CN101928316A - 一种高纯度片状虫草素晶体的制备方法 - Google Patents

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本发明公开了一种高纯度片状虫草素晶体的制备方法，是利用提取剂对北冬虫夏草固体培养基残基中的虫草素进行提取，同时使提取液流经大孔树脂后再次对北冬虫夏草固体培养基残基进行循环提取和吸附；再将吸附在大孔树脂上的虫草素洗脱下来，洗脱液浓缩、结晶和再结晶后得到高纯度片状虫草素晶体。本方法获得的产品HPLC纯度99.9％以上，适合大规模工业化生产。

Description

一种高纯度片状虫草素晶体的制备方法
 
技术领域
本发明涉及医药化工领域，具体为一种高纯度片状虫草素晶体的制备方法，尤其是从北冬虫夏草培养基残基中提取高纯度片状虫草素晶体的方法。
背景技术
北冬虫夏草（北虫草），又名蛹虫草(Cordyceps militaris)，属子囊菌亚门、麦角菌科、虫草属，是一种珍贵的药用菌。近年来，由于天然冬虫夏草(Cordyceps sinensis)需求不断增长，有限的资源日益枯竭，目前尚未人工规模化栽培。于是人们开始培育生产周期短，与天然冬虫夏草有相似医疗保健功效的北冬虫夏草满足消费需求，替代天然冬虫夏草的不足，为人工规模化培育的北冬虫夏草的发展提供了广阔的市场和良好的发展机遇。
人工培育的北冬虫夏草培养基中含有虫草素、虫草多糖等生理活性成份，从残余培养基中提取虫草素、虫草多糖等保健食品或医药中间体，将能变废为宝，提高企业经济效益。
虫草素是天然冬虫夏草、人工培育北冬虫夏草中重要的生理活性成份。虫草素（cordycepin）是由腺嘌呤和脱氧戊糖组成，也称3′-脱氧腺苷(3′-deoxyadenosine)。
大量的药理学试验结果表明，虫草素具有抗肿瘤、抗菌抗病毒、免疫调节、清除自由基、减肥、提高性功能等作用，表现出良好的临床应用前景。目前高含量的虫草素市场价格昂贵，因此，制备高纯度的虫草素具有重要的经济价值和广阔的市场前景。
据国内外所有公开报道的虫草素分离纯化专利文献，未从报道过高纯度片状虫草素晶体的制备方法。报道过的专利文献中，虫草素的分离纯化工艺比较复杂，需经过不同的树脂处理或须借助昂贵的高效液相制备色谱技术设备，生产成本高，难于实现规模化工业生产。
发明内容
本发明旨在提供一种高纯度片状虫草素晶体的制备方法，从北冬虫夏草培养基残基提取高纯度片状虫草素晶体。
一种高纯度片状虫草素晶体的制备方法，是利用提取剂对北冬虫夏草固体培养基残基中的虫草素进行提取，同时使提取液流经大孔树脂后再次对北冬虫夏草固体培养基残基进行循环提取和吸附；再将吸附在大孔树脂上的虫草素洗脱下来，洗脱液浓缩、结晶和再结晶后得到高纯度片状虫草素晶体。
具体步骤包括：
（1） 将北冬虫夏草固体培养基残基粉碎后置于容器内，用提取剂对北冬虫夏草固体培养基残基进行提取；提取剂流出后用大孔树脂进行吸附，然后流回装有北冬虫夏草固体培养基残基的容器循环提取；提取时间为10～20hr；
北冬虫夏草固体培养基残基、提取剂和大孔树脂的用量比为1kg：1～20L：0.3～0.5L，优选为1kg：2～10L：0.3～0.5L；提取剂为水；
（2） 用洗脱剂洗脱大孔树脂，得到洗脱液；洗脱速度为0.5～2BV/hr；
北冬虫夏草固体培养基残基与洗脱剂的用量比为1kg：1～2L；
洗脱剂为10～50%体积浓度的乙醇水溶液；
（3） 取洗脱液浓缩和结晶，分离固体得到虫草素粗品；
（4） 将虫草素粗品洗涤和重结晶，得到高纯度片状虫草素晶体。
步骤（1）中，将粉碎的北冬虫夏草固体培养基残基过10～20mm筛。
步骤（1）中，装有北冬虫夏草固体培养基残基的容器上部出水口连接到装有大孔树脂的吸附柱的底部入水口，吸附柱上部出水口接到流到装有北冬虫夏草固体培养基残基的容器底部的入水口，提取液的流动方向为：容器底部入水口——容器上部出水口——吸附柱底部入水口——吸附柱上部出水口——容器底部入水口。
步骤（1）中，所用的大孔树脂为非极性大孔树脂；可选用H-20型、H-01型或H-10型大孔树脂，优选为H-20型大孔树脂。
步骤（3）中先将洗脱液浓缩至比重为1.05～1.1，再在0～30℃下结晶，优选的结晶温度为0～4℃。
步骤（3）中，用离心或真空抽滤的方法分离固体。
步骤（4）中，用75%～99%体积浓度的乙醇水溶液为溶剂进行重结晶。
将步骤（4）重结晶得到的产品洗涤干燥，用75%～99%体积浓度的乙醇水溶液洗涤，80～100℃下加热烘干，或-50～-10℃下低温冷冻干燥。
本发明的方法，采用大孔吸附树脂作为分离介质，以水、乙醇做为溶剂，在常温下连续动态地进行提取和吸附分离，实现从北冬虫夏草培养基中分离制备出高纯度片状虫草素晶体，变废为宝；克服现有虫草素提取、分离纯化技术的不足，工艺简单，实现连续提取、分离，所用树脂不需经过酸碱再生可以重复使用，设备投资和生产运行成本低，环保，片状虫草素晶体HPLC纯度99.9％以上，适合大规模工业化生产。
附图说明
