CN101007025A - 一种连续提取北冬虫夏草子实体有效成分的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种连续提取北冬虫夏草子实体有效成分的方法，它是经CO₂超临界流体萃取得甾醇类物质、经醇沉得含虫草素的核苷物质及虫草多糖、经正相低压硅胶色谱分离和富集得虫草素粗品、再利用制备型反相高效液相色谱分离、纯化得高纯度虫草素晶体。本发明不仅可以连续提取出北冬虫夏草子实体中的甾醇类化合物、虫草多糖(CM－1)，而且能够制备出高纯度的虫草素单体；它既适宜小型实验，也可以用于产业化生产，由于一次性处理子实体，可以提取出多种物质，不仅降低了产业化成本，而且易创最大化经济效益。

Description

一种连续提取北冬虫夏草子实体有效成分的方法

技术领域

本发明涉及生物活性物质的提取方法，具体地说是一种连续提取北冬虫夏草子实体有效成分的方法。

背景技术

北冬虫夏草子实体中的有效成分包括甾醇类化合物、虫草多糖、虫草素等，目前国内企业或科研单位在对北冬虫夏草子实体中有效成分的提取、多采用单一成分提取的方法，该种方法是使目标成分得率最大化，其它成分作为杂质，不关注损失情况。此外，单一有效成分提取时，所使用的原料都是原始的北冬虫夏草子实体，工艺比较简单，容易掌握。单一有效成分的提取使得北冬虫夏草子实体中大量其它有效成分被白白流失掉，使北冬虫夏草子实体多种生理活性成分或具有多种临床用途的生物活性物质难以开发出来，造成单一产物制成的产品成本过高。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足而提供的一种连续提取北冬虫夏草子实体有效成分的方法，它在提取某一有效成分时，不仅能使该有效成分得率最大化，而且还保证了不损失其它有效成分；可以多、快、好、省的将北冬虫夏草子实体中的有效成分顺次提取、分离、制备出来，而且有利于综合利用和节约高成本的子实体原料。

实现本发明目的的具体技术方案是：

一种连续提取北冬虫夏草子实体有效成分的方法，它是经CO₂超临界流体萃取得甾醇类物质、经醇沉得含虫草素的核苷物质及虫草多糖、经正相低压硅胶色谱分离和富集得虫草素粗品、再利用制备型反向高效液相色谱分离、纯化得高纯度虫草素晶体；其具体包括以下步骤：

(1)、CO₂超临界流体萃取

取700-1000克北冬虫夏草子实体，研磨成粉，装入萃取釜中温度保持在40-80℃，压力为300-500bar，通入CO₂，流速为50-8g/min，加入CO₂含量的5-15％的95％乙醇作助溶剂，平衡10-25min，萃取时间为0.5-3h，得到淡黄色油状浸出物和残渣，淡黄色油状浸出物即甾醇类物质；

(2)、醇沉

将上述步骤得到的残渣，放入提取罐中提取，加入500-2000ml蒸馏水，于50-90℃保温1-2.5h，取出离心，再将残渣重新放入蒸馏水中，重复提取三次，合并三次提取液，弃取残渣；将提取液用旋转蒸发器浓缩，温度为40-80℃，真空度为0.5-1Mpa，浓缩至500-2000ml，离心，去除残渣，加入三倍提取液体积的95％乙醇，放置过夜；利用离心机离心，得到上清液及沉淀物，上清液为含虫草素的核苷物质，沉淀物为以虫草多糖；

(3)、正相低压硅胶色谱分离、富集

以步骤2中上清液为材料，利用正相低压硅胶色谱分离和富集，色谱条件：色谱柱为50mm×1000mm的密封玻璃柱，填料为GF254层析硅胶，以三氯甲烷∶乙酸乙酯∶异丙醇∶水、质量比为：400∶100∶300∶24的洗脱剂进行梯度洗脱；取适量上清液加入硅胶柱、上样，室温下以1-5ml/min均匀加入洗脱剂，收集洗脱后的溶液，合并含有虫草素的洗脱液，冷冻干燥，即得虫草素粗品。

(4)、制备型反相高效液相色谱分离、纯化

制备色谱条件：色谱柱：Sino ODS C18 20×250mm，流速6-20ml/min；进样量：2ml或色谱柱：Sino ODSC18 50×250mm，流速50-200ml/min；进样量：10-15ml，用蒸馏水溶解虫草素粗品并定容至适当体积，以上色谱条件的流动相为甲醇∶水＝15∶85梯度洗脱，检测波长：260nm，收集溶液，反复上述过程，直至溶液纯度达99％以上，再冷冻干燥溶液，即可得到高纯度虫草素晶体。

本发明不仅可以连续提取出北冬虫夏草子实体中的甾醇类化合物、虫草多糖(CM-1)，而且能够制备出高纯度的虫草素单体；它既适宜小型实验，也可以用于产业化生产，由于一次性处理子实体，可以提取出多种物质，不仅降低了产业化成本，而且易创最大化经济效益，是一种适于产业链延伸和符合循环经济方向的方法，并在实施过程中，无任何造成环境污染的物质和其它因素。

