CN102432656B - 一种蛹虫草子实体中虫草素提取纯化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种蛹虫草子实体中虫草素提取纯化的方法。该方法通过乙醇水溶液为提取剂进行提取，然后经中极性大孔树脂柱，树脂型号为ML-7进行纯化，虫草素纯度可达到98.2％。该方法原料资源丰富、成本低廉、工艺简单、适合工业化生产。

Description

一种蛹虫草子实体中虫草素提取纯化的方法
技术领域
本发明涉及一种蛹虫草子实体中虫草素提取纯化的方法，属于农产品深加工技术领域。
背景技术
蛹虫草又名北冬虫夏草，是与冬虫夏草同属不同种的药食两用真菌，其有效成分主要包括虫草素、虫草酸和虫草多糖等活性成分。其中，虫草素被认为是虫草中特有的核苷类活性成分，虫草素又称3′-脱氧腺苷(3′-deoxyadenosine)是1951年由Cunninghan等人从cordyceps militaris原浆液中分离得到的一种物资，后来被证实为我国中草药冬虫夏草(cordyceps sinensis)的有效成分。近年来的研究证明，虫草素具有抗肿瘤、抗病毒、增强免疫功能和预防心脑血管疾病等作用。据报道，在美国已将虫草素作为抗癌抗病毒新药进入临床试用。而我国也已将虫草素作为治疗白血病的新药进入一期临床。正因为虫草素具有特殊的医疗保健功能，所以，引起了国内外医学专家的高度重视。但由于蛹虫草中的虫草素含量较低加上提取纯化工艺较为复杂，导致其生产成本过高，市场价格昂贵，目前虫草素纯品(纯度在99％以上)售价达到每公斤1500万元，因此，如何降低虫草素的提取纯化成本、提高虫草素的纯度对其今后的研究和应用将起到非常重要的作用。目前，有关虫草素的制备一般采取两步：第一步是用水或甲醇、乙醇等有机溶液进行提取；第二步将提取液用树脂、活性碳、硅胶或制备型高效液相色谱进行纯化，得到虫草素。但目前存在的主要问题是由于提取液中除虫草素外，还含有较多其他组份，使虫草素的相对含量较低，一般在1.4％-20％左右，这样即使第二步用树脂等纯化，虫草素的纯度也不会高于90％；而采用制备型高效液相色谱进行纯化虽然纯度可以达到98％以上，但由于该方法色谱柱等的使用成本太高又难以规模化生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种蛹虫草子实体中虫草素提取纯化的方法，包括如下步骤：
①提取：将蛹虫草子实体与乙醇水溶液按1g∶20ml均匀混合，在30～75℃下提取2h，过滤，重复提取2次，65℃减压浓缩至原体积的20％，离心，得提取液I；
其中的乙醇水溶液的质量浓度为20％～90％；
②分离纯化：将步骤①得到的提取液I上中极性大孔树脂ML-7柱，分别以质量浓度为5％、10％、15％和20％的甲醇水溶液作洗脱剂进行梯度洗脱，收集10％和15％的洗脱液，65℃减压浓缩至原洗脱液体积的5％，置于4℃析出晶体，重结晶，干燥；
其中，提取液I与中极性大孔树脂的体积比为1∶1.5，每个浓度梯度的洗脱剂体积均为中极性大孔树脂体积的1.5倍。
优选的技术方案中，所述步骤①中的乙醇水溶液的质量浓度优选60～80％，最优选80％。
进一步优选的技术方案中，所述步骤①中的提取温度为30～60℃，最优选45℃。
再一优选的技术方案中，所述步骤②中重结晶方法是：将所析出晶体在70℃下溶于无水乙醇中，-20℃下重结晶。
本发明的上述技术方案中，所述的作为原料的蛹虫草子实体的含水量不高于7％，颗粒度为60目。
本发明的方法，针对虫草中的组分性质尤其是和虫草素结构相似的腺苷成分，通过实验表明，水作为提取剂对虫草素和腺苷的提纯效果较好，而不同质量浓度的乙醇作为提取剂对虫草素的提纯效果很好但对腺苷的提纯效果较差，因此本发明的方法，在第一步的提取过程中，利用水-乙醇溶液作为提取剂，然后通过参数的优化可以提高虫草素的含量，降低腺苷、糖等组份的干扰，该方法提取液中虫草素的含量达到47.2％，高于一般提取方法2.4～34倍；经第二步ML-7型大孔树脂进行纯化，虫草素纯度达到98.2％。该方法原料资源丰富、成本低廉、工艺简单、适合工业化生产。
附图说明
本发明附图4幅，
图1为本发明实施例1的高效液相色谱图；
图2为本发明实施例1的高效液相色检测组分的含量图；
图3为本发明实施例2的高效液相色谱图；
图4为本发明实施例2的高效液相色检测组分的含量图；
其中：a、腺苷，b、杂质Ⅰ，c、虫草素，d、杂质Ⅱ，e、杂质Ⅲ。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。本发明所使用的蛹虫草子实体来源于铁岭市圣林商贸有限公司。本发明中所采用的高效液相色谱法的检测条件为：以水∶乙腈＝95∶5为流动相；流速：1.2ml/min；柱温：30℃；检测波长：259nm的条件下测定。
实施例1
①将蛹虫草子实体在45℃下干燥6h、使含水量不高于7％，粉碎至颗粒度为60目；
②称取步骤①得到的3g蛹虫草子实体粉与60ml乙醇水溶液混合，其中按以下表1中指定的乙醇水溶液的质量浓度和提取温度下，提取2h，重复提取二次，合并滤液，65℃减压浓缩至10ml，10000rpm离心20min，取上清液即为提取液Ⅰ。采用高效液相色谱法测定提取液Ⅰ中虫草素和腺苷的含量，结果如表1所示。
实施例2～20
按以下表1中指定的乙醇水溶液的质量浓度和提取温度重复实施例1的方法。通过高效液相色谱法测定提取液Ⅰ中虫草素和腺苷的含量，结果如表1所示。图1和图2是本发明中实施例14的高效液相色谱法测定提取液Ⅰ的组份和含量的图谱。从图中可以看出，提取液Ⅰ中腺苷含量为1.2％、杂质Ⅰ含量为16.4％、虫草素含量为47.3％、杂质Ⅱ含量为11.5％及杂质Ⅲ含量为23.6％。
实施例21
将实施例14得到的提取液Ⅰ上中极性大孔树脂柱，树脂型号为ML-7，分别以质量浓度为5％、10％、15％和20％的甲醇水溶液作洗脱剂进行梯度洗脱，收集10％和15％的洗脱液，65℃减压浓缩至洗脱剂体积的5％，置于4℃析出晶体，晶体在70℃下溶于无水乙醇中，-20℃下重结晶，最后，将结晶放入￠21cm真空干燥器中，在40℃、0.08Mpa条件下处理60min；其中，提取液I与中极性大孔树脂的体积比为1∶1.5，每个浓度梯度的洗脱剂体积均为中极性大孔树脂体积的1.5倍。采用高效液相色谱法测定纯化后物质的组份和含量，结果见图3和图4。从图中可以看出，腺苷含量为0.9％、虫草素含量为98.2％及杂质Ⅲ含量为0.9％，而杂质Ⅰ和杂质Ⅱ已除去，纯化后腺苷和杂质Ⅲ的含量明显降低，虫草素含量明显升高，说明此方法对虫草素具有较好的纯化效果。
对比例1～4
按以下表1中指定的100％的水和提取温度重复实施例1的方法。通过高效液相色谱法测定提取液Ⅰ中虫草素和腺苷的含量，结果如表1所示。
表1不同乙醇浓度和不同提取温度对虫草素和腺苷的含量影响
  乙醇水溶液/％   提取温度/℃   虫草素(mg/kg)   腺苷(mg/kg)
  实施例1   20   30   3076   558
  实施例2   20   45   3178   570
  实施例3   20   60   3147   667
  实施例4   20   75   3064   250
  实施例5   40   30   3165   237
  实施例6   40   45   3280   643
  实施例7   40   60   3203   298
  实施例8   40   75   3172   82
  实施例9   60   30   3173   102
  实施例10   60   45   3345   115
  实施例11   60   60   3263   110
  实施例12   60   75   3295   60
  实施例13   80   30   3305   57
  实施例14   80   45   3489   62
  实施例15   80   60   3342   73
  实施例16   80   75   3338   73
  实施例17   90   30   3261   51
  实施例18   90   45   3452   50
  实施例19   90   60   3340   52
  实施例20   90   75   3282   62
  对比例1   100％的水   30   2987   2076
  对比例2   100％的水   45   3127   2162
  对比例3   100％的水   60   3094   2175
  对比例4   100％的水   75   3083   752
上述表1中各实施例和对比例虫草素和腺苷的含量的测试数据说明，通过本发明的提取方法得到的虫草素的含量提高，腺苷的含量降低，本发明的方法明显优于对比例的方法。