图1为实施例1高纯度片状虫草素晶体的HPLC检测图谱。
具体实施方式
用滚轴式不锈钢刀片粉碎机对块状的北冬虫夏草固体培养基的残基进行粉碎，主轴转速为400～600r/min，筛网孔径为10～20mm，得到北冬虫夏草培养基残基颗粒。
虫草素含量的测定方法（高效液相色谱法）如下：
（1）标准品溶液的配制   准确称取2.5毫克虫草素标准品，用纯净水加热溶解后定容到10毫升，冷却至室温备用。
（2）色谱条件   C18色谱柱(150mm*4.6mm)；流动相为甲醇∶水＝15∶85；流速1.0ml/min；柱温40℃；检测波长258nm。
（3）样品含量测定   准确称取2.5毫克样品，用纯净水加热溶解后定容到10毫升，冷却至室温，摇匀，溶解液过0.22цm滤膜过滤，20цL进样，通过样品与标准品的峰面积来计算虫草素的含量。
实施例1
取24.89公斤粉碎好的北冬虫夏草培养基残基颗粒装入两端可封口的φ30×60cm不锈钢桶中，装填要均匀，不挤压，用盖子将桶盖紧。
用隔膜泵将50升饮用水从不锈钢桶底端泵入，不锈钢桶上端出来的水提液从下端流入装有9升H-20大孔树脂的不锈钢柱（φ10×120cm)中，不锈钢柱上端的流出液继续用隔膜泵泵入不锈钢桶底端，进行水循环提取，同时吸附；隔膜泵开启时间即提取时间为16h。
提取后以30升30％（V/V）乙醇水溶液为洗脱剂，洗脱大孔树脂柱，流速为1BV/h；收集洗脱液用旋转蒸发仪真空减压浓缩，浓缩液比重为1.07时停止浓缩。
将浓缩液在0～4℃下结晶，用真空抽滤法将晶体分离出，水洗并热风烘箱干燥得20.6克白色虫草素粗品。
取10克上述白色虫草素粗品溶于85%（V/V）乙醇水溶液中进行重结晶；真空抽滤分离重结晶产物，用85%体积浓度乙醇溶液洗涤，80～100℃烘干，得到6.6克白色的高纯度片状虫草素晶体， HPLC检测纯度大于99.9%，如图1所示。
实施例2
将24.32公斤粉碎好的北冬虫夏草培养基残基颗粒装入两端可封口的φ30×60cm不锈钢桶中，装填要均匀，不挤压，用盖子将桶盖紧。
用隔膜泵将50升饮用水从不锈钢桶底端泵入，不锈钢桶上端出来的水提液从下端流入装有9升H-20大孔树脂的不锈钢柱（φ10×120cm）中，不锈钢柱上端的流出液继续用高压隔膜泵泵入不锈钢桶底端，进行水循环提取，隔膜泵开启时间即提取时间为16h。
用30升20％（V/V）乙醇水溶液为洗脱剂，用隔膜泵将洗脱剂泵入装有大孔树脂的不锈钢柱进行洗脱，流速为1BV/h；收集洗脱液用旋转蒸发仪真空减压浓缩，浓缩液比重为1.06时停止浓缩。
将浓缩液在0～4℃下结晶，用真空抽滤法将晶体分离出，水洗并热风烘箱干燥得19.7克白色虫草素粗品。
取10克上述白色虫草素粗品溶于85%（V/V）乙醇水溶液中进行重结晶；真空抽滤分离重结晶产物，用85%体积浓度乙醇溶液洗涤，-30℃冷冻干燥，得5.9克白色的高纯度片状虫草素晶体，HPLC检测纯度大于99.9%。
实施例3
将250克粉碎好的北冬虫夏草培养基残基颗粒装入两端可封口的φ5.0×40cm PVC管中，装填要均匀，不挤压，用盖子将PVC管盖紧。
用蠕动泵将2500ml饮用水从PVC管底端泵入，PVC管上端出来的水提液从下端流入装有100ml H-20大孔树脂的玻璃柱(φ2.5×50cm)中，玻璃柱上端的流出液继续用蠕动泵泵入PVC管底端，进行水循环提取；蠕动泵开启时间即提取时间为16小时。
用400ml 30％（V/V）乙醇水溶液为洗脱剂，用蠕动泵将洗脱剂泵入装有大孔树脂的玻璃柱进行洗脱，流速为1BV/h；收集洗脱液用旋转蒸发仪真空减压浓缩，浓缩液比重为1.05时停止浓缩。
将浓缩液在0～4℃下结晶，用真空抽滤法将晶体分离出，水洗并热风烘箱干燥得1.8克白色虫草素粗品。
取1克上述白色虫草素粗品溶于85%（V/V）乙醇水溶液中进行重结晶；真空抽滤分离重结晶产物，用85%体积浓度乙醇溶液洗涤，-20℃冷冻干燥，得0.61克白色的高纯度片状虫草素晶体，HPLC检测纯度大于99.9%。
实施例4
将250克粉碎好的北冬虫夏草培养基残基颗粒装入两端可封口的φ5.0×40cm PVC管中，装填要均匀，不挤压，用盖子将PVC管盖紧。
用蠕动泵将2500ml饮用水从PVC管底端泵入，PVC管上端出来的水提液从下端流入装有100ml H-20大孔树脂的玻璃柱(φ2.5×50cm)中，玻璃柱上端的流出液继续用蠕动泵泵入PVC管底端，进行水循环提取；蠕动泵开启时间即提取时间为16小时。
用400ml 10％（V/V）乙醇水溶液为洗脱剂，用蠕动泵将洗脱剂泵入装有大孔树脂的玻璃柱进行洗脱，流速为1BV/h；收集洗脱液用旋转蒸发仪真空减压浓缩，浓缩液比重为1.09时停止浓缩。
将浓缩液在0～4℃下结晶，用真空抽滤法将晶体分离出，水洗并热风烘箱干燥得2.1克白色虫草素粗品。
取1克上述白色虫草素粗品溶于85%（V/V）乙醇水溶液中进行重结晶；真空抽滤分离重结晶产物，用85%体积浓度乙醇溶液洗涤，80～100℃烘干，得0.67克白色的高纯度片状虫草素晶体，HPLC检测纯度大于99.9%。

