO₂条件下培养24小时，取上清液加入96孔培养板各孔中，每孔50μl，另将正常C57BL/6小鼠胸腺制成细胞悬液，每孔加入50μl，加入ConA 20μl，混匀后置37℃，5％CO₂条件下培养48小时后，每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μl，继续培养4小时后,每孔加入溶解液100μl，置37℃培养箱，次日用全自动酶标仪测570nm出OD值，各用药组与荷瘤对照组比较。结果见表8-3。

表8-3.提取物对荷瘤小鼠IL-2分泌的影响

与荷瘤组比较：*P<0.05，**P<0.01。

实验例9：提取物对环磷酰胺引起的小鼠白细胞降低的治疗作用

昆明种小鼠（19-21g，雄性）随机分为6组，每组大于10只，于给药前眼角采血，计数白细胞数，作给药前值（0天），淘汰白细胞数过低的动物，每组选10只白细胞计数合格的动物进行试验。连续3天每天腹腔注射CTX，剂量为100mg/kg/天，同时开始给予受试样品（提取物高、中、低剂量组）或阳性对照药（利可君100mg/kg），体积为0.5ml/20g体重，连续给药24天。另设模型组和正常组。每3天眼角采血，进行白细胞计数。

实验结果以平均值±标准差表示，白细胞计数以给药组各时间点改变值的平均值与生理盐水组的改变值进行t-测验，统计变化的显著性。

动物注射环磷酰胺后，白细胞计数迅速下降，在实验第4天左右到最低值。到第7天，白细胞计数稍有回升。到实验的第10天，提取物三个剂量组，利可君组同模型组白细胞计数均显著升高，至实验的第13天达最高值，给药组升高值高于模型组。实验的第16天起，白细胞计数又开始下降，但给药组白细胞计数降低较模型组慢，实验的第19至25天，模型组的白细胞计数维持在4000-5000个/μl，而提取物高、中、低剂量组与利可君组的白细胞计数维持在正常值水平。

实验结果说明，提取物对小鼠环磷酰胺引起的白细胞降低有明显的升白作用，实验结果见表9和图1。

表9.北冬虫夏草提取物对CTX引起的白细胞减少的改变值

与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01。

以上结果显示，北冬虫夏草提取物在600、300、150mg/kg三个剂量下，对小鼠肝癌H22、小鼠Lewis肺癌和小鼠S180肉瘤的生长均有不同程度的抑制作用，而且随着剂量的增加抑制作用增强，量效关系明显，二批实验结果均能重复。提取物分别与化疗药5FU、CDDP、CTX合用显示了相加作用，疗效好于单独用药。提取物单用及合并CTX对荷白血病P388小鼠的生命有一定的延长作用。

提取物对移植于裸鼠的人体乳腺癌MDA-MB-435、人体肺癌A549成瘤后开始给药，均具有一定的生长抑制作用，量效关系明显。分别与化疗药Taxol和Gemzar合用，显示了一定的相加作用。

与放疗合并，抑瘤作用也明显强于单独放疗。

提取物对荷瘤小鼠的免疫功能有明显的促进作用，能促进脾淋巴细胞增殖，激活NK细胞活性，促进IL-2的产生。

提取物对大剂量环磷酰胺引起的小鼠白细胞降低有明显的治疗作用。

综上所述，提取物具有抗肿瘤、增强免疫、合并放化疗增效以及抗白细胞减少等作用，为临床用于肿瘤辅助治疗提供了试验依据。

Claims (7)

1.一种北冬虫夏草提取物，其中虫草多糖与虫草素的重量比为1－25:1。

2.如权利要求1所述的北冬虫夏草提取物，所述北冬虫夏草提取物选自人工培育北冬虫夏草子实体的提取物、从人工培育北冬虫夏草培养基中得到的提取物，及从人工培育北冬虫夏草培养基中得到的提取物加北冬虫夏草子实体细粉的复合物。

3.权利要求1所述北冬虫夏草提取物在制备治疗肿瘤药物上的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其中所述肿瘤包括实体瘤和非实体瘤。

5.如权利要求4所述的应用，其中所述实体瘤为肝癌、肺癌、乳腺癌和肉瘤中的一种或一种以上。

6.如权利要求4所述的应用，其中所述非实体瘤为白血病。

7.如权利要求3-6中任何一项所述的应用，其中所述治疗肿瘤药物还具有增强免疫功能、协同放疗或化疗的治疗作用和降低放疗或化疗药物毒性的作用。

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