Claims (7)

1.一种蛹虫草子实体中虫草素提取纯化的方法，包括如下步骤：
①提取：将蛹虫草子实体与乙醇水溶液按1g∶20ml均匀混合，在30～75℃下提取2h，过滤，重复提取2次，65℃减压浓缩至原体积的20％，离心，得提取液I；
其中的乙醇水溶液的质量浓度为20％～90％；
②分离纯化：将步骤①得到的提取液I上中极性大孔树脂ML-7柱，分别以质量浓度为5％、10％、15％和20％的甲醇水溶液作洗脱剂进行梯度洗脱，收集10％和15％的洗脱液，65℃减压浓缩至原洗脱液体积的5％，置于4℃析出晶体，重结晶，干燥；
其中，提取液I与中极性大孔树脂的体积比为1∶1.5，每个浓度梯度的洗脱剂体积均为中极性大孔树脂体积的1.5倍。
2.根据权利要求1所述的蛹虫草子实体中虫草素提取纯化的方法，其特征在于所述步骤①中的乙醇水溶液的质量浓度为60～80％。
3.根据权利要求1或2所述的蛹虫草子实体中虫草素提取纯化的方法，其特征在于所述步骤①中的乙醇水溶液的质量浓度为80％。
4.根据权利要求3所述的蛹虫草子实体中虫草素提取纯化的方法，其特征在于所述步骤①中的提取温度为30～60℃。
5.根据权利要求1、2或4所述的蛹虫草子实体中虫草素提取纯化的方法，其特征在于所述步骤①中的提取温度为45℃。
6.根据权利要求5所述的蛹虫草子实体中虫草素提取纯化的方法，其特征在于所述的蛹虫草子实体的含水量不高于7％，颗粒度为60目。
7.根据权利要求6所述的蛹虫草子实体中虫草素提取纯化的方法，其特征在于的所述的②中重结晶方法是：将所析出晶体在70℃下溶于无水乙醇中，-20℃下重结晶。
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