Claims (10)

1.一种高纯度片状虫草素晶体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1） 将北冬虫夏草固体培养基残基粉碎后置于容器内，用提取剂对北冬虫夏草固体培养基残基进行提取；提取剂流出后用大孔树脂进行吸附，然后流回装有北冬虫夏草固体培养基残基的容器循环提取；提取时间为10～20hr；所述的大孔树脂为非极性大孔树脂；
北冬虫夏草固体培养基残基、提取剂和大孔树脂的用量比为1kg：1～20L：0.3～0.5L；提取剂为水；
（2） 用洗脱剂洗脱大孔树脂，得到洗脱液；洗脱速度为0.5～2BV/hr；
北冬虫夏草固体培养基残基与洗脱剂的用量比为1kg：1～2L；
洗脱剂为10～50%体积浓度的乙醇水溶液；
（3） 取洗脱液浓缩和结晶，分离固体得到虫草素粗品；
（4） 将虫草素粗品洗涤和重结晶，得到高纯度片状虫草素晶体。
2.权利要求1所述高纯度片状虫草素晶体的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，将粉碎的北冬虫夏草固体培养基残基过10～20mm筛。
3.权利要求1所述高纯度片状虫草素晶体的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，装有北冬虫夏草固体培养基残基的容器上部出水口连接到装有大孔树脂的吸附柱的底部入水口，吸附柱上部出水口接到流到装有北冬虫夏草固体培养基残基的容器底部的入水口，提取液的流动方向为：容器底部入水口——容器上部出水口——吸附柱底部入水口——吸附柱上部出水口——容器底部入水口。
4.权利要求1所述高纯度片状虫草素晶体的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述北冬虫夏草固体培养基残基、提取剂和大孔树脂的用量比为1kg：2～10L：0.3～0.5L。
5.权利要求1所述高纯度片状虫草素晶体的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所用的非极性大孔树脂为H-20型、H-01型或H-10型大孔树脂。
6.权利要求1所述高纯度片状虫草素晶体的制备方法，其特征在于，步骤（3）中先将洗脱液浓缩至比重为1.05～1.1，再在0～30℃下结晶。
7.权利要求1或6所述高纯度片状虫草素晶体的制备方法，其特征在于，步骤（3）中结晶温度为0～4℃。
8.权利要求1所述高纯度片状虫草素晶体的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，用离心或真空抽滤的方法分离固体。
9.权利要求1所述高纯度片状虫草素晶体的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，用75%～99%体积浓度的乙醇水溶液为溶剂进行重结晶。
10.权利要求1所述高纯度片状虫草素晶体的制备方法，其特征在于，将步骤（4）重结晶得到的产品洗涤干燥，用75%～99%体积浓度的乙醇水溶液洗涤，80～100℃下加热烘干，或-50～-10℃下低温冷冻干燥。
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