具体实施方式

实施例

1、CO₂超临界流体萃取

取700克北冬虫夏草子实体，研磨成粉，装入萃取釜中保持在60℃，压力为400bar，通入CO₂，流速为30g/min，加入CO₂含量的10％的95％乙醇作助溶剂，平衡20min，萃取时间为2h，得到淡黄色油状浸出物和残渣，分别用反相高效色谱法(色谱柱：Kromasil ODS C₁₈ 4.6×250mm，5um；流动相：甲醇∶水＝15∶85；流速：0.8ml/min；检测波长：260nm；检测温度：30℃；进样量为2ul)全程监控子实体及中间产物中的虫草素含量变化情况。

2、醇沉

将上述步骤得到的残渣，放入提取罐中提取，加入1200ml蒸馏水，于70℃保温2h，取出离心，再将残渣重新放入蒸馏水中，重复提取三次，合并三次提取液，弃取残渣；将提取液用旋转蒸发器浓缩，温度为60℃，真空度为0.8Mpa，浓缩至1200ml，离心，去除残渣，加入三倍提取液体积的95％乙醇，放置过夜；利用离心机离心，得到上清液及沉淀物，上清液为含有虫草素的核苷物质，沉淀物为虫草多糖(CM-1)。

3、正相低压硅胶色谱分离、富集

以步骤2中上清液为材料，利用正相低压硅胶色谱分离和富集，色谱条件：色谱柱为50mm×1000mm的密封玻璃柱，填料为GF254层析硅胶，以三氯甲烷∶乙酸乙酯∶异丙醇∶水、质量比为：400∶100∶300∶24的洗脱剂进行梯度洗脱；取适量上清液加入硅胶柱、上样，室温下以3ml/min均匀加入洗脱剂，收集洗脱后的溶液，合并含有虫草素的洗脱液，冷冻干燥，即得虫草素粗品。

4、制备型反相高效液相色谱分离、纯化

制备色谱条件：色谱柱：Sino ODS C18 20×250mm，流速6-20ml/min；进样量：2ml或色谱柱：Sino ODSC18 50×250mm，流速150ml/min；进样量：13ml，用蒸馏水溶解虫草素粗品并定容至适当体积，以上色谱条件的流动相为甲醇∶水＝15∶85梯度洗脱，检测波长：260nm，收集溶液，反复上述过程，直至溶液纯度达99％以上，再冷冻干燥溶液，即可得到1.5克高纯度虫草素晶体。

Claims (2)

1、一种连续提取北冬虫夏草子实体有效成分的方法，其特征在于它是经CO₂超临界流体萃取得甾醇类物质、经醇沉得含虫草素的核苷物质及虫草多糖、经正相低压硅胶色谱分离和富集得虫草素粗品、再利用制备型反向高效液相色谱分离、纯化得高纯度虫草素晶体。

2、根据权利要求1所述的连续提取北冬虫夏草子实体有效成分的方法，其特征在于具体包括以下步骤：

(1)、CO₂超临界流体萃取

取700-1000克北冬虫夏草子实体，研磨成粉，装入萃取釜中温度保持在40-80℃，压力为300-500bar，通入CO₂，流速为50-8g/min，加入CO₂含量的5-15％的95％乙醇作助溶剂，平衡10-25min，萃取时间为0.5-3h，得到淡黄色油状浸出物和残渣，淡黄色油状浸出物即甾醇类物质；

(2)、醇沉

将上述步骤得到的残渣，放入提取罐中提取，加入500-2000m1蒸馏水，于50-90℃保温1-2.5h，取出离心，再将残渣重新放入蒸馏水中，重复提取三次，合并三次提取液，弃取残渣；将提取液用旋转蒸发器浓缩，温度为40-80℃，真空度为0.5-1Mpa，浓缩至500-2000ml，离心，去除残渣，加入三倍提取液体积的95％乙醇，放置过夜；利用离心机离心，得到上清液及沉淀物，上清液为含虫草素的核苷物质，沉淀物为以虫草多糖；

(3)、正相低压硅胶色谱分离、富集

以步骤2中上清液为材料，利用正相低压硅胶色谱分离和富集，色谱条件：色谱柱为50mm×1000mm的密封玻璃柱，填料为GF254层析硅胶，以三氯甲烷∶乙酸乙酯∶异丙醇∶水、质量比为∶400∶100∶300∶24的洗脱剂进行梯度洗脱；取适量上清液加入硅胶柱、上样，室温下以1-5ml/min均匀加入洗脱剂，收集洗脱后的溶液，合并含有虫草素的洗脱液，冷冻干燥，即得虫草素粗品。

(4)、制备型反相高效液相色谱分离、纯化

制备色谱条件：色谱柱：Sino ODS C18 20×250mm，流速6-20ml/min；进样量：2ml或色谱柱：Sino ODSC18 50×250mm，流速50-200ml/min；进样量：10-15ml，用蒸馏水溶解虫草素粗品并定容至适当体积，以上色谱条件的流动相为甲醇∶水＝15∶85梯度洗脱，检测波长：260nm，收集溶液，反复上述过程，直至溶液纯度达99％以上，再冷冻干燥溶液，即可得到高纯度虫草素晶体。